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VALIDACIÓN DE TRES DISTINTOS METODOS ANALÍTICOS POR

ESPECTROFOTOMETRÍA

VALIDATION OF THREE DIFFERENT ANALYTICAL METHODS BY SPECTROPHOTOMETRY

Rojas Agapito, Luis Gianpierre


Facultad de Ingeniería Química-Universidad Nacional Del Callao

RESUMEN
En este trabajo se dará a conocer la aplicación de la espectrofotometría por la validación de
métodos analíticos en distintos rubros de las industrias como es en la farmaceútica y de
tratamiento de licores residuales. En cada artículo presentado se aplican distintos métodos los
cuales son Cuantificación de isoniacida, Método por espectrofotometría y por colorimetría y Método
por el espectrómetro de UV - Vis
Todos los métodos analíticos por espectrofotometría tuvieron resultados favorables en los
estudios de sus parámetros de linealidad, precisión y exactitud, encontrándose dentro de los
límites dentro del rango en el que se trabajó cada uno.

Palabras clave: espectrofotometría, isoniacida, colorimetría.

SUMMARY
In this work, the application of spectrophotometry will be announced through the validation of
analytical methods in different industries such as pharmaceutical and waste liquor treatment.
In each article presented different methods are applied which are Quantification of isoniazid,
Method by spectrophotometry and by colorimetry and Method by the UV spectrometer - Vis
All the analytical methods by spectrophotometry had favorable results in the studies of their
parameters of linearity, precision and accuracy, being within the limits within the range in
which each was worked.

Keywords: spectrophotometry, isoniazid, colorimetry.


INTRODUCCIÓN -A partir de isoniacida estándar USP:
Se procedió a pesar 100 mg de esta muestra y
La espectrofotometría es uno de los se disolvió en agua ionizada a la vez que se
agitaba, llegando a tener una concentración de
métodos de análisis más usados, y se basa
1 mg/mL, teniendo en cuenta que la solución
en la relación que existe entre la absorción
resultante no debe estar expuesta a la luz.
de luz por parte de un compuesto y su
concentración. Cuando se hace incidir luz -Preparación de soluciones de isoniacida a
monocromática (de una sola longitud de partir de tabletas:
onda) sobre un medio homogéneo, una Se procedió a pesar y pulverizar 20 de estas
parte de la luz incidente es absorbida por el muestras, estas muestras de polvo se echaron a
medio y otra transmitida, como un matraz de Erlenmeyer y se le agregó 60 mL
consecuencia de la intensidad del rayo de de agua ionificada y al igual que en el proceso
luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la anterior se tuvo que agitar, se filtró y se
trasladó a matraces de 100 mL de capacidad. Se
intensidad de la luz incidente y P la
obtuvo una concentración de 1 mg/ml. Esta
intensidad del rayo de luz transmitido.
solución también tuvo que protegerse de la luz.
Dependiendo del compuesto y el tipo de
absorción a medir, la muestra puede estar
en fase líquida, sólida o gaseosa. En las
regiones visibles y ultravioleta del espectro
electromagnético, la muestra es
generalmente disuelta para formar una -Procedimiento analítico de cuantificación:
solución. Cada sustancia tiene su propio Se cogieron cierta cantidad de las muestras
espectro de absorción, el cual es una curva resultantes que contiene isoniacida en
matraces con capacidad de 25 mL, a esta
que muestra la cantidad de energía
muestra se le añadió 2 mL de etanol al 3% de
radiante absorbida, Absorbancia, por la
Vainilla. Luego se aforó con ácido clorhídrico en
sustancia en cada longitud de onda del
etanol al 0,5 M y se dejó reposar por 10
espectro electromagnético, es decir, a una minutos. Finalmente se hizo la lectura
determinada longitud de onda de la correspondiente en un espectrómetro a 405
energía radiante, cada sustancia absorbe nm.
una cantidad de radiación que es distinta a
la que absorbe otro. 2. Método por espectrofotometría y por
colorimetría
MATERIALES Y METODOS Se utilizó un espectrofotómetro UV-Vis con
1. Cuantificación de isoniacida dispositivo de barrido, colorímetro.
En el desarrollo de este método se utilizó La solución patrón primaria es sal de cromo
isoniacida estándar USP, tabletas comerciales básica y está compuesto por:
de isoniacida de 100 mg, etanol p.a., ácido -Cr(III), 6%;
clorhídrico p.a., vainillina p.a. y agua purificada. -NaCl comercial,8%
Equipos utilizados: -ácido fórmico, 2%
Espectrofotómetro GÉNESIS 10UV, -sal de CaCO3, 0.8%
Espectrofotómetro UNICO UV2100PU, Balanza Esta sal está disuelta en agua de grifo para
analítica METTER TOLEDO ABS204-S y un obtener soluciones de trabajo que estén
equipo Ultrasonido. Marca: BRANSON 3510, entre el 14 – 36% de la oferta total de cromo.
matraz de Erlenmeyer.
En el método por espectrofotometría, el
Preparación de solución de isoniacida patrón: espectrofotómetro UV-Vis contiene un
dispositivo de barrido, que sirve para medir
los espectros de diferentes soluciones patrón
de trabajo y de licores residuales obtenidos detección del producto de degradación de la
de los procesos de piquelado/curtido. El aminofilina en disolución acuosa, la teofilina.
intervalo de barrido fue de 190-800 nm. Por ello, la reacción complejométrica
En el método por colorimetría, Se utilizó propuesta en este trabajo, se basa en la
también un colorímetro construido para este formación de un complejo de inclusión de
fin, este sirve para comparar el color de las yodo entre la teofilina y un derivado
mismas soluciones patrón con los licores hidroxilado de la etilendiamina. Para ello, en
residuales de curtido. un tubo de ensayo de 12 x 150 mm se
Ambos métodos se basan en patrones colocaron 100 µL de la disolución de ácido
elaborados con los mismos reactivos yodhídrico (50 mg/mL) y se agregaron
químicos (sales de cromo y otros) que se lentamente 50 µL de la disolución estándar
usan corrientemente en la preparación de los de aminofilina (25 mg/mL). Se mezcló
licores curtientes en las fábricas. suavemente durante 5 minutos y se
agregaron 5 µL de la disolución acuosa de
3. Método por el espectrómetro de UV - clorhidrato de hidroxilamina (1 mg/mL). Se
Vis homogenizó suavemente y se agregaron 2
Se utilizó un espectrómetro de UV-Vis de gotas de ácido clorhídrico fumante. Se agitó
doble haz marca SLM-AMINCO modelo DW- vigorosamente hasta observar un color pardo
2000, el cual tiene un rango de longitud de rojizo opalescente. Una vez formado un
onda de trabajo comprendido de 0 y 1100 precipitado fino, se agregaron 2 mL de
nm. peróxido de hidrógeno al 30% para
Los reactivos utilizados fueron: completar la liberación de yodo, lo cual se
-diclorhidrato de aminofilina manifestó por la aparición de un precipitado
-ácido yodhídrico de color gris metálico. Se incubó durante 45
-clorhidrato de hidroxilamina minutos a temperatura ambiente y se filtró.
-ácido clorhídrico fumante Para registrar la longitud de onda de máxima
-peróxido de hidrógeno al 30% absorción, se realizó un barrido comprendido
entre 0 y 1100 nm en celdas de cuarzo de 1
Se analizó aminofilina en solución inyectable. cm de paso óptico, ajustando a cero de
Según las indicaciones del producto, cada absorbancia con un blanco de reactivo.
ampolleta contiene aminofilina (250 mg) y
agua (10 mL). RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se tienen que preparar disoluciones de
trabajo Diariamente, se prepararon las 1. Cuantificación de isoniacida
siguientes disoluciones acuosas: ácido Linealidad del sistema y del método:
yodhídrico (50 mg/mL), estándar de Se trabajaron cinco concentraciones de
aminofilina (25 mg/mL), estándar de xantina isoniacida a partir de muestras estándar y
(25 mg/mL), estándar de 2-xantinol (25 polvo de tabletas, 4 ug/mL, 8 ug/mL, 12
mg/mL), estándar de proxantilina (25 mg/mL) ug/mL, 16 ug/mL y 20 ug/mL. Cada
y clorhidrato de hidroxilamina (1 mg/mL). concentración fue sujeta de 3 análisis
Todas las disoluciones se prepararon independientes.
empleando agua desionizada a través de un
desionizador. Se filtraron empleando filtros
para jeringa de ésteres mixtos de celulosa,
con tamaño de poro de 0.22 µm y se
almacenaron en frascos de vidrio ámbar con
tapón de rosca de polivinilcarbonato (PVC).
Dado que la aminofilina es un preparado
farmacéutico que consta de 2 partes de
teofilina y 1 parte de etilendiamina, esta
última resulta ser una interferencia en la
Precisión y exactitud
La precisión se evaluó analizando la
repetibilidad y la precisión intermedia o
reproducibilidad.
En la Exactitud del método, se trabajaron nueve
muestras a partir del estándar y polvo de
tabletas de isoniacida, tres concentraciones
porcentuales según lo declarado por las
tabletas (100 mg) correspondientes al 67,7%;
100,0% y 133,3%. Se ensayaron por triplicado y
se evaluó el porcentaje de recuperación.

La linealidad comportamiento que para el


sistema se ve caracterizados mediante los
parámetros de la recta resultante, de
pendiente 0,0451 y su intercepto 0,0135;
El valor de la pendiente, está relacionado con
la sensibilidad del método
espectrofotométrico, es decir cambios de
absorbancia al cambiar las concentraciones
del analito, para este caso es
estadísticamente significativo (P<0,05),
además, la desviación estándar relativa (RSD)
es menor del 2% y los límites de confianza no
incluyen a cero (0,0455 – 0,0446). Para la
situación del intercepto; 0,0135; es aceptable
La precisión es expresada, con la desviación
estándar relativa (RSD), se debe considerar a la
precisión intra-ensayo llamada repetibilidad,
que es la capacidad de repetir el mismo
procedimiento con el mismo analista, usando el
mismo reactivo y el equipo en un corto
intervalo de tiempo, por ejemplo dentro de un
día; esperándose resultados similares. Además
se debe evaluar la precisión inter-ensayo o
reproducibilidad, que es la capacidad de repetir
el mismo método bajo condiciones diferentes,
por ejemplo cambio de analista, equipo o
reactivos; para este estudio se consideró dos
analistas, dos equipos y tres días diferentes. Los
resultados para el sistema instrumental, son
mostrados en la Tabla 2, donde se observa que
para repetibilidad y reproducibilidad los valores
de la RSD; 0,4847 y 0,93 son menores que el
valor máximo aceptable 2,74 sugerido por la
AEFI. La desviación estándar relativa (DER) de los
En lo que respecta a la exactitud, el RSD 0,59 factores de respuesta
es menor del máximo valor aceptable 2% y la absorbancia/concentración, obtenidos para
pendiente de la pendiente de la recta obtenida diferentes patrones de trabajo, es 1.12%, un
de la relación entre las concentraciones valor menor que el recomendado de 5%. La
estimadas y reales es 0,9923; valor cercano al pendiente de la recta de calibración, está muy
deseado de 1. Además, los intervalos de cerca del valor promedio de los factores de
confianza al 95%, 1,0045 y 0,9802 están respuesta, satisfaciendo el criterio establecido
alrededor de 1, cumpliéndose con los criterios para pruebas de linealidad. Por consiguiente, se
de aceptación. puede concluir que el método tiene una
respuesta lineal dentro del intervalo de valores
2. Método por espectrofotometría y por operacionales y puede ser utilizado para la
colorimetría determinación cuantitativa de las
concentraciones de cromo en licores residuales
Prueba de linealidad de piquelado-curtido.
A una longitud de onda de 576 nm, se hicieron
pruebas por triplcado en un patrón de trabajo Pruebas de precisión y exactitud
de intervalo 16 – 36% de la oferta total de sal
de cromo.
Se hizo una prueba de repetibilidad sobre una o igual a 0.98, un porcentaje de recobro
muestra de licor residual procedente de una analítico absoluto entre 98.0 – 102.0%, una
curtiembre local para determinar la precisión pendiente de la recta cercana a la unidad y una
del método. La prueba consiste en medir una ordenada al origen cercana a cero y un
muestra independientemente un cierto coeficiente de variación porcentual (C.V.)
número de veces (se realizaron 9 mediciones). menor o igual a 2.5.
La DER obtenida es muy pequeña y menor que
el valor aceptado de 1-2% para el instrumento,
y también menor que el valor aceptado para el
método con todos sus pasos. Kolthoff y Horwitz
recomiendan valores máximos permisibles de
la DER para diferentes concentraciones de
analito (en este caso sal de cromo), los cuales
varían entre 0.001 % y 100%, recomendando
DER de 1% (Kolthoff) y 2.8 % (Horwitz) para
concentraciones de 1%. De acuerdo con este
criterio, puede concluirse que el método es
muy preciso.

Para determinar la exactitud del método, se


hizo una comparación respecto a los resultados
de otro laboratorio que usó el método de
espectrometría de absorción atómica de llama.
Se midió las concentraciones de Cr(III) en cierta
cantidad de muestras de licor residual; se
muestra que los DERs medidos en cada
laboratorio no exceden de los 4 – 5%. Por tanto
se puede decir que estas pruebas fueron
exactas.

Prueba de precisión y exactitud

3. Método por el espectrómetro de UV


- Vis

Prueba de linealidad
En el rango de concentración de 5 a 40 mg de
aminofilina, se satisfacen las condiciones de
linealidad del método analítico pues se
cumplen con los requerimientos de un
coeficiente de determinación lineal (r2) mayor
comprendido entre 0.30 a 0.94% y
límites de detección y
cuantificación de 0.02 y 0.06 mg de
aminofilina, respectivamente.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Validación de un método
espectrofotométrico con vainillina
para la cuantificación de isoniacida en
tabletas
 Desarrollo y validación de un
método
espectrofotométrico/colorimétrico
Como se infiere de los resultados obtenidos, en para la determinación de cromo
cada nivel de concentración, el método (iii) en licores residuales de
analítico propuesto es exacto y preciso. piquelado-curtido
 Validación de un método analítico
Conclusión espectrofotométrico para la
1. Se concluye que los parámetros cuantificación de aminofilina en
linealidad, precisión, exactitud, solución inyectable
especificidad y rango de
cuantificación; cumplen con los
criterios establecidos para validar
métodos analíticos, y por tanto es útil
para cuantificar isoniacida en tabletas
de 100 mg en el rango de 33,3% a
166,7%.
2. Los parámetros desarrollados son
confiables porque cumplen los
criterios fundamentales de validación
de métodos dentro del intervalo
apropiado de concentraciones de sal
de cromo.
3. El método analítico desarrollado
para la cuantificación de
aminofilina en una forma
farmacéutica comercial (solución
inyectable) cumple con los
parámetros de validación mínimos
sugeridos por organismos
normativos internacionales pues es
un método analítico lineal, en el
rango de concentración de 5 a 40
mg de aminofilina, con un
porcentaje de recobro analítico
que oscila entre el 98.1 al 99.2%,
un coeficiente de variación