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Aislamiento de plásmidos

 Conocer los fundamentos para la


purificación del DNA plasmídico
 Realizar el aislamiento de DNA plasmídico
DNA cromosomal

Organismo/otro Pares de bases (pb) Genes Comentarios


4,290 of these genes encode proteins; the rest
E. coli K-12 4,639,221 4,377
RNAs
strain that is pathogenic for humans; has 1,346
E. coli O157:H7 5.44 x 106 5,416
genes not found in E. coli K-12
Vector
ZmHXK8, gen de resistencia ampilicina (β-
recombinante 7312 4
lactamasa), represor lac, Proteína Rop
pEXP42-ZmHXK8
 La extensión de DNA
que tiene cada
organismo no es la
misma.
 El DNA a pesar de su
extensión tiende a
formar una estructura
helicoidal compacta.
 Doble hélice
 Estabilizada por
puentes de hidrógeno
 En la célula
generalmente
superempacada o
superenrollada
 Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas
cadenas del DNA sólo una vez.
 Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA
en una de las cadenas
 DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado.
 Superenrrolado: Covalentemente cerrado y muy
empacado
 Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior
pero un poco menos empacado
 Existen varias
conformaciones
de los
plásmidos en el
estado
superenrollado.
 Propiedad que modifica su migración en un campo eléctrico: mismo
peso molecular distinta migración

Relajado-

Superenrollado-
 El calor, pH, la concentración de
iones, influyen en la estabilidad de
la doble hélice.
Se puede renaturalizar

 En la desnaturalización se deshace
su estructura nativa, es decir se
eliminan sus puentes de hidrógeno.

 Dos hebras separadas que se


pueden volver a unir o renaturalizar.
Apareamiento parcial
 Para renaturalizar el DNA
hay que hacerlo en
condiciones suaves para
que el apareo de bases
sea el correcto.

 De no ser así se pueden


producir agregados
fácilmente precipitables.
 Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias
del DNA plasmídico circular se rompen, ya sea por calentamiento o
por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el
enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente.

 En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA cromosomal se


renaturalizan rápidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el
pH neutro de la solución y la fidelidad de la reasociación es
substancialmente diferente para ambas macromoléculas.
 La re-naturalización de los plásmidos circulares es rápida
porque las cadenas se encuentran próximas. Mientras el DNA
lineal se re-naturaliza menos rápidamente formando agregados
que se pueden remover de la suspensión por centrifugación.

 El plásmido permanece en solución y puede ser precipitado con


alcohol después de remover el DNA cromosomal.
1
1. Lisar células y desnaturalizar
biomoléculas.
2. Neutralización. Se renaturaliza solo el 2
DNA plasmídico generalmente usando
una solución de acetato de sodio (la alta
[acetato de sodio] ocasiona la
precipitación de los complejos proteína- 3
SDS y el RNA de alto peso molecular)
3. Centrifugar para separar DNA
cromosomal y los contaminantes del
DNA plasmídico
4. Precipitación alcohol para purificar el
plásmido o purificación a través de
columna.
4
 Columna de intercambio aniónico
Ejemplos: POROS Anion Exchange Resins, Qiagen, Toso
Haas, Sterogene, Spherodex, Nucleopac, and Pharmacia.
 The column is washed with several bed volumes of the
buffer.
 The flow-through peak contains virtually no plasmid DNA,
indicating nearly complete DNA binding to the column matrix.
 Plasmid DNA is eluted from the column with a single step salt
elution
 Columnas de silica
Unión de DNA por absorción en
presencia de alta concentración de
sales y con un agente agregante
(polietilenglicol) para mantener el
DNA en forma compacta
(superenrollada o supercoiled)
 El DNA se une a la resina en
presencia de polietilenglicol
 El DNA se eluye en presencia o
ausencia del polietilenglicol con Formación de puentes salinos
la adición de sales.
Reversible interactions between DNA and silica are utilized in the solid phase
extraction and purification of DNA from complex samples. Chaotropic salts
commonly drive DNA binding to silica but inhibit DNA polymerase amplification.

Published in: Peter E. Vandeventer; Jessica S. Lin; Theodore J. Zwang; Ali Nadim; Malkiat S. Johal; Angelika Niemz; J. Phys. Chem. B 2012, 116, 5661
DOI: 10.1021/jp3017776
Copyright © 2012 American Chemical Society
GenElute™
Plasmid 200 µL Resuspension solution

Miniprep
200 µL Lysis solution
Kit
350 µL Neutralization solution

500 µL Column preparation solution

750 µL Wash solution

100 µL Elution solution


 Una vez que se tenga el plásmido purificado
entonces:
A. Medir la absorbancia a 260 y 280 m.
B. Estimar la concentración.
C. Correr una muestra en un gel de agarosa
(Sin embargo, haremos la restricción antes de
correr)
D. Guardar a –20°C o HACER RESTRICCIÓN
 Determinación de concentración
 Determinación de pureza

 Determinación de integridad (corrimiento


electroforético)

Índice de absorbancias a 260 / 280 nm


Continuamos con:
 Ensayo de restricción (2 h incubación de DNA con
enzimas) + adición de RNAasa.

 Corrimiento electroforético: Gel de agarosa (aprox


45 min; próxima sesión de 4 h)
 https://www.youtube.com/watch?v=O4oLyd2
mZv8&nohtml5=False