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DOSSIER

Techniques de l’Ingénieur
l’expertise technique et scientifique de référence
p224
Validation des méthodes d'analyse
quantitatives au moyen du profil
d'exactitude
Date de publication : 10/12/2012
Par :
Max FEINBERG
Ingénieur agronome, Docteur d'État en chimie,, Consultant en chimiométrie

Ce dossier fait partie de la base documentaire


Qualité au laboratoire
dans le thème Qualité et sécurité au laboratoire
et dans l’univers Mesures - Analyses

Document délivré le 15/03/2013


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Validation des méthodes d’analyse


quantitatives au moyen du profil
d’exactitude
par Max FEINBERG
Ingénieur agronome, Docteur d’État en chimie,
Consultant en chimiométrie

1. Place de la validation dans le cycle de vie................................. P 224v2 - 2


1.1 Concept de cycle de vie d’une méthode.................................................... — 2
1.2 Méthodologie classique de validation....................................................... — 4
1.3 Méthodologie globale : le profil d’exactitude ........................................... — 5
2. Vocabulaire de la validation ................................................................. — 6
2.1 Critère de justesse ....................................................................................... — 7
2.2 Critère de fidélité ......................................................................................... — 8
2.3 Critère d’exactitude ..................................................................................... — 9
2.4 Autres critères.............................................................................................. — 9
3. Estimation de la fidélité de la méthode ............................................ — 10
3.1 Conditions de mesure ................................................................................. — 10
3.2 Nombre de séries et nombre de répétitions par série ............................. — 11
3.3 Utilisation du coefficient de variation........................................................ — 11
4. Estimation de la justesse de la méthode .......................................... — 11
4.1 Modes d’expression de la justesse ............................................................ — 11
4.2 Traçabilité en chimie ................................................................................... — 12
4.3 Spécificité et interférences ......................................................................... — 12
5. Méthode du profil d’exactitude ........................................................... — 13
5.1 Disposer du mode opératoire et définir le mesurande ............................ — 14
5.2 Définir les objectifs...................................................................................... — 14
5.3 Échantillons de validation et valeurs de référence................................... — 14
5.4 Plan d’expérience de validation ................................................................. — 14
5.5 Plan d’expérience d’étalonnage ................................................................. — 15
5.6 Collecter les données .................................................................................. — 16
5.7 Prédire les concentrations par étalonnage inverse .................................. — 16
5.8 Critères de validation et intervalles de tolérance ..................................... — 16
5.9 Construire le profil d’exactitude................................................................. — 19
5.10 Interpréter les résultats ............................................................................... — 20
6. Exemples d’interprétation et compléments ..................................... — 20
6.1 Ajouts dosés par pesée : réalignement des niveaux................................ — 20
6.2 Effets de matrice : valider un facteur de correction.................................. — 21
6.3 Limite de quantification (LQ)...................................................................... — 21
6.4 Estimation de l’incertitude de mesure....................................................... — 21
7. Calculs pratiques des critères de validation.................................... — 22
7.1 Choix d’un outil de calcul ........................................................................... — 22
7.2 Écarts-types de fidélité................................................................................ — 23
7.3 Intervalles de tolérance (β-IT) ..................................................................... — 26
8. Conclusion ................................................................................................. — 27
Pour en savoir plus ............................................................................................ Doc. P 224v2

es analystes sont maintenant très au fait de la validation des méthodes et,


L depuis 10 ou 15 ans, ils ont acquis une bonne expérience dans ce domaine.
Mais pourquoi – parmi toutes les préoccupations des analystes – la validation

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VALIDATION DES MÉTHODES D’ANALYSE QUANTITATIVES AU MOYEN DU PROFIL D’EXACTITUDE __________________________________________________

des méthodes a-t-elle pris une place aussi importante ? Pour l’expliquer, il faut
rendre compte du développement de l’assurance qualité dans les laboratoires.
Les principes mêmes de l’assurance qualité sont bien connus et codifiés par
des normes très générales, publiées par l’Organisation internationale de nor-
malisation (ou International Organization for Standardisation, ISO). Elles
insistent sur le fait que la qualité des produits ou des services fournis par une
entreprise – comme des résultats d’analyse – a pour but de satisfaire les
besoins d’un client. L’assurance de la qualité est tout ce qui peut individuelle-
ment ou collectivement influencer le résultat d’une analyse.
Conceptuellement, c’est l’ensemble des dispositions à prendre pour assurer
que les résultats fournis seront de la qualité requise pour l’usage auquel l’utili-
sateur final les destine. Pratiquement, pour un laboratoire d’analyse et en
fonction de son domaine d’activité, chaque responsable peut s’appuyer sur des
référentiels qui fournissent des directives plus spécifiques pour organiser
l’assurance qualité. Il existe trois référentiels principaux qui règlent aujourd’hui
la vie des laboratoires d’analyse :
1) La norme ISO/CEI 17025 qui débouche sur l’accréditation, c’est-à-dire la véri-
fication de la compétence et l’aptitude d’un laboratoire à réaliser des analyses ;
elle est très générale et intéresse de nombreux types de laboratoires ;
2) Les bonnes pratiques de laboratoire (BPL) qui s’appliquent aux laboratoires
qui participent au développement de toute molécule chimique nouvelle pou-
vant avoir des effets sur la santé humaine ou l’environnement, tels les médica-
ments, les pesticides etc. ; c’est une démarche obligatoire pour un laboratoire
pharmaceutique ;
3) La norme ISO 15189 qui complète le « Guide de bonne exécution des
analyses » (GBEA) destiné spécifiquement aux laboratoires d’analyse de biolo-
gie médicale et qui précise comment peut se faire leur accréditation.
Tous ces textes affirment la nécessité de valider les méthodes mais sans
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expliquer comment le faire. C’est pourquoi, de nombreux guides, recomman-


dations, normes sectorielles ou guidances ont été publiés pour aider les
analystes dans ces études de validation. Malheureusement, ils présentent
souvent des incohérences, tant dans le vocabulaire employé que dans les
méthodes statistiques proposées et l’expérience montre que les procédures
généralement proposées posent un problème lors de la prise de décision
finale. Aussi, la question pratique de savoir comment valider une méthode
reste-t-elle un sujet de débat.
Cet article est une proposition pour une approche universelle, plus cohérente
et plus opérationnelle basée sur un outil unique : le profil d’exactitude. Elle ne
s’applique qu’aux méthodes d’analyse quantitatives.

1. Place de la validation Étape 1 : Sélection de la méthode. D’abord il faut sélectionner


une technique analytique, c’est-à-dire choisir parmi les diverses
dans le cycle de vie méthodes publiées dans la littérature celle qui, a priori, permettra
de résoudre le problème analytique posé. Cette démarche repose
entièrement sur le savoir-faire et l’expertise du laboratoire. Selon
le Cofrac (Comité français d’accréditation), on peut distinguer trois
1.1 Concept de cycle de vie types de méthodes, mais cette distinction ne signifie pas que le
d’une méthode besoin de validation soit différent :
– les méthodes normalisées ;
D’abord, il convient de préciser à quel moment il faut valider – les méthodes adaptées de normes ou de textes de référence ;
une méthode. En effet, comme tout processus, les méthodes
– les méthodes développées par le laboratoire.
d’analyse naissent, évoluent et disparaissent ; ce périple peut être
résumé sous la forme d’un cycle de vie, concept déjà largement Lorsque le laboratoire applique intégralement une méthode
employé dans l’approche système. La figure 1 résume le cycle de normalisée, certains considèrent parfois qu’il est possible de
vie d’une méthode d’analyse. Par convention, on a représenté les passer directement à l’étape 5 et qu’il n’est pas nécessaire de
étapes principales et sous-étapes dans des rectangles et les outils procéder à une validation complète : une simple vérification d’apti-
associés comme des ellipses. tude suffirait. C’est la position du Comité français d’accréditation

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Cartes de contrôle
a) Capacité de la méthode.
Essai d’aptitude
b) Plan de contrôle.

5. Utilisation en routine

Estimation de l’incertitude

Vérification d’aptitude

Optionnel

4. Validation externe
Expertise
de l’analyste a) Reproductibilité.
1. Sélection b) Répétabilité.

a) Choix des analystes. Étude inter-laboratoires


Test
b) Type de méthode. de robustesse
c) Type de signal.

6. Revalidation

3. Validation interne
Optimisation
Test de robustesse a) Modèle d’étalonnage.
– Sensibilité.
Plan d’expérience b) Justesse.
– Spécificité.
2. Développement Procédure(s) c) Fidélité.
de validation
– Répétabilité (interne).
a) Optimisation de l’appareillage. – Fidélité intermédiaire.
b) Optimisation du mode opératoire. d) Limite de détection.
c) Mode opératoire normalisé (SOP). e) Limite de quantification.

Figure 1 – Cycle de vie d’une méthode d’analyse

(Cofrac). Toutefois, la façon de procéder à cette vérification n’est Validation de la méthode. Comme l’indique très explicitement la
pas très explicite et nous ne traiterons pas de ce cas de figure avec figure 1, la validation ne doit intervenir que sur une méthode
lequel nous sommes en désagrément. complètement mise au point. Son but est de démontrer que la
Étape 2 : Développement de la méthode. Ensuite, il convient de méthode employée permet effectivement d’atteindre les objectifs
mettre au point la méthode, c’est-à-dire optimiser les étapes du de performance exigés par un client. On distingue classiquement
mode opératoire pour les adapter à la matrice et aux conditions deux types de validation :
pratiques où elle sera utilisée. En particulier, il faut préciser – Étape 3 : Validation intralaboratoire ou interne. Elle est
l’ensemble des matrices auxquelles elle s’applique ainsi que la conduite dans un seul laboratoire. C’est surtout ce type de valida-
gamme de concentrations utilisables. En général, le développe- tion qui est traité dans cet article.
ment d’une méthode est synonyme d’optimisation. Pour cela la – Étape 4 : Validation interlaboratoires ou externe. Elle n’inté-
méthodologie de la surface de réponse est maintenant largement resse, en principe, que les méthodes utilisées par plusieurs labora-
reconnue comme l’approche la mieux adaptée à cet objectif [1] toires dont les résultats servent lors d’échanges commerciaux ou
[P 228] [P 229]. de contrôles officiels ; on peut la considérer comme optionnelle.
Si la méthode est « indirecte », une première tâche est d’établir Elle fait l’objet d’un article spécifique des Techniques de
un modèle d’étalonnage. Cependant, il existe aussi de nombreuses l’Ingénieur [P 226].
méthodes quantitatives « directes » qui ne requièrent pas d’étalon-
À l’issue de la validation, le mode opératoire peut évoluer mais,
nage. Un point important est aussi de vérifier l’existence d’éven-
surtout, on peut le compléter des performances effectivement
tuelles interférences. Dans certains cas favorables, un seul plan
constatées de la méthode.
d’expérience suffit pour optimiser les conditions opératoires et
évaluer les interférences. L’étape finale consiste à rédiger le mode Estimation de l’incertitude et vérification d’aptitude. La notion
opératoire retenu sous la forme de ce qu’on appelle dans le cadre d’incertitude de mesure appliquée aux analyses chimiques est
des Bonnes pratiques de laboratoires (BPL) un mode opératoire détaillée dans un article des Techniques de l’Ingénieur [P 105] et
normalisé ou Standard Operating Procedure (SOP). dans le guide désigné de façon abrégée par GUM (Guide pour

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l’expression de l’incertitude de mesure) [2]. C’est un concept relati- Exemple : la Décision européenne 2002/657 est un texte régle-
vement récent en chimie analytique, largement repris dans la mentaire facile à se procurer sur Internet [3]. Selon ce document « La
norme ISO/CEI 17025:2005 : la nouvelle exigence d’estimation de validation doit démontrer que la méthode d’analyse est conforme aux
l’incertitude de mesure revêt une importance particulière pour les critères applicables pour les caractéristiques de performances corres-
laboratoires accrédités. pondantes. Des objectifs de contrôle différents exigent des catégo-
ries de méthodes différentes ».
Étape 5 : Utilisation en routine. La vie de la méthode se poursuit
par son utilisation en routine. L’obligation de maîtrise de la qualité Le tableau 1 reprend un des tableaux de ce texte réglementaire.
implique un contrôle des performances dans le temps. Pour On constate que les critères à déterminer varient en fonction du type
effectuer ce contrôle, il existe des outils spécifiques que sont les de méthode, selon qu’elle sert au dépistage ou à la confirmation. La
cartes de contrôle et les essais d’aptitude. définition des critères CCα et CCβ est fournie par ailleurs dans le
texte.
Étape 6 : Revalidation. Ensuite, après un certain temps d’utilisa-
tion, on peut être amené à apporter des améliorations qui, selon Un point intéressant souligné dans ce texte est que la validation
leur importance, amènent à une revalidation plus ou moins consiste :
complète. – d’une part, en des obligations de résultats sous la forme de
valeurs cibles pour certains critères, comme le taux de récupération ;
– d’autre part, en des obligations de moyens à mettre en œuvre ;
1.2 Méthodologie classique par exemple, pour la détermination de certaines substances toxiques,
la CPG avec un détecteur à capture d’électrons ne peut être utilisée
de validation que si on a deux colonnes de polarités différentes.
Dans plusieurs documents référencés dans la partie Pour en À travers cet exemple, on voit se dessiner une nouvelle tendance,
savoir plus, la validation est présentée comme une suite d’études à savoir qu’à côté des critères de validation, on va associer des
expérimentales servant à calculer des critères de validation. valeurs seuils de performances en fonction de la méthode et de ses
Prenons un exemple pour illustrer les problèmes qu’ils soulèvent. objectifs, comme l’illustre le tableau 2.

Tableau 1 – Classification des méthodes d’analyse et caractéristiques de performances


à déterminer d’après la Décision européenne 2002/657
sur le contrôle des médicaments vétérinaires
Méthodes qualitatives Méthodes quantitatives
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Type de méthodes
Dépistage Confirmation Dépistage Confirmation

Limite de détection CCβ + + + +

Limite de décision CCα – + – +

Justesse/récupération – – – +

Fidélité – – + +

Sélectivité/spécificité + + + +

Applicabilité + + + +

Robustesse + + + +

Stabilité + + + +

Tableau 2 – Valeurs seuils retenues par la Commission européenne pour le contrôle des résidus
de médicaments vétérinaires
Critère Niveau de concentration Valeurs seuils

 1 µg/kg – 50 % < R % < + 20 %

Taux de récupération R % (justesse) > 1 µg/kg à 10 µg/kg – 30 % < R % < + 10 %

 10 µg/kg – 20 % < R % < + 10 %

 10 µg/kg à 100 µg/kg CVR  20 %

Fidélité (CVR) > 100 µg/kg à 1 000 µg/kg CVR  15 %

 1 000 µg/kg CVR  20 %

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Si les moyens de démonstration sont laissés à l’analyste,


souvent ces guides proposent aussi des tests statistiques (appelés Valeur
tests d’hypothèse) pour vérifier la conformité d’un critère par de référence
rapport à son seuil de performance ou d’autres critères plus quali-
tatifs, comme : CV < 15 %
– le test d’homogénéité de la variance dans le domaine
d’application ; +
– le test d’adéquation d’un modèle d’étalonnage (aussi appelé
test de linéarité) ; Biais < 15 %
– le test d’égalité des moyennes pour la technique des ajouts
dosés ;
– etc.
Ces tests viennent compléter ce qui est alors appelé une « étude
de validation ». a valeurs seuils vérifiées indépendamment

Mais, selon nous, l’écueil principal de cette méthodologie de


validation, basée sur des tests, tient au fait que ceux-ci ne portent
que sur l’hypothèse principale : on ne calcule que le risque
fournisseur. L’hypothèse alternative n’est pas prise en compte, au
cas où aucune différence n’est démontrée, c’est-à-dire que le
risque client n’est pas estimé.

Pratiquement, cela veut dire qu’on mesure le risque pour le CV < 15 %


laboratoire d’être accusé à tort de rendre un résultat faux, mais
qu’on ne sait rien sur le niveau de risque du client de recevoir +
un résultat erroné (ou le niveau de garantie que le résultat est
Biais < 15 %
correct). Or dans toute relation commerciale il est normal
d’équilibrer le risque fournisseur et le risque client.

1.3 Méthodologie globale :


le profil d’exactitude
En s’appuyant sur la définition de la validation fournie par le b valeurs seuils vérifiées simultanément
« Vocabulaire international de métrologie », VIM (voir
paragraphe 2), il est possible de proposer une méthodologie alter- Figure 2 – Interprétation géométrique des valeurs seuils
native qui, selon nous, est mieux adaptée aux enjeux de la valida- pour la fidélité et la justesse
tion, à savoir la satisfaction des besoins des clients, tout en
contrôlant le risque du laboratoire. On peut la résumer en trois
points : qui caractérisera un résultat et pas seulement la méthode. En effet,
ce qu’on attend d’une procédure de dosage c’est qu’elle soit capa-
– fixer un objectif global de performance relatif à l’exactitude de ble de quantifier correctement un échantillon, et non pas tellement
la méthode, appelé intervalle d’acceptabilité ; qu’elle soit fidèle ou juste, même si une bonne fidélité et une
– produire des preuves expérimentales qui servent pour calculer bonne justesse constituent souvent (mais pas obligatoirement) des
des paramètres que l’on va combiner pour évaluer l’exactitude ; gages de réussite. Ainsi, qu’importe que la méthode ne soit pas
– vérifier si ces preuves sont en adéquation avec l’objectif très juste, si elle est apte à produire un résultat qui soit globa-
global. lement acceptable pour les objectifs du client ? Nous proposons
Pourquoi fixer un objectif de validation unique et global et non d’appeler ce critère global l’intervalle d’acceptabilité.
pas des objectifs, critère par critère, comme cela se fait
L’objectif de la validation n’est donc pas simplement,
couramment ? Nous allons répondre par l’exemple suivant.
contrairement à ce que la lecture de certains guides de validation
peut porter à croire, d’obtenir des estimations correctes de la
Exemple : prenons une méthode pour laquelle la fidélité, exprimée justesse et de la fidélité. Il paraît raisonnable de prétendre que
sous la forme d’un CV de reproductibilité, doit être inférieure à 15 % l’objectif est de répondre aux besoins du client – demandeurs
et la justesse, mesurée par un biais relatif absolu, doit elle aussi être d’analyse ou autorités de contrôle – c’est-à-dire :
inférieure à 15 %. La figure 2 illustre les contraintes ainsi imposées.
Selon la stratégie classique, la méthode est validée si chacune de
ces contraintes est vérifiée indépendamment l’une de l’autre. On voit L’objectif de la méthodologie globale est de fournir des
ainsi qu’on peut accepter comme conformes des résultats qui garanties que chaque résultat qui sera obtenu en routine sera
diffèrent jusqu’à 30 % de la valeur de référence quel que soit le test, suffisamment proche de la valeur vraie de l’échantillon traité.
ce qui semble cohérent : ce qu’illustre le cercle pointillé de la
figure 2a. Mais, en réalité, ces contraintes s’ajoutent et le biais de
Nota : la notion de « valeur vraie » doit être entendue en un sens très large, moins res-
justesse peut être positif ou négatif. La figure 2b montre qu’en fait trictif que ce que propose le VIM. Il s’agit plutôt d’une valeur de référence, reconnue
on peut être amené à accepter des résultats qui diffèrent jusqu’à comme vraie comme expliqué au paragraphe 2.1.
45 % de la valeur de référence ! On débouche alors sur des tests qui
se contredisent et on pourra conclure à la conformité de la fidélité, À la lecture de cet objectif, deux notions fondamentales se
mais plus à celle de la justesse. dégagent, à savoir :
– « suffisamment proche » signifie que le résultat fourni en
L’éclatement des objectifs « critère par critère » nuit à la clarté routine sera à une distance raisonnable (ou exigée par le client) de
de l’enjeu. Il semble donc préférable de proposer un critère unique la valeur vraie ;

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– « fournir des garanties » signifie qu’il faut calculer la proba-


bilité de produire des résultats situés à cette distance raisonnable. Proportion β
On peut proposer une formalisation mathématique de ces deux
notions. Si l’on appelle Z le résultat fourni en routine et X la valeur
vraie de l’échantillon, la notion de « suffisamment proche » peut +
s’écrire sous la forme suivante :

– λ < Z − X < +λ
Les quantités – λ et + λ représentent ces « distances
raisonnables » maximales qu’un client est prêt à accepter. Elles
forment ce que nous appelons l’intervalle d’acceptabilité. Si ces
distances sont les mêmes de chaque côté de la valeur vraie, l’inter-
valle est symétrique et l’équation précédente devient : Limite Valeur
d’acceptabilité de référence
Z −X < λ

Elle peut aussi s’écrire sous la forme d’un écart relatif : La limite d’acceptabilité représente
« l’emploi prévu » de la méthode.

Z −X
<λ % a méthode 1 (valide)
X
Quant à l’idée de « fournir une garantie », elle peut s’écrire sous
la forme d’une probabilité supérieure ou égale à une proportion β :

Prob ( Z − X < λ )  β

L’objectif de performance globale, noté λ, est appelé la (ou les) +


limite(s) d’acceptabilité de la méthode. Il est défini par le client et
non pas par l’analyste et correspond à la performance attendue de
la méthode en termes d’exactitude. Rappelons que l’exactitude
combine justesse et fidélité (voir paragraphe 2).
Finalement, ce dont on a besoin, c’est d’un outil statistique
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permettant de prédire entre quelles limites se situera une propor-


tion β de futurs résultats pour vérifier si ce nouvel intervalle se
situe bien entre les limites d’acceptabilité. Cet outil existe, il s’agit b méthode 2 (non valide)
de l’intervalle de tolérance moyen de probabilité  (β-IT) ou
intervalle de prédiction. Il a été introduit dès les années 1940 pour
construire les cartes de contrôle très largement utilisées Figure 3 – Les concepts de base de la validation : valeur vraie,
incertitude et limite d’acceptabilité
aujourd’hui pour le contrôle statistique des procédés
industriels [4].
La figure 3 propose une interprétation graphique de la de tenir compte de la relation connue entre la fidélité et la
démarche. Le cercle grisé délimite la zone dans laquelle se situe la concentration. Finalement, une seule illustration graphique
proportion β % moyenne attendue de futures mesures (intervalle permettra de décider de la validité de la méthode sans qu’aucun
de tolérance moyen de probabilité β ou β-IT). Quant à la limite test d’hypothèse ne soit effectué (voir la figure 13).
d’acceptabilité, elle est représentée le grand cercle centré autour
de la valeur de référence. La méthode 1 est valide parce qu’elle est
capable de produire une proportion suffisante de futures mesures
qui se situeront à l’intérieur de la zone d’acceptabilité. Par contre,
la méthode 2 n’en n’est pas capable. Si on s’en réfère à la défini-
2. Vocabulaire
tion de la validation fournie par le « Vocabulaire international de
métrologie » (VIM) (5), on comprend aussi que λ permet de
de la validation
concrétiser la notion d’« usage déterminé » de la méthode (ou de
fitness-for-purpose en anglais). Le terme « validation » est très largement employé dans la litté-
Quant au choix de la probabilité β, un groupe de travail a rature analytique. Du fait de cette fréquence élevée, il existe de
proposé une proportion de 66 % qui faisait référence à une règle nombreuses acceptions et une certaine ambiguïté sur son usage.
dite « 4/6/15 ». À savoir, au moins 4 contrôles de qualité sur 6 Comme il fallait faire un choix, nous partirons des définitions
doivent se trouver dans les limites d’acceptabilité de ± 15 %. Cette proposées dans le VIM [5], rappelées ici.
règle de décision revient donc à accepter que seulement 2/3 – ou
66 % – des futures mesures soient comprises entre les limites
d’acceptabilité fixées. Pour des raisons de sécurité, on a proposé Mesurande (VIM 2.3) : grandeur que l’on veut mesurer.
d’utiliser le seuil β = 80 % mais d’autres valeurs sont possibles. Incertitude de mesure (VIM 2.26) : paramètre non négatif qui
La méthode du profil d’exactitude, décrite en détail dans le caractérise la dispersion des valeurs attribuées à un mesu-
paragraphe 5, consiste d’abord à collecter des mesures, sous rande, à partir des informations utilisées.
condition de fidélité intermédiaire pour tenir compte de toutes les Vérification (VIM 2.44) : fourniture de preuves tangibles
sources d’incertitude, puis, à calculer les limites du β-IT et à les qu’une entité donnée satisfait à des exigences spécifiées.
comparer aux limites d’acceptabilité. Puisqu’il convient de valider
une méthode pour l’ensemble de son domaine d’application, la Validation (VIM 2.45) : vérification, où les exigences
spécifiées sont adéquates pour un usage déterminé.
démarche est généralisée à divers niveaux de concentration, afin

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Selon ces définitions, pour conduire une validation, il faut


d’abord définir le mesurande. Si l’on parcourt la littérature analy- Résultat
tique, on s’aperçoit que le terme « validation » est en fait souvent
utilisé à la place du mot « vérification ». Ainsi, pour de nombreux Valeur de référence X
analystes une méthode est « valide » parce qu’ils ont calculé des +
critères de validation, comme la répétabilité ou la reproductibilité.
Un terme synonyme de vérification peut être « caractérisation ». Mesurage
Pour valider une méthode, il faut, d’une part, bien sûr calculer un
ensemble de critères de validation, comme la répétabilité ou la
justesse définies dans la suite de ce paragraphe, mais aussi
d’autre part, définir des objectifs de performance, en termes de
valeurs cibles à atteindre. C’est cette deuxième partie de la Z X Erreur de mesure
démarche qui est souvent négligée. ou biais Z − X

La définition proposée dans la norme ISO/CEI 17025, quoique


légèrement différente, rejoint celle du VIM : « [valider] c’est établir
à l’évidence, avec un degré de confiance élevée et sous une forme
documentée, qu’un procédé déterminé permet d’obtenir un
produit (ou un service) qui atteint effectivement des spécifications
définies à l’avance ». La clause 5.4.5.2 de la version anglaise + Z
introduit un concept intéressant : « the laboratory shall validate...
methods to confirm that the methods are fit for the intended use ». L’estimation de la justesse suppose la connaissance
On parle ainsi de fitness-for-purpose, terme qu’on pourrait traduire de la valeur de référence.
par « adéquation aux objectifs ».
Figure 4 – Estimation de la justesse
Le nombre de paramètres et/ou de critères proposés pour carac-
tériser les performances des méthodes d’analyse est tout à fait
impressionnant. Il est hors de question d’en faire une revue
exhaustive, d’autant plus que leurs définitions peuvent varier d’un
2.1 Critère de justesse
texte à l’autre ou, pour une même source, d’une édition à l’autre.
Par exemple, le terme « linéarité » peut être employé pour L’estimation de la justesse implique qu’on soit capable de définir
désigner la capacité de l’instrument de mesure à fournir un une valeur de référence. À la place, on parle aussi de valeur vraie,
modèle d’étalonnage qui est une droite (linéarité de la fonction par analogie avec les modèles proposés par les statisticiens ou les
d’étalonnage) ou bien la propriété de la méthode à retrouver la métrologues ; nous utiliserons aussi le terme de valeur cible. En
concentration connue d’échantillons proportionnellement à leurs toute légitimité, une valeur n’est de référence pour autant qu’elle
concentrations théoriques (linéarité de la justesse). soit traçable par rapport aux unités SI. Des indications sur la traça-
bilité des mesures en chimie sont disponibles dans le
On peut proposer une classification des termes usuellement paragraphe 4.2.
rencontrés dans la littérature, basée sur les deux principaux
concepts métrologiques que sont la justesse et la fidélité. Mais ce Dans le reste du texte, on notera X la valeur de référence.
n’est pas tout à fait suffisant car nombre d’autres termes sont La figure 4 est une représentation graphique de la définition de
apparus, essayant de préciser divers concepts plus ou moins flous. la justesse. Chaque mesurage ou répétition est représenté par un
petit point. Le résultat, tel qu’il est défini et tel qu’il sera rendu au
demandeur d’analyse, est illustré par une croix située au milieu du
Grandes catégories de critères de validation et critères associés nuage de points formé par les mesurages.
Justesse : valeur de référence, valeur vraie, valeur Une idée classique, consiste à dire que le meilleur résultat est
conventionnellement vraie, valeur cible, biais, linéarité (de la représenté par le centre de gravité du nuage de points, c’est-à-dire,
justesse), recouvrement, facteur de récupération, taux de lorsqu’on passe au modèle statistique, la moyenne arithmétique
recouvrement, sélectivité, spécificité, erreur systématique, tra- notée Z . Mais cela voudrait dire qu’il faut faire des répétitions
çabilité (du mesurage)... pour fournir un résultat, ce qui n’est pas tenable économiquement
Fidélité : répétabilité (intralaboratoire), reproductibilité (intra dans bien des cas.
et interlaboratoires), erreur aléatoire, condition de répétabilité,
condition de reproductibilité, rapport de Horwitz, fidélité inter-
médiaire (intralaboratoire), limites de répétabilité et de repro- Critères en relation avec la justesse
ductibilité... Justesse de mesure, justesse (VIM 2.14) : étroitesse de
Combinaison (justesse + fidélité) : exactitude (concept et sta- l’accord entre la moyenne d’un nombre infini de valeurs mesu-
tistique), incertitude de mesure, incertitude relative, incertitude rées répétées et une valeur de référence.
étendue, incertitude-type, incertitude-type combinée, résultat... Sélectivité (VIM 4.13) : aptitude d’un système de mesure, uti-
Étalonnage : sensibilité, standard, étalon, blanc, limite de lisant une procédure opératoire spécifiée, à fournir des résul-
détection, limite de quantification, linéarité (de l’étalonnage), tats de mesure pour un ou plusieurs mesurandes, qui ne
courbe d’étalonnage, fonction de réponse, fonction instrumen- dépendent pas les uns des autres ou de toute autre grandeur
tale, facteur de réponse... existant dans le système en cours de mesurage.
Méthodologie dans sa globalité : essai d’aptitude, essai Valeur de référence (VIM 5.18) : valeur d’une grandeur, dont
d’intercomparaison, essai interlaboratoires, étude collaborative, l’incertitude de mesure associée est considérée communément
contrôle qualité, matériau de référence (interne, externe ou comme suffisamment petite pour que la valeur puisse servir de
certifié), profil d’exactitude... base de comparaison pour les valeurs de grandeurs de même
Applicabilité : adéquation à l’objectif (fitness-for-purpose ), nature (valeur vraie ou valeur cible).
praticabilité, robustesse, domaine d’application, domaine Spécificité : capacité d’une méthode à mesurer un analyte
validé, matrice, domaine de concentration, domaine dyna- particulier dans un échantillon sans que cette mesure soit faus-
mique... sée par d’autres composants de l’échantillon.

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VALIDATION DES MÉTHODES D’ANALYSE QUANTITATIVES AU MOYEN DU PROFIL D’EXACTITUDE __________________________________________________

En fait, on ne mesure pas la justesse mais on estime un biais de


justesse défini par Z – X, la justesse est alors estimée comme une Résultat
erreur de mesure moyenne. On pourra aussi calculer le biais de
façon relative, sous la forme 100 × (Z – X )/X. Une autre forme
possible est R = 100 × (Z/X ) qui s’interprète comme un taux de
récupération ou un taux de recouvrement, à savoir « le pourcen- +
tage de la quantité d’analyte exprimée par la méthode (ou expéri-
mentalement retrouvée) par rapport à la quantité d’analyte
réellement présente ».
Les autres critères introduits ici, comme la spécificité ou la sélecti- Fidélité
vité, sont plutôt qualitatifs. En fait, il est assez évident qu’ils sont à ks
l’origine d’un manque de justesse et participeront quantitativement
I

∑z
à ce qu’on appelle globalement l’erreur de mesure ou erreur totale.
i − z2
Z i=1
s=
I −1
2.2 Critère de fidélité
Malgré la similitude entre les premiers mots des définitions de
la justesse et de la fidélité, la fidélité est un critère qui quantifie la
dispersion des mesurages sans faire intervenir la valeur de réfé-
rence, alors que la justesse caractérise un décalage par rapport à
la valeur de référence. La fidélité est toujours évaluée au moyen
d’écarts-types. Mesure Z
+

Principaux termes en relation avec la fidélité L’estimation de la fidélité requiert le calcul d’écarts-types.
Fidélité de mesure (VIM 2.15) : étroitesse de l’accord entre
les indications ou les valeurs mesurées obtenues par des Figure 5 – Estimation de la fidélité
mesurages répétés du même objet ou d’objets similaires dans
des conditions spécifiées.
Condition de répétabilité (VIM 2.20) : condition de mesurage écarts-types : c’est ce qui est défini comme conditions de répétabi-
dans un ensemble de conditions qui comprennent la même lité, de fidélité intermédiaire ou de reproductibilité. Le paramètre
procédure de mesure, les mêmes opérateurs, le même système statistique utilisé pour estimer la fidélité est l’écart-type et, prati-
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de mesure, les mêmes conditions de fonctionnement et le quement, on peut calculer :


même lieu, ainsi que des mesurages répétés sur le même objet – un écart-type de répétabilité, noté sr ;
ou des objets similaires pendant une courte période de temps. – un écart-type de fidélité intermédiaire, noté sF ;
Répétabilité (VIM 2.21) : fidélité de mesure selon un ensem- – un écart-type de reproductibilité, noté sR .
ble de conditions de répétabilité.
Cependant, on ne peut calculer un écart-type de reproductibilité
Condition de fidélité intermédiaire (VIM 2.22) : condition de
que lorsque les mesures sont effectuées dans plusieurs laboratoi-
mesurage dans un ensemble de conditions qui comprennent la
res. Le concept de fidélité intermédiaire, quoique moins connu, est
même procédure de mesure, le même lieu et des mesurages
très utile pour la validation interne des méthodes. Au sein d’un
répétés sur le même objet ou des objets similaires pendant une
même laboratoire, dès qu’on va faire des mesurages en faisant
période de temps étendue, mais peuvent comprendre d’autres
varier les jours ou les opérateurs ou les réglages instrumentaux...
conditions que l’on fait varier.
on est en condition de fidélité intermédiaire.
Fidélité intermédiaire (VIM 2.23) : fidélité de mesure selon un
ensemble de conditions de fidélité intermédiaire.
Condition de reproductibilité (VIM 2.24) : condition de mesu- Pour une validation interne, on fera des mesures sous
rage dans un ensemble de conditions qui comprennent des condition fidélité intermédiaire pour calculer un écart-type de
lieux, des opérateurs et des systèmes de mesure différents, fidélité intermédiaire, parfois appelé à tort écart-type de repro-
ainsi que des mesurages répétés sur le même objet ou des ductibilité interne.
objets similaires.
Reproductibilité (VIM 2.25) : fidélité de mesure selon un
ensemble de conditions de reproductibilité. La figure 6 résume sous forme graphique les différentes
conditions d’estimation d’un écart-type de fidélité. L’échelle hori-
zontale représente le nombre de sources de variation qui sont
La figure 5 illustre le concept de fidélité selon les mêmes prises en compte. Par exemple, si on étudie la seule influence des
conventions que la figure 4. Sur ce graphique, la valeur de réfé- opérateurs au sein d’un seul laboratoire, on est en condition inter-
rence X n’apparaît plus puisqu’elle n’est plus utile pour expliquer médiaire de fidélité. Mais la situation peut rapidement devenir
la définition ; l’estimation d’une fidélité ne demande pas de complexe, car il est possible de combiner plusieurs sources de
connaître la valeur de référence du mesurande. variation, comme les opérateurs et les appareils : on débouche sur
une fidélité intermédiaire opérateurs/appareils.
Le cercle pointillé est une représentation graphique obtenue en
combinant un écart-type de fidélité s et un coefficient k appelé Les notations et les formules de calcul indiquées sur la figure 6
facteur d’élargissement ; le rayon de ce cercle est égal à k × s. Un sont expliquées dans le paragraphe 7. Mais on peut remarquer que
facteur d’élargissement est un coefficient supérieur à 1 par lequel les écarts-types de fidélité intermédiaire et de reproductibilité
on multiplie un écart-type pour prendre en compte une probabilité. incorporent tous la variance de répétabilité, notée s r2 . Par défini-
Si on peut choisir entre différentes valeurs du facteur d’élargis- tion, la répétabilité est toujours plus petite (ou égale) que la fidélité
sement pour traduire une dispersion, on peut aussi avoir différents intermédiaire ou la reproductibilité.

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Sr = Sr2 + S 2I

S fi = Sr2 + S j2ou o S fi = Sr2 + So2 + S 2j

Sr
Sources de variation

0 1 2 n Plusieurs
Jour ou Jour et Sources laboratoires
Opérateur Opérateur

Répétabilité Fidélité intermédiaire Reproductibilité

Figure 6 – Différentes conditions de mesure des écarts-types de fidélité

Tout comme la fidélité, l’incertitude est aussi estimée à partir


d’écarts-types appelés pour la circonstance incertitudes-types. Son
estimation consiste à prendre en compte les diverses sources de
variation et à combiner leurs incertitudes-types et, en particulier, Exactitude
celles qui caractérisent les valeurs de référence des étalons ou les
facteurs de correction (comme un taux de récupération). Les Erreur
méthodes pratiques d’évaluation de l’incertitude sont décrites
dans le paragraphe 6.4 en relation avec l’utilisation des données +
de validation. Justesse Valeur
Biais X – Z de référence X

2.3 Critère d’exactitude Résultat Z


Fidélité
Avec les notions de justesse et de fidélité, on s’intéressait à la
méthode d’analyse. L’exactitude, quant à elle, s’applique à un Mesurage Zi
mesurage. Un mesurage étant la combinaison d’une méthode,
mais aussi d’un laboratoire, d’un type d’échantillon, d’un opéra-
teur, d’un jour donné, etc.
Figure 7 – Représentation schématique de l’exactitude

Exactitude (VIM 2.13 en tant que concept) : étroitesse de


l’accord entre une valeur mesurée et une valeur vraie du 2.4 Autres critères
mesurande ; (VIM 2.14) étroitesse de l’accord entre les valeurs
mesurées qui sont attribuées au mesurande. En ce qui concerne l’étalonnage, on fait souvent la distinction
entre les méthodes directes qui ne demandent pas d’étalonnage et
les méthodes indirectes qui doivent être étalonnées, tel l’azote de
On définit souvent l’exactitude comme une « combinaison » de Kjeldahl ou la cellulose brute de Wende. Dans ce cas, l’analyte
la justesse et de la fidélité. La justesse est l’écart entre le résultat n’est pas exactement défini en termes de molécules clairement
(moyenne) et la valeur de référence, la fidélité est la dispersion identifiées et n’est donc pas disponible sous la forme d’un étalon
moyenne des mesurages autour du résultat et on peut la repré- qu’on peut acheter dans le commerce.
senter comme un cercle qui contient une proportion connue des Si la méthode requiert un étalonnage, on distinguera entre :
mesurages (sans entrer dans le détail de son calcul). L’exactitude
caractérise l’écart entre un mesurage individuel et la valeur de – l’opération d’étalonnage direct qui consiste à établir la
référence. Selon les conventions déjà utilisées, la figure 7 propose fonction mathématique qui relie la réponse instrumentale Y et
une illustration schématique de l’exactitude et des divers critères l’analyte X disponible sous la forme d’un produit pur ;
de justesse et de fidélité déjà présentés. – l’étalonnage inverse qui consiste à prendre l’inverse de la
Si l’on s’intéresse à un futur mesurage unique qui servira à fonction d’étalonnage pour prédire la concentration d’un échan-
fournir un futur résultat, on peut facilement voir que son exacti- tillon. Si la fonction d’étalonnage est une droite Y = a0 + a1 X, son
tude combine la justesse et la fidélité. C’est pourquoi, on utilisera inverse est Xˆ = (Y − a0 ) /a1 . Pour simplifier les notations, nous
ce critère pour conduire une validation, sous la forme d’un profil
d’exactitude, comme décrit dans le paragraphe 6. appellerons Z la quantité prédite inverse X̂ .

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Critères de détection liés à l’étalonnage 3. Estimation de la fidélité


Limite de détection (LD ) (VIM 4.18) : valeur mesurée,
obtenue par une procédure opératoire donnée, pour laquelle la
de la méthode
probabilité de déclarer faussement l’absence d’un constituant
dans un matériau est β, étant donnée la probabilité α de décla-
rer faussement sa présence. 3.1 Conditions de mesure
Limite de quantification (LQ) : la plus petite concentration de
l’analyte pouvant être quantifiée, dans les conditions expéri- La fidélité est une mesure de l’amplitude avec laquelle une
mentales décrites de la méthode. méthode disperse les répétitions ; or les causes de dispersion sont
Sensibilité : mesure de l’amplitude de la variation de la nombreuses. Ainsi, deux opérateurs qui appliquent la même
réponse instrumentale relativement à une variation de la quan- méthode sur un même échantillon obtiendront des mesures diffé-
tité d’analyte. rentes et on pourrait calculer au moins trois valeurs fidélité : une
estimation globale, une estimation pour l’opérateur 1 et une autre
Limite de décision (CCα) : limite à laquelle et au-delà de pour l’opérateur 2.
laquelle il est permis de conclure avec une probabilité d’erreur
α qu’un échantillon est non conforme [3]. La figure 8 présente un diagramme général de toutes les
Capacité de détection (CCβ) : plus petite teneur en substance sources de variation qui peuvent jouer sur la dispersion des
pouvant être détectée, identifiée et/ou quantifiée dans un mesures dans un laboratoire. Il s’appuie sur les 5M « Matière,
échantillon avec une probabilité d’erreur β. Dans le cas des Main d’œuvre, Matériel (ou Moyen), Milieu, Méthode » et s’inspire
substances pour lesquelles aucune limite autorisée n’a été de la méthodologie décrite dans le guide Eurachem pour lister les
fixée, la capacité de détection est la concentration la plus faible sources d’incertitude de mesure [6].
à laquelle une méthode peut détecter des échantillons vérita- Cette classification permet de distinguer entre les trois
blement contaminés avec une certitude statistique de 1 – β. « conditions » expérimentales d’estimation de la fidélité, déjà
Dans le cas des substances pour lesquelles une limite autorisée définies dans le paragraphe 2.2 :
est fixée, cela signifie que la capacité de détection est la
concentration à laquelle la méthode peut détecter des – condition de répétabilité : on fait en sorte qu’aucune source de
concentrations à la limite autorisée avec une certitude statis- variation autre que l’erreur aléatoire n’intervienne ;
tique de 1 – β [3]. – condition de reproductibilité : toutes les conditions changent,
car on fait appel à plusieurs laboratoires ;
– conditions intermédiaires de fidélité : au sein d’un même labo-
ratoire, on fait varier plusieurs sources, comme l’équipement, la
On peut associer la limite de détection à l’instrument de mesure date de mesure, l’opérateur.
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et plusieurs méthodes de calcul de ce critère proposent d’utiliser


Pratiquement, la fidélité est mesurée par des écarts-types et on
les coefficients du modèle d’étalonnage et leurs écarts-types pour
peut ainsi calculer :
obtenir une estimation de la LD. Un article des Techniques de
l’Ingénieur est consacré à ce calcul [P 262]. – l’écart-type de répétabilité, noté sr ;
– l’écart-type de reproductibilité, noté sR ;
Pour la limite de quantification (LQ ), il n’existe pas de véritable
– l’écart-type de fidélité intermédiaire, noté sF .
définition reconnue malgré l’intérêt que lui portent les analystes.
Ce qui explique sans doute pourquoi plusieurs dizaines de Rappelons que le calcul d’un écart-type passe toujours par une
méthodes de calcul ont été proposées à ce jour. À titre d’exemple, étape préliminaire de calcul d’une variance et que les notations et
nous avons cité les définitions de la CCα et de la CCβ proposées formules de calcul sont expliquées au paragraphe 7.2.
par la Commission européenne pour caractériser remplacer la LD
et la LQ respectivement.
Rappel : pour réaliser une validation interne, il est indispen-
La linéarité d’une méthode est souvent confondue avec la linéa- sable d’être sous condition de fidélité intermédiaire et de calcu-
rité de la fonction d’étalonnage de l’appareillage. La linéarité d’une ler un écart-type de fidélité intermédiaire (et par là même la
méthode caractérise la justesse de la méthode alors que la linéa- répétabilité).
rité instrumentale intéresse la seule réponse instrumentale. Il n’est
pas indispensable qu’une fonction de réponse soit linéaire pour
permettre une quantification correcte. De très nombreuses
méthodes utilisent efficacement des modèles d’étalonnage
beaucoup plus complexes que la droite. Installations Méthodes
et conditions d’essai et
Personnel ambiantes d’étalonnage
Pour terminer, on peut évoquer la robustesse d’une méthode.
Une définition récente la décrit comme la « sensibilité d’une
Main-d’œuvre Milieu Méthode
méthode d’analyse aux variations des conditions d’expérience qui
peut s’exprimer par une liste des échantillons, des analytes, des
conditions d’entreposage, des conditions d’environnement et/ou Fidélité
de préparation de l’échantillon pour lesquels la méthode peut être
appliquée telle quelle ou moyennant certaines modifications Moyen Matière
mineures ». Généralement, on l’évalue à l’aide d’un plan d’expé-
rience.
Équipement
Manutention
Lors du calcul de la fidélité intermédiaire, si on constate un effet et transport des objets
inter-séries élevé en comparaison de la répétabilité, on pourra d’essai et d’étalonnage
conclure au manque de robustesse mais selon nous la robustesse
appartient plutôt à l’étape développement de la méthode qu’à celle Figure 8 – Principales sources d’erreur influencant la fidélité
de la validation. d’une méthode

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Tableau 3 – Tableau d’expérience pour l’estimation de la fidélité d’une méthode HPLC


sous condition de FI

Série Étalonnage Répétition 1 Répétition 2 Répétition 3

Lundi Étalonnage 1 Z11 Z1J

Jeudi Étalonnage 2 Zij

Vendredi Étalonnage 3

Lundi suivant Étalonnage 4 ZI1 ZIJ

La procédure la plus simple, qui est généralement retenue pour 3.3 Utilisation du coefficient de variation
établir un profil d’exactitude, consiste à effectuer des répétitions
sur plusieurs jours sur le même échantillon. Les opérateurs Le coefficient de variation (CV) de la fidélité intermédiaire (ou de
peuvent avoir changé, les réactifs évolué, l’échantillon à analyser la répétabilité) est défini comme le rapport de l’écart-type à la
aussi, etc., on va ainsi pouvoir mesurer les effets de différentes moyenne, ce qui donne selon les notations choisies et décrites
sources de variation et simuler, en quelque sorte, les conditions dans le paragraphe 7 :
effectives d’analyse. En effet, lorsqu’un échantillon arrive à la porte
d’un laboratoire, sa date d’analyse n’est pas exactement prévisible, sF
ni l’opérateur qui s’en chargera, etc. CVF = 100 ×
Z
Exemple : pour estimer la fidélité d’une méthode HPLC sous Les analystes aiment bien l’utiliser pour exprimer la perfor-
condition de fidélité intermédiaire, on va sélectionner un échantillon mance d’une méthode. On peut y trouver plusieurs avantages :
homogénéisé, puis réaliser le plan d’expérience présenté tableau 3
– il permet d’additionner des sources de variation ;
comprenant 4 séries et 3 répétitions. Les notations sont celles qui
sont utilisées dans le paragraphe 7. – il est facile à calculer ;
– il permet de comparer facilement deux méthodes appliquées
sur un même échantillon sans tenir compte de la concentration.
Pour certains types d’analytes difficiles à conserver, comme les
comptages bactériens, cette solution peut être problématique. Par Malheureusement, ces avantages qu’on attribue au coefficient
exemple, si le laboratoire analyse des échantillons très instables, de variation sont souvent fallacieux :
comme des échantillons de sang non congelables, on ne peut plus – d’abord, pour une méthode donnée, le CVF dépend de la
utiliser le jour comme série. On va alors demander à plusieurs concentration, comme on le verra au paragraphe 5.8.1. Donc, si on
opérateurs de faire des répétitions sur un seul jour et si le labora- l’utilise pour comparer des méthodes, il faut s’assurer qu’elles ont
toire possède plusieurs appareils, de même modèle ou non, on va été appliquées sur des échantillons ayant des niveaux de
combiner l’opérateur et l’appareil. Dans le cas de 2 opérateurs et 2 concentrations proches ;
appareils, on peut ainsi obtenir 4 séries, comme suit : – ensuite, c’est une mesure relative qui dépend de deux
paramètres : la moyenne et l’écart-type. On peut facilement voir
que, si l’écart-type est constant lorsque la moyenne varie, le
Série 1 Appareil 1 Opérateur 1 coefficient de variation n’est pas constant ;
Série 2 Appareil 1 Opérateur 2 – enfin, il convient donc d’être très prudent vis-à-vis d’un CV car
il peut masquer des situations très différentes et, tout compte fait,
Série 3 Appareil 2 Opérateur 1
n’apporter que peu d’information.
Série 4 Appareil 2 Opérateur 2

3.2 Nombre de séries et nombre 4. Estimation de la justesse


de répétitions par série de la méthode
Une question classique qui se pose, quand il s’agit de préparer
un plan d’expérience, est de savoir quel nombre de séries et quel
nombre de répétitions il faut faire. Les justifications mathéma- 4.1 Modes d’expression de la justesse
tiques de ces choix sont assez complexes et en dehors de l’objet
de cet article. Si l’on pose :
D’une façon générale, on peut retenir que plus on augmente le – X la valeur de référence d’un échantillon (le paragraphe 4.2
nombre de séries, plus l’estimation de l’écart-type de fidélité inter- explique comment elle peut être fixée) ;
médiaire sera bonne. Un nombre idéal se situerait à 8 mais, – Z la moyenne de mesurages répétés sur ce même échantillon,
comme chaque essai a un coût et qu’il ne s’agit pas de déployer la justesse peut s’exprimer de différentes façons. Les trois para-
des efforts disproportionnés pour valider une méthode, un choix mètres présentés ici, mesurent en réalité des défauts de justesse :
raisonnable se situe entre 5 et 3 séries. Mais le minimum est de 3. – biais absolu :
Par contre, le nombre de répétitions a peu d’influence et on peut
choisir 2. B = Z −X

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– taux de recouvrement ou de récupération :

Z 
R % = 100 ×  
X  Étalon
national
– biais relatif :
Institut
de métrologie
 Z −X 
B % = 100 ×   Étalon
 X  de référence Laboratoires
d’étalonnage
Ils sont à peu près équivalents. En particulier, si la valeur du Étalon accrédités
biais absolu ou relatif est négative, cela signifie que la méthode de transfert
sous-estime la valeur de référence, par contre si elle est positive
elle la surestime. Pour le taux de recouvrement, la comparaison Étalonnage
Étalon interne
doit se faire par rapport à 100 %. Le taux de recouvrement est de travail
parlant, car il s’apparente à un facteur de correction qui mesure la
proportion de ce qu’on a effectivement mesuré par rapport à ce
Départements
qu’on aurait dû mesurer. de l’entreprise
La difficulté pour évaluer la justesse tient aux problèmes
rencontrés pour connaître la valeur de référence X. C’est même un Qualification
problème si délicat que beaucoup d’analystes pensent que c’est de l’appareillage
souvent impossible.
Pour essayer d’y voir plus clair, il est intéressant de considérer
comment la métrologie propose d’établir des valeurs de référence
en chimie. Pourquoi la métrologie ? Par définition, c’est l’ensemble Figure 9 – Conception de la traçabilité métrologique
des techniques et des savoir-faire qui permettent d’effectuer des à partir des unités SI
mesures et d’avoir une confiance suffisante dans leurs résultats.
comme l’explique la norme ISO 17043 [7]. La matrice utilisée est
souvent bien adaptée. Ils sont meilleur marché, leur incertitude est
4.2 Traçabilité en chimie connue ;
Pour bien appréhender l’idée de justesse sous l’angle de la 4/ Matériaux de référence internes. La valeur de référence est assi-
gnée par l’utilisateur, parfois en collaboration avec d’autres labora-
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métrologie, il faut se ramener à la définition de la traçabilité métro-


logique qui est la « propriété d’un résultat de mesure selon toires, par exemple dans le cadre d’essais d’aptitude. Ils sont bon
laquelle ce résultat peut être relié à une référence par l’intermé- marché, mais leur incertitude est mal établie et leur traçabilité
diaire d’une chaîne ininterrompue et documentée d’étalonnages faible ;
dont chacun contribue à l’incertitude de mesure (VIM 2.41) ». 5/ Solutions étalons de vérification. Elles sont préparées indépen-
La figure 9 illustre la mise en œuvre pratique de la traçabilité damment des solutions d’étalonnage. Elles ne permettent pas de
métrologique, à partir des unités du système international (SI) détecter des effets de matrice. Elles sont indépendantes de la
gérées au niveau international jusqu’aux départements d’une méthode d’analyse contrairement aux MR et permettent de mettre
entreprise chargés de la réalisation des mesures. Chaque étape se en évidence un effet de matrice. Elles sont bon marché ;
fait sous assurance qualité pour établir cette chaîne ininterrompue 6/ Méthode des ajouts dosés. Un échantillon est analysé avec un
de comparaisons évoquée dans la définition. ou plusieurs ajouts de matière connus. Bien que cette méthode
soit très critiquée, elle représente un substitut réaliste de la
Étant donné le grand nombre d’unités internationales reconnues matrice. Elle ne permet pas de vérifier toutes les sources d’erreur,
par le Bureau international des poids et mesures (BIPM), il existe la traçabilité est très médiocre et l’incertitude doit être calculée à
plus d’une dizaine de comités consultatifs spécialisés pour chaque chaque fois ;
type de mesure (voir le site du BIPM http://www.bipm.org). En ce
qui concerne la chimie, c’est le Comité consultatif pour la quantité 7/ Matrices artificielles. Elles peuvent être considérées comme des
de matière (CCQM) qui en a la charge. substituts de meilleure qualité que la méthode des ajouts dosés.
Elles supposent souvent une connaissance exhaustive des
Aujourd’hui, les principales activités du CCQM concernent les constituants de la matrice, comme dans le cas des excipients
méthodes primaires de mesure de la quantité de matière. En effet, utilisés pour les médicaments ou les produits industriels dont on
pour la plupart des méthodes physiques de mesure, il existe des peut faire des fabrications spéciales. Elles sont bon marché.
étalons de référence non matériels, comme le mètre ou la
seconde. Mais, la traçabilité des mesures en chimie analytique est Ainsi, la prise de conscience du problème de la traçabilité en
plus délicate, ce qui a conduit les métrologues à proposer diffé- chimie a conduit à développer toute une panoplie de solutions
rentes stratégies spécifiques : intéressantes souvent mal connues. Elles se révéleront très utiles
1/ Méthodes primaires d’analyse. Ce sont des méthodes qui pour la mise en œuvre du profil d’exactitude.
permettent de tracer les mesurages au mieux. Elles requièrent des
moyens techniques très lourds et onéreux, tels des spectromètres
de masse à haute résolution associés à la dilution isotopique ; 4.3 Spécificité et interférences
2/ Matériaux de référence certifiés (MRC). C’est la solution la
mieux connue et la plus simple. Ils sont vendus accompagnés En chimie analytique, la cause principale d’un manque de spéci-
d’une valeur de référence établie par un organisme spécialisé. ficité est la présence d’interférences. Les interférences sont une
Malheureusement, il n’en existe pas toujours pour le niveau de des grandes causes d’erreur de justesse. Lorsqu’il s’agit de la
concentration voulu ou la matrice utilisée. Enfin, leur prix élevé spécificité et des interférences, on a à faire avec des erreurs systé-
interdit un usage fréquent ; matiques qui sont directement liées à la méthode. La littérature
3/ Matériaux de référence externes (MRE). La valeur assignée est traite en abondance les divers mécanismes chimiques, physiques,
établie suite à un essai d’aptitude par l’organisateur du circuit, physico-chimiques ou biologiques qui sont à la source d’inter-

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– combinaison des effets :


Effet additif Z = b0 + b1X
Ainsi, le coefficient b1 peut être assimilé à l’inverse d’un taux de
Concentration retrouvée Z

recouvrement moyen, tel que défini plus haut. Lorsqu’on ne peut


Linéarité
pas évaluer l’influence individuelle des constituants de la matrice,
100 « de la justesse »
la méthode des ajouts dosés représente une technique globale et
commode de mise en évidence des interférences.

Effet
multiplicatif
5. Méthode du profil
d’exactitude
Les bases théoriques du profil d’exactitude et les raisons de son
introduction ont été décrites dans le paragraphe 1.3. D’un point de
0 100 vue pratique, c’est la combinaison, sous la forme d’un graphique,
Concentration de référence X de plusieurs intervalles de tolérance (β-IT) calculés à partir de
mesures réalisées sur des échantillons à différents niveaux de
Figure 10 – Interférences à effet additif ou multiplicatif concentration et d’un intervalle d’acceptabilité. Cette méthode a
fait l’objet de nombreuses publications dont certaines sont indi-
quées dans les sources bibliographiques. Une normalisation
férences spécifiquement liées à un type de méthode. La liste complète de cette méthodologie a été réalisée, d’une part, par la
suivante est un essai de classification non exhaustif : Société des sciences et techniques pharmaceutiques (SFSTP) [8],
– interférences spectrales dans les méthodes spectroscopiques ; d’autre part par l’Afnor [9]. Divers projets de normes ISO en cours
– interférences dues au mode de préparation de l’échantillon, de rédaction la reprennent.
pertes à la minéralisation ou pollution par les réactifs ; Cette méthodologie s’appuie sur deux concepts complémen-
– réactions croisées très classiques dans les méthodes taires :
immunologiques ;
– la limite d’acceptabilité qui sert à chiffrer les objectifs de la
– recouvrement de pics en chromatographie...
méthode. C’est le seuil de performance globale fixé par l’utilisateur
Nombre d’interférences sont aussi dues à la présence d’autres du résultat. La plupart du temps, elle s’exprime comme un pour-
constituants que celui qui est recherché dans l’échantillon : on centage autour de la valeur de référence, par exemple ± 10 % ;
parle alors d’effets de matrice. – l’intervalle de tolérance (β-IT) qui délimite un intervalle dans
Pratiquement, les interférences ont deux conséquences lequel se trouvera une proportion moyenne β % de futures
néfastes : mesures.
– soit, elles entraînent une surestimation de la concentration de Elle peut se résumer par les 10 étapes suivantes.
l’échantillon, car la réponse est plus élevée que ce qu’elle devrait
être ;
– soit, elles causent une sous-estimation de la concentration, car Les 10 étapes pour valider une méthode avec le profil
le signal est partiellement masqué. d’exactitude
Dans les deux cas, elles occasionnent donc un biais de justesse. 1. Disposer du mode opératoire et définir le mesurande ;
On peut proposer de représenter graphiquement l’effet du 2. Définir le domaine de validation (gamme de
manque de spécificité en considérant la droite de justesse. La concentrations) et l’objectif attendu de la méthode sous la
figure 10 illustre cette droite de justesse selon trois situations forme d’un intervalle d’acceptabilité ;
hypothétiques : 3. Sélectionner des échantillons de validation dont les
– les cercles pleins produisent une droite confondue avec la valeurs de référence sont connues ;
première bissectrice ; la spécificité est parfaite ; 4. Choisir un plan d’expérience de validation ;
– les carrés illustrent un décalage systématique des
5. Pour les méthodes indirectes, choisir du plan d’expérience
concentrations retrouvées ; on parle d’effet additif ;
d’étalonnage ;
– les losanges illustrent une autre situation dans laquelle le biais
est proportionnel à la concentration ; on parle d’effet multiplicatif. 6. Collecter les données ;
En conservant nos notations, à savoir X la valeur de référence et 7. Pour les méthodes indirectes, calculer les concentrations
Z la concentration retrouvée par étalonnage inverse, ces trois retrouvées par étalonnage inverse ;
droites correspondent aux équations suivantes : 8. Calculer les critères de validation à partir des
– absence d’effet : concentrations retrouvées : principalement les écarts-types de
fidélité de fidélité intermédiaire et des biais de justesse ;
Z =X
9. Calculer les intervalles de tolérance et construire le profil
– effet multiplicatif : d’exactitude ;
Z = b1X 10. Interpréter les résultats et décider si la méthode est valide
ou non.
– effet additif :
Z = b0 + X
Les étapes 5 et 7 sont optionnelles dans le cas des méthodes qui
Mais, on peut aussi supposer qu’il existe des situations où ces fournissent directement la concentration retrouvée sans étalon-
effets se combinent : nage, comme la détermination de l’azote de Kjeldahl.

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VALIDATION DES MÉTHODES D’ANALYSE QUANTITATIVES AU MOYEN DU PROFIL D’EXACTITUDE __________________________________________________

5.1 Disposer du mode opératoire – les méthodes pour lesquelles il existe une méthode de
référence ;
et définir le mesurande – les méthodes pour lesquelles des essais d’aptitude sont orga-
nisés et des MRE disponibles ;
Ce point sert à rappeler qu’une validation ne doit se faire que
– les autres méthodes pour lesquelles aucune des solutions
pour une méthode complètement mise au point. Essayer de
précédentes n’est disponible.
valider une méthode en même temps qu’on procède à sa mise au
point, débouche la plupart du temps sur un échec et, pour le
moins, sur une perte de temps et d’argent. Toujours poursuivant notre exemple, on a en fait, combiné les
propositions 3 et 4, car il n’existe ni MRC, ni essai d’aptitude spécia-
De même, il est important de bien définir la quantité mesurée lement dédié au sucralose. Mais, le sucralose est disponible sous la
(mesurande). Tout comme la procédure qui sert à estimer l’incerti- forme d’un réactif commercial de pureté connue (95 %) et peut ainsi
tude d’une mesure, c’est un point de départ obligé [6]. servir, d’une part pour des solutions d’étalonnage, d’autre part à des
ajouts dosés. Ensuite, il existe des essais d’aptitude sur des aliments
Exemple : à titre d’exemple et comme support de calcul, nous uti- et on peut disposer de matériaux dont l’homogénéité a été vérifiée.
liserons les résultats d’une étude de validation qui a porté sur une Finalement, un échantillon de jus de fruit a été sélectionné qui ne
méthode de quantification d’un édulcorant – le sucralose ou contenait pas de sucralose et qui était disponible en quantité suffi-
trichlorogalactosaccharose – dans les aliments par couplage chroma- sante pour faire tous les essais. Pour faire varier la valeur de réfé-
tographie haute performance avec une colonne échangeuse d’anions rence, on a décidé d’utiliser la méthode des ajouts dosés.
et un détecteur ampérométrique à alimentation pulsée (HPAE-PAD).
Le sucralose a un pouvoir sucrant 500 à 600 fois plus élevé que le
saccharose (à poids égal), soit 2 fois plus que la saccharine et 3 fois 5.4 Plan d’expérience de validation
plus que l’aspartame. Comme il n’apporte que peu de calories, il est
très apprécié dans les industries agroalimentaires pour la formulation La contrainte primordiale est de se situer en condition de fidélité
d’aliments allégés. intermédiaire et de réaliser les séries de mesures de façon à tenir
Le mode opératoire employé a été adapté de la référence [10], en compte des diverses sources d’incertitude. Dans ce cas, le plus
fonction des équipements disponibles au laboratoire et ne fera pas simple est de faire les essais sur plusieurs jours ce qui permet de
l’objet d’une description détaillée. mettre en jeu un grand nombre de sources de variation : évolution
des échantillons ; changements d’opérateurs ; changements
La méthode de quantification se fait par un étalonnage externe à d’étalonnages ; évolution des réactifs ; modification des réglages
l’aide de solutions étalons de sucralose commercial. La réponse instrumentaux, etc. La série est donc équivalente au jour, dans cet
instrumentale est la surface des pics chromatographiques. exemple.
Se posent alors trois questions :
5.2 Définir les objectifs – sur combien de jours (séries) I faut-il faire les mesures ?
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– combien de répétitions J faut-il faire par niveau et par jour ?


– combien de niveaux de concentration K faut-il choisir ?
Reprenons notre exemple. Le but de cette validation est de vérifier
si la méthode HPLC (HPAE-PAD) est acceptable comme méthode de Exemple : les réponses aux deux premières questions ont déjà été
contrôle. Aujourd’hui, la législation autorise la supplémentation de présentées dans le paragraphe 3.2. Mais, la réponse ne peut pas être
nombreuses catégories d’aliments en sucralose entre 0,5 mg/kg (ou strictement statistique, il faut aussi prendre en compte les aspects
mg/L) et 500 mg/kg. A priori, il n’existe pas de référence réglemen- pratiques et économiques. Travailler sur 8 jours veut dire disposer
taire pour fixer une limite d’acceptabilité. Mais en se référant, d’une d’un échantillon stable sur au moins 15 jours, en tenant compte des
part, aux besoins des industriels, d’autre part, aux performances jours ouvrés. Dans le cas traité, une semaine semble être un
d’autres méthodes de dosage, les limites d’acceptabilité peuvent être maximum et il est déjà nécessaire de congeler l’échantillon après
fixées à λ = ± 10 %. chaque jour. Finalement, on a choisi I = 4 jours.
Par ailleurs, un domaine de validation relativement étroit entre En ce qui concerne le nombre de répétitions, là encore les aspects
0,035 et 1 mg/kg a été fixé, afin d’explorer la zone située près de la expérimentaux interviennent. Compte tenu de la durée de préparation
limite de quantification, sachant que le mode opératoire prévoit de de l’échantillon et d’élution après injection, il n’était pas possible de
petites prises d’essai de 2 g ou 2 mL pour simplifier la préparation et faire plus de 20 mesurages par jour. Comme il faut étudier plusieurs
une dilution pour les échantillons trop concentrés. niveaux à la fois, on a décidé de faire J = 3 répétitions/jour/niveau.
En ce qui concerne la proportion β, il a été décidé de prendre 80 % Enfin, le plan d’expérience de validation doit comporter au moins 3
ce qui veut dire qu’un contrôle de qualité sur cinq – vérifié avec une niveaux de concentration (k  3) répartis sur le domaine de valida-
carte de contrôle – pourra être hors des limites de l’intervalle de tolé- tion afin de vérifier si la justesse est bien linéaire, c’est-à-dire si le
rance. En référence à ce qu’exige la FDA pour les médicaments biais ne dépend pas de la concentration.
(66 %), cette contrainte est plus sévère.
Compte tenu des diverses contraintes expliquées plus haut, finale-
Pratiquement, cela veut dire que, pour un aliment supplémenté à ment on a choisi K = 5, avec les niveaux suivants : 0,035 ; 0,125 ;
1 mg/kg, l’analyste pourra garantir qu’au moins 80 % des résultats se 0,250 ; 0,500 et 1,000 mg/L. Ces « niveaux » sont notés respective-
situeront entre 0,9 et 1,1 mg/kg. On verra que, dans cet exemple, les ment A, B, C, D et E.
performances sont en fait bien meilleures.
Ce dernier choix est un peu arbitraire mais, si un objectif
complémentaire est d’estimer au mieux la limite de quantification LQ,
comme on l’expliquera dans le paragraphe 6.3, on a intérêt à
5.3 Échantillons de validation construire un plan avec au moins 4 niveaux.
et valeurs de référence En fonction des choix faits, le plan de validation retenu consiste en
4 × 3 × 5 = 60 essais. Si on connaît le coût d’un essai, il est ainsi
La sélection d’un ou plusieurs échantillons de validation dépend possible de budgétiser le coût global de la validation et le temps
de la méthode. On peut en distinguer quatre types évoqués dans qu’on va y passer. On a, en fait, 5 sous-plans, organisés comme 5
la norme ISO/CEI 17025 : études de fidélité séparées (mais non indépendantes, au sens statis-
– les méthodes pour lesquelles on dispose de MRC ; tique).

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Tableau 4 – Plan de validation. Les réponses instrumentales sont exprimées en unités arbitraires
(ua) et les concentrations de référence (mg/L)
Référence Réponse 1 Réponse 2 Réponse 3
Séries Niveaux
(mg/L) (ua) (ua) (ua)

A 0,035 22 144 21 249 20 577

B 0,125 43 865 40 282 41 850

Jour 1 C 0,25 67 825 68 273 67 377

D 0,5 124 925 123 134 120 447

E 1 224 795 226 139 229 721

A 0,035 22 432 20 227 19 786

B 0,125 37 209 41 179 39 856

Jour 2 C 0,25 66 322 66 101 67 866

D 0,5 120 357 120 136 117 710

E 1 227 324 222 913 227 324

A 0,035 18 563 16 379 16 598

B 0,125 37 127 36 691 39 311

Jour 3 C 0,25 66 393 61 588 64 864

D 0,5 115 751 117 499 116 407

E 1 228 228 228 664 223 860

A 0,035 16 726 15 833 19 183

B 0,125 37 719 39 729 40 623


Jour 4
C 0,25 68 316 69 433 67 646

D 0,5 128 839 121 693 124 149

À ce stade préparatoire, l’utilisation d’un tableur est tout à fait Les paramètres J′ et K′ peuvent être différents de ceux utilisés
commode. On peut alors faire des calculs complémentaires, pour le plan de validation ; ce qui n’est pas le cas pour le nombre
comme prévoir la quantité d’échantillons nécessaire, définir un de séries. En effet, il faut réaliser un étalonnage pour chaque série
calendrier et un planning des travaux entre opérateurs, etc. (jour) et l’utiliser pour quantifier les échantillons de validation. Le
but est de prendre en compte la variabilité de la réponse instru-
Exemple : dans le tableau 4, le plan d’expérience est présenté mentale d’une série à l’autre et de vérifier sur plusieurs jours si la
comme 4 ensembles de mesures. Les 4 séries sont notées en méthode est capable de quantifier de façon constante le même
utilisant les codes : Jour 1, Jour 2, Jour 3 et Jour 4 ; et pour les échantillon.
niveaux de concentration : A, B, C, D et E. Seules les réponses instru-
mentales sont reportées correspondant aux 3 répétitions. Les unités
arbitraires utilisées pour les surfaces de pics sont celles fournies par Dans l’exemple, lors du développement de la méthode, on a pu
le logiciel d’intégration du chromatographe. vérifier que le modèle d’étalonnage était bien une droite ; il est donc
inutile de multiplier les points de la gamme d’étalonnage. Pour se
situer dans les conditions les plus proches possible de celles qui
5.5 Plan d’expérience d’étalonnage seront utilisées en routine, à savoir un étalonnage basé sur 2 solu-
tions étalons de concentration différentes répétées 2 fois, on a choisi
Pour bien des méthodes d’analyse, le plan d’étalonnage est J′ = 2 et K′ = 2. Bien sûr, si on a observé une courbure ou si on
optionnel car il n’est utile que si la méthode est indirecte et utilise un modèle d’étalonnage plus compliqué qu’une droite, il faut
requiert un étalonnage externe ; ce qui est le cas dans l’exemple augmenter le nombre de niveaux K′.
présenté.
Finalement, on a réalisé 4 × 2 × 2 = 16 essais d’étalonnage. Le
Le plan d’étalonnage dépend aussi de trois paramètres : tableau 5 illustre la disposition qu’on peut adopter pour une feuille de
– I le nombre de séries (qui est le même que pour le plan de calcul. Les deux niveaux étalons sont codés « Bas » et « Haut ».
validation) ; Dans ce cas, ils valent 0,02 et 1,5 mg/L et représentent les deux solu-
– J′ le nombre de répétitions ; tions étalons préparées chaque jour, à partir d’une même solu-
– K′ le nombre de solutions étalons de concentrations tion-mère de sucralose à 10 g/L, elle-même préparée chaque jour par
différentes. pesée.

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Le coefficient a0 représente le blanc et a1 la pente ou la sensibi-


Tableau 5 – Plan d'étalonnage. lité. Ces coefficients sont faciles à calculer avec un tableur.
Réponses instrumentales en unités arbitraires
Par exemple, sous Excel, les fonctions ORDONNÉE. ORIGINE et
Concentration Réponse
Séries Niveaux PENTE permettent d’obtenir ces coefficients comme l’illustre la
(mg/L) (ua)
figure 11 dans le cadre de notre exemple. Par convention les deux
formules de calcul sont en caractères gras.
Bas 0,02 15 849
Comme le montre cette figure, un modèle est calculé chaque jour.
On obtient finalement :
Bas 0,02 16 348
Jour 1 Sensibilité Blanc
Haut 1,5 351 436 Jour 1 ........... 223923,311...... 11620,034
Jour 2 ........... 220550,338...... 11625,493
Haut 1,5 343 574 Jour 3 ........... 218400,338...... 10482,493
Jour 4 ........... 223333,446...... 10695,831
Bas 0,02 15 600
Les variations observées de la sensibilité et du blanc – elles
peuvent aller jusqu’à 10 % – illustrent la variabilité des performances
Bas 0,02 16 473
d’étalonnage et font partie de l’incertitude de la mesure. Elles
Jour 2 confirment aussi la nécessité de conduire les essais sous condition
Haut 1,5 343 574 de fidélité intermédiaire.

Haut 1,5 341 328


Ensuite, il faut calculer de la concentration retrouvée Z pour
chaque essai de validation en utilisant le modèle inverse, à savoir :
Bas 0,02 14 601

Bas 0,02 15 100 Y − a0


Z =
Jour 3 a1
Haut 1,5 337 958

Haut 1,5 338 208 Exemple : on utilise les réponses du tableau 4, en veillant à bien
utiliser les coefficients correspondant au jour où les mesures ont été
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Bas 0,02 14 476 faites. Cela permet de construire le tableau 6.

Bas 0,02 15 849 Si la méthode ne nécessitait pas d’étalonnage, on construirait


Jour 4 directement le tableau 6.
Haut 1,5 341 952
Il est tout à fait possible d’utiliser des modèles d’étalonnage qui
Haut 1,5 349 440 ne sont pas des droites, comme un polynôme du second degré ou
une fonction logistique. Ce dernier cas est présenté dans un article
des Techniques de l’Ingénieur [SL 270].
5.6 Collecter les données
Une fois ces plans établis et les feuilles de calcul préparées, la 5.8 Critères de validation et intervalles
partie expérimentale peut commencer. Les ajouts dosés sont de tolérance
préparés chaque jour, de même que les solutions étalons afin
d’intégrer l’incertitude due à ces opérations. Une fois les mesu-
rages effectués pour les deux types de plan, on peut compléter les 5.8.1 Fidélité par niveau
colonnes « Réponse » du tableau 4 et du tableau 5.
Avec certaines molécules difficilement solubles, il peut arriver Les calculs qui vont servir à construire le profil d’exactitude sont
que les ajouts dosés soient faits sous une forme solide, par pesée. effectués sur les données du tableau 6, niveau par niveau. Le
Il est alors difficile d’atteindre exactement le niveau voulu. On détail des formules et les symboles utilisés sont décrits dans le
pourra alors réaligner les concentrations de référence afin de tenir paragraphe 7.2, ainsi qu’un exemple de calcul sous Excel qui porte
compte de petits décalages, comme l’illustre l’exemple du sur les données du niveau B.
paragraphe 6.1.

Exemple : le tableau 7 rassemble les résultats pour les cinq


5.7 Prédire les concentrations niveaux. Pour faciliter une éventuelle vérification des calculs par le
lecteur, tous les chiffres fournis par le tableur sont conservés.
par étalonnage inverse
Ce tableau fournit déjà beaucoup de renseignements sur les perfor-
Il s’agit de transformer les réponses instrumentales mesurées en mances de la méthode. Par exemple, pour le niveau A qui se situe
concentrations. Si on appelle Y la réponse instrumentale et X la près de la LQ, l’écart-type inter-séries est grand comparé à celui de
concentration connue de l’étalon, la première étape est de calculer répétabilité, ce qui pousse à supposer que la méthode n’est pas très
le modèle d’étalonnage qui relie Y et X. Dans cet exemple, on sait robuste aux faibles concentrations. De même, le coefficient de varia-
qu’il est du type : tion de la fidélité intermédiaire est très élevé, près de 25 %, mais
passe rapidement à 2 ou 3 % dès qu’on atteint des concentrations
Y = a0 + a1X + E classiquement rencontrées dans des échantillons de routine.

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A B C D E F G H I
1
Profil d’exactitude du sucralose dans le lait
2 Plan d’étalonnage. Réponses instrumentales en UA
3
4 Série Niveau Concentration Réponse Sensibilité Blanc
5 Jour 1 Bas 0.02 15849 Jour 1 223923.311 11620.034
6 Jour 1 Bas 0.02 16348 en G6 =PENTE(D5:D8;C5:C8)
7 Jour 1 Haut 1.5 351436 en H6 =ORDONNEE.ORIGINE(D5:D8;C5:C8)
8 Jour 1 Haut 1.5 343574
9 Jour 2 Bas 0.02 15600 Jour 2 220550.338 11625.493
10 Jour 2 Bas 0.02 16473
11 Jour 2 Haut 1.5 343574
12 Jour 2 Haut 1.5 341328
13 Jour 3 Bas 0.02 14601 Jour 3 218400.338 10482.493
14 Jour 3 Bas 0.02 15100
15 Jour 3 Haut 1.5 337958
16 Jour 3 Haut 1.5 338208
17 Jour 4 Bas 0.02 14476 Jour 4 223333.446 10695.831
18 Jour 4 Bas 0.02 15849
19 Jour 4 Haut 1.5 341952
20 Jour 4 Haut 1.5 349440
21

Figure 11 – Exemple de feuille de calcul permettant de calculer la sensibilité et le blanc

Tableau 6 – Plan de validation. Concentrations retrouvées par étalonnage inverse


(mg/L)
Référence Résultat 1 Résultat 2 Résultat 3
Séries Niveaux
(mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L)

A 0,035 0,047 0,043 0,040

B 0,125 0,144 0,128 0,135

Jour 1 C 0,250 0,251 0,253 0,249

D 0,500 0,506 0,498 0,486

E 1,000 0,952 0,958 0,974

A 0,035 0,049 0,039 0,037

B 0,125 0,116 0,134 0,128

Jour 2 C 0,250 0,248 0,247 0,255

D 0,500 0,493 0,492 0,481

E 1,000 0,978 0,958 0,978

A 0,035 0,037 0,027 0,028

B 0,125 0,122 0,120 0,132

Jour 3 C 0,250 0,256 0,234 0,249

D 0,500 0,482 0,490 0,485

E 1,000 0,997 0,999 0,977

A 0,035 0,027 0,023 0,038

B 0,125 0,121 0,130 0,134

Jour 4 C 0,250 0,258 0,263 0,255

D 0,500 0,529 0,497 0,508

E 1,000 0,972 1,012 0,997

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Tableau 7 – Récapitulatif des critères de fidélité pour les cinq niveaux


de concentration
Niveaux A B C D E
Valeur de référence 0,035 0,125 0,25 0,5 1
Nombre de séries (I) 4 4 4 4 4
Nombre de mesures (IJ) 12 12 12 12 12
Nombre de répétitions (J) 3 3 3 3 3
SCEr 0,00028867 0,000468 0,00033133 0,00085267 0,001638
SCEt 0,00076425 0,00068467 0,000573 0,00203892 0,00382667
SCEL 0,00047558 0,00021667 0,00024167 0,00118625 0,00218867

Variance de répétabilité (sr2 ) 3,6083 × 10–5 0,0000585 4,1417 × 10–5 0,00010658 0,00020475

Variance inter-séries (sB2 ) 4,0815 × 10–5 4,5741 × 10–6 1,3046 × 10–5 9,6278 × 10–5 0,00017494
Variance de fidélité
7,6898 × 10–5 6,3074 × 10–5 5,4463 × 10–5
intermédiaire sF2 ( ) 0,00020286 0,00037969

Moyenne retrouvée Z 0,0363 0,1287 0,2515 0,4956 0,9793


Écart-type de répétabilité (sr) 0,006007 0,007649 0,006436 0,010324 0,014309
Écart-type inter-séries (sB) 0,006389 0,002139 0,003612 0,009812 0,013226
Écart-type de fidélité
0,008769 0,007942 0,007380 0,014243 0,019486
intermédiaire (sF)
Coefficient de variation
16,6 % 5,9 % 2,6 % 2,1 % 1,5 %
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de la répétabilité CVr
Coefficient de variation
24,2 % 6,2 % 2,9 % 2,9 % 2,0 %
de la fidélité intermédiaire CVF

Même pour gamme de concentrations aussi faible, on Tableau 8 – Calcul du taux de recouvrement
constate un fait important et universel : l’écart-type de fidélité
dépend largement de la concentration ; il augmente avec elle et Niveaux A B C D E
doit toujours être relié à la concentration où il a été estimé.
Valeur
0,035 0,125 0,25 0,5 1
de référence
Mais, pour l’instant nous ne porterons pas de jugement sur les
valeurs individuelles trouvées pour chaque critère, étant donné que, Moyenne
0,036 0,128 0,25 0,49 0,98
par principe, le profil d’exactitude va combiner la fidélité et la jus- retrouvée
tesse et permettre un diagnostic global qui interviendra plus loin.
Taux
104 % 103 % 101 % 99 % 98 %
de recouvrement
5.8.2 Justesse par niveau
La justesse peut être alors calculée à partir des données du
tableau 6, sous diverses formes, comme un biais moyen absolu ou Exemple : le tableau 9 présente un récapitulatif des critères
relatif. Nous préférons l’évaluer à l’aide du taux de récupération d’exactitude pour les 5 niveaux de concentration. La probabilité β
(ou recouvrement) moyen R %, dans la mesure où les valeurs de associée à l’intervalle de tolérance est de 80 % et les limites d'accep-
référence sont obtenues par ajouts dosés. R % s’obtient en faisant tabilité sont de ± 10 %, comme décidé auparavant.
le rapport entre la moyenne des concentrations retrouvées et la On peut interpréter ces valeurs de la façon suivante. Par exemple au
valeur de référence (tableau 8) : niveau A, pour une concentration de référence égale à 0,035 mg/L,
80 % des futures mesures se situeront entre 0,0225 et 0,05 mg/L ; cet
Z intervalle est dissymétrique car la méthode présente un léger biais de
R % = 100 ×   justesse de 4 %. Si on passe en valeurs relatives, obtenues en divisant
 X 
les valeurs absolues par la concentration de référence correspondante,
on obtient 64 % et 143 %. Or, les limites d’acceptabilité sont entre
90 % et 110 %. La méthode n’est donc pas capable de produire au
5.8.3 Intervalle de tolérance par niveau moins 80 % de futures mesures entre les limites d’acceptabilité à ce
Les détails du calcul des intervalles de tolérance sont fournis niveau de concentration : elle n’est donc pas validée aux basses
dans le paragraphe 7.3, ainsi qu’un exemple de calcul sous Excel concentrations. Par contre, elle est valide pour les niveaux C, D et E.
qui porte sur les données du niveau B. Les valeurs qui indiquent un dépassement sont en italique.

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Tableau 9 – Récapitulatif des critères d’exactitude pour les cinq niveaux


de concentration
Niveaux A B C D E
Valeur de référence 0,035 0,125 0,25 0,5 1
Écart-type de l’intervalle de tolérance (sIT ) 0,0095 0,0083 0,0078 0,0154 0,0210
Valeurs absolues
Moyenne retrouvée 0,0363 0,1287 0,2515 0,4956 0,9793
Limite de tolérance basse 80 % 0,0225 0,1173 0,2407 0,4736 0,9494
Limite de tolérance haute 80 % 0,0500 0,1400 0,2623 0,5175 1,0093
Limite d'acceptabilité basse 0,032 0,113 0,225 0,450 0,900
Limite d'acceptabilité haute 0,040 0,142 0,277 0,545 1,077
Valeurs relatives à la référence
Taux de recouvrement .............................................................. (%) 104 103 101 99 98
Limite de tolérance basse ......................................................... (%) 64 94 96 95 95
Limite de tolérance haute ......................................................... (%) 143 112 105 104 101
Limite d'acceptabilité basse...................................................... (%) 90 90 90 90 90
Limite d'acceptabilité haute...................................................... (%) 110 110 110 110 110
Concentration retrouvée (mg/L)

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
Concentration de référence (mg/L)

Moyenne retrouvée Limite de tolérance basse Limite de tolérance haute


Limite d'acceptabilité basse Limite d'acceptabilité haute

Figure 12 – Profil d’exactitude du sucralose représenté à partir des valeurs absolues

5.9 Construire le profil d’exactitude


Deux illustrations graphiques sont alors possibles. La première Dans l’exemple du sucralose, on débouche sur la figure 12. Mais,
(en valeurs absolues) consiste à utiliser en abscisse la valeur de ce graphique est difficile à interpréter car les différentes lignes sont
référence, et en ordonnée la moyenne retrouvée, les limites du β-IT presque confondues, en particulier pour les concentrations proches
et d’acceptabilité exprimées en valeurs absolues. de la LQ qui nous intéressent.

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150

140

130
La flèche indique la position approximative de la
120 limite de quantification telle que définie dans le texte.
Son calcul précis est décrit dans le paragraphe 6.3.
Exactitude (%)

110

100
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
90
Concentration de référence (mg/L)
80

70

60

Taux de recouvrement (%) Limite d’acceptabilité basse (%)


Limite basse tolérance (%) Limite d’acceptabilité haute (%)
Limite haute tolérance (%)

Figure 13 – Profil d’exactitude de la méthode de dosage du sucralose représenté à partir des valeurs relatives
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L’autre mode de représentation consiste à exprimer tous les


résultats en valeurs relatives, ramenées à la valeur de référence du 6. Exemples d’interprétation
niveau. Les limites d’acceptabilité sont aussi exprimées de façon
relative et se situent entre 90 et 110 %.
et compléments
Ce deuxième mode de représentation est beaucoup plus lisible
et facile à interpréter. À partir de quelques cas concrets, il est possible de comprendre
la flexibilité d’application du profil d’exactitude, quelles que soient
Exemple : dans l’exemple du sucralose, on obtient le profil de la les procédures analytiques à valider.
figure 13.

6.1 Ajouts dosés par pesée :


5.10 Interpréter les résultats réalignement des niveaux
L’interprétation d’un profil d’exactitude, comme celui de la
figure 13 est simple : aussi longtemps que les limites de l’inter- Il arrive que l’analyte étudié ne soit pas facile à mettre en solu-
valle de tolérance (β-IT) sont comprises entre les limites d’accepta- tion. Cela pose un problème si on a décidé d’utiliser la méthode
bilité, la méthode est décrétée valide. des ajouts dosés pour établir les concentrations de référence car
d’un ajout à l’autre les pesées risquent d’être différentes. Pour
compenser ces biais systématiques, on peut procéder à un réali-
Exemple : dans le cas du sucralose dans le lait, on voit que la limite gnement des concentrations d’ajout.
supérieure du β-IT coupe la limite supérieure d’acceptabilité aux alen-
tours de 0,15 mg/L. Cette concentration est identifiée par une flèche. Si on note Xi(k) , l’ajout de la série i pour le niveau k, on peut
– en dessous de 0,15 mg/L, l’analyste ne peut pas garantir que la ∑i X i (k )
méthode sera capable, en routine, de produire, en moyenne, au calculer une moyenne pour le niveau k, notée X (k ) = . Cette
I
moins 80 % de résultats acceptables, c’est-à-dire situés à ± 10 % de moyenne des valeurs de référence des échantillons de validation
la valeur vraie d’un échantillon ; va servir de valeur de référence globale du niveau. Il faut ensuite
– au-dessus de 0,15 mg/L, les performances de la méthode devien- corriger chaque réponse instrumentale Yij(k) , mesurée sur un
nent acceptables. À partir de 0,2 mg/L, elle produit sans doute plus échantillon de validation par une simple règle de trois :
de 99 % de mesures acceptables.
En conclusion, pour cette étude, le domaine de validité est X (k )
compris entre 0,15 et 1 mg/L. Yij*(k ) = Yij (k )
X ij (k )
Par ailleurs, on peut faire un certain nombre de diagnostics
complémentaires sur le biais de la méthode et plus de détails sur Cette formule n’est valable que si l’étalonnage correspond à un
la façon d’interpréter un profil d’exactitude sont disponibles à la modèle linéaire. Une solution plus générale pour d’autres modèles
référence [11]. est présentée dans la référence [8] (Partie II).

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6.2 Effets de matrice : valider Exemple


un facteur de correction Avec les données de l’acide nicotinique, l’équation de la droite
vaut : Z = 0,02 + 0,52 X. Cette pente de 0,52 peut s’interpréter
Comme on l’a vu au paragraphe 4.3, s’il existe des effets de comme un taux de récupération moyen de 52 %, quel que soit le
matrice importants, ils peuvent produire un biais de justesse qui niveau de concentration. On peut alors proposer de corriger chaque
empêchera la validation de la méthode. Une pratique courante mesure par un facteur de correction FC = 1/0,52 ≈ 2. Ça revient à dire
dans différents secteurs de la mesure, consiste à corriger les qu’il faut multiplier par 2 chaque mesure fournie par cette méthode.
résultats pour en améliorer la justesse. Il est donc tout à fait
Reste à savoir jusqu’à quelle valeur peut-on accepter un facteur
possible de procéder de la même façon pour s’affranchir d’un effet
de correction ? Par exemple, pourrait-on proposer de multiplier un
de matrice gênant : on applique alors au résultat un facteur de
résultat par 10 parce que le taux de récupération n’est que de
correction.
10 % ? Pour répondre à cette question, il faut calculer l’incertitude
Bien sûr, il faut : car un facteur de correction élevé augmente rapidement l’incerti-
tude de façon critique.
– valider ce facteur de correction ;
– l’inscrire clairement dans le mode opératoire et toujours
utiliser le même pour un type de matrice donné ;
6.3 Limite de quantification (LQ)
– informer le client que le résultat est corrigé.
On a vu sur la figure 13 qu’il existe une concentration en
Exemple dessous de laquelle au moins une des bornes de l’intervalle de
tolérance sort des limites d’acceptabilité. Au-dessus de cette
La figure 14 illustre une étude de validation sur le dosage de
concentration, l’analyste peut garantir que la méthode quantifiera
l’acide nicotinique dans les aliments. Sur le même graphique sont
de façon acceptable les échantillons reçus. Assez naturellement,
reportées les réponses instrumentales :
on peut proposer de désigner cette limite de concentration la plus
– du plan d’étalonnage à 2 niveaux ; basse comme la limite de quantification (LQ) de la méthode. Si on
– du plan de validation à 3 niveaux et 3 répétitions par niveau sur se réfère à la figure 13 et au tableau 9 récapitulatif de l’exemple, la
des échantillons de validation dont les valeurs de référence ont été LQ se situerait entre les niveaux B et C. La LQ peut être obtenue
obtenues par des ajouts dosés. exactement si on connaît l’abscisse de ce point d’intersection entre
Sur ce graphique, on voit clairement que pour un ajout dosé de la limite de tolérance et la limite d’acceptabilité.
2 mg/L, on devrait obtenir des réponses proches de 120 ua, or les 9 Cependant, il faut faire attention car, sur la figure 13, les points
réponses observées se situent entre 55 et 75 ua. Il y a donc de forts sont reliés par des segments de droites alors qu’il faudrait utiliser
effets de matrice qui « masquent » près de 50 % de la réponse. des segments d’hyperboles du fait que ce sont des valeurs rela-
tives à la concentration de référence. Pour éviter une sous-estima-
Pour trouver le meilleur facteur de correction, on va d’abord tion de la LQ, il faut donc conduire les calculs sur les valeurs
calculer les concentrations prédites inverses Z. Puis, si on réfère au absolues telles qu’elles sont représentées sur la figure 12 et dans
paragraphe 4.3, les effets de matrices peuvent être modélisés sous les premières lignes du tableau 9.
la forme d’une droite de régression qui s’ajuste entre les Le calcul des coordonnées du point d’intersection de deux
concentrations X théoriques et les concentrations Z retrouvées. droites est un problème d’algèbre simple : il s’agit de résoudre un
Son équation est : système de 2 équations à 2 inconnues. Appliqué aux données du
Z = b0 + b1X + E tableau 9 et en prenant bien garde d’utiliser les valeurs absolues
et non pas relatives, on trouve que la LQ vaut finalement
La pente b1 est une mesure du biais : en l’absence d’effets de 0,113 mg/L. C’est donc une valeur un peu plus petite que celle de
matrice elle doit être égale à 1. 0,15 mg/L, obtenue visuellement sur la figure 13. On peut alors
dire que le domaine validé ne s’étend plus entre 0,15 et 1 mg/L
mais entre 0,11 et 1,00 mg/L.
Hauteur (UA)

6.4 Estimation de l’incertitude de mesure


300
L’estimation de l’incertitude de mesure est une obligation pour
250 les laboratoires accrédités. Or, si on se réfère aux sources d’incer-
titude classiquement identifiables en chimie et qui sont prises en
200 compte pour construire un profil d’exactitude, comme l’illustre la
figure 8 et qui a servi à introduire la notion de condition de fidélité
150 intermédiaire, il semble naturel de penser que les données
collectées pour construire le profil d’exactitude peuvent servir à
100 estimer l’incertitude. La formalisation la plus intéressante de cette
approche est fournie par la norme ISO 21748 [12].
50
Le modèle de base, sur lequel repose cette norme, s’exprime
sous la forme suivante :
0
0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
Z = µ + δ + B + ∑n =1cnHn + E
N
Concentration (mg/L)

Les lignes représentent les droites étalons, les cercles, les concentra-
tions retrouvées pour des ajouts équivalents à la valeur en abscisse. Dans lequel Z est le résultat observé, µ la valeur vraie du mesu-
Les différentes droites d’étalonnage illustrent les effets de matrice. rande, δ une expression du manque de fidélité de la méthode
(biais), β la composante qui traduit l’effet de la série – comme le
Figure 14 – Données brutes non corrigées pour l’acide nicotinique jour – et E une erreur résiduelle de répétabilité qui est supposée
dans du lait distribuée selon une loi normale.

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Tableau 10 – Incertitude élargie de la méthode de dosage du sucralose


Niveaux A B C D E
Valeur de référence 0,035 0,125 0,25 0,5 1
Écart-type de l’intervalle de tolérance sIT 0,0095 0,0083 0,0078 0,0154 0,0210
Incertitude élargie 95 % U(Z) 0,0190 0,0166 0,0156 0,0307 0,0420
Incertitude élargie relative 95 % U(Z) 54 % 13 % 6% 6% 4%

La somme ΣncnHn est la partie du modèle de mesure qui prend


en compte les légères déviations intervenues, par exemple, lors de 60
la préparation des solutions étalonnage, entre les valeurs 50
assignées et les valeurs effectivement atteintes. Cette partie

Incertitude relative 95 % (%)


40
dépend fortement de la méthode employée et ne sera pas traitée
dans cet article, ce qui revient à simplifier le modèle : 30

Z = µ +δ +B +E 20
10
En appliquant l’équation de la loi de propagation des incerti-
tudes décrite dans le GUM [2], l’expression de l’incertitude-type 0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
composée de Z est à peu près égale à : – 10
– 20 Concentration (mg/L)
uc (Z ) ≈ u 2 (δ ) + sB2 + sr2 – 30
– 40
L’intérêt de cette formulation est de retrouver un certain nombre
de résultats déjà présentés précédemment. Par exemple, la – 50
variance de fidélité intermédiaire est égale à : – 60

sF2 = sB2 + sr2


Figure 15 – Profil d’incertitude illustrant l’incertitude élargie à 95 %
de la méthode, en fonction de la concentration
Où sB2 représente la variance de l’effet série et sr2 la variance
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de répétabilité. Par ailleurs, on montre facilement que la variance


sont pas incluses les sources d’incertitude qui interviennent lors de
de δ est égale à la variance de la moyenne générale. En tenant
la fixation de valeurs de référence. Dans le cas où on utilise des
compte des notations utilisées dans le paragraphe 7.3, on trouve :
matériaux de référence ou si les valeurs de référence sont
obtenues par l’intermédiaire d’une méthode de référence, il est
 1 
u 2 (δ ) = sF2  facile d’incorporer cette incertitude. D’autres sources d’incertitude
 IJ × B 2  existent aussi, comme celles liées à l’échantillonnage.

Si on additionne ces deux variances, comme la loi de propa-


gation des incertitudes le propose, on trouve que l’incertitude
composée de Z est égale à :
7. Calculs pratiques des
 1 
uc (Z ) ≈ sF2 + sF2  = sF 1+
1
= sIT
critères de validation
 IJ × B 2  IJ × B 2

Il en résulte que l’incertitude-type composée de Z est proche de 7.1 Choix d’un outil de calcul
sIT l’écart-type de l’intervalle de tolérance, introduit au
paragraphe 7.3. Une grande partie de l’incertitude peut donc être L’exploitation des données décrite ici fait appel à des techniques
estimée directement à partir des calculs effectués lors de la statistiques qui demandent pas mal de calculs : il est évident que
construction du profil d’exactitude pour les différents niveaux de l’application numérique devient un aspect fondamental de la vali-
concentration retenus dans le plan de validation. D’un point de vue dation. Or, tous les laboratoires d’analyse disposent aujourd’hui de
pratique, on utilise l’incertitude élargie à 95 %, notée U(Z) = 2sIT . tableurs qui permettent parfaitement de réaliser ces calculs. Pour
traiter les données, on peut choisir parmi :
Exemple : à partir des données rassemblées au tableau 9, on peut
– des logiciels commerciaux : Excel® de Microsoft ; iWorks de
facilement calculer l’incertitude élargie, exprimée, soit directement,
Apple ; Lotus 1-2-3 de IBM...
soit de façon relative en la ramenant à la valeur de référence. Le
tableau 10 rassemble ces résultats qui montrent que l’incertitude – des logiciels libres de droit (freewares) : OpenOffice.org Calc
varie entre 54 et 4 %. Les valeurs très élevées à proximité de la LQ initialement développé par Sun Microsystems
illustre bien l’idée que pour les concentrations les plus basses, l’ana- (http://fr.openoffice.org/) ; LibreOffice édité par The Document
lyste ne peut plus vraiment garantir l’acceptabilité de ses résultats. Foundation (http://fr.libreoffice.org/) ; R du Comprehensive R
Archive Network (http://www.r-project.org/)...
On peut aussi visualiser l’incertitude en construisant un profil
d’incertitude comme celui de la figure 15. La seule difficulté est que l’utilisateur possède une compétence
suffisante pour :
Rappelons que ce calcul basé sur l’écart-type sIT permet – créer, organiser et documenter des feuilles de calcul ;
d’estimer la majeure partie de l’incertitude de mesure, mais ne – saisir des fonctions internes et savoir comment elles
prend pas en compte l’incertitude sur la valeur de référence. Ne marchent ;

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– savoir ajouter des protections si ces feuilles sont destinées à Par contre, les conditions de reproductibilité consistent à réaliser
l’ensemble du personnel d’un laboratoire ; pour assurer une bonne les séries de répétitions dans différents laboratoires. Ce sont donc
protection, il est aussi possible de rédiger des macros ou des des conditions typiquement mises en œuvre lors d’une validation
scripts mais ils exigent un effort de programmation et un niveau externe ou inter-laboratoires.
de maîtrise plus élevés. Cependant, quelles que soient les conditions choisies, le modèle
Une évolution prévisible sera la généralisation de logiciels théorique utilisé dans cette norme prend la même forme :
dédiés pour conduire les calculs qui découlent des études de vali- Z ij = m + Bi + Eij
dation. Diverses solutions sont envisageables, qui vont de la
rédaction en interne de feuilles de calcul à l’achat de logiciels Chaque répétition, notée Zij avec i ∈ [1, I] et j ∈ [1, J], est la
spécialisés. Cependant, on peut observer avec surprise que les somme de trois paramètres :
responsables de laboratoire, s’ils sont prêts à investir des sommes – m la valeur moyenne ;
très conséquentes dans des instruments de dernière génération, – Bi qui traduit l’« effet séries » ; dans le cas d’une analyse
considèrent parfois comme peu supportable l’achat d’un logiciel inter-laboratoires, Bi représente l’effet global du laboratoire et on
dont le seul rôle est de valoriser les mesures qui sortent de ces parlera d’« effet laboratoire » ;
nouveaux appareils. – Eij une erreur résiduelle aléatoire.
La grande facilité d’utilisation des tableurs tient à la familiarité Selon ces notations, le numéro de série i varie entre 1 et I et le
des analystes avec leur interface graphique ; ce qui nous permet numéro de répétition j entre 1 et J si toutes les séries contiennent
de ne pas donner plus de détails sur leur utilisation. Leur le même nombre de répétitions. Dans un premier temps, on va
compréhension et leur adaptation requièrent cependant une bonne considérer que toutes les séries ont le même nombre de répéti-
connaissance de la saisie des formules Excel, ainsi que des modes tions, ce qui n’est pas toujours le cas.
de protection des feuilles de calcul pour éviter toute manœuvre
malencontreuse. Il est important de noter que si on utilise un échantillon dont la
valeur de référence X est connue, comme celle d’un matériau de
référence, m peut être différente de cette valeur vraie. On peut, en
effet, écrire :
7.2 Écarts-types de fidélité
m = X +δ
Les divers critères de validation présentés dans le paragraphe 5 où δ représente le biais de justesse de la méthode.
proviennent de méthodes statistiques qui sont décrites ici.
La série des six normes ISO 5725 [13] est consacrée à l’estima- Exemple
tion de l’exactitude (justesse et fidélité) et, principalement, aux Sur la figure 16, sont représentées 3 séries de 5 mesures réalisées
paramètres de fidélité qui sont estimés par différents écarts-types : dans le même laboratoire sur le même échantillon pendant 3 jours.
– de répétabilité, noté sr ; Ces 3 jours n’ont pas à être successifs. Dans le haut de la figure,
– de fidélité intermédiaire, noté sF ; chaque répétition est illustrée par un petit point et les moyennes des
séries par des croix. La valeur m est représentée par un gros point
– de reproductibilité, noté sR .
noir. Si on suppose que les répétitions Zij sont distribuées selon des
Rappelons que les conditions de fidélité intermédiaire consistent lois normales, on peut obtenir la représentation qui est dans le bas de
à réaliser des séries de répétitions sur le même échantillon en
la figure. Chaque moyenne quotidienne est notée Z i . On pourrait
appliquant la même procédure opératoire dans le même lieu mais
sur une période de temps qui peut être étendue ou en faisant alors calculer un écart-type pour chaque série, noté si . Mais, pour
varier d’autres conditions, comme les opérateurs, les réglages modéliser l’idée qu’il existe une répétabilité unique de la méthode,
instrumentaux, etc. Ce sont donc des conditions typiquement comme l’illustre la figure 16, on va associer à chaque jour 3 lois
mises en œuvre lors d’une validation interne. normales ayant le même écart-type de répétabilité sr .

Série 1 Série 2 Série 3

+ + +

Z1 m m Z2 m Z3

B1 B2 B3

+ + +

Figure 16 – Modèle théorique de calcul de la fidélité intermédiaire

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VALIDATION DES MÉTHODES D’ANALYSE QUANTITATIVES AU MOYEN DU PROFIL D’EXACTITUDE __________________________________________________

Par ailleurs, pour chaque série on peut calculer un écart à la Le calcul de la variance inter-séries est un peu plus compliqué :
moyenne générale Bi , qui par définition vaut Z i − m . Cet écart ne
 SCE B 
doit pas être confondu avec le biais de justesse, noté δ.  − s r2 
 I − 1 
s B2 =
J
7.2.1 Cas du plan équilibré
On parle de plan équilibré lorsque toutes les séries ont le même Par définition, l’écart-type de fidélité intermédiaire est alors
nombre de répétitions. Le traitement statistique de ce type de fourni par la formule suivante :
données consiste à utiliser une méthode appelée l’analyse de la
variance à un facteur. Elle s’appelle ainsi car elle permet de sF = sr2 + sB2
décomposer la variance totale de toutes les mesures – toutes
séries confondues – en une variance intra-série et une variance La plupart des logiciels statistiques permettent d’effectuer, ce
inter-séries. qu’on appelle une analyse de variance à un facteur. Par exemple,
La décomposition de la variance totale en ses deux l’utilitaire « Analyse de variance » de Microsoft Excel® contient
composantes se fait de façon très simple. D’abord on va dire que cette fonction. Cependant, on ne peut pas l’utiliser pour estimer les
la différence entre chaque mesure Zij et la moyenne générale, variances de fidélité. En effet, cet utilitaire utilise un modèle, dit « à
effet fixe » qui ne fournit que la valeur de sr mais pas celle de sB .
notée Z , est la somme de deux différences : Le modèle qu’il faut utiliser est dit « à effet aléatoire » et exige de
construire une feuille de calcul spécifique.

(Z − Z ) = (Z
ij ij − Zi + Zi − Z) ( ) Le point de départ est fourni par l’équation d’analyse de la
variance dans sa forme condensée :
En élevant au carré les deux membres de cette équation et en
SCE t = SCEr + SCEB
sommant pour toutes les mesures observées, on obtient l’équation
d’analyse de la variance :
Elle permet de voir qu’il suffit de calculer deux sommes de
carrés pour obtenir la troisième par différence. Classiquement,
(Z − Z ) = ∑ ∑(Z )2 + ∑ J ( Z i − Z )
I J 2 I J I 2
∑∑ ij ij − Zi c’est ainsi qu’on obtient la SCEB :
i =1 j =1 i =1 j =1 i =1
SCEB = SCE t − SCEr
Une notation condensée : SCEt = SCEr + SCEB permet d’intro-
duire trois sommes de carrés d’écarts à la moyenne (SCE) définies
comme suit : Exemple : pour illustrer la méthode, on va utiliser les données du
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– SCEt : somme des carrés des écarts totale ; niveau B de l’étude de validation du sucralose qui sont réunies dans
– SCEB : somme des carrés des écarts inter-séries ; le tableau 6. Il s’agit de 5 séries (I = 5) de 3 répétitions (J = 3) orga-
– SCEr : somme des carrés des écarts intra-série ou résiduelle. nisées selon une disposition tabulaire qui est la plus commode pour
les calculs car elle permet de recopier facilement certaines formules,
Finalement, la somme totale des carrés des écarts à la moyenne comme le montre la figure 17. Par convention, les formules de calcul
se décompose en une somme de carrés d’écarts dus à l’effet série sont situées à droite des cellules auxquelles elles s’appliquent.
et une somme de carrés résiduelle due à l’erreur résiduelle.
Jusqu’à présent, on n’a pas besoin de faire l’hypothèse que les La zone des données brutes se situe dans les cellules B5:D8. La pre-
distributions théoriques des variables Z soient normales pour mière étape est de vérifier si les données sont bien équilibrées,
arriver à ce résultat. c’est-à-dire que chaque série contient le même nombre de répétitions.
Pour faire cette vérification, diverses stratégies sont possibles. Dans la
Les moyennes par série introduites dans les formules précé- cellule F5 la formule = NB(B5:D5) fournit le nombre de répétitions du
dentes sont obtenues en appliquant la formule classique de calcul Jour 01. Elle est recopiée pour toutes les autres séries. Puis on va lire le
de la moyenne. Pour faire ces calculs avec un tableur, on peut nombre de séries, grâce à la formule de la cellule B10 = NB(B5:B8) et
donc tout simplement utiliser la fonction MOYENNE. enfin le nombre total de mesures dans la cellule B11 = NB(B5:D8). La
– Moyenne par série : vérification elle-même est effectuée dans la cellule par le test en
B12 = SI(F5*B10< >B11 ; « Calcul impossible » ; F5). Le principe du test
consiste à vérifier si le nombre total de mesures est égal au produit du
∑ j =1Z i j
J
nombre de séries et de répétitions. On peut vérifier s’il fonctionne en
Zi = supprimant une donnée au hasard. Il serait possible de faire un autre
J
test, en comptant le nombre de cellules vides, comme = SI (NB · VIDE
– Moyenne générale (c’est une estimation de m) : (B5:D8) < > 0 ; « Calcul impossible » ; B11/B10).
On pourrait ajouter divers tests, comme empêcher les calculs si le
∑i =1∑ j =1Z ij
I J
nombre de répétitions par séries est inférieur à 2. L’intérêt de cette
Z = disposition tabulaire et de ces vérifications paramétrées et de faciliter
I ×J l’ajout de nouvelles séries ou de nouvelles répétitions.
Ensuite, il faut calculer les différentes sommes de carrés. Il existe
Ensuite, pour calculer les variances inter-séries sB2 et intra-série
sous Excel® (ou OpenOffice) une fonction statistique nommée
(ou de répétabilité) sr2 qui permettront d’obtenir la variance de SOMME · CARRES · ECARTS qui va servir à ça. La cellule B14 contient
fidélité intermédiaire, il convient de diviser les SCE par les la formule = SOMME · CARRES · ECARTS (B5:D8) et permet de calculer
nombres de degrés de liberté appropriés. C’est à ce stade qu’on va la somme des carrés des écarts totaux, SCEt . Par ailleurs, en colonne G,
supposer que Z est distribuée selon une loi normale. on va entrer la formule = SOMME · CARRES · ECARTS (B5:D5) pour
La variance intra-série (ou de répétabilité) est alors égale à : obtenir la somme des carrés des écarts de la série 01. Elle est recopiée
sur les 4 lignes situées en-dessous. On peut alors obtenir la somme des
carrés résiduelle SCEr , en sommant ces sommes de carrés par série.
SCEr SCEr
sr2 = = Cette somme apparaît dans la cellule B13 sous la forme = SOMME
IJ − I I(J − 1) (G5:G10). La SCEB est calculée par différence dans la cellule B15.

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A B C D F G H I
1 Niveau B
2 Valeur de référence 0.125
3 Données
4 Séries Répétition 1 Répétition 2 Répétition 3 ni SCEi
5 Jour (Série) 01 0.144 0.128 0.135 3 0.000128667
6 Jour (Série) 02 0.116 0.134 0.128 3 0.000168
7 Jour (Série) 03 0.122 0.120 0.132 3 8.26667E–05
8 Jour (Série) 04 0.121 0.130 0.134 3 8.86667E–05
9 Calculs intermédiaires Formules Excel®
10 Nombre de séries (I) 4 =NB(B5:B8)
11 Nombre de mesures (IJ) 12 =NB(B5:D8)
12 Nombre de répétitions (J) 3 =SI(F5*B10<>B11;"Calcul impossible";F5)
13 SCE résiduelle (SCEr) 0.000468 =SOMME(G5:G10)
14 SCE totale (SCEt) 0.000684667 =SOMME.CARRES.ECARTS(B5:D8)
15 SCE inter-séries (SCEB) 0.000216667 =B14–B13
16 Variance inter-séries s2B 4.57407E–06 =((B15/(B10–1))–B17)/B12
17 Variance de répétabilité (s2r) 0.0000585 =B13/(B11–B10)
18 Variance inter-séries (s2B) 4.57407E–06 =SI(B16<0;0;B16)
19 Variance de fidélité intermédiaire (s2F) 6.30741E–05 =SOMME(B17:B18)
20 Fidélité
21 Moyenne retrouvée 0.128666667 =MOYENNE(B5:D8)
22 Écart-type de répétabilité (sr) 0.007648529 =RACINE(B17)
23 Écart-type inter-séries (sB) 0.002138709 =RACINE(B18)
24 Écart-type de fidélité intermédiaire (sF) 0.007941919 =RACINE(B19)

Figure 17 – Feuille pour le calcul de la fidélité intermédiaire dans le cas d’un plan équilibré

Finalement, avec les données du niveau B, on trouve :


Concentration

– SCE résiduelle (SCEr) : 0,000468 = 0,000128 + 0,000168 +


8,267 × 10–5 + 8,867 × 10–5 ;
– SCE totale (SCEt) : 0,000684667 ; 0,150
– SCE inter-séries (SCEB) : 0,000216667 = 0,000684667 – 0,000468
0,145
Puis on va calculer les variances de répétabilité et inter-séries dans
les cellules B16 et B17 en appliquant les équations : 0,140
– variance de répétabilité :
0,135
0,000468
0,0000585 = 0,130
12 − 4
– variance inter-séries : 0,125

 0,000216 667  0,120


 4 −1  − 0,0000585
4,57407 × 10−6 = 0,115
3
0,110
La cellule B18 contient une formule conditionnelle = SI (B16 < 0 ; 0 ; Jour Jour Jour Jour
B16) qui permet de vérifier si la variance n’est pas négative et d’appli- (Série) 01 (Série) 02 (Série) 03 (Série) 04
quer la contrainte précédente. La variance de fidélité intermédiaire est
obtenue en additionnant les variances de répétabilité et inter-séries
Les cercles noirs représentent les répétitions, les barres horizontales
dans la cellule B19. Elle vaut :
les moyennes des séries, le trait plein la moyenne générale et le trait
– 6,3074 × 10−5 = 0,0000585 + 4,5740 × 10−6 pointillé la valeur de référence.
Finalement, on obtient les écarts-types, en appliquant la fonction
RACINE : Figure 18 – Illustration graphique du plan de validation du niveau B
– écart-type de répétabilité :0,007648529 pour le dosage du sucralose par HPLC

– écart-type inter-séries : 0,002138709


– écart-type de fidélité intermédiaire :0,007941919
À ce stade, il peut être intéressant de faire une illustration graphique
des résultats, par exemple, selon le modèle de la figure 18. Remarque : le calcul de la SCEB par différence peut poser un
On voit ainsi que pour la série 01, au moins une mesure est assez problème car la variance inter-séries sB2 peut être négative. La
différente des autres. Il serait tenant de la supprimer pour voir les norme ISO 5725 recommande alors de forcer la valeur à 0, pour
conséquences sur le calcul des critères de fidélité. Mais la suppres- éviter une erreur lorsqu’on calcule sa racine carrée :
sion d’une seule mesure rend le calcul impossible car le plan devient
déséquilibré. Il faut donc disposer d’un autre mode de calcul lorsque Si s B2 < 0 ⇒ s B2 = 0
le plan est déséquilibré.

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7.2.2 Cas du plan déséquilibré (Upper ). Par exemple, si µ est la « valeur vraie » de la moyenne, il
et données aberrantes s’exprime sous la forme :
Prob (L  µ  U ) = 1− α
On parle de plan déséquilibré lorsque toutes les séries n’ont pas
le même nombre de répétitions. Rappelons que l’indice i désigne L’intervalle de tolérance (β-IT), également appelé intervalle de
la série et j le numéro de la répétition. Si on note ni le nombre de prédiction, est de son côté l’intervalle dans lequel on est capable
répétitions, le nombre total de mesures dans ce cas devient : de prédire que se trouve, en moyenne, une proportion connue de
mesures. Il diffère donc de l’intervalle de confiance en ce qu’il
N = ∑i =1ni
I s’intéresse à la population totale et non pas à un paramètre. En
d’autres termes, l'intervalle de confiance caractérise le
Il va permettre de calculer le nombre effectif de mesures, noté comportement d’un paramètre tandis que le β-IT caractérise le
NE : comportement de l’ensemble des mesures.

∑i =1ni2
I Dans le contexte qui nous intéresse, pratiquement, il s’écrit sous
NE = N − la forme :
N Z ∓ k IT × S I T
Et corriger les équations de calcul de la variance de répétabilité : où Z désigne la moyenne des concentrations retrouvées, kIT un
facteur d’élargissement qui dépend de la valeur choisie de β et qui
SCEr rend compte de la proportion de futures mesures qui sera prédite
sr2 =
N −1 par le β-IT, sIT l’écart-type de l’intervalle de tolérance et sF
l’écart-type de fidélité intermédiaire déjà vu.
Et de la variance inter-séries :
Pour calculer l’écart-type de l’intervalle de tolérance, on utilise la
 SECL  formule suivante :
(I − 1)  − sr2 
 I −1  1
sB2 = sIT = sF 1 +
NE IJB 2
Finalement, l’écart-type de fidélité intermédiaire n’est pas avec, les deux coefficients :
modifié :
A +1 s2
sF = sr2 + sB2 B= ; A= B
JA + 1 sr2
Une nouvelle feuille de calcul doit alors être préparée, pour tenir
Le facteur d’élargissement vaut :
compte de ces nouvelles formules.
Ces remarques soulèvent la question des données aberrantes. k IT = tddl ,1+ β
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Traditionnellement, on distingue trois types de données 2


aberrantes ou atypiques possibles : avec tddl ,1+ β quantile de la distribution t de student pour ddl
– la variance d’une série trop « grande » par rapport à celle des 2 degrés de liberté,
autres ; la répétabilité est alors surestimée ; β probabilité attendue du contenu de l’intervalle de
– la moyenne d’une série semble « différente » des celles tolérance.
autres ; alors la fidélité intermédiaire est surestimée ; Le nombre de degrés de liberté est calculé selon l’approximation
– une mesure, au sein d’une série, est jugée « atypique ». de Satterthwaite :
La norme ISO 5725 [13] prévoit différents tests pour traiter ces (A + 1)2
problèmes. Personnellement, je considère que, lors d’une valida- ddl =
2
tion, la notion de mesure aberrante n’a pas lieu d’être. En effet, si  1 1
une méthode au stade de la validation produit encore des données  A + J  1−
+ J
jugées atypiques, c’est qu’elle n’est pas fiable. I −1 IJ
Il faut revenir sur la notion de mesure aberrante. On peut Ces diverses formules appellent les deux remarques suivantes.
essayer d’utiliser les résultats théoriques de la loi normale pour
• Rôle du rapport des variances
définir une donnée aberrante. En effet, les modèles mathéma-
tiques utilisés ici partent tous d’une hypothèse théorique Le rapport des variances A intervient à plusieurs reprises dans
fondamentale : chaque mesure doit être considérée comme la ces formules. Il permet de traduire l’importance relative de l’effet
somme d’un grand nombre d’opérations indépendantes. Cela jour (ou série) par rapport à la répétabilité (en termes de
signifie que, lorsqu’on applique la procédure analytique, les opéra- variances). Dans le cas où la méthode est robuste d’un jour à
tions élémentaires très nombreuses qui sont combinées (pesée, l’autre et qu’elle reste capable de fournir des résultats très proches
étalonnage, réglages des instruments, réactifs, etc.) ne doivent pas pour un même échantillon, sB2 sera plus petite que sr2 et le rapport
s’influencer l’une l’autre. Il devient alors acceptable de penser que A sera inférieur à 1 ; le nombre de degrés de liberté augmentera.
les valeurs obtenues suivent une loi normale. Or, plus il est grand, plus le quantile de la distribution t de Student
Les efforts de l’analyste doivent donc converger vers un mode est petit et l’intervalle de tolérance étroit.
opératoire qui évite au maximum ces inconvénients, tout en
restant pratique.
Au tableau 11 sont rassemblées diverses valeurs de A
obtenues lorsque I = 4, J = 3, comme dans l’exemple du sucra-
7.3 Intervalles de tolérance ( - IT ) lose.

L’intervalle de confiance est bien connu mais il ne doit pas être


confondu avec l’intervalle de tolérance. L’intervalle de confiance On peut voir, pour une fidélité intermédiaire constante et égale à 1
s’applique à un paramètre statistique, telle une moyenne ou une et des valeurs de A variant entre 0 et 20, que le nombre de degrés de
variance. Il s’exprime sous la forme d’un intervalle de valeurs liberté varie entre 11 et 3 et que le β-IT varie de 1,87 à 2,57, soit une
[L, U] où L est sa limite inférieure (Lower ) et U sa limite supérieure augmentation de 37 % ; ce qui est loin d’être négligeable.

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Tableau 11 – Influence du rapport des variances sur la largeur de l’intervalle de tolérance


pour un écart-type de fidélité intermédiaire égal à 1 et diverses valeurs du rapport A
( = 0 , 9 0 )
I J sr sB A sF kIT ddl sIT k IT × sIT
4 3 1,00 0,00 0,0 1,00 1,80 10,80 1,04 1,87
4 3 0,95 0,30 0,1 1,00 1,81 10,24 1,05 1,90
4 3 0,82 0,58 0,5 1,00 1,87 7,84 1,07 1,99
4 3 0,71 0,71 1,0 1,00 1,93 6,17 1,08 2,09
4 3 0,41 0,91 5,0 1,00 2,18 3,77 1,11 2,41
4 3 0,30 0,95 10,0 1,00 2,27 3,39 1,11 2,52
4 3 0,22 0,98 20,0 1,00 2,31 3,20 1,11 2,57

• Calcul du t de Student avec un tableur • Le critère global d’acceptabilité étant basé sur l’exactitude, on
On voit aussi dans le tableau 11 qu’on obtient une valeur de ddl peut enfin régler les conflits entre la justesse et la fidélité. Les
qui n’est pas un nombre entier. Sous Excel ou Open Office, cela méthodologies classiques de validation traitent généralement
pose un problème car la fonction LOI · STUDENT · INVERSE séparément la justesse et la fidélité. Comme conséquence, on
arrondit automatiquement le nombre de degrés de liberté à l’entier peut déboucher sur des conclusions ambiguës si seulement
le plus proche. Ce qui n’est pas le cas si on utilise un logiciel l’un de ces deux critères est satisfaisant. Par contre, le profil
spécialisé, comme R. Cet arrondissage introduit un biais qui se d’exactitude permet de représenter simultanément, sur un
révèle important pour des valeurs de ddl inférieures à 20. On peut même graphique, ces deux critères (ou des combinaisons de
efficacement corriger ce biais par une simple interpolation linéaire ces critères).
entre les deux valeurs du t de Student, calculées avec les arrondis La validation des méthodes d’analyse s’inscrit dans la logique de
inférieure et supérieure de ddl. la mise en place des systèmes d’assurance qualité au laboratoire.
C’est pourquoi, dès les années 1990, des guides – normatifs ou
Exemple : c’est cette méthode qui est utilisée dans les cellules B34 réglementaires – ont été publiés pour aider les analystes à orga-
à B36 de la feuille de calcul illustrée par la figure 19 en utilisant les deux niser leurs études de validation. Après quelques années d’expé-
fonctions ARRONDI. · INF et ARRONDI. · SUP. Finalement, le détail de rience, il est possible d’identifier une série d’écueils et une série
ces calculs pour le niveau B, est fourni par la feuille de la figure 19. Une d’avancées liées à la validation des méthodes d’analyse.
feuille identique est préparée pour chaque niveau et les limites basse Écueils
et haute du β-IT sont ainsi obtenues pour l’ensemble des données.
• L’accent n’est pas assez mis sur le fait que la validation doit
On peut alors réunir tous ces résultats dans un tableau récapitu- intervenir lorsque la méthode est complètement mise au point.
latif, comme le tableau 9 du paragraphe 5.8 qui a servi à construire Trop d’analystes sont tentés, espérant ainsi gagner du temps,
le profil d’exactitude de la figure 12 et celui de la figure 13. de démarrer une validation alors qu’ils n’ont ni rédigé un
mode opératoire complet, ni étudié certaines matrices qu’ils
veulent inclure dans le domaine d’application de la méthode.
La conséquence est que la méthode peut être invalidée.
8. Conclusion • Une façon classique de démontrer qu’une méthode est valide
consiste à réaliser des tests d’hypothèse : tester qu’une
La méthodologie du profil d’exactitude a déjà connu un grand moyenne de répétitions n’est pas statistiquement différente de
nombre d’applications (voir la liste non exhaustive dans la partie la valeur de référence, tester qu’un écart-type de fidélité ne dif-
Pour en savoir plus). fère pas d’une valeur de référence, etc. Cette méthodologie
On peut tirer de ces exemples un certain nombre de conclusions. très classique soulève deux problèmes de fond :
• La grande généralité de cette approche. La liste est déjà longue – d’abord, ces tests d’hypothèse sont menés de façon
des méthodes qui ont été étudiées : chromatographie, spec- incomplète. Une conséquence immédiate est que plus une
troscopie, titrimétrie, gravimétrie, ELISA, PCR, microbiologie, méthode disperse les mesurages plus elle est facile à valider ;
physique, etc. – d’autre part, ces tests portent sur des statistiques comme des
moyennes ou des écarts-types. Or ce qu’attend un client, ce
• D’une façon très globale, si on prend la définition de la valida- n’est pas de savoir si une moyenne est « bonne », c’est qu’un
tion, la démarche proposée suit très exactement cette résultat soit « acceptable », ce qui n’est pas la même chose.
définition : 1) partir des objectifs à atteindre en termes de limites Les tests statistiques sont un peu comme un arbre qui cache
d’acceptabilité ; 2) collecter les preuves effectives grâce à des une forêt.
plans d’expériences ; 3) puis les examiner statistiquement et
graphiquement pour confirmer ou infirmer la validité. Avancées et tendances
• Le mode de calcul du profil niveau par niveau permet de • Les analystes ont fait de grands progrès pour améliorer la jus-
couvrir une très large gamme dynamique de concentrations. tesse des méthodes. Le développement rapide des matériaux
L’approche est donc applicable à des méthodes dont le de référence est la réponse à ce problème majeur. Divers gui-
domaine d’application peut comprendre plusieurs décades. Ce des ou normes ont aussi proposé des moyens pratiques et
point est important car, avec beaucoup d’autres procédures, on reconnus pour définir les valeurs de référence.
doit faire l’hypothèse – irréaliste – que la fidélité est constante • Pendant longtemps la normalisation d’une méthode revenait à
dans tout le domaine étudié. rédiger une procédure plus ou moins détaillée, assortie d’un
• On peut utiliser des modèles d’étalonnage variés et même non catalogue d’obligations de moyens. La tendance qui se fait
linéaires. En effet, l’hypothèse de linéarité de la fonction d’éta- jour consiste à ne plus fixer que des obligations de résultats. À
lonnage peut être totalement abandonnée. terme, l’idée sous-jacente est que n’importe quels moyens

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VALIDATION DES MÉTHODES D’ANALYSE QUANTITATIVES AU MOYEN DU PROFIL D’EXACTITUDE __________________________________________________

A B C D F G H

1 Niveau B
2 Valeur de référence 0.125
3 Données
4 Séries Répétition 1 Répétition 2 Répétition 3 ni SCEi
5 Jour (Série) 01 0.144 0.128 0.135 3 0.000128667
6 Jour (Série) 02 0.116 0.134 0.128 3 0.000168
7 Jour (Série) 03 0.122 0.120 0.132 3 8.26667E–05
8 Jour (Série) 04 0.121 0.130 0.134 3 8.86667E–05
9 Calculs intermédiaires Formules Excel®
10 Nombre de séries (I) 4 =NB(B5:B8)
11 Nombre de mesures (IJ) 12 =NB(B5:D8)
12 Nombre de répétitions (J) 3 =SI(F5*B10<>B11;"Calcul impossible";F5)
13 SCE résiduelle (SCEr) 0.000468 =SOMME(G5:G10)
14 SCE totale (SCEt) 0.000684667 =SOMME.CARRES.ECARTS(B5:D8)
15 SCE inter-séries (SCEB) 0.000216667 =B14–B13
16 Variance inter-séries s2B 4.57407E–06 =((B15/(B10–1))–B17)/B12
17 Variance de répétabilité (s2r) 0.0000585 =B13/(B11–B10)
18 Variance inter-séries (s2B) 4.57407E–06 =SI(B16<0;0;B16)
19 Variance de fidélité intermédiaire (s2F) 6.30741E–05 =SOMME(B17:B18)
20 Fidélité
21 Moyenne retrouvée 0.128666667 =MOYENNE(B5:D8)
22 Écart-type de répétabilité (sr) 0.007648529 =RACINE(B17)
23 Écart-type inter-séries (sB) 0.002138709 =RACINE(B18)
24 Écart-type de fidélité intermédiaire (sF) 0.007941919 =RACINE(B19)
25 Justesse
26 Biais (%) 0.029333333 =(B21/B2)–1
27 Intervalle de tolérance
28 Rapport des variances (R) 0.0781893 =B18/B17
29 Coefficient B2 0.873333333 =(B28+1)/(B12*B28+1)
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30 Nombre effectif 1.046623068 =RACINE(1+1/(B11*B29))


31 Nombre de degrés liberté 10.37885241 =(B28+1)^2/((B28+1/B12)^2/(B10–1)+(1–1/B12)/B11)
32 Écart-type de l’intervalle de tolérance (sIT) 0.0083 =B30*B24
33 Probabilité tolérance (bêta) 80% =B14–B13
34 t Student bas 1.372 =LOI.STUDENT.INVERSE(1–B33;ARRONDI.INF(B31;0))
35 t Student haut 1.363 =LOI.STUDENT.INVERSE(1–B33;ARRONDI.SUP(B31;0))
36 t Soudent interpolé 1.369 =B34–(B34–B35)*(B31–ARRONDI.INF(B31;0))
37 Facteur de couverture (ktol) 1.433 =B36*B30
38 Lmite de tolérance basse 0.1172884 =B21–B37*B24
39 Lmite de tolérance haute 0.1400450 =B21+B37*B24

Figure 19 – Feuille de calcul modèle pour un des niveaux du plan de validation. La probabilité  est saisie directement

instrumentaux ou analytiques pourront être mis en œuvre, culs, il faut absolument énoncer une conclusion claire sur la vali-
aussi longtemps que l’analyste sera capable de faire la preuve dité (ou non) de la méthode. On ne doit pas se contenter d’un
qu’il a atteint des prescriptions de performance fixées. Bien simple tableau de chiffres dont on laissera l’interprétation au seul
évidemment, c’est pour ce type d’approche que la méthode du auditeur. Bien sûr, en cas de non-validité, les causes doivent être
profil d’exactitude est bien adaptée. recherchées et les actions prises : soit abandonner la méthode,
On ne peut pas conclure sans évoquer les problèmes pratiques soit changer les objectifs, soit recommencer la mise au point. Tou-
d’organisation d’une étude de validation dans un laboratoire. On tes ces actions doivent être consignées et justifiées.
peut identifier une séquence de trois étapes. Dans un laboratoire possédant un système qualité, pour ne pas
avoir à réinventer à chaque fois ce qu’il faut faire, il est intéressant
• Préparation de l’étude : la décision de valider une méthode
d’incorporer la procédure de validation dans le système d’assurance
doit correspondre à une décision formelle : un document décri-
qualité. En complément, on peut élaborer des documents types et
vant les objectifs, le mode opératoire à valider et la procédure
définir un modèle de dossier de validation qui contiendra les comptes
de validation doit être préparé à l’avance. On nommera alors
rendus, les résultats des études expérimentales, les calculs et les
un(e) responsable qui coordonnera les travaux et réglera les
conclusions. Si le laboratoire possède un LIMS, il est judicieux de ras-
problèmes logistiques inhérents : calendrier des travaux, distri-
sembler les mesures de validation sous un code de projet unique.
bution des tâches entre opérateurs, choix et mise en réserve
des matériaux de travail, etc. Finalement, le développement de procédures et d’outils adaptés à
la validation des méthodes est en pleine évolution. Nous sommes
• Réalisation des essais : durant cette étape, le rôle du coordina- fermement convaincus du rôle central que joue le laboratoire au
teur est fondamental. Il doit effectuer un suivi et noter les sein de l’entreprise : en l’absence d’un système de mesure et de
déviations par rapport à ce qui avait été prévu. contrôle, toute activité de production est bloquée. La qualité des
• Interprétation des résultats : une fois tous les résultats d’essais résultats d’analyse est un point important, souvent sous-estimé, de
rassemblés, les divers calculs sont réalisés. À l’issue de ces cal- la qualité globale des entreprises.

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P
O
U
Validation des méthodes d’analyse R
quantitatives au moyen du profil
E
d’exactitude N

par Max FEINBERG


S
Ingénieur agronome, Docteur d’État en chimie
Consultant en chimiométrie
A
V
O
Sources bibliographiques
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Peut être téléchargé sur le site http://
www.bipm.org
en vue de la validation d’une méthode d’ana-
lyse quantitative par construction du profil
d’exactitude. NF V03-110:2010.
Method Validation, Comparison and Transfer
(ISSN 1570-0232) rassemble une trentaine d’ar-
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d’exactitude
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métrologie – Concepts fondamentaux et gé- Partie 1 : Principes généraux et définitions (B.), CHAPUZET (E.), COHEN (N.), COMPA-
néraux et termes associés (VIM). 3e édition ISO 5725-1:1994. GNON (P.-A.), DEWÉ (W.), FEINBERG (M.),
(2012) Partie 2 : Méthodes de base pour la détermi- LAURENTIE (M.), MERCIER (N.), MUZARD (G.)
Téléchargeable sur : http://www.bipm.org/fr/ nation de la répétabilité et de la reproducti- et VALAT (L.). – Harmonization of strategies for
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des de mesure. 2nde édition (2000) Partie 3 : Mesures intermédiaires de la fidé- Part I : Journal of Pharmaceutical and Biomedi-
Téléchargeable sur : http://www.lne.fr/publi- lité d’une méthode de mesure normalisée cal Analysis, 36(3), p. 579-586 (2004).
cations/eurachem_guide_incertitude_fr.pdf ISO 5725-3:1994. Part II : Journal of Pharmaceutical and Biome-
Partie 4 : Méthodes de base pour la détermi- dical Analysis, 45(1), p. 70-81 (2007).
[7] ISO. – Évaluation de la conformité. Exigences
nation de la justesse d’une méthode de me- Part III : Journal of Pharmaceutical and Biome-
générales concernant les essais d’aptitude.
sure normalisée ISO 5725-4:1998. dical Analysis, 45(1), p. 82-96 (2007).
NF EN ISO/CEI 17043:2007.
Partie 5 : Méthodes alternatives pour la dé- Part IV : Examples. Journal of Pharmaceutical
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NGUYEN-HUU (J.-J.), BOULANGER (B.), mesure normalisée ISO 5725-5:1995. Cette série de quatre publications vient
CHAPUZET (E.), COHEN (N.), COMPAGNON Partie 6 : Utilisation dans la pratique des va- compléter la référence [8].
(P.-A.), DEWÉ (W.), FEINBERG (M.), LAUREN- leurs d’exactitude ISO 5725-6:1994.
TIE (M.), MERCIER (N.), MUZARD (G.) et VA- MARINI (R.D.), CHIAP (P.), BOULANGER (B.), RU-
LAT (L.). – Validation des procédures analy- Livres spécialisés DAZ (S.), ROZET (E.), CROMMEN (J.) et HU-
tiques quantitatives, harmonisation des BERT (P.). – LC method for the determination of
démarches : BLIESNER (D.). – Validating Chromatographic R-timolol in S-timolol maleate : Validation of its
Partie I. STP Pharma Pratiques, 13(3), p. 101- Methods. John Wiley & Sons, Inc., ability to quantify and uncertainty assessment.
138 (2003). ISBN 978 047 174 1473 (2005). Talanta, 68(4), p. 1166-1175 (2006).

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P VALIDATION DES MÉTHODES D’ANALYSE QUANTITATIVES AU MOYEN DU PROFIL D’EXACTITUDE __________________________________________________

O
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of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
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– Bootstrap-based tolerance intervals for appli-
cation to method validation. Chemometrics and

R determination of sotalol in human plasma


using restricted access material with cation ex-
Intelligent Laboratory Systems, 89(2), p. 69-81
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À lire également dans nos bases


E PORTE (C.). – Méthodes directes d’optimisation : FEINBERG (M.) et LAMARQUE (G.). – Validation ex- NEUILLY (M.). – Limite de détection. [P 262] (1998).
méthodes à une variable et simplex. [P 228] terne des méthodes d’analyse. [P 226] (2004).
N (2002).
PORTE (C.). – Méthodes directes d’optimisation :
DÉSENFANT (M.), PRIEL (M.) et RIVIER (C.). – Éva-
luation des incertitudes des résultats d’analyse.
HUET (S.). – Dosages immunologiques : modélisa-
tion et inférence statistique. [SL 270] (2008).

méthodes dérivées de la méthode simplex. [P 105] (2005).


[P 229] (2002).

S Outils logiciels

A Il existe peu de logiciels purement dédiés à la validation des méthodes. La


Société Arlenda (http://www.arlenda.com/) en a développé un sous le nom
de « e-noval® ». Il utilise le profil d’exactitude et produit un rapport certifié.
solution) : l’utilisateur copie les données dans une interface Internet, elles
sont expédiées et il reçoit le rapport ; il n’a pas à installer de logiciel et béné-
ficie toujours de la dernière version.
Son originalité consiste à fonctionner à travers Internet (Web-based
V
O Sites Internet
AOAC (Association of Official Analytical Chemists) : initialement améri- motion des bonnes pratiques de qualité
I caine cette association d’analystes est devenue internationale. Outre un rôle
de normalisateur, elle réalise des validations de méthodes selon divers pro-
http://www.eurachem.org/
International Conference On Harmonization of Technical Requirements for
tocoles Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) : ce groupe de travail
R http://www.aoac.org/
EURACHEM, réseau d’organisations européennes dont l’objectif est de
est propre aux industries du médicament. Les aspects techniques de la vali-
dation des procédures analytiques sont traités par le groupe de travail
mettre en place un forum sur la traçabilité des mesures chimiques et la pro- « Quality Guidelines Q2 »
http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html

P Normes et standards
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L Association française de normalisation Afnor


NF T90-210 2009 Qualité de l’eau – Protocole d’évaluation ini-
ISO 11843-3 2004 Capacité de détection – Partie 3 : Méthodo-
logie pour déterminer la valeur critique
d’une variable de réponse lorsqu’aucun éta-
tiale des performances d’une méthode dans
U un laboratoire
International Organization for standardization ISO
ISO 16140 2003
lonnage n’est utilisé
Microbiologie des aliments – Protocole pour
la validation des méthodes alternatives
S NF EN ISO/CEI 17025 2005 Exigences générales concernant la
compétence des laboratoires d’étalonnages
et d’essais
ISO 11352 2012 Qualité de l’eau — Détermination de l’incer-
titude de mesure basée sur des données de
validation et de contrôle qualité
NF EN ISO 15189 2007 Laboratoires d’analyses de biologie médi-
cale. Exigences particulières concernant la NF EN ISO 17994 2004 Qualité de l’eau — Critères pour établir
qualité et la compétence, voir également l’équivalence entre les méthodes microbio-
références [7] [9] [12] [13] logiques
ISO 11843-2 2000 Capacité de détection – Partie 2 : Méthodo- ISO/TR 13843 2000 Qualité de l’eau — Lignes directrices pour la
logie dans le cas de l’étalonnage linéaire validation des méthodes microbiologiques

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