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Manual Bioensayos con Fitoplancton en Aguas Contaminadas – Método para medir Toxicidad con

Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina

SECCIÓN I

INTRODUCCIÓN

El procedimiento de bioensayos que se proporciona en este manual se estableció para


proporcionar procedimientos para realizar una evaluación biológica de los materiales de
desecho que se eliminarán en el océano. La prueba realizada de acuerdo con estos
procedimientos de bioensayo proporcionará información sobre la toxicidad relativa de los
diversos materiales que se eliminarán. Sin embargo, estos procedimientos de bioensayo,
como todos los métodos de laboratorio, son intentos de simulación de condiciones reales
y, por lo tanto, sufren todas las inexactitudes inherentes a los sistemas de simulación.

Si bien estos procedimientos de bioensayo no son métodos "estándar" de la EPA, están


diseñados como guías para aquellos involucrados en la evaluación de permisos de
descarga en el océano. En consecuencia, cada método difiere en detalle y estilo y no se
ajusta al formato estándar. Se espera que los solicitantes de permisos modifiquen los
procedimientos de bioensayo de acuerdo con la naturaleza del material de desecho y el
tipo de procedimiento involucrado.

Tres de los procedimientos de bioensayo presentados en este manual han sido


clasificados como "especiales" (es decir, no deben usarse de manera rutinaria). Estos
procedimientos son el procedimiento de crecimiento de conchas de ostra, el
procedimiento crónico de huevo a huevo de pez, y la prueba de inhibición de
acetilcolinesterasa. Los bioensayos restantes se prestan a mediciones más rutinarias.

El Comité de ensayos biológicos sobre el vertido oceánico declaró que el número mínimo
de especies que se utilizarán en la evaluación de un permiso de vertido debería ser de
tres. Estas especies deben seleccionarse de los diferentes grupos taxonómicos
enumerados en la sección sobre el método de flujo continuo para la prueba de toxicidad
aguda con peces y macroinvertebrados (vea la página 71).

Tenga en cuenta que el camarón de salmuera (Artemia salina) no está en esta lista. El
comité consideró que el camarón de salmuera no era un organismo satisfactorio para su
uso en bioensayos marinos. Sin embargo, están disponibles y se pueden realizar pruebas
fácilmente para comparar su sensibilidad para un material de desecho seleccionado con
la de los organismos nativos, siempre que sea posible, además de los organismos
recomendados en este manual.

El grupo de trabajo de bioensayos de la EPA tiene la intención de revisar periódicamente


estos procedimientos de bioensayos a medida que haya nueva información disponible. Se
prevé una revisión anual.

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SECCION II

PROCEDIMIENTOS DE BIOASAYO PARA APLICACIÓN DE RUTINA

A. INFORMACIÓN DE ANTECEDENTES PARA EL DESARROLLO DE LOS


BIOENSAYOS MARINOS DE FITOPLANCTON

Las poblaciones de los procesos primarios de los estuarios consisten principalmente en


actividades del fitoplancton microscópico. En su función de almacenar energía potencial, a
través de la fotosíntesis, estos organismos representan el aporte de energía primaria en
los ecosistemas acuáticos (Joint Industry / Government, 1969). Por esta razón, es
imperativo que las condiciones de calidad del agua sean favorables para su crecimiento y
reproducción si se quiere evitar alteraciones graves en otros componentes de las
comunidades marinas.

En condiciones naturales, tanto los aspectos cualitativos como los cuantitativos de la


dinámica de la población de fitoplancton muestran un alto grado de estacionalidad,
caracterizado por patrones de sucesión bien definidos. Es esencial que no solo se
mantenga la productividad de varios sistemas, sino también la abundancia relativa de las
especies de acuerdo con las composiciones estacionales normales; como las principales
poblaciones de herbívoros exhiben selectividad en sus patrones de pastoreo. En
consecuencia, si bien la contaminación puede parecer que no tiene un impacto aparente
en la producción primaria total, puede haber alterado drásticamente la estructura y
composición de la comunidad. Tales cambios ocurren a menudo cuando las especies
nativas sensibles son eliminadas y ecológicamente menos deseables, pero dominan otras
especies igualmente activas en la fotosíntesis. Si las especies más resistentes son
incompatibles con la nutrición y/o las necesidades nutricionales de las poblaciones de
herbívoros primarios, la transferencia de energía a niveles tróficos más altos se verá
afectada y, en última instancia, contribuirá a efectos significativos en las poblaciones
deseables que ocurren naturalmente. Para describir y predecir adecuadamente los
efectos potenciales de un tóxico en la respuesta de un ecosistema estuarino, los datos
para el fitoplancton son una necesidad.

1. Selección de Especies

En el diseño de un programa de bioensayos, la selección de pruebas de especies es


fundamental para la adquisición de información realista y significativa. Las técnicas de
algas históricamente se han centrado en el desarrollo de medios de cultivo apropiados
para sostener ciclos de vida completos. Los niveles nutricionales y la composición media
a menudo se parecen poco a las condiciones ambientales reales que la organización
encontró. Además, la investigación a menudo se limitaba a unas pocas especies que se
mantenían fácilmente en el laboratorio.

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En la última década, la cultura técnica ha ampliado el alcance de las especies disponibles


para la investigación.

En la elección de las especies para los bioensayos, los siguientes criterios son guías
útiles:

a. Siempre que sea posible, se deben estudiar las especies nativas que
representan una diversidad de tipos filogenéticos de las principales sucesiones
estacionales.

b. Dado que las sensibilidades varían entre las especies, cuando sea posible,
seleccione las especies más sensibles para el bioensayo.

c. De los estudios estacionales y de laboratorio, las condiciones de mayor


vulnerabilidad también deben identificarse de las especies seleccionadas.

d. Dado que el bioensayo mide básicamente la respuesta de un organismo al


producto a la concentración de tóxicos y al tiempo de exposición, debe
considerarse la tasa de respuesta de las especies de prueba. Tanto las especies
de prueba como las condiciones de cultivo deben permitir tasas de crecimiento de
0.5 a 1.0 por día sin condiciones de estrés.

Los criterios anteriores ofrecen la máxima flexibilidad para el investigador experimentado.


Para los trabajadores con fondos y experiencia limitados, se recomiendan dos especies,
ambas se utilizarán si las formas nativas no están disponibles.

También se recomienda que estas especies se usen junto con otras para servir como
controles en el sistema que se está probando. Skeletonema costatum es un
fitoplanceador de importancia ecológica que es común a una amplia gama geográfica de
aguas neríticas. Thalassiosira pseudonana, aunque tiene menos importancia ecológica,
es sensible a los metales pesados y tiene un tiempo de generación de 8 horas que ofrece
un valor más práctico en el establecimiento de respuestas toxicológicas.

2. Condiciones de cultivo

Las condiciones de cultivo para la prueba de especies generalmente deben reflejar sus
condiciones naturales. Para desarrollar cierta apariencia de uniformidad, se recomiendan
dos regímenes básicos. Para las especies templadas, es deseable una temperatura de
ciclo oscuro (ciclo 14:10). Para las formas de agua fría, se recomienda una temperatura
de 8 +/- 2 ° C, 2500-500 lux en un ciclo de 10:14. Los cultivos madre de la prueba de
especies deben mantenerse en enriquecido natural (Tabla 1 A). O aguas marinas
sintéticas (Tabla 2 A).

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Se deben transferir a un medio mediano diluido nutricionalmente y se les debe permitir


pasar por dos ciclos de crecimiento completos antes de usarlos en un bioensayo. Esto es
necesario ya que el historial nutricional puede tener efectos marcados en las respuestas.
Hemos encontrado hasta cinco veces diferencias en las respuestas de los organismos de
bioensayo mantenidos en niveles altos y naturales de nutrientes (Gentile et al., 1973). Los
cultivos madre deben mantenerse libres de bacterias siempre que sea posible y
transmitirse a intervalos de 1 a 2 semanas.

TABLA 1-A. ENRIQUECIMIENTOS PARA AGUA Y ESTERILIDAD

Enriquecimientos de agua de mar para el mantenimiento de la historia de cultivo de algas


(Después de Guillard y Ryther, 1962).

NaNO3 (Nitrato de Sodio) 75 mg/liter

NaH2PO4.H2O (Bifosfato sódico) 5 mg/l

Na2 SiO3.9H2O (Silicato sódico) 10 mg/l

Vitaminas:

Tiamina HCl 0.10 mg/l

Biotina 0.50 mg/l

B12 0.50 mg/l

Metales Traza:

CuSO4.5H2O (Sulfato de cobre) 0.002 mg/l

ZnSO45H2O (Sulfato de Zinc) 0.004 mg/l

CoCL2.6H2O (Cloruro de cobalto) 0.002 mg/l

MnCl2.4H2O (Cloruro manganeso) 0.036 mg/l

NaMoO4.2H2O (Molibdato de sodio) 0.001 mg/l

Fe secuestrante (Hierro secuestrante) 1.0 mg/l (0.13 mg Fe) / l

Buffer:

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TRIS – 500 mg/l @ pH 7.8 – 8.2

Los enriquecimientos de esterilidad que se deben añadir al medio de agua del mar antes
de la autoclave:

Glutamato de Sodio 250 mg/l


Acetato de Sodio 250 mg/l
Ciclina 250 mg/l
Agar Nutriente 50 mg/l
Sacarosa 250 mg/l
Lactato de Sodio 250 mg/l
Alanina 250 mg/l

TABLA 2 – A. FORMULACIÓN DE AGUA DE MAR SINTÉTICA PARA ENSAYOS


ALGALES (Después de Kester et al., 1967).

________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

Componentes Concentraciones

NaCl (Cloruro de Sodio) 24.00 g

Na2SO4 (Sulfato de Sodio) 4.00 g

H3BO3 (Ácido bórico) 0.03 g

CaCl2 . 2 H20 (Cloruro de Calcio) 1.47 g

MgCl2 . 6 H2O (cloruro de magnesio) 10.78 g

Na2Si:O3 . 9H20 * (silicato de sodio – vidrio) 30.00 mg

KCl (cloruro de potasio) 700 mg

NaHCO3 (bicarbonato de sodio) 200.00 mg

* Prepare la solución madre en agua desionizada y ajústela a pH 7.8 - 8.2

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3. Agua de mar

La elección del agua de mar está dictada por la disponibilidad, calidad y costo. El agua de
mar natural a menudo se puede utilizar para bioensayos, aunque las variabilidades
inherentes en la calidad pueden complicar el análisis de los resultados. El agua limpia en
alta mar es adecuada si se observan las precauciones adecuadas durante la recolección y
el procesamiento. En general, se prefiere el agua de mar sintética por la constancia de su
composición y calidad, aunque los restos de contaminantes deben eliminarse mediante
purificación adicional. El costo de los productos químicos requeridos y la purificación es
generalmente equivalente al gasto de recolección, transporte y procesamiento de agua de
mar natural.

a. Agua de Mar Natural

El agua de mar se recolecta de 3 a 10 metros (para evitar la contaminación de la


superficie) con un muestreador de agua no metálico y se transporta en bombas de
polietileno autoclavables. El vidrio también es adecuado si se puede evitar la rotura. En 24
horas, el agua se filtra a través de filtros de membrana lavados con ácido en un sistema
de filtración no metálico. El agua de mar filtrada se almacena a 4 ° C en la oscuridad.

b. Agua de Mar Sintética

Se ha desarrollado una formulación de agua de mar sintética modificada (Tabla


2A) de Kester et al., (1967). Esta agua de mar se recomienda para peces, invertebrados y
bioensayos de plancton. Esta agua de mar sintética ha sido avalada por la Agencia de
Protección Ambiental, la 14ª Edición de los Métodos Estándar y la A.S.T.M. Comisión de
Bioensayos.

c. Salinidad

La salinidad de 30 °/oo se recomienda para todos los bioensayos. Los ajustes de salinidad
en aguas marinas naturales o sintéticas deben hacerse con vidrio destilado (silicato de
sodio) o agua desionizada.

d. Esterilización

La esterilización del medio de mantenimiento del cultivo madre puede lograrse


satisfactoriamente mediante autoclave, ya que el pH se estabiliza por la presencia de
buffer TRIS. Como el medio de bioensayo no se puede esterilizar en autoclave, se
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recomiendan dos métodos alternativos: 1) presión de filtración y/o 2) pasteurización (60 °


+/- 2 ° C durante 4 horas). Estos tratamientos no alterarán apreciablemente las
propiedades físico-químicas del agua de mar, pero proporcionarán una esterilización
efectiva. Sin embargo, el medio debe filtrarse (0,45 µ) a través de un filtro previamente
lavado con ácido (HCl 2 N). La eliminación del ácido residual se logra enjuagando el filtro
con agua destilada / desioinizada y desechando el primer litro de agua de mar filtrada. El
medio debe almacenarse en vidrio de borosilicato disuelto en ácido o en bombas de
polietileno lineal. A estos se pueden conectar en una torre de dispensación estéril para
distribuir los medios.

Los controles de esterilidad se realizan semanalmente en este medio de prueba


mediante la inoculación de alícuotas de 2 ml de agua de mar en 10 ml de agua de mar
estéril enriquecida como en la tabla 3 - A. Los tubos se incuban a 20 ° C en la oscuridad
durante una semana. Las contaminaciones están indicadas por la turbidez y opalescencia
del medio.

TABLA 3-A ENRIQUECIMIENTOS NUTRIENTES PARA EL MEDIO ALGAL EN


BIOENSAYO
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

Nutriente Cantidad
________________________________________________________________________
NaNO3 (Nitrato de sodio) 4.42 mg/l (50 µMN)

K2HPO4 (fosfato dipotásico) 0.87 mg/l 5 µMN)

Tiamina 100.00 µg/l

Biotina 0.50 µg/l)

B12 0.50 µg/l)

Fe* (hierro) 25.00 µg/l

Mn (manganeso) 10.00 µg/l

Zn (zinc) 1.00 µg/l

Mo (molibdeno) 0.50 µg/l

Co (monóxido de carbono) 0.10 µg/l

Cu (cobre) 0.10 µg/l


________________________________________________________________________
* Fe y Cl: Disuelva la esponja de hierro o los rellenos en HCl mínimo con calentamiento y diluya al
volumen con agua desionizada.

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4. Cristalería

Toda la cristalería es de vidrio de borosilicato de alto grado (Pyerx / Kymax). Los


bioensayos se realizan en matraces Erlenmeyer de 125 ml, que contienen 50 ml de medio
y se taponan con espuma. La cristalería se calienta con calor (170 ° C durante 2 horas) en
lugar de autoclavarse, ya que el tallo a menudo lleva contaminantes que pueden interferir
con los bioensayos que involucran toxicidad por metales.

La limpieza rigurosa es necesaria para que toda la cristalería se asegure contra la


contaminación. La cristalería se empapa en detergente, se cepilla a mano o
mecánicamente, se enjuaga con agua desionizada, se sumerge totalmente en HNO3 al
10% durante 2 a 6 horas, se enjuaga bien con agua destilada o desioinizada de doble
vidrio y se seca al aire o al horno.

Para trabajos relacionados con la toxicidad de los metales, la cristalería debe recibir el
siguiente tratamiento posterior al lavado. Para eliminar los problemas de contaminación
positiva o negativa, se aplica una monocapa de silico-polímero a todas las superficies que
entran en contacto con el agua de mar. El SC-87 * disponible comercialmente se prepara
como una solución al 5% en ciclohexano, se vierte en el drenaje y deja una película en las
superficies de los artículos de vidrio que han estado en contacto con la solución. El
resultado es una superficie completamente no productiva que, después de un doble
enjuague con agua destilada, está lista para su uso. Un recubrimiento a menudo dura dos
o tres ensayos antes de volver a recubrir. El recubrimiento nuevo se puede realizar sobre
el recubrimiento anterior o un álcali fuerte (2N NAOH + 10% ETOH) puede eliminar
completamente el recubrimiento anterior antes de volver a recubrir. En la mayoría de los
casos, el decapado alcohólico-alcalino se puede evitar usando un detergente caliente
cada vez antes de volver a recubrir.

5. Protocolo del bioensayo

El diseño del bioensayo consta de tres componentes integrados principales: preparación


de inóculo de fase larga, medio de bioensayo enriquecido con nutrientes y soluciones
tóxicas.

a. Inóculo

El inóculo para el bioensayo se prepara inoculando 0,5 ml (0,1 - 1,0 ml) de


cultivo de reserva en matraces por triplicado de 125 ml que contienen agua de mar
enriquecida con nutrientes como nivel de bioensayo (Tabla 3-A). En el punto de inflexión
de la curva de crecimiento. Las células de esta segunda transferencia o posteriores son
adecuadas para su uso en el bioensayo. Estas células ahora se han adaptado a los
niveles de nutrientes más naturales, y su respuesta reflejará más de cerca la esperada de
una población natural de la especie de prueba.
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b. Medio de bioensayo

El agua de mar enriquecida filtrada, agitada y / o pasteurizada, se dispensa en


un matraz de 1-2 litros preesterilizado que es compatible con un dispensador de Ace de
50 ml (número de catálogo 8004, Ace Glass Co., Vineland, N.J.). Los nutrientes (Tabla 3-
A) se agregan asépticamente y el inóculo (como se describe anteriormente) se agrega
para dar una densidad celular inicial de 2.500 células/ml a 10.000 células/ml. La
inoculación del volumen de medio total permite dispensar una población celular uniforme
a todos los matraces. Se mide la densidad celular inicial o biomasa. Se dispensan
cincuenta mililitros de medio inoculado enriquecido en matraces de 125 ml utilizando un
dispensador de Ace de 50 ml en una campana estéril.

La selección de una densidad celular inicial dependerá de la sensibilidad del


sistema de medición de parámetros de biomasa. Por ejemplo, en sistemas limpios que
usan contadores de partículas, se emplean densidades celulares iniciales de 2,5 x 10³
conteos microscópicos, las densidades celulares iniciales de 1 x 10⁴ células / ml pueden
ser apropiadas. Para las técnicas de extracción (ATP, Chl "a") o de isótopos, la densidad
celular inicial puede mantenerse baja, ya que la alícuota examinada puede ajustarse.

c. Tóxicidad

Las soluciones tóxicas se preparan en agua destilada o disolvente adecuado


para compuestos hidrófobos. Las soluciones de reserva o diluciones de un residuo deben
prepararse para asegurar que se agregue el mismo volumen en todos los niveles de
prueba. Esta adición no debe exceder un mililitro / 50 ml de medio de prueba. Cuando se
trabaja con efluentes de desecho, se permite una adición máxima de 5 ml, ya que esto
constituirá una alteración máxima del 10% en la salinidad. Se hacen adiciones tóxicas a
los matraces que contienen agua de mar enriquecida inoculada y se colocan en una
incubadora.

d. Diseño

El diseño del bioensayo se determina en parte por el tipo de tóxico probado. Un


formato general incluirá una selección de una amplia gama de concentraciones a partir de
las cuales se seleccionan los niveles para una evaluación definitiva. En general, los
exámenes preliminares deben cubrir concentraciones en cuatro órdenes de magnitud con
cultivos duplicados en cada nivel. El ensayo definitivo debe incluir una concentración por
encima y dos por debajo del nivel de inhibición calculado del 50% utilizando bisección

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logarítmica de intervalos. Se deben utilizar cultivos por triplicado para el bioensayo


definitivo.

La medición de los parámetros debe evaluarse al menos una vez cada 24 horas
durante la duración del experimento. Esto permite el cálculo de tasas de respuesta que
son importantes para interpretar el comportamiento del tóxico. La duración del
experimento debe ser adecuada para que la población de control complete su fase de
crecimiento logarítmico y alcance una tasa de crecimiento estacionario. También es
conveniente determinar para cultivos inhibidos: la duración de la fase de retraso, la tasa
máxima de crecimiento y el rendimiento máximo (Figura 1-A). Sin embargo, no toda esta
información puede estar fácilmente disponible en un solo ensayo y en todas las
concentraciones.

e. Modificaciones

El sistema de ensayo descrito anteriormente utiliza pequeños volúmenes (50


ml/125). Esto no pretende frustrar la expansión de los volúmenes de ensayo. Los
sistemas pueden escalarse fácilmente hasta las siguientes dimensiones de 125/250;
250/500; 500 /1.000. Con los medios de sistemas de mayor volumen, la dispensación se
puede hacer directamente en los matraces estériles. Los nutrientes y las especies de
prueba también se pueden agregar a cada matraz. Esto aumenta el potencial de
variabilidad y contaminación pero, con la experiencia, las dificultades pueden minimizarse.
Los sistemas más grandes requieren más medio y espacio de ensayo, sin embargo,
mayores volúmenes permitirán un análisis más frecuente de un mayor número de
parámetros. Esto permite una caracterización más precisa de las anomalías resultantes
de exposiciones a contaminantes específicos.

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Figura 1 –A. Relación hipotética entre crecimiento Algal y concentración


toxicante.

6. Parámetros

Existe una variedad de parámetros disponibles que caracterizan la respuesta de


los cultivos de algas. Estos parámetros miden los índices de biomasa en el momento del
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muestreo. El cual, cuando se grafica contra el tiempo, produce una curva de respuesta de
crecimiento. Esta curva se puede utilizar para determinar la fase logarítmica, la tasa o el
bajo crecimiento, y una densidad de población máxima para los cultivos de control y
eliminados.

a. Densidad de población

Las mediciones microscópicas de la densidad celular se pueden realizar


utilizando un hemocitómetro, Palmer - Maloney, (Camara Neubauer) o un microscopio
invertido con cámaras de sedimentación. Los detalles de estos métodos de conteo están
disponibles en la literatura (Schwoerbel, 1970; Weber, 1973).

Los métodos microscópicos presentan dos problemas: consumen tiempo cuando


se realizan correctamente y su significación estadística se reduce significativamente a
densidades celulares por debajo de 1 x 10⁴. En consecuencia, cuando se requieren
grandes cantidades de ensayos y repeticiones, resulta poco práctico contar
microscópicamente cada ensayo. .

La medida más rápida, práctica y estadísticamente precisa de la densidad de


población, se realiza con un contador de partículas electrónico. El costo inicial, aunque
alto, se compensa con el aumento del volumen de trabajo, la precisión y el ahorro de
tiempo.

b. Biomasa poblacional

Los valores de biomasa se pueden calcular a partir de los datos de densidad de


población utilizando las dimensiones de la celda y suponiendo que la celda tenga una
forma geométrica particular (es decir, una esfera, un cilindro, etc.). Este método,
dependiendo de los recuentos de células, está sujeto a las mismas limitaciones
mencionadas anteriormente.

Los contadores electrónicos de partículas también pueden dar mediciones


volumétricas, pero generalmente tales capacidades se obtienen a un costo adicional. Aun
así, vale la pena el gasto, si se anticipan grandes cantidades de ensayos.

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c. Clorofila

La clorfila "a" se usa a menudo como una medida de la biomasa de algas. Están
disponibles las técnicas de absorbancia espectrofotométrica y de fluorescencia (in vivo e
in vitro) (Strickland y Parsons, 1968). La técnica espectofotométrica carece de sensibilidad
particularmente a bajas densidades celulares. Sin embargo, los sistemas fluorescentes
son más sensibles y se pueden usar a densidades celulares de menos de 1 x 10⁴
células/ml. La técnica de fluorescencia in vivo es particularmente útil porque no requiere
extracción y es muy sensible.

Una limitación potencial de este indicador es la variabilidad general de la clorofila


celular "a" en función de las variables nutricionales y ambientales (Odum et al., 1959;
Yentsch y Ryther, 1957; Yentsch y Menzel, 1963).

d. Asimilación de carbono 14

Las mediciones de productividad, basadas en la asimilación de carbono


radiactivo, es una técnica estándar aplicable tanto al agua dulce como a las algas marinas
(Steeman-Nielson, 1962; McAllister, 1961; Jitts, 1963; Jenkins, 1965; Strickland and
Parsons, 1968). Esto se usa generalmente como una medida a corto plazo de la actividad
fotosintética. Las alícuotas de cultivo se pueden marcar por pulsos durante cuatro horas y
registrar el marcador C - 14 incorporado por las células y utilizar este valor relativo como
índice de biomasa. Este último enfoque ha demostrado una correlación con las tasas de
crecimiento medida por los cambios en el número de células o la biomasa. Los cambios
transitorios en la asimilación de C - 14, que no reflejan las respuestas de crecimiento a
largo plazo, también se han observado y merecen una interpretación cuidadosa de estos
datos.

Se pueden obtener procedimientos adecuados de conteo de C-14 en Brandsom


(1970) y Chase y Rabinowitz (1967).

e. ATP – Concentración

El ATP se ha sugerido como una medida sensible y precisa de la biomasa viva


debido a la constancia de la relación celular ATP / carbón (Holm-Hansen y Booth, 1966;
Hamilton, Holm-Hansen, 1967; Holm-Hansen, 1969). Los estudios han demostrado una
excelente correlación entre el ATP y las mediciones directas de la biomasa (conteo de
partículas) y el marcaje por pulsos con carbono-14 (Gentile et al., 1973; Cheer et al.,
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1974). Esta técnica requiere instrumentación (aproximadamente U$ 5,000) y cuesta


aproximadamente U $ 1.00 por análisis. Al ser una medida de material vivo, los desechos
altamente contenidos (es decir, lodo) podrían proporcionar una interferencia excesiva.

Las técnicas anteriores todas ofrecen ciertas ventajas o desventajas,


dependiendo del diseño del bioensayo, el tipo de efluente probado, instalaciones y
personal.

El conteo automatizado de partículas, al tiempo que ofrece el método más


rápido, sensible y estadísticamente válido, tiene limitaciones. La más restrictiva es la
relacionada con interferencias de partículas. El compuesto de prueba o el efluente debe
tener un fondo bajo en el rango de tamaño de partícula de la especie de prueba o se
producirán enmascaramientos y errores inevitables. Esto limita los tipos de efluentes que
se evaluarán con esta técnica, a menos que la fracción de partículas se pueda eliminar sin
poner en peligro las características tóxicas del material.

Los otros métodos funcionan bien en sistemas que contienen material


particulado, pero tanto la clorofila "a" como la captación de carbono tienen patrones de
respuesta potencialmente indeseables que pueden dificultar la interpretación de datos.

La ATP, por otro lado, parece ser un excelente indicador de la biomasa viva,
aunque su medición rutinaria es algo costosa y puede no ser apropiada para desechos
biológicamente contaminados (es decir, lodo).

Todos los datos se pueden convertir a control de porcentaje para cualquier


período de exposición finito y se puede determinar el porcentaje de respuesta
representada en función de la concentración de toxicidad y el grado de inhibición.

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Figura 2 – A. Relación entre el porcentaje de crecimiento de control (0 - 48 hrs) y cobre.

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7. Presentación de datos

El diseño del bioensayo requiere un mínimo de una observación cada


veinticuatro horas durante la duración del experimento. Dentro de este calendario, varias
opciones están disponibles para el investigador. La salida de datos básicos representa
una curva de crecimiento para todas las concentraciones examinadas. Esto puede
proporcionar la tasa de crecimiento:

K = ln _N t__ / ∆T
No

K = tasa de crecimiento

No = Concentración de la población en el tiempo cero.

Nt = Concentración de la población en el momento t

∆T = intervalo de tiempo desde el tiempo cero

y el tiempo de generación:

G = ∆T
K

G = tiempo generacional

K = Tasa de crecimiento

∆T = intervalo de tiempo desde el tiempo cero

y comparaciones de densidad máxima de la población. Los cultivos expuestos en fase de


crecimiento y la biomasa de la población pueden compararse mediante análisis
estadístico estándar para determinar la diferencia con los controles.

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8. Toxicante estándar

Para asegurarse de que los aspectos técnicos del bioensayo se realicen de


forma inmediata, se recomienda un estándar interno (La Roche et al., 1970). El
compuesto que utilizamos habitualmente es el dedecilsulfato de sodio (SDS), un agente
tensoactivo y lítico de membrana. Este compuesto produce una curva de respuesta muy
marcada que indica un efecto de casi "todo o uno" a concentraciones de 1-2 mg/l.
Además, SDS es soluble y estable en soluciones acuosas.

Si bien el uso de un estándar interno puede servir como un monitor de garantía


de calidad, no valida, en sí mismo, un experimento. Puede haber situaciones en las que la
concentración de EC50 para los tóxicos estándares en dos experimentos sea
esencialmente idéntica, pero las tasas de crecimiento de control difieren en un factor de
dos. La desviación del control de crecimiento de lo normal es una indicación de un
problema y esto solo justifica la repetición del experimento.

9. Aplicaciones

Los bioensayos de algas, con su sensibilidad y respuesta rápida, son útiles en


muchas áreas de la investigación de la calidad del agua.

a. La aplicación más simple es para la detección de rutina de posibles tóxicos. Esto


representa un sistema bien definido y controlado donde se recomienda el conteo
de partículas, ya que las interferencias generalmente se pueden minimizar. Estos
estudios deben diseñarse para producir curvas de crecimiento completas con tasa
de crecimiento y producción de densidad máxima.

b. Otra aplicación del bioensayo de algas es como una evaluación de la calidad del
agua. Si está siendo investigado un área impactada, muestras de agua se pueden
recoger a lo largo de un transecto o matriz, en función de los datos hidrográficos.
El agua se recolecta y procesa de acuerdo con las técnicas descritas en la sección
4 y luego se introduce con la especie de prueba que se ha cultivado en agua
enriquecida desde una estación de control. La tasa de crecimiento y la densidad
de población se pueden comparar de una estación a otra.

c. El ensayo de algas también se puede usar para medir el impacto biológico de


efluentes mixtos que contienen sólidos suspendidos. En este caso, el conteo de
partículas puede no ser práctico debido a los altos niveles de interferencia. En
consecuencia, el crecimiento del cultivo de algas puede controlarse obteniendo
alícuotas y evaluando el ATP, el clorofila "a" o midiendo la incorporación de C-14
después del marcaje por pulsos de la alícuota (2-4 horas) con NaH14CO3. Los
datos resultantes, cuando se representan de forma semi-logarítmica con el tiempo,
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Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina

producirán una curva de respuesta de crecimiento que se puede presentar según


la interpretación que se describe en este documento.

d. Cabe mencionar las aplicaciones in situ del bioensayo de fitoplancton. Usando


ATP, la captación de C - 14 y el clorofilo "a", se estimará la biomasa viva in situ y
la productividad de la masa de agua. Estos estudios se pueden realizar en el sitio,
las muestras se pueden conservar y analizar en una fecha posterior. Aplicaciones
tales como la evaluación del arrastre de la central eléctrica y el monitoreo de la
contaminación de fuentes puntuales, comúnmente utilizan este enfoque.

10. Observaciones

Cabe destacar que se han logrado importantes avances con la utilización de


bioensayos de fitoplancton en el establecimiento de criterios realistas de calidad del agua
para la vida marina.

Las anomalías biológicas fundamentales en este organismo podrían perjudicar la


supervivencia de niveles tróficos altos y ciertamente estar asociadas con exposiciones a
contaminantes específicos. Sin embargo, se debe tener en cuenta que existen problemas
en los hallazgos de laboratorio a las condiciones que se pueden encontrar en el entorno
natural. Una disciplina científica que ha sido coleccionada gratamente en esta área es
ciertamente la de la sistemática del fitoplancton. Como frecuencia, se considera que, en
muchos casos de evaluación in situ de la productividad del fitoplancton, la identificación
de las especies revelará la importancia de conocer las especies presentes.

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Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina

Referencias Bibliográficas

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Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina

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B. MÉTODO ESTÁTICO PARA LA PRUEBA DE TOXICIDAD AGUDA CON


FITOPLANCTON

1. Introducción

El método descrito aquí es el diseñado para el análisis de los efectos del material vertido
en el océano en el crecimiento de algas marinas unicelulares, implica la adición de
residuos líquidos o extractos de lodos al medio de crecimiento de algas, adición de algas
al medio y medidas de crecimiento de 96 horas.

Debido a la capacidad de calcular EC50, los valores de los datos de bioensayos son
requeridos por la ley son necesarias diluciones de material vertido al mar, como es
imposible estimar la toxicidad potencial de algas, o Acción estimulante de cada lote de
material vertido en el océano. Las diluciones recomendadas pueden no ser suficientes
para producir EC50 valores en cada caso. La logística del bioensayo de algas es
complicada y requiere mucho tiempo, deben considerarse cuidadosamente antes de
imponer requisitos definidos a las organizaciones de prueba.

2. Mantenimiento de organismos de ensayo.

La especie de algas marinas unicelulares a utilizar es Chlorococcum sp. (Millford”C”)


Cuando solo se usa una especie. Si se van a utilizar dos o tres especies en la prueba
Thalassiosira pseuonana (también conocida como Cyclotella nana) Es la segunda especie
elegida, y Porphyridium cruentum la tercera. Estas algas se pueden obtener del
Departamento de Botánica, Colección Cultural de Algas, Universidad de Indiana,
Bloomington, Indina 47401.

Las algas pueden ser organizadas de esta forma:

Number Species

819 Chlorococcum (Milford “C”)

1269 Cyclotella sp.

637 Porphyridium sp.

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Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina

Las especies se mantendrán en colecciones de cultivo en medio de agua de mar artificial.


El agua de mar artificial se prepara disolviendo sal marina artificial. En agua destilada de
vidrio a una salinidad de 30 partes por mil. 30 gramos de sal en 1000 ml de agua de mar
artificial. Agregue 30 ml de mezcla de metal, 2,0 ml de mezcla de sal menor y 1,0 ml de
mezcla de vitamina a cada litro. La composición de las mezclas se da en la Tabla 1-B.

Filtre (con succión) el medio de agua de mar a través de un filtro de membrana de 0,22 U
(como el fabricado por Millipore Corporation, Bedford. Massachusetts 01730, número de
catálogo GSWP 047 00). Antes de filtrar, pasar 1 litro de HCl 0.1 N y 5 litros de agua
destilada de vidrio a través del filtro. Dispense 200 ml de medio en 500 ml de matraces
Erlenmeyer y use tapones de espuma de poliuretano para sellar los matraces, Autoclave a
120 ° C y presión de 20 lb durante 15 minutos. Los matraces deben haberse limpiado
lavándolos con detergente, empapándolos en HCl al 10% y aumentando 10 veces con
agua destilada.

Equilibrar a temperatura ambiente durante un día. Y comprobar el pH del medio en un


matraz especialmente configurado, como arriba, para este propósito. El pH debe estar
entre 7,8 y 8,1. Si el pH no está dentro de este rango, deseche todos los matraces y haga
un nuevo Medio. El pH debe estar dentro de este rango antes de comenzar la prueba

Agregue 10 ml de cultivo de algas madre a cada matraz e incube sin agitar a una
iluminación de velas de 450-500 pies a 20 ° +/- 2 ° C con períodos alternos de luz (16
horas) y oscuridad (8 horas). Use técnicas microbiológicas estándar para flamear los
cuellos de los matraces cuando se transfieran algas.

3. Preparación del medio de prueba

a. Residuos líquidos

Los residuos líquidos deben ser probados, No será modificado antes de su uso.
Cuando se toman muestras líquidas para análisis, sin embargo, deben tomarse en
recipientes de vidrio con tapas forradas de teflón. La cristalería y los revestimientos se
deben tomar con detergente. Remojo durante la noche en HCl al 10%, se enjuaga 10
veces con agua destilada, se enjuaga una vez con acetona y se enjuaga de nuevo 10
veces con agua destilada el vidrio.

Preparación de la dilución de aguas residuales, de la siguiente manera:

1. Mezcle 100 ml de aguas residuales con 900 ml de agua de mar


artificial que no contenga trazas de metales, sales menores o mezclas de
vitaminas. Esto se considerará como medio sin diluir.
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2. Agregue 1 parte de 1. a 9 partes de agua de mar artificial. Esta es una


solución al 10% de medio sin diluir.

3. Añadir 1 parte de 2. a 9 partes de agua de mar artificial. Esta es una


solución al 1% de medio sin diluir.

COMPOSICIÓN DE LAS MEZCLAS QUE SE AÑADIRÁN AL AGUA DE MAR


ARTIFICIAL.
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________

Mezcla de Metales Cantidad

Fe Cl2. 6 H2 O*…………………………………………………….0.480 g

Mn Cl2. 4 H2 O*…………………………………………………….0.144 g

Zn SO4. 7 H2 O*…………………………………………………….0.045 g

Cu SO2. 5 H2 O*…………………………………………………….0.157 mg

Co Cl2. 6 H2 O*……………………………………………………..0.404 mg

H3BO3…………………………………………………………………0.140 g

Na2EDTA………………………………………………………………1.000 g

Agua Destilada…………………………………………………………1 l

Mezcla de Vitaminas:

Clorhidrato de Tiamina………………………………………………..50.0 mg

Biotina…………………………………………………………………..0.01 mg

B12………………………………………………………………………0.10 mg

Agua Destilada…………………………………………………………100 ml

Mezcla de sales menores:

K3PO4……………………………………………………………………3.0 g

NaNO3……………………………………………………………………50.0 g

Na2SIO3 . 9 H2 O……………………………………………………….20.0 g

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Manual Bioensayos con Fitoplancton en Aguas Contaminadas – Método para medir Toxicidad con
Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina

Agua Destilada…………………………………………………………..1l

Las soluciones acuosas preparadas de estas sales metálicas se mantienen a concentraciones tan altas
que se agrega 1 ml de cada una a un 1 litro de mezcla.
La Biotina se mantiene como 1 mg / 100 ml de solución madre alcohólica;
B12 en una solución acuosa de 10 g / 100 ml.

4. Agregue 1 parte de 3. a 9 partes de agua de mar artificial. Esta es una solución al 0,1%
de medio no diluido.

b. lodo

Cuando se van a analizar los lodos, se utilizará como agente de extracción agua
de mar artificial sin metales traza, sales menores o vitaminas. La salinidad del extractante
es de 30 partes por mil y el procedimiento es el siguiente:

1. Coloque una porción representativa del lodo en un cilindro graduado de


250 ml de capacidad, llenando hasta la marca de 250 ml. Deje que los lodos
se depositen durante la noche (aproximadamente 16 horas). Decantar y
desechar cuidadosamente el sobrenadante.

2. Agregue 100 ml de agua sedimentada húmeda a un frasco de boca


ancha de un galón y agregue 900 ml de agua de mar artificial a temperatura
ambiente. Si se requerirá más medio de crecimiento, agregue más
sedimentos sedimentados y agua de mar artificial a los recipientes, pero
mantenga la proporción de 100: 900 constante. Tape los frascos con fuerza y
agite en un agitador automático aproximadamente a 100 revoluciones por
minuto durante 30 minutos. Al final del período de agitación, retire la jarra del
agitador, colóquela en posición vertical y deje reposar durante 1 hora.

3. Filtre el líquido sobrenadante a través de lana de vidrio, un filtro de


membrana de porosidad de 5.0 micras, y luego a través de un filtro de
membrana de porosidad de 0.22 micras. Cuando los filtros se obstruyan,
reemplácelos según sea necesario. Los filtros deben lavarse antes de
usarlos, pasando un litro de HCl 0.1 N y 5 litros de agua destilada a través de
ellos. Toda la cristalería asociada con la filtración debe prepararse antes de
su uso lavándola con detergente, remojándola durante la noche en HCl al
10% y enjuagándola con agua destilada.

4. Las siguientes soluciones serán utilizadas en la prueba:

a. Extracto filtrado. Esto se considerará como medio sin diluir.


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b. Añadir 1 parte de a. A 9 partes de agua de mar artificial. Esta


es una solución al 10% de medio sin diluir.

c. Añadir 1 parte de b. A 9 partes de agua de mar artificial. Esta


es una solución al 1% de medio sin diluir.

d. Añadir 1 parte de c. A 9 partes de agua de mar artificial. Esta


es una solución al 0,1% de medio sin diluir.

5. Después de filtar y diluir el líquido o el material del lodo, agregue 30,0


ml de mezcla de metal, 2,0 ml de mezcla de sales menores y 1,0 ml de
mezcla de vitaminas a cada litro y registre el pH.

6. Agregue 48.0 ml de cada solución a los matraces Erlenmeyer de 125


ml que se lavaron con detergente, se empaparon durante la noche en HCl al
10%, se enjuagaron 10 veces con agua destilada, se enjuagaron una vez
con acetona y nuevamente 10 veces con agua destilada. . Prepare tres
matraces para cada solución y para cada especie de algas utilizada. Utilice
tapones de espuma de poliuretano para tapar los matraces.

7. Los aparatos sugeridos para la extracción, o sus equivalentes son:

a. Agitador de laboratorio, Eberback 600 con una caja de utilidad


605 o su equivalente, capaz de agitar un contenedor de 1 galón a
100 revoluciones por minuto.

b. vidrio, frascos, mes ancho, capacidad de 1 galón con tapas


forradas de teflón, tapas superiores nerew. Nota: puede ser
necesario comprar los frascos y las láminas de teflón por separado,
en cuyo caso el personal del laboratorio puede preparar los forros
de la tapa de teflón. Los frascos y tapas deben ser equivalentes en
calidad a los suministrados por Cincinnaty Corporation, 2833 Spring
Grove Avenue, Cincinnati, Ohio 45225.

4. Bioensayo

a. Preparación de algas.

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Cuatro días antes de que se realice la prueba de bioensayo, agregue 5


ml de cultivo de algas que tiene al menos 5 días de vida a 45 ml de agua de mar artificial
agitada que contiene metales traza, sales menores y vitaminas como se describe en 2.
"Mantenimiento de organismos de ensayo". Haga esto con matraces Erlenmeyer de 125
ml equipados con tapones de espuma de poliuretano. Incubar estos nuevos cultivos bajo
450 - 500 pies en tubos de velas fluorescentes blancos fríos a 20 +/- 2 ° C. Incúbalos en la
plataforma centrifuga de New Brunswick Scientific Co., New Brunswick, New Jersey
08903, o equivalente) a 140 +/- 10 revoluciones por minuto. El ciclo de iluminación debe
ser de 16 horas de luz seguido de 8 horas de oscuridad.

El primer día de la prueba, agregue 1.0 ml de cultivo de algas a un matraz volumétrico de


25 ml de capacidad. De aproximadamente a la mitad del volumen con medio de prueba,
agregue 2 gotas de formalina al 10% en medio de crecimiento y llévelo a volumen
completo con medio de prueba. Espera 5 minutos.

Agitar cada matraz para lograr una suspensión homogénea de células. Rápidamente,
extraiga una muestra de la suspensión homogénea con una pequeña pipeta y rellene
cada lado de una cámara de Neubauer o hemocitómetro Spencer de línea brillante.
Asegúrese de que la suspensión no se desborde en los canales del hemocitómetro
(cámara de Neubauer). Con un aumento de 100 x, cuente todas las celdas dentro y que
inciden en las 4 esquinas 1 mm2 de cada cuadrícula. Para encontrar el número de células
en 1 ml de la suspensión original, multiplique el recuento de los 10 cuadrados por 25.000.

El objetivo de estos conteos es determinar la dilución requerida para alcanzar una


concentración final de 100.000 células por ml en el cultivo celular original. Por ejemplo, si
el número de células en un ml de cultivo fue de 200.000, en el cultivo original se debe
diluir 1: 1 con medio de prueba para producir 100.000 células por ml.

b. Crecimiento de algas.

Agregue, utilizando pipetas estériles, 2,0 ml de la suspensión de algas que


contiene 100,000 células por ml a los matraces que se prepararon con 48,0 ml de medio
de prueba.

Coloque los matraces en plataformas de agitadores rotativos y fije la plataforma


a 140 +/- 10 excursiones por minuto. La iluminación debe ser de luces fluorescentes frías.
La intensidad de la luz debe estar entre 450 y 500 pies velas con un ciclo de iluminación a
las 16 horas de luz seguidas de 8 horas de oscuridad. La temperatura debe ser de 20 +/-
2 ° C.

Incubar los cultivos agitados durante 96 horas. En ese momento, agregue dos
gotas de formalina al 10% en agua de mar artificial a cada matraz, espere cinco minutos,
agite los cultivos para resuspender las células a una suspensión homogénea y cuente en
una cámara de Neubauer ó hemocitómetro como se describe anteriormente.

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Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina

c. Controles no tratados

Los cultivos de algas de control deben cultivarse en un medio no tratado en el


momento en que se realizan los bioensayos sobre residuos líquidos o lodos. En este
caso, el medio sin tratar, con su complemento completo de metal, vitaminas y mezclas de
sales menores se agita, se filtra y se agrega a los matraces exactamente de la misma
manera que cuando se extraen los fangos. La suspensión celular utilizada para inocular el
crecimiento no tratado se prepara exactamente como se describe anteriormente, excepto
que el medio de crecimiento no tratado se usa para diluir.

Se utilizan tres matraces en el crecimiento de los controles, y el conteo se


realiza como se describe anteriormente.

5. Análisis de resultados

Calcule los valores promedio para el número de células de algas por mililitro en
control y cada dilución de matraces tratados con desechos.

Un valor de EC50 es la dilución a la que el material de desecho causa una


reducción del 50% en el crecimiento. Para estimar este valor. Para estimar este valor,
inspeccione los valores promedio para saber si el número de células de algas en los
matraces tratados con desechos fue (1) menos de la mitad que en los matraces de control
sin tratar. Si no, entonces un valor de EC50 no puede ser determinado.

Si el recuento promedio de células entre las diluciones es mayor y menor de la


mitad de las de los controles, se deben estimar los valores de EC50. Usando el papel de
coordenadas semilogarítmicas, traza el recuento promedio de células para una dilución.

Eso produjo más de la mitad, y el recuento celular promedio en una dilución que
produjo menos de la mitad del recuento celular promedio de los matraces de control. La
dilución se debe trazar en el eje logarítmico. Dibuja una línea recta entre los dos puntos.
La concentración a la que esta línea cruza la línea de crecimiento del 50% es el valor de
EC50.

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C. METODOS ESTÁTICOS PARA LA PRUEBA DE TOXICIDAD AGUDA CON


CAMARONES DE BRINE, Artemia salina

1. Introducción

El organismo de prueba es el camarón de salmuera, Artemia salina. La Artemia


es ecológicamente insignificante y puede ser más resistente a muchos tóxicos que las
especies naturales de zooplancton que limitan su uso incluso durante los períodos de
mayor abundancia.

Veinticuatro horas de nauplio se exponen a 6 concentraciones del material de


prueba durante 48 horas. Cada concentración y control se replica; Uno es aireado y otro
sin aire. La concentración efectiva contra el 50% de los animales (EC50) se puede
determinar por inspección de un gráfico de los datos. La toxicidad de los residuos para el
camarón en salmuera debe compararse con la de organismos marinos sensibles
apropiados que incluyen, cuando es posible, especies nativas del vertedero. El camarón
de salmuera no se debe utilizar solo.

2. Selección y Preparación del Organismo de Ensayo

La Artemia fue seleccionada como el organismo de prueba debido a su


disponibilidad universal y no estacional y al costo relativamente bajo del ensayo. Los
huevos de Artemia pueden comprarse en tiendas de mascotas locales y almacenarse en
un estado desecado pero viable durante largos períodos de tiempo, y el número requerido
de organismos se puede obtener fácilmente en cualquier momento mediante el uso de
procedimientos de eclosión adecuados. Los huevos del área de la Bahía de San
Francisco son preferibles.

Una bandeja rectangular (vidrio o esmalte) que tiene aproximadamente 1300


centímetros cuadrados (cm) de superficie inferior es adecuada para incubar huevos de
Artemia. Divida esta bandeja en dos partes por una partición que se extiende desde la
parte superior hasta aproximadamente 2.0 a 1.5 cm desde la parte inferior. Esta partición
puede ser de cualquier material opaco, biológicamente inerte (una tira de cartón de pasta,
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Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina

sellada con envoltura de parafina es satisfactoria). Levante un extremo de la bandeja


aproximadamente 1,5 cm y agregue 3 litros de formulación de agua de mar. Unte
aproximadamente 0,5 g de huevos de camarón en salmuera en el extremo poco profundo
de la bandeja. Cubra este extremo de la bandeja con un pedazo de cartón para mantener
los huevos en la oscuridad hasta que se complete la eclosión. Después de 20 a 23 horas
de incubación, dirija un haz de luz estrecho a través de la parte descubierta de la bandeja.
Los camarones de salmuera son fototácticos y se sumergirán debajo de la partición en el
extremo iluminado de la cámara. La Artemia concentrada en el haz de luz se puede
recolectar fácilmente mediante el uso de una pipeta o sifón de recolección conectada a un
tubo de goma de 30,5 cm (12 pulgadas) y una boquilla y se transfiere a un vaso de
precipitados o un plato poco profundo que contiene una pequeña cantidad de agua
salada.

3. Agua Salada

Para la prueba de toxicidad aguda con Artemia, un criterio práctico para un agua
salada aceptable es que los animales de prueba sanos sobrevivan en ella durante la
incubación y las pruebas sin mostrar signos de estrés.

El agua salada debe prepararse a partir de formulaciones disponibles en el


mercado o de los ingredientes que se enumeran en la página 5. Utilizando agua
desionizada. Se debe utilizar agua desionizada o destilada para diluir el agua salada a
una salinidad de 30 partes por mil (°/oo).

4. Procedimiento recomendado para probar el material

a. Diseño experimental

El procedimiento de prueba recomendado consiste en dos bioensayos por


separado de 48 horas con un control y seis concentraciones del material a probar. Un
bioensayo de 48 horas será sin aireación y el segundo será con aireación. En este último,
los contenedores se airearán con aire limpio a una velocidad de 100 +/- 15 burbujas por
minuto entregadas desde un tubo de vidrio de 1 milímetro (mm) de diámetro interior.

Debe haber al menos 20 animales de control y al menos 20 animales deben


estar expuestos a cada concentración o dilución del material a analizar, pero pueden
dividirse entre dos o más contenedores de prueba. El uso de más animales y tratamientos
de replicación es deseable. Si se usan réplicas, deben ser réplicas verdaderas sin
conexión de agua entre los contenedores de prueba de réplica. Asignación aleatoria
estratificada de los tratamientos (evaluación aleatoria de un contenedor de prueba para
cada tratamiento en una fila seguido de la asignación aleatoria de un segundo contenedor
de prueba para cada tratamiento en otro o una extensión de la misma fila) o se
recomienda la aleatorización total de los tratamientos.

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Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina

Una muestra representativa de los animales de prueba debe distribuirse de


manera imparcial entre los participantes de la prueba, ya sea agregando uno (si hay
menos de 11 animales por contenedor) o dos (si hay más de 11 animales por
contenedor), luego agregue uno o dos más a cada contenedor de prueba, y repita el
proceso hasta que cada contenedor de prueba tenga el número deseado de animales de
prueba en él. Alternativamente, los animales pueden asignarse por aleatorización total o
por aleatorización estratificada (asignación aleatoria de un animal a cada contenedor de
prueba, asignación aleatoria de un segundo animal a cada contenedor de prueba, etc.).

Cada prueba requiere un control que consiste en que el mismo este en agua
salada, las condiciones y los animales que se utilizan en recipientes son material de
prueba. Una prueba no es aceptable si más del 10% de los animales de control mueren.

b. Temperatura

La temperatura del agua de prueba debe mantenerse dentro de 1 ° C de la temperatura


del agua indicada en la página 65.

c. Salinidad

La salinidad del agua de prueba debe ser de 30 ° /oo antes de agregar el material a
probar.

d. Contenedores de prueba

Use cajas de Petri (o su equivalente) que tengan dimensiones de aproximadamente 9.0


por 6.5 centímetros.

Los recipientes de prueba deben limpiarse antes de su uso. Los recipientes nuevos deben
lavarse con detergente y enjuagarse con ácido clorhídrico (HCl) al 10%, acetona y agua
del grifo u otra agua limpia.

Al final de cada prueba, si los contenedores de prueba se vuelven a utilizar, deben (1)
vaciarse, (2) enjuagarse con agua, (3) limpiarse mediante el procedimiento adecuado para
eliminar el tóxico, por ejemplo. , ácido para eliminar metales y bases; detergente, solvente
orgánico o carbón activado para remover compuestos orgánicos; y (4) enjuagados con
agua. El ácido es útil para eliminar las incrustaciones y el hipoclorito (lejía) es útil para
eliminar la materia orgánica y para la desinfección. Todos los recipientes de prueba deben
enjuagarse con agua salada justo antes de usarlos.

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Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina

e. Preparación del material a ensayar

(Ver otra sección del manual sobre este tema).

f. Concentraciones

Se recomiendan como diluciones de muestras, en volumen, del


10% (100.000 ppm, 100 ml / l),
1% 0.001% (10 ppm, .01 ml / l) y
0.0001% (1 ppm, 0.001 ml / l)
como pruebas iniciales de concentraciones.

La concentración más alta (dilución) se preparará de la siguiente manera: se agregarán 9


volúmenes de agua salada a 1 volumen de la muestra agitada. (Se debe reservar un
espacio adecuado en el contenedor de prueba para agitar y agregar animales).

Cada concentración sucesiva se preparará mediante una dilución en serie de 1 en 10


similar del contenedor de prueba anterior. La agitación adecuada del contenido del
recipiente es esencial antes de cada dilución.

g. Aireación de un bioensayo

Después de la disolución, la aireación de un conjunto de concentraciones debe comenzar


a usar 100 +/- 15 burbujas por minuto administradas a través de un tubo de vidrio ID de 1
mm.

h. Transferencia de animales

Los animales deben agregarse a los contenedores de prueba dentro de 1 hora después
de que se hayan realizado las diluciones adecuadas del material a probar y se haya
iniciado la aireación de un conjunto de contenedores de prueba.

i. Alimentación

El organismo debe ser alimentado mientras que se encuentre en los contenedores de


prueba.

j. Mediciones

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La concentración de oxígeno disuelto, el pH y la temperatura deben medirse (1) antes de


agregar animales (2) a intervalos de 24 horas en la concentración más alta y más baja y el
control de los ensayos biológicos aireados y no aireados. Se requieren medidas
adicionales en recipientes en los que mueren los animales. Las muestras de agua deben
tomarse a mitad de camino entre la parte superior, la parte inferior y los lados de los
recipientes de prueba y no deben incluir ningún acumulado de superficie de material
removido desde la parte inferior o los lados.

k. Observaciones

Como mínimo, el número de animales muertos o afectados debe registrarse a intervalos


de 24 horas a lo largo de la prueba. Más observaciones son a menudo deseables,
especialmente cerca del comienzo de la prueba. Los animales muertos deben ser
retirados tan pronto como sean observados.

Para contar los animales muertos con precisión y con relativa facilidad, coloque los platos
de prueba en una superficie negra y sostenga un haz de luz estrecho paralelo al fondo del
plato. Al buscar en la superficie, el fondo y las áreas intermedias, se tienen en cuenta los
animales vivos. El uso de una pipeta de gotero para eliminar los animales vivos facilita el
conteo y disminuye la confusión de intentarlo.

Para contar los animales muertos con precisión y con relativa facilidad, coloque los platos
de prueba en una superficie negra y sostenga un haz de luz estrecho paralelo al fondo del
plato. Al buscar en la superficie, el fondo y las áreas intermedias, se tienen en cuenta los
animales vivos. El uso de una pipeta de gotero para eliminar los animales vivos facilita el
conteo y disminuye la confusión de tratar de contar las larvas en movimiento. Debido a la
turbidez que puede acompañar a las concentraciones más altas de materiales de lodo,
puede ser útil un período de sedimentación de 5 minutos. Verter el contenido del
recipiente de prueba en un recipiente limpio con una superficie mayor puede hacer que
los animales sean más visibles. También pueden ser útiles varios dispositivos de
aumento.

El efecto adverso más utilizado para estudiar la toxicidad aguda con animales acuáticos
es la muerte. Sin embargo, la muerte no se puede determinar fácilmente para algo de
Artemia, y por lo tanto una EC50 (concentración efectiva al 50% de los animales de
prueba). El efecto generalmente utilizado para determinar una EC50 es la inmovilización,
que se define como la incapacidad para moverse, excepto por una actividad menor de los
apéndices o pérdida de equilibrio.

5. Cálculos e informes

Al final del período de prueba, los bioensayos se terminan y se determinan los valores de
LC50 o EC50.

f. Cálculos
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Manual Bioensayos con Fitoplancton en Aguas Contaminadas – Método para medir Toxicidad con
Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina

Una LC50 es una concentración a la que murió el 50% de los animales experimentales y
una EC50 es una concentración a la que se afectó el 50% de los animales
experimentales. Cualquiera de los dos puede ser un valor interpolado basado en
porcentajes de animales que mueren o se ven afectados en dos o más concentraciones.
Estimar la LC50 o EC50 por interpolación implica trazar los datos en papel de
coordenadas semilogarítmicas o animales afectados en el eje aritmético. Se dibuja una
línea recta entre dos puntos que representan la muerte o el efecto en concentraciones
que fueron letales o efectivas contra más de la mitad y menos de la mitad del organismo.
La concentración a la que la línea cruza la mortalidad del 50% o la línea de efecto es el
valor de LC50 o EC50. Si el 50% de los animales de prueba no se ven afectados por la
concentración más alta, se debe informar el porcentaje de afectados.

g. Informes

Cualquier desviación de este método debe anotarse en todos los informes de resultados.
Un informe de los resultados de las pruebas aireadas y sin aire debe incluir:

1. Se incluye el nombre del método, el autor, el laboratorio y la prueba de la fecha:

2. Una descripción detallada del material analizado, que incluye la fecha y la hora
de la colección, la composición, las propiedades físicas y químicas conocidas y la
variabilidad del material analizado;

3. La fuente del agua salada, fecha preparada y método de preparación;

4. Información detallada sobre los animales de prueba, incluyendo nombre y fuente

5. Una descripción del diseño experimental, los contenedores de prueba, el


volumen de la solución de prueba, la forma en que se inició la prueba, el número
de organismos por concentración y la carga;

6. Definiciones de los criterios utilizados para determinar el efecto y un resumen de


las observaciones generales sobre otros efectos o síntomas;

7. Porcentaje de organismo de control que murió o se efectuó en cada contenedor


de prueba durante la prueba;

8. Las LC50 o EC50 de 24 y 48 horas.

9. Métodos utilizados y los resultados de todo el oxígeno disuelto, pH y mediciones


de temperatura; y

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Fitoplancton – Método para medir Toxicidad con Artemia salina

10. Cualquier otra información relevante.

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