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valores D y Z
PRÁCTICA No. 7
PARÁMETROS DE LETALIDAD TÉRMICA
Valores D y Z
Cultivo microbiano.
2 pipetas de 1 mL estèriles.
Autoclave.
Incubadora a 37°C.
V.- PROCEDIMIENTO
1. Bajo las condiciones asépticas adecuadas, tomar inóculo a partir de un cultivo puro.
2. Resuspender en un tubo con medio de enriquecimiento (BHI), hasta que se observe
turbidez.
3. Homogeneizar perfectamente.
4. Con una pipeta estéril tomar 0.5 mL del medio con inóculo y colocar en un tubo
limpio y estéril.
5. Repetir el mismo procedimiento hasta completar una serie de 10 tubos.
VII.- REPORTE
* Tiempo Térmico Mortal:
1. Anotar en una tabla las UFC/mL obtenidas en cada tiempo y hacer una gráfica.
VIII.- BIBLIOGRAFÍA
1. Heldman D. R., Singh P. R. 1993. Introduction to Food Engineering. Academic
Press. U.S.A.
2. Sharma., Mulvaney y Rizvi., Ingeniería de Alimentos. 1986. Ed. Limusa Wiley.
3. Madigan, M. T., J.M. Martinko y J. Parker.2003. Brock Biología de los
microorganismos. Madrid, España. 10a edición. Editorial Pearson-Prentice-Hall.
4. Tortora J. G., B. R. Funke y C.L. Case. 2007. Microbiology an introduction.
9thEd.Pearson Education, Inc. San FranciscoCA.
Control de los Microorganismos
DEFINICIONES IMPORTANTES:
- Esterilización: Proveniente del latín sterilis “incapaz de reproducirse”. Proceso por el cual las
células vivas, esporas viables, virus y viroides destruidos o eliminados de un objeto o hábitat.
- Germicida: Terminación _cida del latín que significa “destruir”. Es un agente que puede
destruir microorganismos patógenos y muchos no patógenos pero no necesariamente esporas.
(Bactericida, fungicida, viricida)
- Terminación _statico: proveniente del griego statikos “que causa detención”, agente con
capacidad de inhibir el crecimiento microbiano, pero sin matarlos. (Bacteriostático,
fungistático)
1. Tamaño de la población: Debido a que la muerte es exponencial, una población muy grande
requiere de mayor tiempo.
2. Composición de la población: la eficiencia del antimicrobiano varía considerablemente con
respecto a la naturaleza de los organismos que son tratados porque su susceptibilidad es
distinta. Por ejemplo: las endosporas bacterianas son más resistentes que las células
vegetativas, las células jóvenes mueren con mayor facilidad y algunas especies soportan mejor
condiciones adversas.
- Alteración del estado físico químico de las proteínas y ácidos nucleicos, o inhiben su síntesis
- Inhibición enzimática
- Métodos físicos
- Métodos químicos
- Agentes Antimicrobianos
MÉTODOS FÍSICOS: Los métodos físicos se utilizan a menudo para lograr la descontaminación,
la desinfección y la esterilización microbiana.
La eficacia del calor como agente antimicrobiano, se puede expresar como el Tiempo de
muerte térmico (TMT), que se define como el tiempo más corto necesario para destruir los
microorganismos en una suspensión, a una temperatura específica y en condiciones definidas.
Sin embargo como la destrucción es logarítmica no es posible eliminar completamente los
microorganismos de una muestra.
En estas condiciones se destruyen todas las células vegetativas y endosporas en un tiempo que
por lo general es de 15 minutos. Se piensa que el calor húmedo degrada los ácidos nucleicos,
desnaturaliza proteínas y además alterar las membranas celulares.
El indicador biológico consiste en una ampolla estéril con un medio y un papel cubierto con
esporas de Bacillus stearothermophilus o Clostridium. Luego de la esterilización se rompe la
ampolla y se incuba por unos días. El indicador químico consiste en una cinta especial con
letras o líneas que cambian de color después del tratamiento suficiente con calor.
b. Pasteurización: Se utiliza para sustancias o medios que no pueden ser calentadas a más de
su temperatura de ebullición.
Existen variaciones que son utilizadas en la industria de la leche: la pasteurización rápida (HTST
high temperature short-term) que consiste en calentar a 72°C por 15 segundos. Y la
pasteurización a temperatura ultra elevada (UTH ultrahigh temperature) que calienta a 140-
150°C por 1 a 3 segundos.
El primer calentamiento destruye células vegetativas pero no esporas, por lo que germinan a
37ºC y luego son eliminadas con el siguiente calentamiento.
d. Calor seco: Se utilizan hornos o estufas a una temperatura de 160-170°C por 2 o 3 horas. Es
menos efectivo que el calor húmedo, pero no corroe utensilios metálicos. Es lenta y no se
puede utilizar para material termo sensible.
e. Incineración: Destruye por completo los microorganismos. (calentar las asas en los
mecheros).
f. Temperaturas bajas: Refrigeración y congelación, son únicamente bacteriostáticos. En
general, el metabolismo de las bacterias está inhibido a temperaturas por debajo de 0° C. Sin
embargo estas temperaturas no matan a los microorganismos sino que pueden conservarlos
durante largos períodos de tiempo.
Esta circunstancia es aprovechada también por los microbiólogos para conservar los
microorganismos indefinidamente. Los cultivos de microorganismos se conservan congelados a
-70° C o incluso mejor en tanques de nitrógeno líquido a -196° C.
a. Filtros de profundidad: Se utilizan materiales fibrosos o granulados que forman una capa
gruesa con canales de diámetro muy pequeño. La solución es aspirada al vacío y los
microorganismos quedan retenidos o son adsorbidos por el material. Se utilizan diatomeas,
porcelana no vidriada, asbestos.
b. Filtros de membrana: Son circulares con un grosor de 0.1 mm y con poros muy pequeños,
de unos 2 μm por lo que los microorganismos no pueden atravesarlo. Se fabrican de acetato
de celulosa, policarbonato, fluoruro de polivinilo u otros materiales sintéticos.
RADIACIÓN:
a. Ultravioleta: Es letal para todas las clases de microorganismos por su longitud de onda corta
y su alta energía. Es letal a 260 nm ya que es la longitud de onda que es más efectivamente
absorbida por el ADN.
El mecanismo primario del daño al ADN es la formación de dímeros de timina lo que
inhibe su función y replicación. Son escasamente penetrantes y se utilizan para
superficies.
MÉTODOS QUÍMICOS:
- Actividad antimicrobiana
- Estable y homogéneo
Modo de acción:
a. Fenoles: El primer desinfectante y antiséptico utilizado, en 1867 Joseph Lister los empleó
para reducir el riesgo de infección en las cirugías. Hasta ahora los fenoles y sus derivados
(cresol, xilenol) son utilizados como desinfectantes en laboratorios y hospitales. Elimina
micobacterias, eficaz aún en presencia de materia orgánica y permanece activo en la superficie
después de mucho tiempo de su aplicación. Desnaturaliza proteínas y altera la membrana.
Tiene olor desagradable y puede producir irritaciones cutáneas.
b. Alcoholes: No elimina esporas pero son bactericidas y fungicidas y algunas veces viricida
(virus que contienen lípidos), son comúnmente utilizados principalmente el etanol y el
isopropanol en concentraciones de 70-80%. Tienen el mismo modo de acción de los fenoles.
c. Metales pesados: mercurio, arsénico, plata, zinc y cobre. Son bacteriostáticos ya que el
metal se combina con los grupos sulfihidrilos de las proteínas inactivándolas o precipitándolas.
Son tóxicos. Ejemplos: sulfato de cobre (alguicida) y nitrato de plata (gonorrea oftálmica en
niños)
d. Halógenos:
- Yodo: antiséptico cutáneo. Oxida componentes celulares y forma complejos con las
proteínas. En altas concentraciones puede destruir algunas esporas. Puede lesionar la piel,
dejar manchas y desarrollar alergias.
Su actividad está influida por la presencia de materia orgánica, pues puede haber en el medio
sustancias capaces de reaccionar con los compuestos clorados que disminuyan la
concentración efectiva de éstos.
- Oxido de etileno: microbicida y esporicida, se combina con las proteínas celulares. Alto poder
penetrante. En concentraciones de 10-20% mezclado con CO2 o diclorodifluorometano. Se
debe de airear ampliamente los materiales esterilizados para eliminar el gas residual porque es
muy tóxico.
AGENTES ANTIMICROBIANOS:
- Los antibióticos más selectivos son aquellos que interfieren con la síntesis de la pared
bacteriana. (penicilinas, vancomicina, bacitracina, cefalosporinas).
Existen diversos métodos para determinar la actividad de los agentes antimicrobianos, entre
ellos tenemos:
Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento. Luego de la
incubación adecuada (usualmente de un día para el otro) se observa la turbidez de los tubos
que indicará desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los
otros que no contengan suficiente agente antirnicrobiano como para inhibir su desarrollo. La
concentración de antibiótico que presente ausencia de crecimiento, detectada por falta de
turbidez (igualando al control negativo), se designa como la CMI. Para medir la CLM se debe
realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mismo sistema de dilución en caldo
que para medir la sensibilidad.
Una vez determinada la CMI, se siembra una cantidad conocida de inóculo de cada uno de los
tubos de caldo que no presentaban turbidez en placas de agar (la pequeña cantidad del agente
antimicrobiano que es llevada junto con el inóculo se elimina por dilución en el agar), y el
número de colonias que crece en estos subcultivos, después de incubar durante la noche, se
compara con el número de UFC/ml del cultivo original.
Dado que incluso las drogas bactericidas no siempre esterilizan totalmente una población
bacteriana, la mínima concentración del agente antibacteriano que permite sobrevivir a menos
de 0,1 % del inóculo original se denomina CLM.
Se incuban las placas durante 16-24 horas a 35ºC y al cabo de este tiempo se estudia el
crecimiento en ellas.
Método de E-test:
Se trata de una técnica cuantitativa en placa que permite obtener una lectura directa de CMI
en µg/ml, ya que se emplean tiras plásticas impregnadas en concentraciones crecientes de
antibiótico indicadas en una escala graduada sobre la propia tira.
El microorganismo a investigar se inocula en una placa y sobre ella se deposita la tira del
antibiótico (o antibióticos) a ensayar. Tras la incubación de 16-24 horas a 35ºC se observan las
placas y se valora la zona de inbición, de forma elíptica, alrededor de cada tira. La CMI se lee
directamente observando el punto más bajo de la elipse que presente crecimiento.
Pruebas automatizadas:
- Por un cambio genético, se pueden producir vías metabólicas que bloqueen el antimicrobiano.
- El organismo puede ser capaz de bombear hacia fuera el antibiótico que haya entrado a la
célula.