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Los péptidos cortos se auto-ensamblan para producir

amiloides catalíticos
Caroline M. Rufo1†, Yurii S. Moroz1†, Olesia V. Moroz1†, Jan Sto¨hr2, Tyler A. Smith1, Xiaozhen Hu3,
William F. DeGrado3* and Ivan V. Korendovych1*
Las enzimas se pliegan en estructuras tridimensionales únicas, que subyacen a sus notables propiedades catalíticas. el requisito
de adoptar una conformación estable y plegada probablemente contribuya a su tamaño relativamente grande (> 10.000 Da). Sin
embargo, los péptidos mucho más cortos pueden lograr conformaciones bien definidas a través de la formación de fibrillas de
amiloide. Probar si los péptidos formadores de amiloide cortos podrían de hecho ser capaces de una catálisis tipo enzima,
diseñamos una serie de siete residuos péptidos que actúan como esterasas dependientes de Zn2+. Zn2+ ayuda a estabilizar la
formación de fibrillas, mientras que también actúa como cofactor para catalizar la hidrólisis del éster acílico. Estos resultados
indican que las fibrillas de tipo prión pueden catalizar no solo su propia formación, pero también pueden catalizar reacciones
químicas. Por lo tanto, podrían haber servido como productos intermedios en la evolución de las enzimas modernas. Estos
resultados también tienen implicaciones para el diseño de nanoestructurados de autoensamblaje catalizadores que incluyen unos
que contienen una variedad de iones metálicos biológicos y no biológicos.

Los mecanismos por los cuales las proteínas evolucionaron para propiedades catalíticas de los péptidos amiloidogénicos que se
poseer enzimas la actividad está en gran parte sin resolver. El unen a Zn2+. Zn2+ fue elegido como un cofactor dada su alta
aminoácido de una enzima secuencia subyace a su capacidad de abundancia y ocurrencia frecuente en las modernas hidrolasas
plegarse en una estructura nativa, que posiciona y sintoniza la dependientes de metales tales como la anhidrasa carbónica y las
dinámica de los grupos funcionales requerido para unión y catálisis. metaloproteasas. El ion Zn2+ reduce el pKa de un agua unida,
Las enzimas modernas son generalmente al menos 100 residuos de estabilizando y colocando hidróxido para el ataque nucleofílico del
longitud, que está cerca de la cadena longitud requerida para crear sustrato. El sitio de unión a Zn2+ en las enzimas a menudo contiene
un núcleo hidrofóbico bien definido en una proteína globular. Una dos ligandos His que se proyectan desde las posiciones i y i+2 de
proteína de esta longitud, sin embargo, tendría una una hoja β; un tercio Su ligando de un filamento vecino completa
astronómicamente gran cantidad de secuencias posibles, y es no el entorno del ligando primario. Este sitio de unión al metal
está claro cómo la naturaleza pudo haber probado un número interestrans 3-His muy simple se observa en proteínas tales como
suficiente de permutaciones para encontrar uno capaz de plegar y la anhidrasa carbónica de eritrocitos (figura 1a) 9; de manera
funcionar. similar, se observan dos restos de His de posiciones vecinas de
cadenas b en la estructura de solenoide b de tipo amiloide de una
Esta aparente paradoja ha llevado a la sugerencia de que las anhidrasa gcarbónica arqueal10. Adicionalmente, los ácidos / bases
primeras proteínas podrían haberse formado a partir de péptidos o generales de las cadenas laterales vecinas sirven como ligandos
polímeros cortos con secuencias repetitivas de aminoácidos que secundarios y ayudan a los eventos de protonación / desprotonación
dependían del autoensamblaje para lograr una estructura doblada en la catálisis. Por lo tanto, preguntamos si podría crearse un sitio
De hecho, heptapéptidos simples con alternando residuos apolares similar dentro de la secuencia heptapéptido minimalista formadora
y polares se autoensamblan en forma extendida hojas beta de lámina β (LKLKLKL). Este y los péptidos relacionados tienen
estabilizadas a través de la asociación intermolecular de los residuos hidrofóbicos alternos, lo que crea una cadena b anfifílica
residuos apolares en la secuencia de repetición. Por otra parte, que se asocia adicionalmente a través de interacciones hidrófobas
caracterización estructural de péptidos formadores de amiloide para formar estructuras β amiloides extendidas. Se tolera una
cortos ha revelado una miríada de las variaciones conformacionales variación de secuencia considerable siempre que se preserve la
en la conformación cruzada básica. Por lo tanto, es posible que las periodicidad hidrofóbica. Conservamos los residuos de Leu
primeras enzimas proteicas primitivas fueran péptidos cortos con apolares para impulsar el ensamblaje, mientras que las cadenas
estructuras amiloides que proporcionan los marcos para apoyar sus laterales de Lys en posiciones y 6 se cambiaron a residuos polares
actividades catalíticas. capaces de soportar la unión de iones de metales de transición y la
Los metales también podrían haber figurado en gran medida en la catálisis. Los restos de unión a Zn2+ His se colocaron en las
aparición de la actividad catalítica de las proteínas. Los iones del posiciones 2 y 4, mientras que en la posición 6 (Fig. 1b) exploramos
metal de transición no solo ayudan a catalizar las reacciones, sino residuos ácidos (Asp, Glu), neutros (Gln, Tyr) y básicos con
que también pueden influir en el plegamiento de las proteínas diversos valores de pKa (His, Lys, Arg).
mediante la interacción con las cadenas laterales de ligadura. Por
lo tanto, exploramos el diseño, las interacciones metálicas y las
Resultados y discusión catalizadores proteicos diseñados. La mayoría de los siete diseños
originales mostraron actividad mensurable sobre el control de
Las enzimas hidrolíticas realizan un conjunto diverso de funciones tampón (pH 8 en presencia de 1 mM de ZnCl2) en el cribado inicial
que van desde la hidrólisis de amidas, ésteres o lípidos hasta la para la hidrólisis de pNPA, como se muestra en la Tabla 1. La
catalización del equilibrio entre el CO2 y el bicarbonato. A pesar dependencia de la velocidad inicial de la reacción sobre la
de tal diversidad, muchas enzimas hidrolíticas se analizan y concentración de sustrato para un péptido típico (7, LHLHLRL) es
comparan usando un sustrato cromogénico simple, p- consistente con el modelo de Michaelis-Menten, con Kcat =3.2±0.4
nitrofenilacetato (pNPA). Por lo tanto, elegimos este sustrato para × 10ˉ2 sˉ1, KM = 1.8 ±0.4 mM y a eficiencia catalítica de kcat /
permitir la comparación con enzimas naturales y varios KM = 18 ± 4 Mˉ1sˉ1 (Fig. 2a, Tabla 1).

Figura 1 | Visión general del concepto y diseño. a, Estructura de la anhidrasa carbónica humana que muestra un motivo de unión a metal típico. b,
Modelo para uno de los péptidos diseñados (11, Ac-IHIHIQI-CONH2) en la configuración de cadena b extendida que muestra las posiciones de los
residuos en la secuencia. c-e, modelo de fibrillas derivado computacionalmente formado por 11, que muestra el pliegue global (c), el relleno del núcleo
hidrofóbico (d) y la esfera de coordinación primaria de zinc (e).

La actividad de 7 es extrictamente zinc-dependiente y no se observa


ninguna actividad significativa sobre el fondo en la ausencia de
Zn²+. La actividad catalítica también muestra una marcada
referencia de la naturaleza de los residuos de la posición 6.
Curiosamente, péptido 3, con un residuo amyloidogenico de
glutamina en esta posición fue más activo, con Kcal/KM= 30 ± 3M
1- s-1. Péptidos con residuos de Asp, Glu o His en posición 6 (1,2
y 5 respectivamente) tuvieron poca actividad, posiblemente porque
estas cadenas laterales compiten con residuos de His en las
posiciones 2y 4 para el estancamiento al ion del metal creando los
sitios catalíticos inactivos.

Relaciones estructura-actividad. Integrado por el hallazgo de que


un potencialmente amiloide promoviendo el residuo de Gln
catalizado realzó la actividad catalítica que variamos los residuos
hidrofóbicos del Leu que eran se esperaba que estabilizara la
asociación del Leu que eran se esperaba, que estabilizadora la
asociación hojas β proporción residuos de Ile o Leu producidos por La actividad 9 podría aumentarse aún más por inclusión de Glu en
péptidos 9 y 10 con al menos 50% incrementado de la actividad la posición que se4 había demostrado para aumentar la actividad en
comparado con 7. Inversamente, reemplazando Leu con Ala, el leucina que contiene péptidos. Los efectos de introducción β-
residuo con una hidrofobia más baja y una proporción más débil de amino ácidos ramificados y glutamina fue añadido: El péptido
la forma de hojas β, dio un péptido que es mucho más inactivo que contiene ambas isoleucinas en este hidrofóbico núcleo y Gln en
la esterasa. El acetil terminal y carboxamida también parecía ser posición 6 es 3-5 el triple más activo que 7 (tabla 1) y alcanza un
importante en la actividad porque el péptido que carecía estos valor de Kcat/Km de 360 + 30 M21s atpH 10,3 (figura 2b). La
grupos (14) era catalítico inactivo. Estas observaciones están en catálisis sigue la cinética d Michaelis-Menten, y no se observó
buen acuerdo con los anteriores estudios que demostraban que las ninguna inhibición del producto sobre 20 volúmenes de ventas. Un
modificaciones sutiles de la estructura secundaria en los efecto similar, aunque en menor medida, fue observado el Gln fue
catalizadores cortos del péptido conducen a los mejores introducido en el péptido 10 de la valina que contenía.
substanciales en la actividad y el substrato específico 17-18. Curiosamente, en ambos lados la ganancia en eficiencia catalítica
proviene de la disminución en km en lugar de la mejora de kcat.

Figura 2 | Caracterización funcional de los catalizadores. a, gráficos de la actividad de esterasa catalizada por péptidos representativos (7, 8, 9, 11
y 14 como se especifica en la clave) a pH 8 en presencia de Zn2+ 1 mM, con la curva suave que muestra el ajuste a la ecuación de Michaelis-Menten.
El perfil del péptido más activo (11) muestra una saturación tipo enzima a concentraciones de sustrato más altas. b, El perfil de pH de la actividad
esterasa de 11 es consistente con un modelo de protonación de dos estados. c, Dependencia de la actividad de 11 sobre la concentración de Zn2+, que
muestra una estequiometría de péptido: metal 2: 1. d, Dependencia de la tasa de hidrólisis de p-nitrofenil acetato (pNPA) catalizada por 11 (Ac-
IHIHIQI-CONH2) sobre la concentración de péptido monomérico utilizado para producir fibrillas. La eficacia catalítica de las fibrillas no depende de
la concentración inicial del péptido monomérico utilizado para el ensamblaje. La reacción es de primer orden en péptido en el rango de concentración
estudiado. Las barras de error en todos los gráficos representan desviaciones estándar de al menos tres mediciones independientes.
La actividad de 11 es más de 100 veces mayor en presencia de Zn2+ Figura 3 | Las especies activas tienen una estructura secundaria de
que, en su ausencia, lo que demuestra que la actividad no surge de hoja B. a, b, espectros de CD de 7 (a) y 11 (b) bajo diferentes condiciones.
la catálisis del imidazol simple (que es considerablemente menor
que la tasa medida para las fibrillas de Zn2+ -11). Además, la
actividad de las fibrillas formadas por el 11 es diez veces mayor
que las esterasas no basadas en metales identificadas en líneas
combinatorias por Hecht et al21,22. y diseñado por Baltzer et al23,
Mayo y colegas20. Las fibrillas formadas por 11 tienen un orden
de magnitud más activo que el diseñado de novo, y que la fijación
de zinc en espirales reportadas por Pecoraro et al. y están a la par
con el complejo de zinc-proteína más activo (hasta la fecha)
informado por Kuhlman y colegas. Además, la actividad de 11
sobre una base de peso es mayor que el de la anhidrasa carbónica,
que cataliza la hidrólisis de pNPA con kcat/KM = 2,550 M-1 s-1.
Esta notable eficiencia se debe al pequeño tamaño de la unidad
activa en 11 (probablemente un dímero de péptidos de siete
residuos), mientras que la proteína es al menos 15 veces mayor en
peso molecular.

La coordinación adecuada del ion metálico también es crucial,


porque una sola mutación de residuos de la histidina a alanina, da
como resultado al menos 60 veces de disminución en la actividad
de la esterasa (Tabla 1). La examinación adicional de la actividad
catalítica de 11 (IHIHIQI) como una función de la concentración
del Zn2+, mostró que la actividad aumentó linealmente hasta que
se alcanzó una estequiometría de 1:2 (zinc a péptido), después de
lo cual no se observó ningún aumento (fig. 2C). Este hallazgo es
consistente con el diseño en el que dos péptidos cooperan para
formar el catalizador activo. El perfil de actividad de pH del 11 e
consistente con dos pasos de protonación / desprotonación con
valores de pKa de 7.1 ± 0.4 y 9.3 ± 0.1 (Fig. 2b). Es posible que un
pKa refleje la desprotonación de una de sus cadenas laterales para
liberarla y ligarla al Zn2+, mientras que el pKa superior refleja el
pKa del Zn2+ en agua / hidróxido, aunque se requerirá más trabajo
para confirmar esto. La protonación en dos etapas similares; el En presencia de Zn2+, 7 muestra un espectro típico de la configuración
comportamiento que se observó para otros péptidos activos cruzada, y el péptido 11 más activo muestra un espectro de CD de tipo B a
pH 8, incluso en ausencia del metal. La concentración de péptido fue de 24
(Suplementario Fig. 1). La eficiencia catalítica de las fibrillas no
mM en todos los experimentos.
depende de la concentración inicial del péptido monomérico
utilizado para el ensamblaje; la reacción es de primer orden del Se observaron resultados similares para los péptidos restantes (1-6)
péptido en el rango de concentración estudiado (24-200 μM) (Fig. examinados (Figura 2 complementaria). Curiosamente, el péptido
2d). 5 casi inactivo (LHLHLHL) mostró un espectro de CD tipo β,
incluso en ausencia de Zn2+. Este hallazgo sugiere que este péptido
Caracterización de la especie activa. Habiendo establecido que los
podría estar preorganizado en una estructura que no admite catálisis
péptidos son catalíticamente activos, utilizamos dicroísmo circular
o, como se mencionó anteriormente, el His adicional compite por
(CD) espectroscopias infrarrojas (IR) para demostrar que adoptaron
la unión catalíticamente competente de Zn2+. Curiosamente, los
una conformación de láminas β en presencia de Zn2+. Además, la
péptidos sustituidos Leu-to-Ile más catalíticamente activos (9, 11)
fijación de tioflavina T (ThT) de tinción negativa en la microscopía
mostraron un espectro CD de tipo hoja β a pH 8, incluso en ausencia
electrónica de transmisión (TEM) se utilizaron para investigar la
de Zn2þ (Fig. 3b), lo que sugiere que esta sustitución promovió la
formación de fibrillas. El péptido 7 que contiene Leu adopta una
formación de una estructura catalíticamente competente. La
estructura de lámina β estrictamente dependiente de Zn2+. En
posición de la banda de amida I 'IR de los péptidos catalíticamente
ausencia de zinc, el péptido muestra una característica de espectro
activos (7, 9, 11) cerca de 1,626 cm-1 apoyaba más estas
CD de espirales aleatorios, pero además el ion metálico una
conclusiones27 (Fig. 3 complementaria). Los espectros de CD de 9
configuración de espectro típico β-cruz la cual se observa en (Fig.
y 11 a pH 8 en presencia de Zn2þ muestran mínimos altamente
3a). La Comparación de espectros a pH 2 y 8 mostraron que el
intensos alrededor de 207nm. Se encontraron espectros similares
desencadenamiento del Zn2+ de la estructura de lámina β se
con fibrillas formadas por péptidos derivados de una proteína
producía solo a pH 8, donde los ligandos debían ser desprotonados
priónica de ratón y podrían ser indicativos de estructuras β en
y quedar disponible para iones metálicos complejos.
complejos amiloides fácilmente formados28,29.
Los métodos de separación física mostraron que el catalizador presente en forma de especies de bajo peso molecular, a juzgar por
activo se ensambla en agregados de alto peso molecular. La diálisis su absorbancia ultravioleta. Después de 24 h de incubación, la
extensa de 11 utilizando una membrana de corte de peso molecular fracción soluble de 7 cae al 20% y permanece constante a partir de
de 10 K (MWCO) contra el tampón que contiene zinc mostró que entonces (Fig. 7 suplementaria). Los estudios TEM proporcionan
la especie catalíticamente activa no podía difundirse a través de la información adicional sobre la oligomerización de 7: las muestras
membrana. Además, cuando los péptidos agregados se filtraron a recién producidas muestran protofibrillas que maduran
través de membranas con 0,1, 0,22 o 0,45 mm de poros, el filtrado completamente después de una incubación prolongada (Fig. 4c, d).
fue al menos 800 veces menos activo que la suspensión de partida De manera importante, el péptido 8 no fibrilar no mostró
(Fig. 4a). Además, La unión de ThT y TEM identificaron esta disminución en la absorbancia de la fracción soluble, lo que indica
agregación catalíticamente activa como fibrillas. El ThT se une a que no se formaron especies oligoméricas.
las fibrillas con preferencia a los estados oligoméricos prefibrilares
o péptidos monoméricos, y la unión se evalúa convenientemente a Finalmente, no se observó ninguna evidencia sólida para la
través de una gran mejora en la fluorescencia de este colorante. En estructura de lámina β basada en los espectros de CD para el
efecto, La fluorescencia de ThT aumentó significativamente en péptido catalíticamente inactivo 14, que ha desbloqueado los
presencia de Zn2+ con pH 8, y los péptidos más activos tendieron a extremos N y C. Además, bajo condiciones en las que los péptidos
tener la mayor potencia de fluorescencia en este ensayo (Fig. 4b). activos mostraron una formación de fibrillas extensa, 14 no
Este hallazgo fue confirmado por imágenes TEM de 7, 9 y 11, que produjeron fibrillas, según se juzgó por TEM. Este hallazgo podría
revelan fibrillas amiloideas extendidas (Fig. 4c-f, Figuras indicar que las hebras β en las fibrillas activas están dispuestas en
complementarias. 4, 5). forma paralela; en tal escenario, la neutralización de los grupos
terminales por acetilación y amidación estabilizaría la estructura al
La formación de estructuras de tipo amiloide a menudo requiere eliminar las interacciones electrostáticas desfavorables entre los
una nucleación adecuada y, por lo tanto, se observa con frecuencia grupos terminales cargados. Sin embargo, se requerirán estudios
una fase de retraso. Hemos caracterizado la actividad de los estructurales para confirmar esta topología y estructura detallada de
péptidos diseñados en varios momentos después de la adición de las fibrillas.
Zn2+ y el aumento concomitante del pH. Péptidos 4, 6 y 7, que
tienen un núcleo Leu, muestran una fase de retraso, alcanzando su Esfera de coordinación de metal. Para sondear la esfera de
actividad máxima a las 24 h. Introduciendo Gln en la secuencia y, coordinación del ion metálico en el catalizador activo, estudiamos
especialmente, sustituyendo leucina con isoleucina, Reduce la fibrilación de 9 y 11 en presencia de iones de cobalto. Co2+
drásticamente el tiempo de fibrilación y la actividad máxima se desencadena la formación de fibrillas de una manera análoga al
logra sin necesidad de una incubación más prolongada (Figura zinc, a la vez que proporciona una fácil comprensión
suplementaria 6). Esta observación es consistente con los espectroscópica de la geometría de coordinación del metal. La
resultados de los estudios de centrifugación realizados para amplitud e intensidad de la banda de transición d-d en el espectro
determinar la fracción de grandes agregados. Las soluciones de UV-vis de las fibrillas formadas por 9 y 11 en presencia de cobalto
péptidos representativos a pH 8 en presencia de Zn2+ se sometieron excluyen la posibilidad de disposición de ligandos octaédricos y
a centrifugación a 100.000 g durante 1 h inmediatamente después son consistentes con la coordinación tetraédrica de cobalto30 (Fig.
de la preparación y después de 24-48 h de incubación a temperatura 8). Los estudios TEM muestran que la morfología de las fibrillas
ambiente. Inmediatamente después de la adición del tampón de pH formadas en presencia de cobalto no está alterada en comparación
8 que contiene Zn2+, 11 se oligomeriza esencialmente por completo con las fibrillas unidas a zinc (Fig. 9).
(al menos 95%), mientras que 55% del péptido 7 todavía está
Figura 4 | Las fibrillas amiloides grandes son responsables de la catálisis. a, la diálisis extensa de 11 (24 mM) no afecta la actividad (la diferencia
observada en la actividad es el resultado de una precipitación parcial irreversible de las fibrillas, como lo indica la disminución de la absorbancia
ultravioleta). Además, el examen del filtrado después de pasar una suspensión acuosa de 11 a través de un filtro de 450 nm muestra que las especies
activas son incapaces de impregnar el filtro. b, la actividad se correlaciona con el grado de fibrilación de diversos péptidos (7, 8, 9 y 11 como se describe
en la clave, la concentración de péptido se mantuvo a 200 mM), como se muestra mediante el aumento de fluorescencia de tioflavina T (25 mM). c-f,
imágenes TEM representativas (a × 25,000 aumentos, barra de escala, 100 nm) de fibrillas formadas por diferentes péptidos a pH 8 en presencia de
Zn2+: 7 inmediatamente después de la preparación (c); 7 después de 72 h de incubación a temperatura ambiente (d); 11 inmediatamente después de la
preparación (e); 11 después de 72 h de incubación a temperatura ambiente (f). Tanto 7 como 11 forman fibrillas amiloides. Las muestras recién
producidas de 7 muestran protofibrillas que maduran completamente después de una incubación prolongada, mientras que 11 forman fibrillas muy
rápidamente, esencialmente después de la mezcla. La concentración de péptido fue de 24 mM en todos los experimentos TEM. Las barras de error en
todos los gráficos representan desviaciones estándar de al menos tres mediciones independientes.

Estos resultados están en buen acuerdo con aquellos resultados de disminución de la actividad se observó al aumentar la proporción
computación usando el software Rosetta. La energía- modelo de 4 relativo a 7 (Fig. 5b). Se necesitarán estudios estructurales
minimizada de las fibrillas formadas por 11 en presencia de Zn2þ detallados para dilucidar la composición y la geometría de la unidad
iones se presenta en la Fig. 1c-e. Muestra un núcleo hidrofóbico activa como los datos también podrían ajustarse a una
formado por residuos de isoleucina, donde los residuos de histidina oligomerización más compleja (p. péptido trímero que constituye
soportan una esfera tetraédrica de coordinación de zinc. la especie activa) modelos.

Interacciones sinérgicas entre péptidos Los estudios anteriores Conclusión


muestran que se necesitan principios de diseño relativamente
simples para descubrir péptidos similares al amiloide, que muestran Aquí, hemos demostrado que pequeños péptidos formadores de
actividad catalítica muy sustancial para la hidrólisis del éster. Más amiloide de siete residuos diseñados a partir de los primeros
de la mitad de los 14 péptidos estudiados aquí estaban activos, y la principios forman una catálisis eficiente de la hidrólisis del éster.
actividad podría mejorarse fácilmente mediante principios físicos Esta observación respalda una posible formación de enlaces de
simples como mejorar el potencial amiloidogénico y las especies reactivas de oxígeno (ROS) en una forma incompleta
propiedades de formación de láminas peptídicas. Esto es solo una manera entendida (33-35. La facilidad con la que pudimos
pequeña fracción de los 207 ¼ 1.28 × 109 posibles secuencias descubrir catalizadores de metaloproteína robustos y reproducibles
peptídicas que podrían estar compuestas por los 20 aminoácidos de sugieren que las actividades catalíticas tóxicas se deben considerar
origen natural, o 37 ¼ 2,187 si uno fuera a restringir el alfabeto a como posible fuente de toxicidad amiloide.
solo tres aminoácidos, como His, Ile y Gln en los péptidos más Entre las Asambleas amiloideas y la aparición de catalizadores
activos estudiados aquí. Queda por verse cuántas otras actividades proteicos durante la evolución de las enzimas. La capacidad de
podrían descubrirse en ausencia y presencia de otros procesos pantalla múltiple los arreglos estables de grupos funcionales en
biológicos y iones metálicos no biológicos. Además, la diversidad una sola fibrilla proporcionan oportunidades esencialmente
podría ser mejorado en gran medida (por un factor de (n þ n2) / 2, ilimitadas para la detección de alto rendimiento para la actividad
donde n es el número de péptidos) si los péptidos fueron funcional simplemente mezclando péptidos con diferentes
considerados una mezcla binaria de solo dos péptidos. Para probar secuencias. Esperamos que este enfoque forme una herramienta
la posibilidad de una mezcla de dos péptidos podría tener para diseñar los nuevos materiales capaces de realizar catálisis en
interacciones sinérgicas. Para asegurar la mezcla de un péptido ambos naturales y sustratos no naturales. Este trabajo también
dentro de la fibrilla, se mezclaron en diferentes proporciones en podría tener implicaciones para los mecanismos de toxicidad
HCl acuoso (10 mM) y luego se diluyó en El tampón Tris que amiloide, con zinc y cobre iones que alteran la cinética y la
contiene Zn2þ (1 mM) a pH 8 para garantizar una efectividad naturaleza de la proteína de prión celular (PrPc) 31, 32. Además,
mezcla de péptidos antes de la formación de fibrillas. La actividad se ha sugerido que la formación de amiloides. Los péptidos AB
muestra sinergia entre 4 y 7 (Fig. 5a) con la máxima actividad pueden formar complejos con Cu2þ que median la formación de
esterasa observada cuando los péptidos se mezclaron en relación a especies reactivas de oxigeno (ROS) en una incompleta entendido
los individuos, donde un dímero es la especie activa y los péptidos de manera33-35. La facilidad con la que pudimos descubrir los
se distribuyen aleatoriamente en la fibrilla. Por el contrario, si las catalizadores meloproteinas robustos y reproducibles sugerían
fibrillas de los péptidos individuales se dejaron formar primero, y como una fuente posible de toxicidad amiloidea.
luego se mezclaron, no se observó sinergia. En cambio, una lineal
trifluoroacético (TFA)/H2O/triisopropyl silano (TIS)
(95:2.5:2.5, vol/vol) durante 2 h a temperatura ambiente. Los
péptidos crudos eran precipitado y lavado con frío metil-terc-
butilo éter, y purificado en un sistema de cromatografía líquida
de alto rendimiento de fase inversa preparativa (HPLC) (Varian
PROSTAR 210) con una columna preparativa C4 (Vydac),
utilizando un gradiente lineal del solvente a (0,1% TFA en
Millipore H2O) y solvente B (90% CH3CN, 10% H2O, 0,1%
TFA). Las identidades y las purezas de los péptidos purificados
fueron confirmadas por masa de desorción láser asistida por
matriz de ionización de tiempo de vuelo (MALDI-TOF)
Espectrometría con una masa Bruker Autoflex III SmartBeam
MALDI-TOF Espectrómetro. La pureza de los péptidos
obtenidos se evaluó Adicionalmente en un Shimadzu
prominencia UFLC instrumento con un ZORBAX analítico
Eclipse XDB-C18 columna (4,6 mm × 150 mm).

Preparación de stocks y soluciones peptídicas. Los péptidos


liofilizados purificados fueron disueltos en ácido hidroclórico
10mM para hacer la solución stock 1,1M.

La concentración fue determinada usando un Agilent 8453 UV-


Vis usando una absorbancia de 214nm en el espectrofotómetro.
Los coeficientes de extinción para los péptidos en esta longitud
de onda fue calculada usando la literatura valores (37). La
acción de trabajo del pH 8 la solución de péptidos se preparó
mezclando 180 ml de la acción pH 2 con 20 ml isopropanol
seguido por adición de buffer 1,8 ml (25 mm Tris pH 8 que
contiene 1 mm ZnCl2). La adherencia a este protocolo garantiza
la reproducibilidad entre las ejecuciones y proporcionó un
método estándar para comparar diferentes péptidos. La solución
de stock pH 2 fue estable por lo menos una semana, mientras
que la solución de stock de trabajo de péptidos en pH 8 se
preparó inmediatamente antes de los experimentos. Ensayos
cinéticos. Las mediciones cinéticas se realizaron en un termo
Labsystems Lector de placa de espectro Multiskan control de
absorbancia del producto (p-nitrofenol) a 348 nm y 405 nm a
Figura 5 | Interacciones sinérgicas entre péptidos. a, el perfil de
eficiencia catalítica (KCAT/km) muestra sinergias entre 4 y 7 con la
22 8C en placas de 96 pocillos. p-Nitrophenylacetate se utilizó
actividad de esterasa máxima observada cuando los péptidos fueron a partir de un stock de 0,1 M en acetonitrilo (la última el
mezclados en relación con los individuos solos. Los datos contenido de acetonitrilo fue del 2% en todas las mezclas de
experimentales son bien descritos por un modelo simple, donde un reacción). Un volumen de 150 ml de recién solución de sustrato
dímero es la especie activa y los péptidos se distribuyen aleatoriamente preparado en Tris de 25 mm (pH 8), 1 mm ZnCl2 (a un sustrato
en la fibrilla (Fit). B. No se observa ninguna sinergia cuando se final la concentración de 0.195-0.75 milímetros) fue agregada a
preforma las fibrillas de 4 y 7 se mezclan juntas; en cambio, una 50 ml buffered (amortiguador de 25 milímetros) solución de
disminución lineal de la actividad es visto al aumentar la relación de 4 stock de péptidos a pH 8 (hasta una concentración de péptidos
relativo a 7. Condiciones: pH 8; concentración de péptido mantenido a
finales de 24 mm). Los coeficientes de extinción de 1.700,
24 µM; contiene buffer 1 mM Zn²+; las fibrillas se equilibraron por 48
h antes de las mediciones. Las barras de error en todos los gráficos
4.300, 9.100, 12.700 y 16.600 M21 cm21 fueron utilizado para
representan desviaciones estándar de al menos tres mediciones determinar la concentración del producto en los valores de pH
independientes. de 6, 6,5, 7, 7,5 y 8, respectivamente, a 405 nm. Se utilizó un
coeficiente de extinción de 18.700 M – 1 cm21 en pH 8,5 y
Métodos superior a 405 nm. Los coeficientes de extinción reportados
obtenida experimentalmente midiendo espectros UV-Vis de p-
Síntesis de péptidos. Los péptidos fueron sintetizados por
nitrofenol en tampones en diferentes valores de pH. Las
manual fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), síntesis de fase
soluciones de p-nitrofenol fueron obtenidas por la dilución 40-
sólida a elevada temperatura utilizando nuestro previamente
Fold de 2,5 mm de solución de stock de p-nitrofenol en
protocolo divulgado optimizado para los péptidos (36)
acetonitrilo en el apropiado búferes. Los resultados reportados
hidrofóbicos. La segmentación de los péptidos de la resina y de
se obtuvieron promediando al menos tres medidas. Los
la desprotección de la cadena lateral fue alcanzado
parámetros cinéticos (KCAT y km) se obtuvieron ajustando los
simultáneamente por el tratamiento con una mezcla de ácido
datos a la ecuación de Michaelis-Menten {V0 ¼ KCAT [E] 0
[S] 0/(km þ [y])}. valores de KCAT/km se obtuvieron ajustando
la porción lineal de la parcela de Michaelis-Menten a v0 ¼
(KCAT/km) [E] 0 [S] 0. los estudios de Perfil de pH se
realizaron en un Agilent 8453 Espectrofotómetro control de la
absorbancia del producto a 405 nm a 22 8C utilizando una
cubeta de cuarzo de 1 cm. Avolume de solución tampón 150 ml
(los siguientes buffers fueron utilizado en una concentración de
25 mm: mes (pH 6 – 6,5), HEPES (pH 7 – 7,5), Tris (pH 8 –
8.5), se añadieron los grifos (pH 9 – 9.5) y los tapones (pH 10
– 10.5) a 50 ml de péptido solución (en 25 mm Tris pH 8 que
contiene 1 mm de ZnCl2) en una cubeta, seguida de la adición
de 2 ml de 20 mm pNPA en acetonitrilo. Debido a la
precipitación de hidróxido de zinc a altos valores de pH, los
tampones añadidos a valores de pH de 8 y a continuación
contenía 1 mm ZnCl2, los tampones de pH 8,5 – 9 contenían
0,5 mm ZnCl2 (Zn2þ final de 0,625 mm) y a valores de pH
superiores a 9,5 el búfer añadido contenía Sin sales de zinc
(Zn2þ final de 0,25 mm). los cambios del pH que se presentan
de mezclar diferente se tomaron en cuenta los volúmenes de
búfer a diferentes valores de pH. Producto

la formación se monitoreó durante 5 minutos cada 30 s. Los


datos del perfil de pH fueron

ajustar a la siguiente ecuación