ETAPELE UNUI PROCES • BIOTEHNOLOGIC

Elaborarea şi industrializarea unei tehnologii de biosinteză presupune parcurgerea mai multor faze constând în cercetări la nivel de: laborator, pilot şi industrial. Aceste cercetări permit transpunerea procedeului de biosinteză de la o fază la alta.

1. FAZA DE LABORATOR
Cercetările de obţinere a unui produs prin biosinteză încep cu lucrări de laborator care sunt prezentate în cele ce urmează. Izolarea şi selecţia. Se izolează şi se selectează un mare număr de microorganisme cunoscute din literatura de specialitate ca producători ai compusului ce urmează a fi biosintetizat. Tehnicile utilizate în acest scop sunt specifice pentru fiecare microorganism şi sunt realizate de microbiologi cu pregătire corespunzătoare. Manualele de specialitate indică mai frecvent, pentru izolarea şi selecţia microorganismelor, metode ca: tehnica diluţiilor şi tehnica granulelor de sol. Microorganismele sunt preluate din diferite habitate cultivate pe medii solide sau lichide, astfel încât să fie posibilă punerea în evidenţă a unor caracteristici fiziologice. In prima etapă se urmăreşte realizarea unei culturi pure prin tehnici microbiologice specifice (epuizarea ansei, diluţii succesive etc.). în continuare se stabileşte o metodă de triere (screening) adecvată scopului urmărit. De obicei, microorganismele sunt cultivate pe plăci Petri, pe medii solidificate cu agar-agar. Testele de identificare a compusului care interesează pot "fi calitative sau cantitative. în cazul enzimelor, de exemplu, se aplică, de obicei, metode de identificare calitativă prin includerea în mediul solid, pe care se cultivă microorganismele, a substratului specific asupra căruia acţionează enzima ce se doreşte a se sintetiza (amidon în cazul amilazelor, caseină în cazul proteazelor, celuloză în cazul celulazelor). După dezvoltarea coloniilor izolate, enzimele difuzează în gelul de agar-agar, atacând substratul inclus în mediu şi, astfel, zona respectivă poate fi vizualizată, în cazul în care devine transparentă sau cu un reactiv specific.

. fluorescentă. fiziologice. Atât tulpinile parentale cât şi tulpinile mutante sunt conservate prin metode speciale şi păstrate la temperaturi scăzute. specifice fiecărui microorganism şi formează aşa-numita „cultură stoc" de la care se porneşte procesul de biosinteză. Dintre metodele de conservare amintim: liofilizarea şi conservarea în azot lichid. polarimetrice. cantitate. imunologice. din etapa următoare. Tulpina astfel caracterizată se înregistrează într-o colecţie de microorganisme sub un număr de identificare. De obicei. se porneşte de la o astfel de cultură vegetativă. Bucureşti. coloniile izolate se cultivă pe medii specifice. cultura stoc este păstrată la frigider. biochimice. Pentru prepararea unei culturi inocul de laborator.producerea de enzime existente în cadrul Facultăţii de Biotehnologii. în tub înclinat. după metode de întreţinere a culturilor.2 FUNDAMENTELE BIOTEHNOLOGIEI în cazul altor enzime la care nu se poate aplica un test calitativ. iar extractul sau lichidul de biosinteză este preluat şi prelucrat în scopul dozării cantitative a acesteia prin metode spec-trofotometrice. aceste tulpini sunt supuse unor lucrări de selecţie naturală şi artificială (mutageneză) în scopul obţinerii de tulpini mutante înalt producătoare. agitare. aerare). temperatură. De obicei. toxicologice. întreţinerea tulpinilor producătoare. După faza de izolare şi selecţie. Transvazarea culturii inocul în mediul de biosinteză se realizează în condiţii aseptice. Inoculul constituie materialul de însămânţare al mediului de biosinteză propriu-zis. titrimetrice. în figura 1 poate fi urmărită o instalaţie de laborator {shake-flask cultures) pentru . tulpinile producătoare se supun unor lucrări de caracterizare după criterii morfologice. Cultura de inocul. Tulpinile din colecţie utilizate în lucrările de biosinteză curente se păstrează sub diferite forme. după o perioadă de dezvoltare bine stabilită de către microbiolog (vârstă. în urma acestor teste se reţin numai câteva tulpini care au dat cele mai bune rezultate în ceea ce priveşte biosinteză enzimei. pe geloză nutritivă. aspect microscopic). Inoculul reprezintă o cultură microbiana în curs de multiplicare pe un substrat nutritiv corespunzător şi în anumite condiţii specifice de dezvoltare (pH.

Când raportul între capacitatea de inocul şi cantitatea de mediu de fermentaţie (numit raport de inoculare) nu permite pregătirea culturii inocul în laborator. 1 m 3. fiind precedată de operaţii de sterilizare a aparaturii utilizate şi a mediului de cultură stabilit. 100 m3). ca fiind optim. . utilizat pentru producţia de enzime (Facultatea de Biotehnologii. numite „cultură intermediară".3 FUNDAMENTELE BIOTEHNOLOGIEI Fig. Bioreactor de laborator. Bucureşti). Instalaţie de laborator cu flacoane agitate pentru obţinerea enzimelor prin fermentaţie. tehnologia elaborată la nivel de laborator este verificată şi optimizată pe instalaţii de biosinteză de capacitate medie (pilot). se elaborează aşa-numitul „proces tehnologic pilot" care urmează o fază de experimentare industrială şi apoi producţia propriu-zisă de enzimă. se poate vedea un echipament micropilot (bioreactor de tip „Biotech Braun" de capacitate 5 1). FAZA DE STAŢIE PILOT Faza de biosinteză propriu-zisă se realizează în aparate speciale. 2. 100 1. Pe baza datelor de cercetare obţinute la nivel pilot. începutul fazei de biosinteză este considerat momentul transvazării culturii inocul în mediul de cultură sterilizat şi răcit la temperatura de cultivare a microorganismului producător. în faza de staţie pilot. 1. pentru obţinerea enzimelor prin fermentaţie. Fig. numite bioreactoare de diferite capacităţi (10 1. 10 m3. la nivel de laborator. 2. în figura 2. este necesară introducerea unei trepte intermediare de cultivare.

medii de uz curent. 3. semisolide. Compoziţia mediilor de cultură are o mare importanţă asupra reproductibilităţii şi eficienţei tehnologiei respective. . de origine vegetală sau animală. solide. care conţin elemente nutritive. care pot fi dozaţi. - . mediile de cultură sunt constituite din suporturi nutritive sterilizate care permit dezvoltarea şi studiul unui microorganism. • după scopul şi frecvenţa întrebuinţării: . în afara nişei ecologice naturale. în funcţie de consistenţă. • după compoziţie: medii naturale. compoziţie. care conţin numai compuşi cu structură chimică cunoscută.4 FUNDAMENTELE BIOTEHNOLOGIEI Datele furnizate de tehnologia pilot elaborată constituie elemente de proiectare pentru instalaţiile industriale.medii sintetice. • după tipul respirator al microorganismelor cultivate: medii pentru microorganisme aerobe sau anaerobe. scopul utilizării. MEDII DE CULTURĂ în procesele biotehnologice. mediile de cultură se clasifică astfel: • după consistenţă: medii lichide.

.

(NKibSCu etc). de îmbogăţire. alegându-se astfel. mai ieftine. din care o parte este înma- gazinată în compuşii macroergici (ATP). necesarul de oxigen şi hidrogen în scopul dezvoltării microorgani smului. pentru cultura de regim.microelemente: Mn. de conservare. de identificare. Un mediu de cultură utilizat pentru dezvoltarea microorganismelor trebuie să conţină întotdeauna: o sursă de carbon (în general glucide: glucoza. făină de porumb. selective. o sursă de azot. (NH^PCu. pilot sau mediu de cultură industrial. de soia. Compoziţia mediului nutritiv specific pentru un microorganism se stabileşte în laborator. de asemenea. Sursa de carbon furnizează. Aceste medii conţin. coenzime. . . Uneori. Mediile naturale sunt. Co. uree) sau anorganic (NH 3. Spre deosebire de mediile naturale. Acestea pot fi. la rândul lor: elective. respectiv glucidele. vitamine. zaharoză etc). în funcţie de scopul urmărit. • după faza de biosinteză la care este utilizat mediul de cultură poate fi mediu laborator. W. iar restul este preluat de mediul de cultură cu ajutorul sistemelor de termostatare ale bioreactoarelor. Mg (din MgS04). în consecinţă. în procesele de biosinteză. în general. pentru creşterea randamentului în faza de biosinteză. se adaugă la mediu precursori care sunt substanţe având porţiuni structurale ale moleculei produsului de biosinteză. în general. sursa principală de energie o constituie sursa de carbon. amidon. numite şi medii de fermentaţie sau medii de biosinteză. nu permite reproducerea procesului de biosinteză cu un randament constant. în general. mediile sintetice sunt perfect repro-ductibile la scară industrială. proteine. în studiile de izolare a microorganismelor la nivel de laborator.6 FUNDAMENTELE B10TEHNOLOG1E1 medii speciale utilizate. elemente nutritive necesare dezvoltării microorganismelor.factori de creştere: aminoacizi. în procesele catabolice. mediul optim de cultivare. oligoelemente: K (din KC1 sau K:HP04). extract de porumb. prin cultivarea acestuia. dar prezintă dezavantajul variabilităţii compoziţiei. Fe (din . - - FeCl3). • după destinaţia finală a culturii dezvoltate mediile pot fi: pentru cultura inocul. o sursă de fosfor (H3P04. KH2P04 etc). Ni. proteine. prin oxidarea biochimică a glucozei se eliberează o mare cantitate de energie. care poate fi organic (aminoacizi. ceea ce nu permite o standardizare corespunzătoare şi. completându-se de obicei cu cantităţi mici de săruri minerale. în biotehnologie se utilizează în mod curent mediile naturale având la bază subproduse agroalimentare: şrot de floarea-soarelui. lactoză. tărâţe d* grâu.

Ratledge a făcut o trecere în revistă a tuturor surselor de carbon posibil de utilizat în industria fermentativă [Ratledge. zinc. sulf. sărurile de amoniu) sau amestecuri complexe (extract de drojdie. azot. Dintre factorii de creştere. magneziu. făină de soia sau distilate solubile). amidonul de porumb sau de cartofi. 1979. porumb) sunt în mod frecvent folosite ca surse de glucoza.In 1970. sulful şi cationii esenţiali sunt. Medii tipice utilizate în producţia de enzime bacteriene şi fungice au fost descrise de Aunstrup şi Lambert [Aunstrup. Sursa de carbon utilizată în compoziţia mediilor de cultură este suplinită în mod obişnuit de glucide de o anumită puritate sau de un material natural conţinând un amestec de glucide. hidrolizatul de amidon de cereale (grâu. 1977]. . fosfor. dar de obicei acestea sunt aduse de apă sau de alte componente ale mediului. extract de porumb. Uneori se adaugă elemente specifice în cantităţi mici. molibden. cobalt. supliniţi de sărurile anorganice. Peppler şi Harrison au demonstrat că există o valoare minimă a concentraţiei elementelor în mediul de cultură. Sursa de azot poate fi reprezentată în diferite forme de surse anorganice (amoniacul. Aceasta conduce la utilizarea unor substraturi cât mai ieftine şi mai accesibile în conjunctura economică respectivă. De cele mai multe ori este însă nevoie să se utilizeze un mediu de cultură cât mai ieftin şi posibil de reprodus o perioadă cât mai lungă de timp. oxigen. iar zerul ca sursă de lactoză. care sunt necesare funcţiilor celulare de bază [Bridson şi Brecker. 1970]. Alte surse de carbon utilizate: siropul de glucoza. înlocuirea unui component din compoziţia mediului nutritiv conduce la variaţii în randamentul de producere. cupru. necesară dezvoltării nerestrictive a microorganismului. Lambert. mangan. 1983]. Fosforul. peptonă. Mediile de cultură utilizate în bioprocesele microbiene trebuie să conţină elementele esenţiale: carbon. melasa de sfeclă sau de trestie este folosită în multe cazuri drept sursă de zaharoză. Astfel. calciu şi numeroase alte elemente în cantităţi foarte mici (urme): fier. orez. în general. tiamina şi biotina sunt necesare pentru creşterea microorganismelor. astfel încât studiul aprofundat al influenţei diferitelor componente ale mediului de cultură asupra biosintezei constituie un element important al cercetărilor în domeniul bioteh-nologiei.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful