You are on page 1of 7

ETAPELE UNUI PROCES

• BIOTEHNOLOGIC

Elaborarea şi industrializarea unei tehnologii de biosinteză presupune parcurgerea
mai multor faze constând în cercetări la nivel de: laborator, pilot şi industrial. Aceste
cercetări permit transpunerea procedeului de biosinteză de la o fază la alta.

1. FAZA DE LABORATOR

Cercetările de obţinere a unui produs prin biosinteză încep cu lucrări de laborator
care sunt prezentate în cele ce urmează.
Izolarea şi selecţia. Se izolează şi se selectează un mare număr de microorganisme
cunoscute din literatura de specialitate ca producători ai compusului ce urmează a fi
biosintetizat. Tehnicile utilizate în acest scop sunt specifice pentru fiecare microorganism şi
sunt realizate de microbiologi cu pregătire corespunzătoare. Manualele de specialitate indică
mai frecvent, pentru izolarea şi selecţia microorganismelor, metode ca: tehnica diluţiilor şi
tehnica granulelor de sol.
Microorganismele sunt preluate din diferite habitate cultivate pe medii solide sau
lichide, astfel încât să fie posibilă punerea în evidenţă a unor caracteristici fiziologice. In
prima etapă se urmăreşte realizarea unei culturi pure prin tehnici microbiologice specifice
(epuizarea ansei, diluţii succesive etc.). în continuare se stabileşte o metodă de triere
(screening) adecvată scopului urmărit.
De obicei, microorganismele sunt cultivate pe plăci Petri, pe medii solidificate cu
agar-agar. Testele de identificare a compusului care interesează pot "fi calitative sau
cantitative. în cazul enzimelor, de exemplu, se aplică, de obicei, metode de identificare
calitativă prin includerea în mediul solid, pe care se cultivă microorganismele, a substratului
specific asupra căruia acţionează enzima ce se doreşte a se sintetiza (amidon în cazul
amilazelor, caseină în cazul proteazelor, celuloză în cazul celulazelor). După dezvoltarea
coloniilor izolate, enzimele difuzează în gelul de agar-agar, atacând substratul inclus în
mediu şi, astfel, zona respectivă poate fi vizualizată, în cazul în care devine transparentă sau
cu un reactiv specific.

2 FUNDAMENTELE BIOTEHNOLOGIEI în cazul altor enzime la care nu se poate aplica un test calitativ. aspect microscopic). specifice fiecărui microorganism şi formează aşa-numita „cultură stoc" de la care se porneşte procesul de biosinteză. De obicei. după metode de întreţinere a culturilor. temperatură. în urma acestor teste se reţin numai câteva tulpini care au dat cele mai bune rezultate în ceea ce priveşte biosinteză enzimei. agitare. aceste tulpini sunt supuse unor lucrări de selecţie naturală şi artificială (mutageneză) în scopul obţinerii de tulpini mutante înalt producătoare. întreţinerea tulpinilor producătoare. titrimetrice. după o perioadă de dezvoltare bine stabilită de către microbiolog (vârstă. De obicei. din etapa următoare. Pentru prepararea unei culturi inocul de laborator. fluorescentă. toxicologice. iar extractul sau lichidul de biosinteză este preluat şi prelucrat în scopul dozării cantitative a acesteia prin metode spec-trofotometrice. în figura 1 poate fi urmărită o instalaţie de laborator {shake-flask cultures) pentru . cultura stoc este păstrată la frigider. Tulpina astfel caracterizată se înregistrează într-o colecţie de microorganisme sub un număr de identificare. tulpinile producătoare se supun unor lucrări de caracterizare după criterii morfologice. Inoculul constituie materialul de însămânţare al mediului de biosinteză propriu-zis. în tub înclinat. Tulpinile din colecţie utilizate în lucrările de biosinteză curente se păstrează sub diferite forme. biochimice. Transvazarea culturii inocul în mediul de biosinteză se realizează în condiţii aseptice. Dintre metodele de conservare amintim: liofilizarea şi conservarea în azot lichid. aerare). polarimetrice.producerea de enzime existente în cadrul Facultăţii de Biotehnologii. Bucureşti. Inoculul reprezintă o cultură microbiana în curs de multiplicare pe un substrat nutritiv corespunzător şi în anumite condiţii specifice de dezvoltare (pH. pe geloză nutritivă. Cultura de inocul. . fiziologice. se porneşte de la o astfel de cultură vegetativă. Atât tulpinile parentale cât şi tulpinile mutante sunt conservate prin metode speciale şi păstrate la temperaturi scăzute. După faza de izolare şi selecţie. coloniile izolate se cultivă pe medii specifice. imunologice. cantitate.

fiind precedată de operaţii de sterilizare a aparaturii utilizate şi a mediului de cultură stabilit. 10 m3. Bucureşti). 1. Pe baza datelor de cercetare obţinute la nivel pilot. Instalaţie de laborator cu flacoane agitate pentru obţinerea enzimelor prin fermentaţie. FAZA DE STAŢIE PILOT Faza de biosinteză propriu-zisă se realizează în aparate speciale. pentru obţinerea enzimelor prin fermentaţie. la nivel de laborator. utilizat pentru producţia de enzime (Facultatea de Biotehnologii. . începutul fazei de biosinteză este considerat momentul transvazării culturii inocul în mediul de cultură sterilizat şi răcit la temperatura de cultivare a microorganismului producător. Când raportul între capacitatea de inocul şi cantitatea de mediu de fermentaţie (numit raport de inoculare) nu permite pregătirea culturii inocul în laborator. Fig. 2. 2. se poate vedea un echipament micropilot (bioreactor de tip „Biotech Braun" de capacitate 5 1). tehnologia elaborată la nivel de laborator este verificată şi optimizată pe instalaţii de biosinteză de capacitate medie (pilot). în faza de staţie pilot. ca fiind optim. 1 m 3.3 FUNDAMENTELE BIOTEHNOLOGIEI Fig. se elaborează aşa-numitul „proces tehnologic pilot" care urmează o fază de experimentare industrială şi apoi producţia propriu-zisă de enzimă. numite bioreactoare de diferite capacităţi (10 1. în figura 2. este necesară introducerea unei trepte intermediare de cultivare. numite „cultură intermediară". 100 m3). 100 1. Bioreactor de laborator.

semisolide. compoziţie. în funcţie de consistenţă. • după tipul respirator al microorganismelor cultivate: medii pentru microorganisme aerobe sau anaerobe. MEDII DE CULTURĂ în procesele biotehnologice. mediile de cultură se clasifică astfel: • după consistenţă: medii lichide. • după scopul şi frecvenţa întrebuinţării: . care conţin numai compuşi cu structură chimică cunoscută. . în afara nişei ecologice naturale.medii sintetice. solide. de origine vegetală sau animală. Compoziţia mediilor de cultură are o mare importanţă asupra reproductibilităţii şi eficienţei tehnologiei respective. care pot fi dozaţi.4 FUNDAMENTELE BIOTEHNOLOGIEI Datele furnizate de tehnologia pilot elaborată constituie elemente de proiectare pentru instalaţiile industriale. care conţin elemente nutritive. . 3. scopul utilizării. mediile de cultură sunt constituite din suporturi nutritive sterilizate care permit dezvoltarea şi studiul unui microorganism. medii naturale. • după compoziţie: .medii de uz curent.

.

mediul optim de cultivare. pentru creşterea randamentului în faza de biosinteză. zaharoză etc). medii speciale utilizate. selective. iar restul este preluat de mediul de cultură cu ajutorul sistemelor de termostatare ale bioreactoarelor. făină de porumb. . Acestea pot fi. de îmbogăţire. Ni. pentru cultura inocul. Fe (din FeCl3). oligoelemente: K (din KC1 sau K:HP04). Mg (din MgS04). Sursa de carbon furnizează. prin cultivarea acestuia. 6 FUNDAMENTELE B10TEHNOLOG1E1 . Co. ceea ce nu permite o standardizare corespunzătoare şi. în general. în biotehnologie se utilizează în mod curent mediile naturale având la bază subproduse agroalimentare: şrot de floarea-soarelui. (NKibSCu etc). o sursă de azot. Mediile naturale sunt. din care o parte este înma- gazinată în compuşii macroergici (ATP). proteine. o sursă de carbon (în general glucide: glucoza. . (NH^PCu. lactoză. în studiile de izolare a microorganismelor la nivel de laborator. în general. care poate fi organic (aminoacizi. pentru cultura de regim. coenzime. • după faza de biosinteză la care este utilizat mediul de cultură poate fi mediu laborator. . se adaugă la mediu precursori care sunt substanţe având porţiuni structurale ale moleculei produsului de biosinteză. prin oxidarea biochimică a glucozei se eliberează o mare cantitate de energie. numite şi medii de fermentaţie sau medii de biosinteză. o sursă de fosfor (H3P04. necesarul de oxigen şi hidrogen în scopul dezvoltării microorgani smului. Spre deosebire de mediile naturale. uree) sau anorganic (NH 3. în general. în consecinţă. nu permite reproducerea procesului de biosinteză cu un randament constant. tărâţe d* grâu. extract de porumb. de soia. . completându-se de obicei cu cantităţi mici de săruri minerale. sursa principală de energie o constituie sursa de carbon. vitamine.microelemente: Mn. amidon. dar prezintă dezavantajul variabilităţii compoziţiei. . elemente nutritive necesare dezvoltării microorganismelor. de identificare. . mediile sintetice sunt perfect repro-ductibile la scară industrială. de conservare. pilot sau mediu de cultură industrial. în procesele de biosinteză. Uneori. în funcţie de scopul urmărit. W. • după destinaţia finală a culturii dezvoltate mediile pot fi: . la rândul lor: elective. mai ieftine. KH2P04 etc). proteine. în procesele catabolice. Un mediu de cultură utilizat pentru dezvoltarea microorganismelor trebuie să conţină întotdeauna: . alegându-se astfel. de asemenea.factori de creştere: aminoacizi. Aceste medii conţin. Compoziţia mediului nutritiv specific pentru un microorganism se stabileşte în laborator. . respectiv glucidele.

extract de porumb. Alte surse de carbon utilizate: siropul de glucoza. magneziu. cobalt. în general. De cele mai multe ori este însă nevoie să se utilizeze un mediu de cultură cât mai ieftin şi posibil de reprodus o perioadă cât mai lungă de timp. Sursa de carbon utilizată în compoziţia mediilor de cultură este suplinită în mod obişnuit de glucide de o anumită puritate sau de un material natural conţinând un amestec de glucide. făină de soia sau distilate solubile). Mediile de cultură utilizate în bioprocesele microbiene trebuie să conţină elementele esenţiale: carbon. sărurile de amoniu) sau amestecuri complexe (extract de drojdie. azot. înlocuirea unui component din compoziţia mediului nutritiv conduce la variaţii în randamentul de producere. dar de obicei acestea sunt aduse de apă sau de alte componente ale mediului. zinc. amidonul de porumb sau de cartofi. mangan. Uneori se adaugă elemente specifice în cantităţi mici. 1970]. necesară dezvoltării nerestrictive a microorganismului. cupru. Medii tipice utilizate în producţia de enzime bacteriene şi fungice au fost descrise de Aunstrup şi Lambert [Aunstrup. In 1970. sulful şi cationii esenţiali sunt. melasa de sfeclă sau de trestie este folosită în multe cazuri drept sursă de zaharoză. hidrolizatul de amidon de cereale (grâu. . molibden. 1977]. calciu şi numeroase alte elemente în cantităţi foarte mici (urme): fier. Sursa de azot poate fi reprezentată în diferite forme de surse anorganice (amoniacul. care sunt necesare funcţiilor celulare de bază [Bridson şi Brecker. oxigen. orez. peptonă. Lambert. fosfor. astfel încât studiul aprofundat al influenţei diferitelor componente ale mediului de cultură asupra biosintezei constituie un element important al cercetărilor în domeniul bioteh-nologiei. Dintre factorii de creştere. iar zerul ca sursă de lactoză. supliniţi de sărurile anorganice. Peppler şi Harrison au demonstrat că există o valoare minimă a concentraţiei elementelor în mediul de cultură. porumb) sunt în mod frecvent folosite ca surse de glucoza. Fosforul. Astfel. 1979. Ratledge a făcut o trecere în revistă a tuturor surselor de carbon posibil de utilizat în industria fermentativă [Ratledge. sulf. Aceasta conduce la utilizarea unor substraturi cât mai ieftine şi mai accesibile în conjunctura economică respectivă. 1983]. tiamina şi biotina sunt necesare pentru creşterea microorganismelor.