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MICROSCOPIA
1. INTRODUCCION
Desde los inicios de la microscopia, los investigadores vienen desarrollando métodos cada
vez más sensibles, eficaces y con mejor resolución. Al principio, se enfrentaron a los
problemas de aberraciones ópticas, imágenes borrosas y pobre desarrollo de lentes, los
cuales se mantuvieron hasta mediados del siglo XIX, donde aparecieron los lentes objetivos
que reducían la aberración cromática con una apertura numérica entre 0.65 y 1.25. Estos
avances se iniciaron con los reportes sobre los métodos de iluminación que propuso el
profesor August Kölher, en 1893, y que sentaron las bases de la microfotografía moderna.
En las últimas décadas se ha incrementado la aplicación de la microscopía óptica en los
laboratorios de investigación de una amplia variedad de disciplinas como la biología celular
y molecular, microbiología, inmunología y virología. El rápido desarrollo de diferentes
métodos como los de fluorescencia, contraste de fases, confocal y de campo oscuro entre
otros, que sumados a los avances en la digitalización y análisis de imágenes, han permitido
a los microscopistas obtener resultados rápidos, cuantificables y confiables de una gran
variedad de especimenes biológicos. Al margen de estos avances, las bases del
funcionamiento de los distintos tipos de microscopios ópticos siguen siendo los mismos que
se presentan en esta práctica y con los cuales el estudiante deberá familiarizarse.
CLASES DE MICROSCOPIOS
PARTE MECÁNICA
PARTE ÓPTICA
Está integrada por los objetivos, oculares y el aparato de iluminación (espejo, diafragma,
condensador y filtros). Estos elementos son los que permiten la iluminación, ampliación y
la visión aumentada del objetivo.
a. Objetivo: Es la pieza más importante del microscopio. Ellos se acoplan mediante roscas
estándar al revólver y pueden ser cambiados de posición con sólo rotarlos. Reciben el
nombre de objetivos porque son los lentes que están más cerca del objeto. La mayoría de
los microscopios tienen tres o cuatro objetivos. Las lentes de los objetivos son de aumentos
diversos, los más usados son: Objetivos de pequeños aumentos 3.5x; 4x, 5x, 6x, 8x y 10x;
objetivos de grandes aumentos 40x, 45x, 50x y objetivos de inmersión 90x, 95x y 100x.
Las lentes de inmersión se emplean con aceite de inmersión para conectar la lente frontal
(lente inferior del objetivo) al porta-objeto. Entre el objetivo y el objeto se produce una
pérdida de luz por reflexión que se corrige adicionando al preparado unas gotas de aceite
de cedro (aceite de inmersión) cuyo índice de refracción 1.515, es próximo al cristal. Este
aceite también reduce o suprime por completo la refracción de los rayos de luz
provenientes de la fuente luminosa.
b. Ocular: Están colocados en la parte superior del tubo ocular. Está formado por dos
sistemas de lentes dispuestos de un cilindro. Su finalidad es aumentar la imagen dada por
el objetivo y eventualmente corregir algunos defectos de la misma. Reciben dicho nombre
porque son las lentes que se encuentran más cerca del ojo. Hay oculares de 3.5x; 5x; 6,3x;
10x; 12.5x; 15x; 20x y 25x.El aumento de la imagen de un objeto observado a través de un
microscopio, se calcula multiplicando el número de aumento del objetivo con el cual se está
trabajando por el número de aumento del ocular que se está utilizando.
AUMENTO DEL MICROSCOPIO: Esta propiedad es la relación directa entre la imagen real y la
que obtenemos por medio del objetivo, queriendo decir con esto que si ampliamos el aumento
del objetivo, obtendremos una imagen aumentada cuantas veces como aumentos tenga el
objetivo.
CAMPO DE VISIÓN
El campo de visión de un microscopio es la zona circular que se observa al mirar la
preparación bajo un determinado aumento. Para medir el campo de visión de un
microscopio, se debe usar una unidad llamada micra. Una micra equivale a 0,001 mm; en
otras palabras, hay 1000 micras en un milímetro. El diámetro de este campo es su medida.
MICROSCOPIO ESTEREOSCOPIO
Se utiliza para ofrecer una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. Para ello, y como
ocurre en la visión binocular convencional, es necesario que los dos ojos observen la imagen
con ángulos ligeramente distintos. Obviamente todos los microscopios estereoscópicos, por
definición, deben ser binoculares, por lo que a veces se confunden ambos términos.
TEMAS DE CONSULTA
COMPETENCIAS
MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales:
Gotero, Láminas portaobjeto, láminas cubreobjeto, Solución limpiadora de lentes, Aceite
de inmersión, Papel arroz, cristales de sulfato de cobre, papel milimetrado,
Materiales que trae el estudiante: Recorte de periódico, Recortes de tela o hilos de
colores, Polen de flores, cristales de azúcar, tijeras.
METODOLOGIA
ACTIVIDAD 1. IDENTIFICACIÓN DE LAS PARTES DEL MICROSCOPIO
Una vez se socializan las partes del microscopio según las instrucciones dadas por el
docente, pase a identificar las partes del microscopio compuesto y posteriormente
ubíquelas en el esquema adjunto en la hoja de los resultados.
La preparación debe estar enfocada a 40X (objetivo seco), basta con girar el revólver de
modo que el objetivo de inmersión quede en una posición intermedia (40X y 100X).
Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el cubre objeto, sin mover la platina para
evitar que se desenfoque la muestra a observar.
Lleve el objetivo de inmersión al eje óptico.
Utilice el tornillo micrométrico para lograr el enfoque del objeto, si es necesario
modifique la cantidad de luz del condensador para que la imagen se vea más clara.
Al finalizar la observación baje la platina, retire la preparación y limpie tanto el objetivo
como la preparación con un paño humedecido con solución para limpiar lentes.
Seleccione una letra (e, x, o, r) de papel periódico que tenga un tamaño mediano, (arial
8 ) sobre una lámina portaobjetos deje caer una gota de agua en el centro de la placa,
ubique la letra sobre la gota de agua, cubra la letra con una lámina cubreobjetos
formando un ángulo de 45 grados entre el portaobjetos y el cubreobjetos. Déjelo caer
lentamente para evitar la formación de burbujas en la placa.
Coloque la placa ya preparada sobre la platina de tal manera que quede bien ajustada. Enfoque
con el objetivo de 4X utilizando el tornillo macrométrico. Abra el diafragma hasta que obtenga
una buena iluminación de la muestra. Utilice el tornillo micrométrico para obtener mayor
nitidez, dibuje lo que observa en el espacio asignado para esto en los resultados.
Luego gire lentamente el revólver para colocar el objetivo 10X. Utilice el tornillo
micrométrico para obtener una imagen nítida. No utilice el tornillo macrométrico; éste
no es necesario si usted enfocó correctamente con el objetivo de 4X. Si se requiere abra
un poco el diafragma para aumentar la entrada de luz.
Dibuje lo que observa en el objetivo de 10X. Repita la operación con el lente de 40X.
Al terminar su observación gire lentamente el revólver y coloque el objetivo de 4X,
ahora realice desplazamientos del microscopio de izquierda a derecha y luego de arriba
abajo.
Observe con atención que pasa con los movimientos que realiza y que sucede con la
imagen?
Cuál es la posición de la imagen?
Realice esquemas secuenciales en 4X, 10X y 40 X. (Utilice un círculo para simular el campo
visual)
ACTIVIDAD 3. (PROFUNDIDAD DE ENFOQUE Y PODER DE RESOLUCIÓN) MONTAJE CON
HILOS DE COLORES
Cuál es el orden de los hilos en su laminilla de arriba hacia abajo enfocando con el tornillo
macrométrico?
Según vaya enfocando, usted verá que los diferentes hilos enfocan a diferente nivel.
Un hilo o parte de un hilo está enfocado mientras que los otros se verán opacos.
Enfocando hacia arriba y hacia abajo los hilos, usted puede percibir la profundidad de
enfoque que no es evidente cuando el enfoque se deja en un mismo punto.
Por tanto, bastará con realizar un sencillo cálculo matemático para saber el nuevo diámetro.
Diámetro del objetivo por hallar= Diámetro calculado en objetivo anterior/ objetivo de
donde se determinó el diámetro/objetivo por determinar el diámetro.
Ponga el espécimen o muestra en la platina; si está húmedo colóquelo sobre una placa Petri
o una laminilla.
Prenda y ajuste la fuente de luz. Algunos microscopios tienen la fuente de luz integrada al
microscopio mientras que otros la tienen aparte. Asegúrese de que la fuente de luz esté
iluminando su espécimen.
Enfoque el objeto que desea ver y muévalo hacia arriba, hacia abajo y hacia los lados. ¿Hacia
dónde se mueve la imagen? ¿Puede explicar estas observaciones.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
1. Becker Wayne; Kleismith Lewis; Hardin Jeff. El mundo de la célula. sexta edición 2007.
2. Audesirk, T., Audesirk, G. y Byers, B.E. (2008). Biología. La vida en la tierra. 8a Edición.
Editorial Prentice-Hall. [LIBRO TEXTO]
3. Curtis, H., N. S. Barnes., A. Schnek y G. Flores. (2008). Biología. . 7a edición, Editorial
Médica Panamericana, S. A. Argentina.
4. Cooper Geoffrey y Hausman Robert. La célula. Marban libros. 2008.
5. http://www.curtisbiologia.com/node/70