FACULTAD DE INGENIERÍA Y GESTIÓN AMBIENTAL

TEMA
“Microbiología Ambiental en el estudio de
microorganismos dentro de la Columna de
Winogradsky”

INTEGRANTES

Caja Molina, Valeska; Elera Palma, Williams; Quesquén Bello,

Tiffani; Ramos Coronado, Milagros; Rivas Galindez, Ilich;
Sotomayor Chávez, Astrid

CURSO

Microbiología Ambiental

DOCENTE

Alexandra Muñoz Blandon

JULIO DEL 2014

“Microbiología Ambiental en el Estudio de Microorganismos
dentro de la Columna de Winogradsky”

I. OBJETIVOS:

- Establecer el ecosistema microbiano de sedimentos de ambientes naturales

(Lagunas de Villa I de la UCSUR) a partir de la construcción de una
columna de Winogradsky.

- Reconocer e interpretar los diferentes estratos de la Columna de

Winogradsky, en base a su microbiota colonizadora y sus interrelaciones.

II. INTRODUCCIÓN:

La COLUMNA DE WINOGRADSKY es un instrumento útil para estudiar y

demostrar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos en
comunidades mixtas, y constituye una forma de observar cómo los
microorganismos ocupan “microespacios” altamente específicos, de
acuerdo con sus tolerancias medioambientales y sus necesidades vitales,
como los requerimientos de carbono y energía (altamente específico).

Además, constituye una estupenda práctica para comprobar cómo se

establece un ecosistema microbiano, ya que se puede reproducir un
ecosistema natural en el laboratorio, correspondiente a un sedimento con
contenido orgánico de diferente origen (restos de raíces de plantas,
hojarasca etc.). Es, en síntesis, un sistema completo y autónomo de
reciclaje, mantenido sólo por la energía lumínica.

Objetivo de la Columna de Winogradsky

Evidenciar los diferentes metabolismos bacterianos, los cuales generan

ecosistemas complejos y son los protagonistas fundamentales de los ciclos
biogeoquímicos.

III. PARTE EXPERIMENTAL: (valeska)

III.I. Construcción de la Columna de Winogradsky

a. Materiales

- 2 cilindros de vidrio o plástico transparente.

- 2 hojas de papel filtro (fuente de carbono y energía para la cadena
trófica microbiana)
- Sulfato de calcio
- Carbonato de calcio (agente tamponador del pH)
- Muestra de sedimento

2
 - Arena (color claro)
- Agua destilada
- Agua de charco
- 2 platos desechables
- Restos de hojas, plantas, ramas, etc.
- Papel parafilm
- Papel aluminio

b. Procedimiento:

1. Tomar una muestra de sedimento o suelo (60% del volumen).

2. Cortar trozos pequeños de papel filtro.
3. Mezclar la muestra con 1 g de sulfato de calcio, y 1 g de carbonato de
calcio, restos de hojas, plantas, ramas, etc. Y con las trozos de papel
filtro.
4. Agregar la mezcla al fondo de la columna.
5. Agregar arena.
6. Adicionar agua del lugar de donde proviene la muestra (de preferencia)
hasta casi al borde.
7. Cubrir con papel parafilm la parte superior de la columna e incubar en
presencia de la luz.
8. Realizar el mismo procedimiento desde el punto 1 a 7 con una segunda
columna que se envolverá en papel aluminio para incubarla bajo
condiciones de oscuridad.
9. Haga observaciones de su columna diariamente durante una semana y
cada tercer día durante las siguientes tres semanas. Registre los
cambios macroscópicos que se presenten.
10. Mantenga el volumen de agua adicionando agua destilada en caso de
observar evaporación.
11. Al final del experimento, observar al microscopio muestras de la
columna de agua como del sedimento.

c. Experimentación: (Realizado el 12 de Mayo del 2014)

La muestra de sedimento fue obtenida de la laguna ubicada en Villa I de la
UCSUR (Fig.1), para lo que se utilizó baldes de 1 litro y guantes quirúrgicos
al momento de retirar la muestra. Esta laguna presenta una coloración
predominantemente verde, lo que podría indicarnos la presencia de micro-
algas.
El sedimento de la laguna presentó una coloración gris con puntos negros,
acompañado de gravas (Fig. 2). La muestra emitía un fuerte y
desagradable olor, además de presentar una textura entre líquida y
gelatinosa. Se trató de obtener la muestra de la mayor profundidad posible
de la laguna, para así obtener gran cantidad y variedad de nutrientes y
microorganismos de la laguna. Paralelamente se extrajo una muestra del
agua de la laguna, la cual presentó una coloración amarilla con pequeños
puntos marrones. (Fig.3)
Por otro lado, los restos de hojas, plantas y ramas fueron retiradas de las
áreas verdes de villa I (Fig. 4), y la arena fue obtenida de la playa ubicada
en Villa 6 de la misma universidad.

3
Fig. 1. Obtención de la muestra de sedimento de la laguna de Villa I de la UCSUR

Fig. 2. Muestra retirada de la laguna de Villa I de la UCSUR

Fig. 4 Muestra de agua de la laguna de Villa I de la UCSUR

4
 Fig. 4. Restos de plantas, hojas y ramas

La muestra se vertió en una probeta transparente de 1000 ml, hasta ocupar

un poco más de la mitad del volumen (600 ml aproxidamente),
ayudándonos con un cucharón de plástico. A esto se le añadió la arena, los
restos de plantas, hojas y ramas, el gramo de sulfato de calcio y carbonato
de calcio (previamente pesados en la balanza eléctrica), y los trozos de
papel filtro.

Por último, se le añadió el agua procedente de la laguna hasta completar

los 1000 ml de la probeta, y se tapó la probeta con parafilm. Esta columna
fue rotulada como COLUMNA EXPUESTA. (Fig. 5)

Se procedió a realizar los mismos pasos para nuestra segunda columna,

con la diferencia que ésta fue tapada con papel aluminio, para evitar que
tenga contacto con la luz. Esta probeta fue rotulada como COLUMNA
TESTIGO. (Fig. 5)

Ambas columnas fueron incubadas en el invernadero de Villa 3 ubicadas en

la UCSUR.

Fig. 5 Columna Testigo (izquierda) y Columna Expuesta (derecha) dejadas a

incubación
IV. SEGUIMIENTO DE LA COLUMNA DE WINOGRADSKY: (Astrid)

5
 Las columnas fueron dejadas en incubación por 7 semanas y 3 días.
IV.I. COLUMNA EXPUESTA A LA LUZ SOLAR
- 13 de Mayo del 2014

Parte líquida:

1000 ml aproximadamente

Volumen: 200 ml aproximadamente.

Coloración: Amarillo claro.

En la parte más alta de la columna se

puede observar pequeños restos de
hojas o plantas.

Materia orgánica:

Volumen: 800 ml aproximadamente:

Coloración: Marrón oscuro en los primeros

centímetros y pasa a negro en la parte más
baja de la columna.

La Materia orgánica o sedimento comienza a

descender.

- 27 de Junio del 2014

6
 3

Según lo observado el 27-06-14, la columna presentó 3 zonas diferenciadas:

7
 1. Zona baja: (Materia orgánica)

- Volumen: 650 ml aproximadamente (descendió desde el primer análisis)

- Coloración: Entre marrón oscuro y negro.

2. Zona Intermedia:

- Volumen: 100 ml aproximadamente (entre 650 ml y 750 ml de la probeta)

- Coloración: Presentó colores en
- No se observaba esta fase en los primeros análisis.

3. Zona alta: (Líquido)

- Volumen: 300 ml aproximadamente (aumentó desde el primer análisis).

Entre 750 ml y 1050 ml de la probeta (se fue aumentando agua a la columna
para mantener el volumen aproximadamente.
- Coloración: Marrón claro (cambio su coloración desde el primer análisis).

IV.II. COLUMNA TESTIGO

La Columna Testigo no fue

sometida a ningún cambio.

El aluminio no fue retirado hasta

el día del análisis de las columnas
en el laboratorio.

V. ANÁLISIS DE RESULTADOS (MILAGROS)

8
V.I. ANÁLISIS DE LAS COLUMNAS

El análisis de resultados se realizó el 03 de julio del 2014 en el laboratorio

de microbiología.

Este procedimiento consistió, en primera instancia, de remover el agua de

la superficie de la columna, se vertió el agua excedente en un recipiente
aparte, para luego utilizar una pipeta de 10mL para extraer el líquido
restante. Luego se utilizó un asa de siembra de ojo para sacar una muestra
y ponerla sobre una placa y observarla bajo el microscopio.

Para cada zona de color encontrada a lo largo de las columnas trabajadas,

testigo y la que fue expuesta a la luz, se realizó tinción Gram para su
observación en el microscopio.

A. Columna expuesta
Esta columna presentó un total de siete fases de las que se extrajo una
muestra por fase.
La primera de éstas es, la fase líquida, de agua superficial. Las siguientes
fases diversas de coloración morada, amarilla, verde, y las dos últimas
presentaron una coloración marrón.
Además, también se realizó la medición de pH de la columna, donde se
obtuvo un pH 8.
OBSERVACION AL MICROSCOPIO
Se describe a continuación lo observado en el microscopio por cada una de
las 7 fases encontradas a los largo de la columna expuesta.
1. Primera fase: Fase líquida de coloración marrón oscura.

Se realizó un fresco de la muestra, encontrando probablemente una

diatomea, la cual fue alcanzada a observar a 10X en el microscopio.
(Fig. 6)

9
 10 X

Fig. 6. Observación de una diatomea de la fase líquida a 10X

2. Segunda fase:

Fase
marrón

Se realizó una tinción Gram de esta fase. Observamos una coloración

morada, lo que indica la presencia de bacterias del tipo Gram positivo, y
por la forma observada, estas son bacterias Beggiatoas. (Fig. 7)
Además, se observaron formas alargadas, que podrían indicar la
presencia de estreptobacilos. (Fig. 7)

100 X

10
Estreptobacilos
 Beggiatoa

Fig. 7. Observación de Beggiatoas y estreptobacilos a 100X

3. Tercera fase:

Fase
morada

Se realizó una tinción Gram de esta fase. Observamos una coloración

morada, lo que indica la presencia de bacterias del tipo Gram positivo, y
por la forma observada, se determinó la presencia de esporas. (Fig. 8)

11
 40X

Esporas

Fig. 8. Observación de Esporas a 40X

4. Cuarta fase:

Fase
amarilla

Se realizó una tinción Gram de esta fase. Observamos una coloración

rosada lo que indica la presencia de una bacteria Gram negativa. También
se observó la posible presencia de micelios, constituyentes del cuerpo
vegetativo de un hongo. (Fig. 9)

12
 100X

Fig. 9. Observación de bacterias Gram – y posible presencia de hongo

vegetativo

5. Quinta fase:

Fase
verde

Se realizó una tinción Gram de esta fase. Observamos una coloración

morada, lo que indica la presencia de bacterias del tipo Gram positivo.
Además, se observó presencia de bacilos. (Fig. 10)

13
 10X

Bacilos

Fig. 10. Observación de bacterias Gram + y bacilos

6. Sexta y Séptima fase:

Fase
marrón
oscura y
negra

Se realizó una tinción Gram de esta fase. Observamos una coloración

morada, lo que indica la presencia de bacterias del tipo Gram positivo, y
probablemente la presencia de Clostridium, bacterias anaerobias (Fig. 11)

14
 10X

Fig. 11. Observación de bacterias Gram + y Clostridium

B. Columna testigo
Esta columna presentó un total de cinco fases. Sólo 3 de ellas
fueron evidentemente diferenciadas.
La primera de éstas, es la fase líquida o fase superficial. La
fase 2 y 3 presentaron una coloración marrón y las restantes, y
poco distinguidas, presentaron una coloración más oscura que
las anteriores.
Se realizó medición del pH de la columna testigo, para lo que 1

se obtuvo un pH igual a 8.

FASE 1: Fase líquida de coloración amarrilla. 2y3

(Ocupa 200 ml aproximadamente)

FASE 2 Y 3: Materia orgánica de coloración

marrón. (Ocupa 300 ml aproximadamente)

FASE 4 Y 5: Materia orgánica de coloración

marrón oscuro. (Ocupa 500 ml 4y5
aproximadamente)

15
 OBSERVACION AL MICROSCOPIO

1. Primera fase: Fase liquida

Se realizó un fresco de la muestra y pudimos observar filamentos

cilíndricos que hacían evidenciar la presencia de hifas dentro de la
muestra. (Fig. 12)

40X

Filamentos
cilíndricos

Fig. 12. Observación de filamentos cilíndricos a 40X

16
2. Segunda fase: Marrón

Entre 760 ml y 650 ml

Se realizó una tinción Gram, donde se observó una coloración morada,

lo que indica la presencia de bacterias Gram positivas (Fig. 13)

40X

Fig. 13. Observación de bacterias Gram + de la segunda fase de la

columna testigo

17
3. Tercera fase: Marrón

Entre 650 ml y 500 ml

Se realizó una tinción Gram, donde se observó una coloración morada,

lo que indica la presencia de bacterias Gram positivas y, por las formas
observadas, la posible presencia de esporas. (Fig. 14)

40X

Fig. 14. Observación de bacterias Gram + y esporas

18
4. Cuarta fase: Marrón oscuro.

Entre 500 ml y 300 ml

Se realizó un fresco de esta fase. Se encontró filamentos pequeños,

pertenecientes probablemente a la estructura vegetativa de algún
hongo. (Fig. 15)

10X

Fig. 15. Observación de filamentos

19
5. Quinta fase: Marrón oscuro.

Últimos 300 ml

Se realizó una tinción Gram, donde se observó una coloración morada, lo

que indica la presencia de bacterias Gram positivas y, por las formas
observadas, se detectó la presencia de esporas. (Fig. 16)

40X

Fig. 16. Observación de filamentos

20
En ambas columnas se observaron presencia de macroporos, lo que indica
desprendimiento de gases por las bacterias debido a su metabolismo.
Estos macroporos se observaron en mayor cantidad en la columna
expuesta a los rayos solares.

 Cada zona de las columnas analizadas fueron estriadas en 4 placas de

petri y analizadas al siguiente día mediante tinción de Gram y tinción de
Esporas.

1. Zona de la superficie aerobia de la Columna Normal o Expuesta (N)

y Testigo (T)

2. Zona media o mitad aerobia de la Columna Normal o Expuesta (N) y

Testigo (T).

3. Zona media o mitad anaerobia de la Columna Normal o Expuesta

(N) y Testigo (T).

4. Última zona anaerobia de la Columna Normal o Expuesta (N) y

Testigo (T).

21
V.II. ANÁLISIS DE LAS PLACAS PETRI (04/07/14)

a. Superficie Aerobia

- Columna Normal o Expuesta (N)

22
 Se realizó tinción de espora, donde se pudo observar la presencia de
esporas con coloración azul.

- Columna Testigo (T)

Se realizó tinción de espora, donde se pudo observar la presencia de

esporas con coloración azul.

b. Mitad Aerobio

- Columna Normal o Expuesta (N)

Esporas
Bacilos

23
 Se realizó tinción de espora, donde se pudo observar la presencia de
esporas con coloración azul y bacilos, en forma de palos alargados
verdes.

- Columna Testigo (T)

Cuando se le sometió a Tinción de espora, se observó presencia de

esporas, como pequeños puntos verdes.

Cuando se le sometió a Tinción de Gram, se pudo observar la presencia

de bacilos y esporas.

c. Mitad Anaerobio

24
 - Columna Normal o Expuesta (N)

Cuando se le sometió a Tinción de espora, se observó presencia de

esporas, como pequeños puntos verdes y bacilos, como palos
alargados rojos.

Esporas
Bacilos

Cuando se le sometió a Tinción de Gram, se pudo observar la presencia

de bacilos, esporas y cocos.

- Columna Testigo (T)

25
 Cuando se le sometió a Tinción de Gram, se pudo observar la presencia
de bacilos y cilios.

VI. CONCLUSIONES:

 Han proliferado organismos anaerobios, debido a que la columna fue

sellada y nunca fue removida, por lo que no hay forma que su
contenido haya sido oxigenado.

 En cada paso del ciclo de los elementos que se observan dentro de la

columna siempre está implicado algún grupo de organismos.

 Un microorganismo particular y sus productos metabólicos suele servir

como fuente de nutrientes esenciales para otros organismos,
generándose una red trófica dentro de la columna.

 Los procesos bioquímicos utilizados por estos microorganismos para

obtener energía (ATP y poder reductor) y fuente de carbono son los
mecanismos más eficientes para sortear las condiciones
fisicoquímicas adversas imperantes en estos hábitats.

 El único requerimiento es la fuente de carbono orgánico para generar

los productos de la fermentación necesarios para las sulfo-reductoras.

 Esta columna es un sistema completo y autónomo de reciclamiento,

mantenido sólo por la energía de la luz.

26
  Hemos diferenciado los grupos microbianos presentes en un
microambiente también pudimos comparar los microorganismos que
crecen a lo largo de la columna en diferentes tiempos, relacionando la
diversidad microbiana presente en un microambiente con algunas de
sus características fisiológicas.

 Esto es una clásica demostración de cómo los microorganismos

ocupan micro-sitio muy específico de acuerdo a su medio ambiente y
sus tolerancias de carbono y las necesidades de energía.

 El oxígeno difunde desde la superficie, creando condiciones similares

a las que existe en un largo sedimento ricos en nutrientes.

 Con la luz se reproduce la penetración de la luz solar en la región

inferior anaeróbica, para facilitar el desarrollo, de los microorganismos
fotosintéticos anoxigénicos y en la parte más alta se pueden ver
cianobacterias.

VII. DISCUSIONES:

Al comparar las columnas con las de los demás grupos de estudio,

obtuvimos coloraciones distintas en la estructura de la columna. Much de
esta diferenciación se debe al tipo de suelo utilizado para la muestra de
nuestra columna.

La coloración morada es debido a la acción de la Cromatium y a sus

cúmulos, debido a sus compuestos carotenoidicos como la “okenona” (caso
especial es la especie Cromatium okenii.), la cual se puede observar en el
trabajo de José L. Perez (2008).

Los ciclos biogeoquímicos, como el del azufre, se observaron de la misma

forma más de no de la misma particularidad con las demás columnas José
L. Perez (2008).

VIII. CUESTIONARIO:

a. ¿Por qué se adiciona el sulfato de calcio a la muestra de sedimento?

 Funciona como base de sulfato. Se liberan sulfuros que difunden a la

zona superior oxigenada creando un gradiente en el que se desarrollan
bacterias fotosintéticas que utilizan el azufre. Por encima de esta zona
pueden desarrollarse las bacterias purpuras que no utilizan azufre.
Cianobacterias crecen en la parte superior y liberan oxigeno que
mantiene aerobia esta zona.

b. ¿Cuál es la función de los restos de hojas, plantas, ramas, etc, en la

columna?

27
  La función de los restos de hojas, plantas, ramas y demás en la
columna, es simular la materia orgánica que se encuentra de forma
natural en el ambiente. Así logrando una simulación más real que se
puede dar de forma natural en el medio. Además la materia orgánica
promueve el crecimiento de microorganismos y para algunos de estos
sirve como nutriente.

c. ¿Por qué razón la columna testigo se mantiene en la oscuridad durante

el transcurso del experimento?

 Esta columna se mantiene en la oscuridad con el fin de poder

determinar si en ésta podrán proliferar microorganismos en la misma
cantidad o menor cantidad que en la columna expuesta a la luz solas.
Por otro lado, la columna en mención se mantiene tapada para evitar la
evaporación.

Además, esta columna simula un micro-ecosistema o microambiente

que ilustra cómo los microorganismos ocupan micro-espacios altamente
específicos de acuerdo con sus necesidades vitales, tales como:
requerimientos de carbono, energía y oxígeno, así como la
interdependencia, prescindiendo de la energía solar.

IX. ANEXOS

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 Organismos encontrados en cada fase de la Columna expuesta a la luz
solar

X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

 Obtenido de: http://www.redalyc.org/pdf/920/92050311.pdf, 2008, José

Pedro López Pérez, Murcia.

 Atlas, R.M.y R. Bartha. 2001. Ecología microbiana y microbiología

ambiental. Ed. Addison Wesley.

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