Ivonne Wendolyne González Robles

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN

TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.

ESTUDIO DE LA FERMENTACIÓN DEL JUGO DE

AGAVE EN CULTIVOS MIXTOS DE LEVADURAS
TEQUILERAS DEL GÉNERO Kloeckera Y Saccharomyces:
“EFECTO DEL SISTEMA FERMENTATIVO Y LAS
CONDICIONES NUTRIMENTALES ”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO
ACADEMÍCO DE
MAESTRO EN CIENCIA Y
TECNOLOGÍA EN LA
ESPECIALIDAD DE PROCESOS
AGROINDUSTRIALES
PRESENTA:
IBQ. IVONNE WENDOLYNE GONZÁLEZ ROBLES
GUADALAJARA, JAL. ENERO 2012.

TITULO
Estudio de la fermentación del jugo de agave
en cultivos mixtos de levaduras tequileras
del género Kloeckera y Saccharomyces:
Efecto del sistema fermentativo y las
condiciones nutrimentales
2
AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS
A Dios por brindarme la posibilidad de poder concluir esta grandiosa etapa en mi vida, a mis padres y familiares
por su apoyo incondicional, a la Dra. Dulce María Díaz Montaño por darme la oportunidad de incorporarme a
su grupo de investigación, por los sabios consejos, amistad y paciencia mostrada para el desarrollo y culminación
de este trabajo de investigación, a la Dra. Mirna Estarrón Espinosa por su paciencia y constante apoyo
proporcionado en la parte cromatográfica y analítica de este trabajo de tesis, al Dr. Héctor Escalona por la
asesoría en la etapa sensorial y estadística y al Dr. Enrique Herrera por su apoyo durante el montaje y
monitoreo de los experimentos desarrollados en continuo.
A todos mis compañeros del laboratorio de Biotecnología Industrial por su constante apoyo y ánimo.
Al CIATEJ por el apoyo en instalaciones y laboratorios y a todas las personas tan amables que laboran en él que
hicieron posible y llevadero cada día de trabajo.
A CONACYT por la beca otorgada y al proyecto PROTECO No. 24547, SEP-CONACYT por el financiamiento
otorgado.
4
CIENCIA Y TECNOLOGIA
Guadalajara, Jalisco a 6 de Enero del 2012
Dr. Guillermo Rodríguez Vilomara

Director de Posgrado
PICYT-CIDESI
Querétaro
Los abajo firmantes miembros del comité tutorial del estudiante Ivonne Wendolyne
González Robles, una vez leída y revisada la Tesis titulada “ESTUDIO DE LA
FERMENTACIÓN DEL JUGO DE AGAVE EN CULTIVOS MIXTOS DE
LEVADURAS TEQUILERAS DEL GÉNERO KLOECKERA Y SACCHAROMYCES:
EFECTO DEL SISTEMA FERMENTATIVO Y LAS CONDICIONES
NUTRIMENTALES” aceptamos que la referida tesis revisada y corregida sea presentada
por el alumno para aspirar al grado de Maestro en Ciencia y Tecnología en la opción
terminal de Procesos Agroindustriales durante el examen correspondiente.
Y para que así conste firmamos la presente a los seís días del mes de Enero del año 2012.
Nombre y firma Nombre y firma

Tutor Tutor en Planta
Nombre y firma
Asesor

CIENCIA Y TECNOLOGIA

Guadalajara, Jalisco a 6 de Enero del 2012
Dr. Guillermo Rodríguez Vilomara

Director de Posgrado
PICYT-CIDESI
Querétaro
Los abajo firmantes miembros del Jurado del Examen de Grado del estudiante Ivonne
Wendolyne González Robles, una vez leída y revisada la Tesis titulada “ESTUDIO DE
LA FERMENTACIÓN DEL JUGO DE AGAVE EN CULTIVOS MIXTOS DE
LEVADURAS TEQUILERAS DEL GÉNERO KLOECKERA Y SACCHAROMYCES:
EFECTO DEL SISTEMA FERMENTATIVO Y LAS CONDICIONES
NUTRIMENTALES” aceptamos que la referida tesis revisada y corregida sea presentada
por el alumno para aspirar al grado de Maestro en Ciencia y Tecnología en la opción
terminal de Procesos Agroindustriales durante el examen correspondiente.
Y para que así conste firmamos la presente a los seís días del mes de Enero del año 2012

Presidente Secretario

Vocal Vocal
Nombre y firma
Vocal
6
Índice de Contenido
CONTENIDO Pág.
Índice de Contenido …………………………………………………………………... I

Índice de Tablas ………………………………………………………………………. VII
Índice de Figuras ……………………………………………………………………… XI
Glosario de Abreviaturas y Símbolos ………………………………………………… XV
Titulo ………………………………………………………………………………….. 2
Agradecimientos ……………………………………………………………………… 3
Abstract ……………………………………………………………………………….. 5
Resumen ………………………………………………………………………………. 9
Antecedentes ………………………………………………………………………….. 12
Hipótesis ………………………………………………………………………………. 15
Justificación …………………………………………………………………………… 17
Objetivos ……………………………………………………………………………… 20
Objetivos general ……………………………………………………………………. 20
Objetivos específicos ………………………………………………………………. 20
Impacto ………………………………………………………………………………... 21
1. Fundamentación ……………………………………………………………………. 23
1.1 Proceso y elaboración de Tequila ………………………………………………. 24
1.2 Fermentación alcohólica ……………………………………………………….. 25
1.3 Levaduras y su metabolismo …………………………………………………… 27
1.3.1 Selección de levaduras …………………………………………………… 27
1.3.2 Capacidades fermentativas y producción de aromas de levaduras 28

convencionales y no convencionales …………………………………………...
1.4 Tipos de cultivo …………………………………………………………………. 31
1.4.1 Cultivo Puro ………………………………………………………………. 31
1.4.2 Cultivos Mixtos …………………………………………………………… 32
Selección de levaduras en cultivos mixtos ………………………............... 34
1.4.3 Sistemas de fermentación …………………………………………………. 35
1.4.3.1 Cultivo por lote …………………………………………………… 35
I
1.4.3.2 Fases del crecimiento microbiano por lote ………………………... 36

1.4.3.3 Cultivo continuo …………………………………………………... 39
1.5 Compuestos volátiles en bebidas alcohólicas fermentadas …………………….. 41
1.5.1 Compuestos volátiles …..………………………………………………… 42
1.5.1.1 Alcoholes Superiores …………………………………………….. 43
1.5.1.2 Glicerol …………………………………………………................ 44
1.5.1.3 Ácidos orgánicos …………………………………………………. 45
1.5.1.4 Ésteres …………………………………………………................. 45
1.5.1.5 Grupos carbonilo ………………………………………………… 47
1.5.1.6 Aldehídos …………………………………………………............ 47
1.5.1.7 Cetonas …………………………………………………................ 48
1.5.1.8 Compuestos azufrados …………………………………………… 49
1.5.1.9 Fenoles …………………………………………………………… 50
1.5.1.10 Terpenos ………………………………………………………… 50
1.5.1.11 Amidas y aminas ………………………………………………... 52
1.6 Técnicas Instrumentales y sensoriales empleadas para la caracterización del
sabor de alimentos y bebidas ……………………………………………………….. 52
1.6.1 Técnicas Instrumentales .…………………………………………………. 52
1.6.2 Técnicas Sensoriales …………………………………………………….. 53
2. Procedimiento y método ………………………………………………………...…. 55
2.1 Levaduras empleadas ………………………………………………………...… 56
2.1.1 Conservación de los microorganismos …………………………………… 56
2.2 Medios de cultivo y condiciones de fermentación ……………………………... 57
2.2.1 Medio y condiciones de propagación …………………………………….. 57
2.2.2 Medio de fermentación …………………………………………………... 58
2.3 Sistemas de fermentación ………………………………………………………. 59
2.3.1 Cultivo por lote ………………………………………………………… 59
2.3.2 Cultivo en continuo ………………………………………………………. 60
2.4 Métodos Analíticas ……………………………………………………………... 62
2.4.1 Análisis de biomasa y viabilidad celular …………………………………. 62
2.4.1.1 Población Celular ………………………………………………… 62
II
2.4.1.2 Peso Seco ………………………………………………………… 64

2.4.1.3 Viabilidad Celular ………………………………………………... 65
2.4.2 Análisis de los sustratos y productos de la fermentación ………………… 68
2.4.2.1 Análisis de azúcares reductores ………………………………….... 68
Preparación de la solución de DNS ………………………………. 68
Solución de Glucosa ….………………………………………….... 69
Curva de Calibración ….……………………………….................. 69
Determinación de azúcares reductores directos ……….................. 69
2.4.2.2 Análisis de amonio ….………………………………...................... 70
2.4.4 Análisis de etanol ………………………………………………………… 71
2.4.5 Destilación del mosto fermentado ….……………………………….......... 72
2.4.6 Análisis de fructosa, glucosa y de compuestos producidos durante la 74

fermentación…………………………………………………………………….
2.4.6 Análisis de compuestos volátiles minoritarios en mosto ………………… 74
2.4.7 Análisis de compuestos volátiles mayoritarios en destilado……………… 76
2.4.8 Análisis de compuestos volátiles minoritarios en destilado ……………… 77
2.4.9 Análisis sensorial ………………………………………………………… 78
2.5 Diseños Experimentales ………………………………………………………... 80
2.5.1 Diseños unifactoriales ……………………………………………….......... 80
2.5.2 Diseños multifactoriales ………………………………………………....... 80
2.5.3 Diseños factoriales ………………………………………………............... 81
2.6 Ecuaciones para el cálculo de los parámetros cinéticos, rendimientos,
productividades y eficiencia alcohólica ………………………………………………. 83
2.6.1 Cálculo de las variables en los cultivos por lote ………………………... 83
Parámetros cinéticos en el cultivo por lote ……………………………... 83
Velocidades instantáneas en el cultivo por lote ………………… 83
Velocidades específicas en el cultivo por lote ………................... 84
Rendimientos en el cultivo por lote ……….................................. 84
Productividades en el cultivo por lote ……….............................. 84
2.6.2 Cálculo de las variables en los cultivos en continuo ………...................... 85
III
2.6.2.1 Parámetros cinéticos en el cultivo en continuo ………...... 85

Velocidades instantáneas, específicas y rendimientos en
cultivo en continuo ………............................................................. 85
Productividades en el cultivo en continuo ………......................... 86
2.7 Programas de software empleados para cálculos, gráficas y análisis de datos …. 87
3. Resultados y discusiones………................................................................................. 88
3.1 Fermentación de jugo de agave por lote utilizando las levaduras del
género Saccharomyces (S1 y S2) y Kloeckera (K1 y K2) en cultivo puro y
mixto ………........................................................................................................ 89
3.1.1 Análisis de las cinéticas de fermentación en cultivo puro ………………... 89
3.1.2 Análisis de las cinéticas de fermentación en cultivo mixto ……................. 93

3.1.3 Análisis de compuestos volátiles de las fermentaciones en cultivo
puro y mixto ............................................................................................... 97
3.2 Caracterización de los compuestos volátiles en destilados obtenidos con las
levaduras de estudio S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo puro en 103
medio basal .................................................................................................................
3.2.1 Análisis de compuestos volátiles mayoritarios …………………………... 104
3.2.2 Análisis de compuestos volátiles minoritarios …………………………… 107
3.2.3 Evaluación sensorial ……………………………………………………… 111
3.2.4 Conclusiones ……………………………………………………………... 114
3.3 Efecto de ciertos factores de crecimiento sobre la supervivencia y capacidad
fermentativa de Kloeckera africana (K1) en cultivo puro y mixto con
Saccharomyces (S1) ……………………………………………………………....... 116
3.3.1 Análisis de las cinéticas de fermentación en cultivo puro y mixto en
medio reformulado ……………………………………………………………... 116
3.3.2 Análisis de los compuestos volátiles en mosto obtenidos en cultivo puro
y mixto ……………………………………………………………..................... 120
3.4 Caracterización de los compuestos volátiles en destilados obtenidos con las
levaduras de estudio S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto
en medio reformulado ……………………………………………………………..... 125
IV
3.4.1 Análisis de compuestos volátiles mayoritarios …………………………... 126

3.4.2 Análisis de compuestos volátiles minoritarios …………………………... 130
3.4.3 Conclusiones ……………………………………………………………... 136
3.5 Efecto de las condiciones operacionales y nutrimentales sobre la supervivencia,
capacidad fermentativa y aromática de Kloeckera africana (K1) al trabajar en
cultivo mixto con Saccharomyces cerevisiae (S1) en cultivo continuo ……………. 137
3.5.1 Efecto de las condiciones nutrimentales y operacionales sobre las
capacidades fermentativas de Kloeckera africana (K1) al trabajar en cultivo
mixto con Saccharomyces cerevisiae (S1) en cultivo continuo ………………... 137
3.5.2 Análisis de compuestos volátiles en mosto de las fermentaciones
efectuadas en cultivo mixto en continuo de Kloeckera africana (K1) y
Saccharomyces cerevisiae (S1) ………………………………………………… 150
3.5.3 Análisis de compuestos volátiles mayoritarios de los destilados obtenidos
de las fermentaciones en cultivo mixto en continuo de Kloeckera africana (K1)
y Saccharomyces cerevisiae (S1) ……………………………………………… 156
3.5.4 Análisis de compuestos volátiles minoritarios de los destilados obtenidos
de las fermentaciones en cultivo mixto en continuo de Kloeckera africana (K1)
y Saccharomyces cerevisiae (S1) ……………………………………………… 164
3.5.5 Evaluación sensorial ……………………………………………………… 175
3.5.6 Conclusiones ……………………………………………………………... 185
Discusión General …………………………………………………………….............. 187
Conclusiones Generales ……………………………………………………………..... 193
Perspectivas ……………………………………………………………........................ 197
Bibliografía ……………………………………………………………........................ 199
Anexos ……………………………………………………………............................... 209
Anexo 1. Composición del medio agar nutriente WL de Fluka Analytical………...... 210
Anexo 2. Compuestos minoritarios calibrados y homólogos (familia química)
cuantificados a partir del estándar puro………………………………………………... 211
Anexo 3. Cuestionario evaluación hedónica ………………………………………….. 213
Anexo 4. Cuestionario “A” “No-A” y descriptores sensoriales de olor, aroma, gusto y 215
sensaciones táctiles
V
Anexo 4. Modelos matemáticos y matemático-fisiológicos para las cinéticas ……… 217

Anexo 5. Cartas de Aceptación Congresos Nacionales e Internacionales …………... 219

VI
Índice de Tablas
Tabla 1.1 Productos secundarios de las fermentaciones llevadas a cabo por K.

apiculata (K), H. guillermondii (H) y S. cerevisiae (S) en cultivos puros, mixtos y
secuenciales ……………………………………………………………....................... 33
Tabla 1.2 Compuestos volátiles de levaduras no-Saccharomyces ……........................ 34
Tabla 2.1 Concentración mínima inhibitoria de CYH en mg/mL obtenida para las
levaduras K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1) en cultivos puro y mixto ………….. 66
Tabla 2.2 Concentración celular obtenida para K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1)
en cultivo puro y mixto en los medios WL y YEPD ………………………………… 66
Tabla 2.3 Composición de la solución de DNS ……………………………………… 66
Tabla 3.1 Comparación de los parámetros cinéticos para las diferentes cepas
estudiadas en cultivo puro ……………………………………………………………. 93
estudiadas en cultivo mixto …………………………………………………………... 96
Tabla 3.3 Concentración de compuestos volátiles producidas por las levaduras
Kloeckera africana (K1), Kloeckera apiculata (K2), Saccharomyces cerevisiae (S1)
y Saccharomyces cerevisiae (S2) en cultivos puros y mixtos ……………………….. 101
Tabla 3.4 PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada
para cada componente ………………………………………………………………... 103
Tabla 3.5 Concentración de compuestos volátiles mayoritarios producidos por K.
africana (K1) y S. cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto ………………………….. 105
Tabla 3.7 Concentración de compuestos volátiles minoritarios producidos por los
destilados de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1) en cultivos puros y mixtos …….. 109
estudiadas en cultivo puro y mixto …………………………………………............... 120
Tabla 3.10 Concentración de compuestos volátiles en mosto producidas por las
levaduras Kloeckera africana (K1), y Saccharomyces cerevisiae (S1) en cultivo puro
VII
Índice de Tablas
y mixto ………………………………………….......................................................... 124
para cada componente …………………………………………................................... 125
Tabla 3.12 Concentración de compuestos volátiles mayoritarios producidos por K.
africana (K1) y S. cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto ………………………….. 127
Tabla 3.14 Concentración de compuestos volátiles minoritarios producidos por los
destilados de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1) en cultivos puros y mixtos …….. 132
Tabla 3.16 Condiciones experimentales y factores estudiados en la fermentación en
continuo de K. africana (K1) en cultivo mixto con S. cerevisiae (S1) ………………. 138
Tabla 3.17 Concentración final de sustratos, productos y producción de metabolitos
obtenidos en los estados estacionarios de las primeras cuatro condiciones probadas
en las fermentaciones en continuo de K. africana y S. cerevisiae en cultivo mixto en
medio reformulado …………………………………………........................................ 146
Tabla 3.18 Concentración final de sustratos, productos y producción de metabolitos
en los estados estacionarios de las últimas cinco condiciones probadas de las
fermentaciones en continuo de K. africana y S. cerevisiae en cultivo mixto en medio
basal y el punto al centro …………………………………………............................... 147
Tabla 3.19 Parámetros cinéticos obtenidos en los estados estacionarios de las
diferentes condiciones probadas de las fermentaciones en continuo de K. africana y
S. cerevisiae en cultivo mixto …………………………………………....................... 148
Tabla 3.20 Concentración de compuestos volátiles en mosto en medio reformulado
de las fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1) y S.
cerevisiae (S1) …………………………………………............................................... 153
Tabla 3.21 Concentración de compuestos volátiles en mosto en medio basal y punto
al centro de las fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1) y
VIII
Índice de Tablas
S. cerevisiae (S1) …………………………………………........................................... 154
Tabla 3.23 Análisis de varianza (ANOVA) de los puntajes de los componentes
principales (PC) de los cultivos mixtos, debidos a la temperatura, oxígeno y medio
de fermentación …………………………………………............................................. 156
Tabla 3.24 Concentración de compuestos volátiles mayoritarios obtenidos en medio
reformulado de las fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1)
y S. cerevisiae (S1) …………………………………………........................................ 161
Tabla 3.25 Concentración de compuestos volátiles mayoritarios obtenidos en medio
basal y en el punto al centro de las fermentaciones en cultivo mixto de K. africana
(K1) y S. cerevisiae (S1) en reactor continuo ………………………………………... 162
para cada componente ………………………………………….................................. 163
de fermentación …………………………………………............................................. 164
Tabla 3.28 Concentración de compuestos volátiles minoritarios obtenidos en medio
reformulado de las fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1)
y S. cerevisiae (S1) …………………………………………........................................ 168
Tabla 3.29 Concentración de compuestos volátiles minoritarios obtenidos en medio
basal y punto al centro de las fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K.
africana (K1) y S. cerevisiae (S1) …………………………………………………… 169
173
para cada componente …………………………………………..................................

de fermentación …………………………………………............................................. 174
IX
Índice de Tablas
Tabla 3.32 PLS factor loadings de los compuestos volátiles (variable en X) y

atributos sensoriales (variables en Y) y su varianza explicada para cada componente. 180
Tabla 3.33 PLS factor loadings de los compuestos volátiles (variable en X) y
frecuencia de descriptores sensoriales (variables en Y) y su varianza explicada para
cada componente. 183
X
Índice de Figuras
Figura 1.1 Proceso de producción del Tequila ……………………………………….. 25

Figura 1.2 Fermentación Alcohólica …………………………………………………. 26
Figura 1.3 Cinética típica de un cultivo microbiano por lote ………………………… 36
Figura 1.4 Cinética típica de un cultivo microbiano en reactor continuo ……………. 39
Figura 1.5 Representación esquemática de la derivación de compuestos aromáticos
activos provenientes del metabolismo de los azúcares, aminoácidos y azufre en
levaduras ……………………………………………………………………………... 42
Figura 1.6 Representación esquemática de la síntesis de alcoholes superiores en
levaduras ……………………………………………………………………………... 44
Figura 1.7 Representación esquemática de la síntesis de acetato de etilo y acetato de
isoamilo en levaduras ………………………………………………………………… 47
Figura 1.8 Representación esquemática de la síntesis de esteroles y terpenos en
levaduras ……………………………………………………………………………... 51
Figura 2.1 Morfología de K. africana (K1), K. apiculata (K2), S. cerevisiae (S1),
S. cerevisiae (S2) bajo anaerobiosis no estricta en jugo de agave …………………… 56
Figura 2.2 Metodología para iniciar una fermentación ………………………………. 57
Figura 2.3 Cinéticas de crecimiento en lote de S. cerevisiae (S1 y S2) y K. africana
(K1) y K. apiculata (K2) en el medio de crecimiento ……………………………….. 58
Figura 2.4 Matraces y Biorreactor New Brunswick de 14 L empleados en las
fermentaciones por lote …………………………………………………………………...... 60
Figura 2.5 Biorreactor Applikon de 3 L conectado a una Bioconsola ADI 1035
61
utilizado en las fermentaciones en continuo ………………………………………….
Figura 2.6 Cultivo continuo empleado en las fermentaciones en cultivo mixto ……... 62
Figura 2.7 Cámara de Neubauer y microscopio empleados ………………………….. 63
Figura 2.8 Centrifuga SOLBAT C- 600 ……………………………………………… 64
Figura 2.9 Crecimiento en caja en unidades formadoras de colonia (UFC) en medio
WL obtenidas de las fermentaciones con S. cerevisiae y K. africana en cultivo puro
y mixto …………………………………………………………………...................... 67
Figura 2.10 Crecimiento en caja en unidades formadoras de colonia (UFC) de los
cultivos mixtos en medio YEPD y medio YPD+CHY de las fermentaciones con S.
XI
Índice de Figuras
cerevisiae y K. africana en cultivo puro ……………………………………………... 67
Figura 2.11 Espectrofotómetro y microplaca empleados para la técnica del DNS …... 70
Figura 2.12 Equipo YSI modelo 2700 Select empleado para la determinación de
etanol …………………………………………………………………......................... 71
Figura 2.13 Destilador utilizado a nivel laboratorio …………………………………. 73
Figura 2.14 Equipo HPLC de Varian ProStar ………………………………………... 74
Figura 2.15 Equipo de Cromatografía de gases acoplado a un Head space …………. 75
Figura 2.16 Equipo de Cromatografía de gases acoplado a un detector de ionización
de flama (FID) …………………………………………………………………........... 76
Figura 2.17 Equipo de Cromatografía de gases acoplado a un espectrómetro de
masas …………………………………………………………………......................... 78
Figura 2.18 Panel de jueces efectuando evaluación sensorial en el laboratorio del
CIATEJ …………………………………………………………………..................... 80
Figura 3.1 Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFC, biomasa, azúcares
reductores y etanol de las fermentaciones en cultivo puro empleando las levaduras S.
cerevisiae (S1), S. cerevisiae (S2), K. africana (K1) y K. apiculata (K2)…………... 92
reductores y etanol de las fermentaciones en cultivo mixto formadas por las
levaduras S. cerevisiae (S1), S. cerevisiae (S2), K. africana (K1) y K. apiculata
(K2) …………………………………………………………………........................... 95
Figura 3.3 PCA de compuestos volátiles de las cepas de levaduras S. cerevisiae (S1),
S. cerevisiae (S2), K. africana (K1) y K. apiculata (K2) en cultivo puro y mixto ….. 102
Figura 3.4 PCA de compuestos volátiles mayoritarios de los destilados S. cerevisiae
(S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto …………………………………….. 106
Figura 3.5 PCA de compuestos volátiles minoritarios de los destilados obtenidos S.
cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto …………………………. 110
Figura 3.6 Niveles de aceptabilidad de los destilados obtenidos de S. cerevisiae (S1)
y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto ………………………………………….. 113
Figura 3.7 Perfiles sensoriales de olor, aroma, gusto y sensaciones trigeminales de los
destilados S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto ……………. 113
XII
Índice de Figuras
reductores y etano de las fermentaciones en cultivo puro empleando las levaduras S.
cerevisiae (S1) y K. africana (K1)………………………………………...………….. 118
reductores y etanol de las fermentaciones empleando las levaduras S. cerevisiae (S1)
y K. africana (K1) en cultivo mixto ………………….................................................. 119
Figura 3.10 PCA de compuestos volátiles en mosto de las fermentación en medio
reformulado empleando S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y
mixto ……………………………………………………............................................. 124
Figura 3.11 PCA de compuestos volátiles mayoritarios de los destilados obtenidos
de las fermentaciones en medio reformulado empleando S. cerevisiae (S1) y K.
africana (K1) en cultivo puro y mixto ……………………………………………….. 129
Figura 3.12 PCA de compuestos volátiles minoritarios de los destilados obtenidos de
las fermentaciones en medio reformulado empleando S. cerevisiae (S1) y K.
africana (K1) en cultivo puro y mixto ……………………………………………….. 134
reductores y etanol de las fermentaciones en continuo en cultivo mixto empleando
las levaduras S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1)………........................................... 139
Figura 3.14 Morfología al microscopia (40×) de K. africana y S. cerevisiae en
cultivo mixto bajo diferentes condiciones de cultivo, en las fermentaciones del jugo
de agave en cultivo continuo …………………………………………………………. 149
Figura 3.15 PCA de compuestos volátiles en mosto de las fermentaciones en
continuo empleando S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo mixto ………... 155
Figura 3.16 PCA de compuestos volátiles mayoritarios de los destilados obtenidos
de las fermentaciones en continuo empleando S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1)
en cultivo mixto ……………………………………………………............................ 163
Figura 3.17 PCA de las familias de compuestos volátiles minoritarios de los
destilados obtenidos de las fermentaciones en continuo empleando S. cerevisiae (S1)
y K. africana (K1) en cultivo mixto ………………………………………………….. 171
Figura 3.18 PCA de compuestos volátiles minoritarios de los destilados obtenidos de
las fermentaciones en continuo empleando S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en
XIII
Índice de Figuras
cultivo mixto ……………………………………………………................................. 172
Figura 3.19 Niveles de aceptabilidad de los destilados obtenidos las fermentaciones

en continuo empleando S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo mixto……... 178
Figura 3.20 PLS de los compuestos volátiles y niveles de agrado promedio de olor,
aroma y sensaciones táctiles de los destilados obtenidos de las fermentaciones en
continuo empleando S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo mixto
………………………………………………………………………………………… 179
Figura 3.21 PLS de los compuestos volátiles y frecuencia de descriptores en olor,
aroma y sensaciones táctiles de los destilados obtenidos de las fermentaciones en
continuo empleando S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo mixto
………………………………………………………………………………………… 182
XIV
Glosario de Abreviaturas y Símbolos
“A” “no A” Prueba discriminativa "A" "No A"

% v/v Porcentaje alcohol volumen
3-fen-prop 3-Fenilpropanal
4-pent-o 4-Penten-1-ol
5mf 5-Metil-furfural
9-hexdec-et 9-Hexadecenoato de etilo
acid Ácido
ac Acetoína
ac-acet Ácido acético
ac-etil Acetato de etilo
ac-fen Acetato de fenetilo
ac-isom Acetato de isoamilo
aceit Aceituna
acet Acetoína
acet-fur; acf 2-Acetil furan
ag-coc Agave cocido
alc-fen 2-Fenil etanol
alc-iso Alcohol isoamílico
am Amargo
anís Anís
ANOVA Análisis de varianza
AR Azúcares reductores
ARD Azúcares reductores directos
ast Astringente
barn Barniz
but n-Butanol
car Caramelo
CG-FID Cromatógrafo de gases con detector de ionización de flama
Cromatógrafo de gases con detector de ionización de flama acoplado a un
CG-FID-HS espaciador de cabeza
XV
CG-MS Cromatógrafo de gases con acoplamiento espectrometría de masas

CG-IR Cromatógrafo de gases con acoplamiento a espectroscopía de infrarrojo
CG-O Cromatógrafo de gases con acoplamiento a olfatometría
cidna Ciclopent-4-ene-1,3 dione
ciona Ciclopent-2-en-1-one
CYH Cycloheximida
D Tasa de dilución (h-1)
dca; dec-ac Ácido decanoico
dec-9-et 9-Decenoato de etilo
dec-etil Decanoato de etilo
dhfar Dihidrofarnesol
dod-et Dodecanoato de etilo
dod-isom Decanoato de isoamilo
dul Dulce
etil-hex 2-Etil-1-hexanol
etol 3-Etoxipropan-1-ol
F Flujo volumétrico de alimentación (h-1)
f-des Fruta descompuesta
f-ferm Fruta fermentada
f-sec Fruta seca
fda Furfural dietil-acetal
fen Fenólico
fen-isov Isovalerato de fenetilo
fen-prop Propionato de fenetilo
ferm Fermentado
ferm-avin Fermentado avinagrado
fru Frutal
fur-alc Alcohol furfurílico
furf Furfural
HCL Ácido clorhídrico
XVI
hex-ac Ácido hexanoico

hex-etil Hexanoato de etilo
hexd-et Hexadecanoato de etilo
hexdec-9-et 9-Hexadecenoato de etilo
hexdec-et Hexadecanoato de etilo
hum Humo
hxa Ácido hexadecanoico
hyona 1-Hidroxi-2-propanona
isa; iso-ac Ácido isobutírico
isob Isobutanol
K1 Kloeckera africana
Cultivo mixto formado por Kloeckera africana y Saccharomyces
K1+S1-G1 cerevisiae
K2 Kloeckera apiculata
Cultivo mixto formado por Kloeckera apiculata y Saccharomyces
K2+S1-G2 cerevisiae
Cultivo mixto formado por Kloeckera apiculata y Saccharomyces
K2+S2-G3 cerevisiae
Ks Constante de saturación o de afinidad (gL-1)
lact-et Lactato de etilo

lev-et Levulinato de etilo
lin-et Linoleato de etilo
lin-oxd; linox cis-Óxido de linalol
linto-et Linolenato de etilo
LSD Análisis de rangos múltiples
mad Madera
mad-res Madera resinosa
man-roja Manzana roja
mboct 3-Metilbutil octanoato
met Metanol
XVII
meta Metálico
mfne 5-Metil-2(5H)-furanona
mfona 5-Metil-2(3H)-furanona
µmáx Velocidad específica de crecimiento máxima (h-1)
mttfona 2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona
mtton 2-Metil tetrahidro-3-furanona
MS-MS Espectrometría de masas acoplado espectrometría de masas
NaOH Hidróxido do de Sodio
Nuez Nuez
º Bx Grados Brix
oca; oct-ac Ácido octanoico
ocdec-et Octadecanoato de etilo
oco Octan- 3-ol
oct-et; oct-etil Octanoato de etilo
ole-e Oleato de etilo
paja-húm Paja húmeda
PCA Análisis de componentes principales
PE Productividad de producción de etanol (g/l-h)
Pic Picante
PLS Prueba de cuadrado mínimos parciales
pol 4-Penten-1-ol
prop n-Propanol
prop-ac Ácido propanoico
Px Productividad de formación de biomasa (g/l-h)
qp Velocidad específica de producción de etanol (g/g-h)
qpmáx Velocidad específica máxima de producción de etanol (g/g-h)

qsmáx Velocidad específica máxima de consumo de sustrato (g/g-h)
que Quemante
rpmáx Velocidad instantánea máxima de formación de producto (g/l-h)

rsmáx Velocidad instantánea máxima de consumo de sustrato (g/l-h)
XVIII
rxmáx Velocidad instantánea máxima de formación de biomasa (g/l-h)
S Sustrato residual presente en el medio (gL-1)
S1 Saccharomyces cerevisiae
S2 Saccharomyces cerevisiae
sal Salado
solv Solvente
suavid Suavidad
SPME-HRGC- Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas con relación
IRMS isotópica
SPME-CG-EM Microextracción en fase sólida acoplada a cromatografía de gases
t Tiempo (h)
τ Tiempo de residencia (h)
T-hum Trapo húmedo
terp α-Terpineol
tet-et Tetradecanoato de etilo
tfar trans-Farnesol
tner trans-Nerolidol
ttdol Tetradecanol
UFC Unidades formadoras de colonia
V Volumen de operación del biorreactor (l)
vin Vinagre
vvm Volumen de aire por volumen de líquido por minuto
WL Medio WL (Bioche ika)
x Concentración de biomasa (gL-1)
x0 Concentración inicial de biomasa (gL-1)
Xo Concentración de biomasa en la alimentación (gL-1)
xt Concentración de biomasa en un tiempo t
YEPD Agar YEPD
XIX
Rendimiento de formación de producto respecto al consumo de sustrato

Yp/s
(g/g)
Yp/x Rendimiento de formación de producto a partir de biomasa
Yx/s Rendimiento de formación de biomasa (g/g)
µ Velocidad específica de crecimiento (h-1)
XX
ABSTRACT

ABSTRACT
Tequila can be obtained either by spontaneous fermentation or by inoculation with the yeast
Saccharomyces cerevisiae. However, in most distilleries, fermentation occurs spontaneously. The
first stages of fermentation are characterized by the growth of certain non-Saccharomyces yeasts
belonging to the Torulaspora, Kluyveromyces and Hanseniaspora genera. Subsequent stages are
dominated by alcohol-tolerant S. cerevisiae. The growth of these non-Saccharomyces yeasts is
considered to be beneficial due to their high alcohol production and the release of important
metabolites such as esters, terpenes, acetoin and acetic acid that markedly impact the aroma and
flavor of the alcoholic beverage. Despite of the advantages of using pure cultures of S. cerevisiae
for ease of control and homogeneity of fermentation, many authors suggest that the use of non-
Saccharomyces yeasts in co-culture with S. cerevisiae improves the sensory properties of the
final product. The presence and survival of these non-Saccharomyces yeasts during fermentation
is influenced by several factors including: competition for sugar uptake, oxygen availability,
nutrient limitation, presence of toxic compounds, and ethanol tolerance. In this context, the
objective of this work was to study the effects of oxygen, temperature, and growth factors on the
survival and fermentative capacity of non-Saccharomyces yeasts belonging to the Kloeckera
genera in the fermentation of agave juice in mixed culture with S. cerevisiae in batch and
continuous cultures.
First, the fermentation kinetics of Kloeckera and Saccharomyces yeast strains were characterized
separately in pure cultures and then together in a mixed culture. For the pure cultures, Kloeckera
showed limited growth and fermentative capacity compared to S. cerevisiae, which presented
high fermentative capacity. Furthermore, Kloeckera produced higher concentrations of acetate
esters, acetic acid and acetoin than did S. cerevisiae, which produced high concentrations of
6
higher alcohols, acetaldehyde and ethyl esters. The mixed culture produced higher concentrations
of higher alcohols and acetaldehyde than did the pure culture of S. cerevisiae and produced
intermediate concentrations of acetate esters similar to the concentrations obtained with K.
africana.
Next, the effect of certain growth factors on the survival and fermentative capability was
analyzed for pure cultures of K. africana and S. cerevisiae, and for a mixed culture of both yeasts.
These cultures were fermented in two different media: a reformulated medium, supplemented
with ammonium sulfate, thiamine and asparagine; and the basal medium supplemented with
ammonium sulfate. For K. africana in pure culture grown in the reformulated media, the biomass,
CFU, ethanol production, and reducing sugar consumption increased by 44%, 50%, 75%, and
45%. For S. cerevisiae in pure culture, they increased 4.2%, 75%, 25%, and 3.5%; and for the
mixed culture they increased by 4.66%, 94%, 90%, and 7% respectively compared to the basal
media. The production of volatile compounds by each different culture was similar for both
media. K. africana in pure culture produced higher concentrations of acetate esters, n-butanol,
acetoin, acetic acid and 5-methyl furfural than did S. cerevisiae, which produced predominantly
high concentrations of higher alcohols, ethyl esters and acetaldehyde. The mixed culture
produced intermediate concentrations of acetate and ethyl esters compared to K. africana and S.
cerevisiae in pure culture. The mixed culture also produced concentrations of higher alcohols and
2-acetyl furan similar to K. africana in pure culture and concentrations of isoamyl acetate and 2-
phenyl ethanol similar to S. cerevisiae in pure culture.
Finally, the effects of oxygen, temperature and fermentation media on the survival and
fermentative capability of K. africana in continuous culture fermentations with S. cerevisiae were
7
studied. Of these factors, the fermentation media was the most important to the survival of K.
africana in a mixed culture with S. cerevisiae. In comparison to the basal media, under the
conditions developed in the reformulated media, the biomass, CFU, ethanol production, and
reducing sugar consumption increased by 40%, 70%, 13% and 10% respectively. Nevertheless,
the third condition (25ºC, 0.03 vvm in reformulated medium) was the most important, because it
significantly stimulated the growth and survival of K. africana and S. cerevisiae in mixed culture.
Furthermore, the reformulated media produced higher concentrations of higher alcohols, ethyl
esters and acids, than were produced in the basal media. On the other hand, the basal media
produced higher concentrations of acetate esters, acetaldehyde, furans, ketones, terpenes and
acetals.
8
RESUMEN

RESUMEN
El tequila puede ser obtenido, de la fermentación espontánea del jugo de agave ó por inoculación
con S. cerevisiae. Sin embargo en la mayoría de las destilerías, la fermentación ocurre de manera
espontánea, caracterizándose las primeras etapas por el crecimiento de levaduras no-
Saccharomyces de los géneros Torulaspora, Kluyveromyces y Hanseniaspora y las etapas
posteriores son invariablemente dominadas por levaduras alcohol tolerantes como
Saccharomyces. Actualmente el crecimiento de las levaduras no-Saccharomyces es considerado
benéfico, debido al realce del sabor y el olor de la bebida por la alta producción y liberación de
importantes metabolitos como ésteres, terpenos, acetoína y ácido acético. Sin embargo su
crecimiento ésta condicionado a las primeras etapas de la fermentación, después del cual mueren
por una presunta intolerancia a etanol y/o limitación nutricional. A pesar de las enormes ventajas
que representa el utilizar cultivos puros de S. cerevisiae con respecto al fácil control y
homogeneidad durante la fermentación, algunos autores han sugerido utilizar levaduras no-
Saccharomyces en cultivo mixto con S. cerevisiae, debido a que su empleo podría mejorar las
propiedades sensoriales de la bebida. Por esta razón, varios estudios han sido realizados con el
objetivo de elucidar las posibles causas de la muerte de las levaduras no-Saccharomyces durante
la fermentación en cultivo mixto con S. cerevisiae, encontrando que la temperatura de
fermentación, la aireación del medio y la composición en nutrientes del medio son factores
determinantes en la supervivencia. En este contexto, el objetivo del presente trabajo fue estudiar
el efecto del oxígeno, la temperatura y los factores de crecimiento en la fermentación de jugo de
agave en lote y en continuo de cultivos mixtos de levaduras tequileras no-Saccharomyces del
género Kloeckera con S. cerevisiae, buscando incrementar la prevalencia y capacidad
fermentativa de las levaduras no-Saccharomyces. Primeramente se caracterizaron las cinéticas de
fermentación de las levaduras del género Kloeckera y Saccharomyces en cultivo puro y mixto en
medio basal. Durante estos cultivos, las levaduras Kloeckera presentaron un limitado crecimiento
y capacidad fermentativa en comparación con Saccharomyces que mostraron una alta eficiencia
fermentativa. La mayor concentración de ésteres de acetato, ácido acético y acetoína se presentó
en los cultivos puros de Kloeckera y de alcoholes superiores, acetaldehído y ésteres de etilo en
los cultivos puros de Saccharomyces, en los cultivos mixtos debido al limitado crecimiento de
Kloeckera y al mayor dominio de Saccharomyces durante la fermentación, la concentración de
10
compuestos volátiles estuvo fuertemente orientada a la producción de alcoholes superiores y
acetaldehído como en los cultivos de Saccharomyces y a producir concentraciones intermedias de
ésteres de etilo debido a la influencia de Kloeckera. Posteriormente se analizó el efecto de ciertos
factores de crecimiento (medio reformulado) sobre la supervivencia y capacidad fermentativa de
K. africana en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae, encontrándose durante estos cultivos en K.
africana un incremento de 1.2 veces mayor en la formación de biomasa, 2.16 y 15 veces mayor
en la formación de UFC en cultivo puro y mixto, 4.27 veces en la producción de etanol y se
detectó el consumo total de los azúcares del medio en comparación con las cinéticas de
fermentación en medio basal. Adicionalmente durante estos cultivos, K. africana presentó la
mayor concentración de ésteres de acetato, n-butanol, acetoína, ácido acético y 5-metil furfural.
S. cerevisiae nuevamente produjo la mayor concentración de alcoholes superiores, ésteres de etilo
y acetaldehído y en cultivo mixto la concentración producida de alcoholes superiores y 2-acetil
furan fue similar a la de K. africana, de acetato de isoamilo, 2-fenil etanol a S. cerevisiae y de
ésteres de etilo y acetato se produjo una concentración intermedia. A pesar que durante los
cultivos en medio reformulado K. africana aumentó significativamente su crecimiento y
capacidad fermentativa, su población celular continuó declinando. Por lo anterior, además del
medio de fermentación se analizó el efecto del oxígeno y la temperatura en continuo. Durante
estos cultivos, el medio de fermentación fue el factor de mayor peso sobre la supervivencia y
capacidad fermentativa de K. africana, debido a que durante las condiciones en medio
reformulado se incrementó 1.45 veces la formación de biomasa, 3.13 y 4.9 veces la formación de
UFC en S. cerevisiae y K. africana, 1.12 veces la producción de etanol y se consumió el 90% de
los azúcares del medio en comparación con las condiciones en medio basal. Sin embargo la
condición que favoreció el mayor crecimiento de K. africana así como de S. cerevisiae fue la
tercera condición (25ºC, 0.03 vvm y medio reformulado), alcanzándose las máximas
concentraciones de biomasa, etanol y UFC (5.85 y 51. 35 gL-1, 1057.53, 7855 × 106 UFC mL-1)
con un total consumo de los azúcares del medio. Durante estas condiciones el oxígeno, la
temperatura y el medio de fermentación influyeron significativamente en la composición volátil
de la bebida, sin embargo el medio de fermentación fue el factor de mayor peso. Presentándose la
mayor concentración de alcoholes superiores, ésteres de etilo y ácidos en las condiciones en
medio reformulado y la mayor concentración de ésteres de acetato, acetaldehído, furanos, cetonas,
terpenos y acetales en las condiciones en medio basal.
11
ANTECEDENTES

ANTECEDENTES
El tequila es una bebida alcohólica destilada elaborada de la fermentación del jugo de Agave
tequilana Weber variedad azul (NOM-006-SCFI-2005, 2006) y cuyo proceso de elaboración
incluye: la cosecha de la planta de agave, el cocimiento de las cabezas para hidrolizar los
fructanos, la molienda de las cabezas de agave para extraer los azúcares, la fermentación de los
azúcares del jugo y una doble destilación del mosto para producir tequila “blanco” y si el
producto lo requiere un proceso de añejamiento de 3 a 12 meses para obtener tequila “reposado”
o “añejo” (Cedeño, 1995; NOM-006-SCFI-2005). Durante el proceso de elaboración de tequila,
la fermentación alcohólica representa la etapa de mayor importancia, debido a que durante este
período las levaduras producen etanol y compuestos volátiles y no volátiles que forman el
bouquet de la bebida (Valle-Rodríguez et al., 2011). Las características óptimas de las levaduras
empleadas para la fermentación incluyen: alta producción de etanol, alta velocidad de
fermentación, eficiencia en la conversión de sustrato a etanol, tolerancia a etanol y presión
osmótica, balance en la producción de compuestos volátiles deseables y baja producción de
biomasa (Pretorius, 2000).
Actualmente en las fermentaciones tradicionales de jugo de uva y agave se ha cobrado particular

interés en las levaduras no-Saccharomyces del género Kloeckera/Hanseniaspora, debido a la
ventajas que representa su utilización principalmente por la alta producción y liberación de
importantes metabolitos como ésteres, terpenos, acetoína y ácido acético que mejoran
significativamente las propiedades de sabor y aroma en la bebida (Romano et al., 1997; Díaz-
Montaño et al., 2008; Swiegers et al., 2005). Sin embargo su crecimiento se ha limitado a las
primeras etapas de la fermentación, tiempo después del cual mueren por una presunta intolerancia
a etanol y/o limitación nutricional, cediendo su paso a levaduras con mayor tolerancia al etanol
como S. cerevisiae. No obstante hasta el momento no se han logrado elucidar las principales
causas de la muerte de las levaduras no-Saccharomyces en la fermentación en cultivo mixto con S.
cerevisiae; algunas hipótesis han sido publicadas para explicar el bajo crecimiento de estas
levaduras y su muerte temprana, tales como: (1) La producción de compuestos tóxicos por las
levaduras alcohólicas durante la fermentación alcohólica que pueden resultar inhibitorios para
otras especies de levaduras o cepas; como por ejemplo el etanol y ciertos metabolitos como
ácidos grasos de cadena corta a larga (ácido acético, hexanoico, octanoico y decanoico) pueden
13
alcanzar concentraciones que conducen a la muerte celular de algunas levaduras, incluyendo
cepas de S. cerevisiae (Ludovico et al., 2001; Fleet, 2003). (2) La llamada actividad killer ciertas
levaduras (Pérez et al., 2001; Mendoza et al., 2007). Este mecanismo consiste en la producción
de glicoproteínas extracelulares específicas por ciertas cepas de levadura (levaduras killer) que
son capaces de matar a otras cepas de levadura (levadura sensibles). (Díaz-Montaño & Rámirez-
Cordova, 2009). Algunas cepas que exhiben actividad killer positiva son levaduras del género
Saccharomyces, Hanseniaspora, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Zygosaccharomyces,
Metschikowia y Cryptococos. (3) Mecanismo de contacto entre célula y célula. Nissen &
Arneborg (2003) reportó que la muerte temprana de dos levaduras vinícolas (K. thermotolerans y
T. delbrueckii) durante la fermentación mixta con S. cerevisiae no es debida a la presencia de
etanol ni a algún compuesto tóxico sino a un mecanismo de contracto entre célula y célula que
ocurre cuando S. cerevisiae esta presente en altas concentraciones celulares, abatiendo el
crecimiento de las levaduras presentes en menor cantidad. (4) Limitación nutricional en el medio
de cultivo. Durante la fermentación del mosto, el oxígeno y el nitrógeno asimilable son
rápidamente agotados debido tanto a las condiciones de crecimiento semianaeróbico, como al
bajo contenido de nitrógeno del jugo. Hansen et al (2001) reportó que T. delbrueckii y K.
thermotolerans son menos tolerantes a condiciones de baja disponibilidad de oxígeno que S.
cerevisiae, precisando de este nutriente para su crecimiento. Adicionalmente, trabajos previos
efectuados con H. guillermondii y K. africana han revelado que estas cepas tienen escaza
capacidad fermentativa debido al deficiente consumo de azúcar, en algunos casos relacionado con
una limitación nutricional y no a una intolerancia a etanol (Albergaria et al., 2003; Díaz-Montaño
et al., 2008). Bajo esta temática, recientemente se ha reportado que K. africana es capaz de
sobrevivir por mayor tiempo en la fermentación del jugo de agave, principalmente cuando el
medio no es limitante en nutrientes y se trabaja dentro de ciertas condiciones operacionales
(flujos volumétricos de aire < 0.03 vvm y temperaturas < 30ºC) (Díaz-Montaño et al., 2010;
Valle-Rodríguez et al., 2011).
14
HIPÓTESIS

HIPÓTESIS
Dado que existe evidencia experimental de que las levaduras no-Saccharomyces pueden
sobrevivir a lo largo de la fermentación cuando se proporcionan las condiciones adecuadas; se
propone que la concentración de oxígeno disuelto, la temperatura y la presencia de factores de
crecimiento son los principales factores que permitirán que una levadura tequilera del género
Kloeckera aumente su capacidad fermentativa al trabajar en cultivos mixtos con levaduras del
género Saccharomyces; contribuyendo además a diversificar el perfil aromático de la bebida.
16
JUSTIFICACIÓN

JUSTIFICACIÓN
Una correcta elección de los microorganismos en las fermentaciones alcohólicas, es un punto

clave en la eficiencia de conversiones del sustrato a etanol, así como, en la calidad aromática del
producto final. En el caso del tequila, este aspecto no ha sido completamente satisfecho
empleando cepas del género Saccharomyces. Por otro lado, la presencia de levaduras no-
Saccharomyces en la fermentación tradicional de jugo de uva, ha contribuido a obtener bebidas
con características sensoriales interesantes, a pesar de su corto periodo activo. La falta de
investigación relacionada con aspectos fisiológicos de las levaduras Kloeckera en cultivos mixtos
con Saccharomyces, no permite conocer las condiciones en que Kloeckera co-exista más tiempo
en la fermentación con S. cerevisiae. El interés de este trabajo es el de contribuir a un mejor
conocimiento sobre las capacidades fermentativas y aromáticas de cepas no-Saccharomyces del
género Kloeckera, en cultivo mixto con S. cerevisiae observando su respuesta a factores
nutrimentales y operacionales empleando como medio de cultivo jugo de agave.
18
OBJETIVOS

OBJETIVOS
Objetivo general
Estudiar el efecto del oxígeno, la temperatura y los factores de crecimiento en la fermentación de

jugo de agave en lote y en continuo para lograr una mayor prevalencia y capacidad fermentativa
de levaduras tequileras no-Saccharomyces del género Kloeckera al trabajar en cultivo mixto con
levaduras del género Saccharomyces.
Objetivos específicos
1) Determinar las condiciones operacionales y nutrimentales en cultivo por lote y

continuo que favorezcan la prevalencia y aumenten las capacidades fermentativas
y aromáticas de levaduras tequileras del género Kloeckera y Saccharomyces en
cultivo mixto.
2) Comparar los perfiles de compuestos volátiles generados durante la fermentación

alcohólica en lote y en continuo de los cultivos mixtos.
3) Caracterizar sensorialmente los tequilas seleccionados de las fermentaciones en

cultivo mixto.
20
IMPACTO

IMPACTO
Científico
Contribuir a un mejor conocimiento de los requerimientos nutricionales de una levadura

perteneciente al género Kloeckera, durante la fermentación de jugo de agave en cultivo mixto con
Saccharomyces y su impacto en las características sensoriales del tequila.
Formación de recursos humanos
Titulación de un estudiante de maestría
Tecnológico
El establecimiento de las condiciones nutrimentales para fermentar jugo de agave en cultivos

mixtos de levaduras del género Kloeckera con Saccharomyces, a fin de lograr un tequila con altas
cualidades aromáticas.
Económico
Con la utilización de cultivos mixtos de levaduras Kloeckera con Saccharomyces, se obtendrá un

tequila con una gran diversidad de compuestos aromáticos, que posiblemente permitirá colocar
una marca especial en el mercado de esta bebida.
Social
La obtención de un tequila con mayor riqueza aromática, permitirá abrir un nuevo mercado a
nivel nacional e internacional, por lo que aumentaría las exportaciones fortaleciendo a la industria
y por ende manteniendo el empleo a su personal.
Regional
Fortalecimiento a la industria de bebidas alcohólicas a partir de agave, obtener un producto con

características sensoriales diferentes a los que existen en el mercado.
Ecológico
Con los resultados obtenidos en este trabajo, se evaluará la posibilidad de fermentar altas
concentraciones de azúcar, con la finalidad de disminuir las descargas contaminantes (vinazas)
así como reducir el uso de la energía durante la destilación.
22
FUNDAMENTACIÓN

FUNDAMENTACIÓN
FUNDAMENTACIÓN
1.1 Proceso y elaboración del tequila.
El tequila es una bebida alcohólica mexicana obtenida de la destilación y rectificación de la

fermentación de jugo de Agave tequilana Weber (variedad azul), cuya producción está
estrictamente regulada tal que su elaboración sólo puede efectuarse en los estados con
denominación de origen que comprenden a Jalisco, Nayarit, Michoacán, Guanajuato y
Tamaulipas (NOM-006-SCFI-2005). Existen dos clases de Tequila: el Tequila 100% obtenido
exclusivamente a partir de los azúcares del Agave tequilana Weber variedad azul y el tequila
producido usando el 51% de azúcares a partir A. tequilana Weber variedad azul y el 49% de
azúcares provenientes de otras fuentes como el azúcar de caña (Cedeño, 1995; NOM-006-SCFI-
2005). El proceso de elaboración de tequila (Figura 1) comprende cuatro pasos generales que van
desde el cultivo del agave, su cosecha después de 8 años, el cocimiento de la cabezas de agave en
hornos de ladrillo o autoclaves en donde se hidrolizan los fructanos para obtener una mezcla de
azúcares principalmente fructosa, la molienda para la extracción de los azúcares, la subsecuente
fermentación del jugo de agave con cepas de Saccharomyces cerevisiae para la conversión de los
azúcares presentes en el jugo a etanol y compuestos aromáticos, los cuales estos últimos son
responsables de la personalidad del tequila y finalmente dos etapas de destilación. La
maduración si es necesaria es llevada a cabo en barricas de roble blanco para la obtención de
tequila reposado o añejado después de 2 ó 12 meses, respectivamente (Pinal et al., 2009).
24
FUNDAMENTACIÓN
Figura 1.1 Proceso de producción del Tequila
1.2 Fermentación alcohólica.
La fermentación alcohólica es el proceso por el cual, los azúcares simples como la glucosa o la
fructosa contenidas en el mosto se convierten en alcohol etílico. Para llevar a cabo este proceso es
necesaria la presencia de levaduras, y algunas clases de bacterias donde el oxígeno es el
desencadenante inicial de la fermentación, ya que las levaduras lo van a necesitar en su fase de
crecimiento (Amaral, 1989). Sin embargo en el proceso de fermentación conviene que la
presencia de oxígeno sea pequeña para evitar el consumo de etanol por parte de los
microorganismos y la conversión de éste en ácido acético y acetilo.
El proceso simplificado, de la fermentación así como su balance energético es:
Azúcares + Levaduras  Alcohol etílico + CO2 + Calor + Otras sustancias
C6H12O6 +2Pi+2ADP  2CH3 –CH2OH + 2CO2 + 2ATP + 25.5 Kcal
25
FUNDAMENTACIÓN
La fermentación alcohólica es un proceso exotérmico; es decir, se desprende energía en forma de

calor. Es necesario controlar este aumento de temperatura ya que si ascendiese a 37ºC o más las
levaduras comenzarían a morir, deteniéndose el proceso fermentativo (Amaral, 1989).
La ruta metabólica para la conversión de los azúcares en etanol y dióxido de carbono y otros
compuestos es llevada a cabo a través de la glucólisis, la cual se ilustra en la Figura 1.1.
Figura 1.1 Fermentación Alcohólica.
26
FUNDAMENTACIÓN
1.3 Levaduras y su metabolismo.
Las levaduras son microorganismos unicelulares que presentan formas ovaladas, redondas y
elípticas, miden de 3-7 micras de ancho por 5-12 de largo y son cerca de cinco veces más grandes
que las bacterias. Existen alrededor de 350 especies de levaduras (cada una con un aspecto
morfológico característico que aún en cultivo puro presentan variaciones considerables de tamaño
y forma de las células individuales, dependiendo de la edad y del medio), separadas en unos 39
géneros.
La reproducción de las levaduras puede ser por un proceso asexual o sexual, siendo la más común
la reproducción asexual a través de la formación de un brote o protuberancia en la superficie de la
célula madre, que después de crecer se separa, formando una célula nueva. Este ciclo es de
aproximadamente 30 minutos, produciendo la célula madre cerca de 24 generaciones de células
hijas durante su ciclo vital (Pelczar et al., 1990). En el metabolismo de las levaduras los
nutrientes son transformados en células y productos nuevos mediante una serie de reacciones
llevadas a cabo por la ruta de Embden – Meyerhof – Parnas (EMP) (Figura 1.1), en la cual el
ácido pirúvico producido durante la glucólisis se convierte en acetaldehído y etanol, donde
monosacáridos como glucosa y fructosa son los componentes principales ya que interviene como
generador de energía y material de construcción celular (Quintero, 1993).
1.3.1 Selección de Levaduras.
En la fermentación espontánea del jugo de agave se han identificado 10 géneros de levaduras

(Lachance, 1995): Brettanomyces, Candida, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia,
Saccharomyces, Saccharomycodes, Zygosaccharomyces, Torulaspora e Iwatchenkia, ocho de las
cuales están presentes en el proceso de producción del vino (Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova,
2009). Sin embargo para realizar una fermentación en cultivo puro, la selección de levaduras
debe apoyarse en análisis comparativos fisicoquímicos y sensoriales que permitan detectar las
cepas con mayor cantidad de características deseables para mejorar la calidad del producto final,
para ello la levadura debe de cumplir con ciertos requisitos previos como: tolerancia a altas
concentraciones de etanol, que además de propiciar fermentaciones más rápidas, reduzcan el
riesgo de contaminación, resistencia a altas temperaturas, resistencia a la acidez, la cual previene
y combate la contaminación, resistencia a altas concentraciones de azúcar, producción de un
27
FUNDAMENTACIÓN
adecuado perfil de aromas, altos rendimientos y, una buena estabilidad de la cepa (Lachance,
1995). Las levaduras del género Saccharomyces dominan la fermentación alcohólica, siendo sus
características principales: alta tolerancia a alcohol (>11 %v/v), estabilidad de cultivo, alta
rapidez de división y rápido consumo de azúcares, tolerante a un rango amplio de pH (2.4 – 8.2),
alta conversión de azúcar a etanol y una baja exigencia en las necesidades nutrimentales
(azúcares simples como fuente de carbono, sales de amonio como fuente de nitrógeno y en
alguno casos la biotina o vitamina B8 como factores de crecimiento) (Pretorius, 2000). En
adición, las levaduras del género Saccharomyces presentan otras importantes características que
contribuyen a su alta eficiencia fermentativa como son: 1) Crabtree positivas, es decir su
actividad glicolítica se incrementa en presencia de oxígeno y altas concentraciones de azúcar,
permitiendo un incremento en la biomasa, en concentración intracelular de piruvato y en la
formación de etanol (Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova, 2009), 2) Las rutas metabólicas de la
fermentación y la glucólisis son muy eficientes en esta levadura, pudiendo convertir el 51% de
los azúcares iniciales a etanol y 3) ésta levadura es capaz de resistir el estrés osmótico causado
por las altas concentraciones de azúcar y etanol (Pretorius, 2000; Pina et al., 2004). No obstante a
pesar de su alta capacidad fermentativa, las levaduras del género Saccharomyces presentan una
baja capacidad de síntesis de compuestos sensorialmente importantes, ya que por regla general
las cepas que producen altas concentraciones de etanol, producen menos concentración de
compuestos volátiles (Moreno et al., 1991).
1.3.2 Capacidades fermentativas y producción de aromas de levaduras convencionales y

no convencionales: necesidades nutricionales y condiciones operacionales
Las levaduras son de gran importancia en el proceso de fermentación de varias bebidas

alcohólicas ya que éstas son las responsables de la transformación de los azúcares presentes en el
mosto a etanol y de la generación de compuestos volátiles que imparten características especiales
al bouquet de la bebida en olor, aroma, gusto y sensaciones trigeminales.
Algunos autores han reportado que las primeras etapas de la fermentación espontáneas en vinos,
son dominadas activamente por las levaduras no-Saccharomyces (levaduras no convencionales),
principalmente por las cepas de los géneros Kloeckera/Hanseniaspora (Fleet, 2003; Cianni &
Picciotti, 1995) La alta tolerancia a concentraciones de sustrato (> 200 gL-1) de estas levaduras
28
FUNDAMENTACIÓN
explica su predominancia en las primeras etapas de la fermentación (Ciani & Fatichenti, 1999).
Sin embargo el crecimiento de estas levaduras esta condicionado a los primeros días de la
fermentación, tiempo después del cual mueren por una presunta intolerancia a etanol (5-6% v/v)
y/o a una limitación nutricional, cediendo su paso a levaduras mucho más resistentes del género
Saccharomyces (levaduras convencionales) (Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova, 2009). No
obstante a pesar de su corto periodo activo durante la fermentación, las levaduras no-
Saccharomyces del género Kloeckera/Hanseniaspora contribuyen al sabor y a la calidad
aromática del producto final, ya que tienen la capacidad de producir y secretar enzimas al medio,
tales como β-glucosidasas, que liberan monoterpenos derivados de sus formas glucosidadas,
aportando descriptores florales y frutales al producto final (Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova,
2009). La contribución de las levaduras no-Saccharomyces al bouquet de la bebida está
condicionado por su supervivencia durante la fermentación, la cual se ha reportado en las
fermentaciones del jugo de uva y agave depende ciertos factores. Hansen et al. (2001) observó
que la muerte de levaduras del género T. delbrueckii y K. thermotolerants en cultivos mixtos con
S. cerevisiae está asociada principalmente con la baja disponibilidad de oxígeno en el medio de
cultivo y no por la presencia de compuestos tóxicos producidos por S. cerevisiae como el etanol.
Por otro lado Erten (2002) reportaron que la disminución en la población celular de las levaduras
del género apiculata en la fermentación del jugo de uva con S. cerevisiae es debida a la
temperatura de fermentación, obteniéndose una mayor viabilidad a temperaturas bajas (< 20ºC),
un aumento en la concentración de ésteres de etilo y una reducción de alcoholes superiores.
Posteriormente Nissen & Arneborg (2003) dedujeron que la principal causa del paro del
crecimiento K. thermotolerans y T. delbrueckii en la fermentación de jugo de uva en cultivo
mixto con S. cerevisiae no es debida ni a una limitación nutricional ni a la presencia de
compuestos tóxicos inhibitorios, sino más bien a un mecanismo de contacto entre célula y célula
dependiente de la presencia de altas concentraciones de células viables de S. cerevisiae. Llegaron
a estas conclusiones al realizar varias fermentaciones en cultivo puro y mixto con las tres
levaduras. En cultivo puro observaron que K. thermotolerans y T. delbrueckii presentan altas
concentraciones celulares y no cesan su crecimiento; sin embargo para dar respuesta al porqué
del fenómeno observado en cultivo mixto, realizaron fermentaciones en cultivo mixto empleando
un tubo de diálisis compartimentado, el cual separó a S. cerevisiae y las levaduras no-
29
FUNDAMENTACIÓN
Saccharomyces en dos compartimientos, permitiendo únicamente la migración de los solutos del

medio; al alcanzar S. cerevisiae y las levaduras no-Saccharomyces altas concentraciones
celulares en el interior y en el exterior del tubo de diálisis y al no haber habido un contacto entre
las levaduras, dedujeron que la principal causa del paro en el crecimiento de las levaduras no-
Saccharomyces en la fermentación mixta con S. cerevisiae es debida al contacto previamente
mencionado. Por otro lado Pérez-Nevado et al. (2006) estudiaron la causa de la muerte de las
levaduras no-Saccharomyces de los géneros H. guillermondii y H. uvarum en la fermentación del
jugo de uva en cultivo mixto con S. cerevisiae en. Encontrando que las levaduras no-
Saccharomyces mueren en los primeros días de la fermentación (indistintamente de la
concentración de inóculo y etanol) fue debida a la presencia de compuestos tóxicos producidos
por S. cerevisiae (además del etanol y las toxinas killer). Adicionalmente estudios efectuados en
tequila señalan que las levaduras no-Saccharomyces como K. africana (K1) pueden llegar a
presentar capacidades fermentativas similares a S. cerevisiae, cuando el medio de cultivo no es
limitante en nutrientes (fuentes de nitrógeno orgánico y factores de crecimiento) y las
condiciones operacionales se encuentran en los siguientes rangos: temperatura entre 30-35°C, pH
entre 3-4 y O2 entre 0.001-0.003 vvm (Díaz-Montaño et al., 2004; Díaz-Montaño et al., 2010;
Valle-Rodríguez et al., 2009). Valle-Rodríguez et al. (2011) estudiaron el efecto de la adición de
ciertos factores de crecimiento (vitaminas y aminoácidos) al jugo de agave sobre las capacidades
fermentativas y aromáticas de K. africana (K1) en cultivo por lote y continuo, obteniendo como
resultados que la adición de estos aminoácidos (asparagina) mejoran significativamente la
eficiencia fermentativa de K. africana, consumiéndose dos veces más los azúcares del medio y
aumentando 30 y 45 % la formación de biomasa y etanol en comparación con las fermentaciones
efectuadas con la misma levadura pero en un medio enriquecido sólo con sulfato de amonio.
Cabe mencionar que durante la fermentación las levaduras nunca encuentran el ambiente
fisiológico óptimo; y son de hecho expuestas simultánea y secuencialmente a una gran cantidad
de condiciones de estrés como son: la oxidación, el estrés hiperosmótico, el estrés iónico, altas
temperaturas, la presencia de ácidos orgánicos y alcoholes, altas concentraciones de etanol,
limitación nutricional e inanición. En respuesta a éstas condiciones de estrés, las células activan y
coordinan una serie de actividades intracelulares específicas para responder, adaptarse y
aumentar la probabilidad de sobrevivir y proliferar. Esta respuesta implica un estricto control del
30
FUNDAMENTACIÓN
crecimiento, así como modificaciones en los programas de expresión génica y de la actividad

metabólica, que se manifiestan en cambios del estado fisiológico, metabólico, bioquímico y
morfológico (Zuzuarregui & Del Olmo, 2004). Sin embargo el estrés oxidativo, el estrés
osmótico y el estrés al etanol han sido las condiciones de estrés más importantes asociadas a la
producción de biomasa y la fermentación alcohólica. El estrés oxidativo es la situación en la que
se produce un incremento en la concentración intracelular de especies reactivas de oxígeno
(ROS) como consecuencia de un aumento en la generación o una disminución en la degradación
de las mismas que pueden inactivar biomoléculas como lípidos, proteínas y DNA o causar la
muerte celular. El estrés osmótico por su parte, se presenta cuando la levadura se ve expuesta a
altas concentración de azúcar en el medio de cultivo, el cual puede dañar aspectos importantes de
la fisiología celular como el crecimiento, el transporte vesicular y el nivel estructural de las
membranas, incluyendo la expresión de genes del metabolismo lipídicos, la flexibilidad y
permeabilidad de la membrana celular. Por su parte el estrés al etanol se presenta cuando la célula
de levadura responde a una alta acumulación de etanol en el ambiente microbiano, generalmente
bajo esta condición de estrés las células de la levadura modifican la composición lipídica de la
membrana plasmática, previendo una mayor síntesis de ácidos grasos insaturados y esteroles que
aseguran un ajuste de las propiedades fisicoquímicas de la matriz en un rango fisiológico óptimo.
(Zuzuarregui & Del Olmo, 2004; Zuin A, 2009; Pina et al., 2004).
1.4 Tipos de Cultivos
1.4.1 Cultivo Puro
La utilización de cultivos puros de S. cerevisiae para la elaboración de bebidas alcohólicas tiene

un inmenso valor en el mundo, debido a las ventajas innegables que ofrecen como son fácil
control y homogeneidad durante la fermentación, sin embargo generalmente las cepas que
producen altas concentraciones de etanol como el caso de S. cerevisiae, producen
concentraciones menores de compuestos sensorialmente importantes (Moreno et al., 1991). El
empleo de cultivos puros en la elaboración del vino va acompañado del cumplimiento de
determinados requisitos previos, como son que la levadura debe prevalecer ella sola durante la
fermentación; por ello, debe agregarse antes de que otros microorganismos (levaduras silvestres,
31
FUNDAMENTACIÓN
mohos, bacterias) tengan oportunidad de multiplicarse (Brown et al., 1989). Sin embargo, ahora
se sabe que en las fermentaciones espontáneas del vino y del tequila, participan una sucesión de
diferentes poblaciones de levaduras que pueden contribuir positivamente al bouquet de la bebida
final ya que sintetizan una gran variedad de compuestos volátiles (Lachance et al., 1995, Romano
et al., 2003).
1.4.2 Cultivos Mixtos
En muchas fermentaciones tradicionales, se emplean cultivos mixtos de composición variable, un

ejemplo de ello son los excelentes vinos de todo el mundo producidos a partir de la flora natural
de las uvas, que nunca serán igualados por el uso de cultivos puros, aunque esto último pueda
proporcionar vinos uniformes de calidad razonable. Los cultivos mixtos están siendo explotados
en diversos aspectos de la Biotecnología moderna por que ofrecen estabilidad de cultivo,
resistencia a la contaminación y rendimientos de biomasa más altos que los monocultivos,
debido al trabajo en conjunto por parte de las levaduras asociadas, y a la capacidad de
metabolizar materiales de desecho tóxicos que no pueden ser degradados por muchas cepas
(Brown et al., 1989). Se han realizado numerosos estudios utilizando cultivos mixtos aplicados a
fermentaciones por lote en vinos; los cuales sugieren que las especies no-Saccharomyces pueden
contribuir positivamente al sabor y olor de la bebida durante las fermentaciones en cultivo mixto
con S. cerevisiae por la gran variedad de compuestos volátiles sintetizados como alcoholes
superiores, ésteres, ácidos y compuestos carbonilos (Zohre et al., 2002; Rojas et al., 2001, 2003;
Romano et al., 2003; Ciani et al., 2006; Moreira et al., 2005). Estos trabajos mostraron que existe
una diferencia significativa en la composición química de los mostos procedentes de cultivos
puros y mixtos de levaduras no-Saccharomyces y S. cerevisiae. Por ejemplo Zironi et al. (1993)
estudió el efecto de utilizar cultivos puros, mixtos y secuenciales de H. guillermondii, K.
apiculata y S. cerevisiae en la fermentación del jugo de uva. Encontrando que los cultivos puros
de S. cerevisiae y los cultivos mixto y secuenciales producen altas concentraciones de alcoholes
superiores y compuestos trazas de acetoína que los cultivos puros de K.apiculata y H.
guilliermondii que mostraron sólo altas cantidades de acetoína y 2-3-butanediol (Tabla 1.1).
Asimismo Zohre et al. (2002) estudiaron el efecto de emplear cultivos puros y mixtos de K.
32
FUNDAMENTACIÓN
apiculata, C. pulcherrima y S. cerevisiae en la fermentación del jugo de uva; encontrando que las
especies no-Saccharomyces, pueden crecer y sobrevivir en cultivo mixto con S. cerevisiae,
produciendo bajos contenidos de alcohol y altas concentraciones de acetato de etilo. Sin embargo
S. cerevisiae resultó ser la especie dominante en todos los casos, mostrando altos contenidos de
etanol y bajos de acetato de etilo, en comparación a los cultivos puros de las levaduras no-
Saccharomyces. Concluyendo que la presencia de las levaduras no-Saccharomyces durante la
fermentación con S. cerevisiae pudiese ser de interés tecnológico, por el gran contenido de
acetato de etilo y otros ésteres de cadena corta como hexanoato de etilo y acetato de isoamilo
contribuyendo a las propiedades de sabor de la bebida aportando notas florales y frutales.
Tabla 1.1: Productos secundarios de las fermentaciones llevadas a cabo por K. apiculata (K), H. guillermondii
(H) y S. cerevisiae (S) en cultivos puros, mixtos y secuenciales.
Cultivos
Compuestos
-1 Puros Mixtos Secuenciales I Secuenciales II
(mg L )
S H K HS KS HS KS HS KS
Etanol (%) 9.52 4.26 4.42 9.64 9.59 9.54 9.57 10 10.7
n-Propanol 59 17 14 81 82 95 111 146 128
Isobutanol 43 16 13 36 36 37 39 31 34
Alcohol amílico 37 7 8 28 29 16 22 14 16
Alcohol isoamílico 198 22 23 130 125 73 84 63 58
Acetoína Tr 184 147 Tr Tr Tr Tr 11 8
2,3 – Butanediol 448 653 791 415 446 620 654 534 459
Tr: Trazas. Los valores obtenidos es el promedio de triplicados. (Datos obtenidos de Zironi et al. 1995)
Asimismo otro estudio conducido por Moreira et al. (2004) mostró que el empleo de levaduras
no-Saccharomyces del género Hanseniaspora con S. cerevisiae, puede resultar atractivo por la
síntesis de compuestos que contribuyen a la composición aromática del producto final. Llevaron
a cabo fermentaciones en cultivo puro y mixto con H. guilliermondii, H. uvarum y S. cerevisiae.
Encontrando que los cultivos puros y mixtos de las levaduras presentan similares rendimientos
de etanol y diferentes velocidades específicas de crecimiento, produciendo H. guilliermondii la
mayor concentración de acetato de fenetilo y 2-fenil etanol en cultivo puro y mixto y S.
cerevisiae por su parte sólo produjo niveles similares de metionol y 2-metiltetrahidrotiofen-3-ona
que H. guilliermondii. Concluyendo que el empleo de las levaduras apiculata en la fermentación
33
FUNDAMENTACIÓN
del jugo de uva con S. cerevisiae, puede resultar beneficioso por la producción de compuestos
aromáticos que contribuyen significativamente a realzar el bouquet del vino como el acetato de
fenetilo y 2-fenil etanol, aportando sabores florales y frutales.
1.4.2.1 Selección de levaduras en cultivos mixtos
En la aplicación de cultivos mixtos durante la fermentación, es conveniente utilizar levaduras

silvestres enriquecidas con cultivos puros de levaduras seleccionadas para brindar mayor
uniformidad y balance. Al utilizar una cepa debe tomarse en cuenta los productos formados
durante la fermentación, por ejemplo las levaduras apiculata son conocidas por producir altas
concentraciones de ésteres, acetoína y glicerol. La cepa de Candida Stella produce una gran
cantidad de glicerol. Estas levaduras pueden ser utilizadas para iniciar la fermentación
incrementando los niveles de glicerol característico en el vino. Por otro lado, las cepas de
Torulaspora delbrueckii son caracterizadas por su gran pureza fermentativa (baja producción de
ácido acético, acetaldehído y acetato de etilo), de tal manera que su empleo en cultivo mixto con
S. cerevisiae ha sido sugerido debido a puede reducir el contenido de ácido acético y acetaldehído
en la bebida pudiendo tener un efecto positivo en el sabor y el aroma (Bely et al., 2007). Algunos
ejemplos de levaduras y sus productos volátiles están presentes en la siguiente tabla (Tabla 1.2).
Tabla 1.2: Compuestos volátiles de levaduras no-Saccharomyces
Compuesto Volátil Sustrato Descriptor Microorganismo

Compuestos
Vinilguayacol Humo Rhodotorula glutinis
fenólicos
Vainilla* Ácido ferúlico Dulce, crema Rhodotorula glutinis
Zygosaccharomyces
Glicerol Glucosa, Fructosa Dulce
acidifaciens
Acetato de etilo Glucosa Frutal Candida pulcherrima
Acetato de etilo Glucosa Frutal Hansenula anómala
Benzaldehído Alcohol Bencílico Almendra, cereza Pichia pastoris
Δ - Decalactona Δ - ácido caproico Queso Candida globiformis
2 – pentanol 2 – pentanona Queso Torulopsis sphaerica
Acetato de etilo,
acetoína y fenil Glucosa, Fructosa Frutal, floral y mantequilla. Kloeckera apiculata
propianato
Fuente: (Ciani & Picciotti 1995; Bisson & Karpel 2002).
34
FUNDAMENTACIÓN
La selección de levaduras en cultivos mixtos debe basarse no sólo en las capacidades

fermentativas de las cepas y en la producción de compuestos aromáticos, también debe tomarse
en cuenta el factor Killer presente en algunas cepas de S. cerevisiae, esta cualidad puede ser
utilizada para prevenir el crecimiento de levaduras silvestres de Saccharomyces cerevisiae o de
otro género (Moreno et al., 2000; Mendoza et al., 2007).
1.4.3 Sistemas de fermentación.
En la fermentación alcohólica existen diferentes sistemas de cultivo para producir las células
necesarias y/o para la transformación del azúcar a etanol. En cada uno de estos cultivos es
importante mantener las condiciones óptimas en la cuales la levadura podrá trabajar y transformar
de esta forma la glucosa a etanol, dichas condiciones varían en función de la levadura que se
utilice en la fermentación.
Los principales tipos de cultivo se presentan a continuación:
1.4.3.1 Cultivo por lote
El cultivo por lote también conocido como fermentación discontinua, batch o sistema cerrado, es
el que se utiliza actualmente en la industria del tequila (Figura 1.2). Consiste en preparar un
medio con al menos una fuente de carbono y nitrógeno más el microorganismo (levadura) que se
desee emplear y no se adiciona ningún otro nutriente, es decir, el flujo de alimentación (Fent) y el
flujo de salida (Fsal) son iguales a cero:
Fent = Fsal = 0
Cuando los azúcares han sido consumidos el cultivo finaliza.
Algunas de las ventajas que se presentan al utilizar un cultivo por lote es que los costos de
inversión son muy bajos, requiere escaso control y puede ser escalado al proceso industrial sin
muchos problemas (Çaylak & Vardar-Sukan, 1998). Una de las desventajas del cultivo por lote es
que requiere mucho espacio en planta, y el periodo de fermentación es largo (Virkajarvi, 2001),
además de los tiempos muertos entre cada corrida.
35
FUNDAMENTACIÓN
Figura 1.2 Cinética típica de un cultivo microbiano por lote.
1.4.3.2 Fases del crecimiento microbiano por lote
En la fermentación tanto la composición del mosto como la concentración de biomasa y

metabolitos cambian generalmente en forma continua como resultado del metabolismo de las
levaduras. Durante la operación del cultivo por lote, se presentan diferentes fases de crecimiento
del microorganismo (Figura 1.2), cada una de ellas se explica a continuación:
(1) Fase de adaptación (lag). En esta etapa, el microorganismo se adapta a las nuevas
condiciones y reorganiza sus constituyentes moleculares y dependiendo de la
composición de los nutrientes, nuevas enzimas son sintetizadas y/ reprimidas.
(2) Fase exponencial. Durante esta fase, los nutrientes se encuentran en exceso, y el
microorganismo crece a su velocidad de crecimiento máxima (µmax), de tal manera que
cada célula se divide para formar dos células, cada una de las cuales también se divide
para formar dos células más y así sucesivamente. La mayor parte de los organismos
unicelulares crecen exponencialmente. La velocidad de crecimiento exponencial varía de
un organismo a otro. Las condiciones ambientales como la temperatura y la composición
del medio de cultivo, afectan a la velocidad de crecimiento exponencial así como a las
características del microorganismo.
36
FUNDAMENTACIÓN
(3) Fase estacionaria. En esta fase no hay aumento neto de microorganismos, lo que no
significa que no se dividan algunos, sino que la aparición de nuevos individuos se
compensa por la muerte de otros. Durante la fases estacionaria la concentración total de
masa celular permanece constante, pero el número de células viables decrece, así mismo
la lisis celular puede ocurrir y la masa celular viable descender. Durante la fase
estacionaria, la célula cataboliza reservas celulares para generar nuevos bloques de
construcción y monómeros para producir energía. A este fenómeno se le denomina
metabolismo endógeno. La célula también puede gastar energía para mantener una
membrana energizada y transportar nutrientes y para funciones metabólicas esenciales;
tales como, su movilidad y reparación del daño a estructuras celulares. Este gasto
energético es llamado energía de mantenimiento.
(4) Fase de muerte. Durante esta etapa ocurre una disminución en la concentración de células
vivas. Esta baja es resultado de los subproductos tóxicos y/o del agotamiento del abasto
de nutrientes (Black, 1996).
El lapso de cada una de estas fases depende de varios factores tal y como: la cepa de
microorganismo empleado, la composición y concentración del medio de cultivo empleado, las
condiciones operacionales y ambientales, y de la preparación del inóculo.
La fase exponencial de crecimiento, puede ser descrita por la siguiente ecuación:
𝐝𝐱
𝐝𝐭
= 𝛍𝐱 (1)

Donde: x: concentración de biomasa (gL-1),

t: tiempo (h) y,
µ: velocidad específica de crecimiento (h-1)
Al integrarse la ecuación (1), se obtiene:
𝐱 𝐭 = 𝐱 𝟎 𝐞𝛍 (2)
Donde: x0: concentración inicial de biomasa
37
FUNDAMENTACIÓN
xt : concentración de biomasa en un tiempo t.
La disminución en la velocidad de crecimiento y el crecimiento durante la fase estacionaria,

debida al consumo de la concentración de nutrientes en el medio, puede ser representado por la
ecuación de Monod:
𝛍 𝐒
𝛍 = (𝐊𝐦á𝐱
!𝐒)
(3)
𝐒
Donde: S: sustrato residual presente en el medio (gL-1) y,

Ks: constante de saturación o de afinidad (gL-1)
Si el organismo tiene una alta afinidad hacia el sustrato (se tendrá un valor de Ks bajo), la
velocidad de crecimiento no se verá afectada hasta que la concentración de sustrato alcance un
valor muy bajo. Por el contrario si el microorganismo tiene una baja afinidad hacia el sustrato (se
tendrá un valor de Ks alto), y en estas condiciones la velocidad de crecimiento se verá afectada a
una alta concentración de sustrato (Ecuación 3).
Cuando la formación de un producto de interés está relacionada al crecimiento celular

(metabolitos primarios), su formación puede ser relacionada con la producción de biomasa.
También, la velocidad específica de formación de producto (qp), puede ser expresada en función
de µ y el rendimiento de formación de producto a partir de biomasa (Yp/x):
q! = Y!/! µμ (4)
La máxima productividad (qpmáx) se alcanzará cuando la velocidad específica de crecimiento sea

máxima (µmáx). Asimismo, se logrará una mayor velocidad de producción del producto, cuando
la biomasa sea la mayor concentración.
38
FUNDAMENTACIÓN
1.4.3.3 Cultivo continuo
El cultivo continuo o sistema abierto se ha utilizado desde 1950´s en las fermentaciones de vino
y cerveza debido a las altas productividades obtenidas comparadas con los sistemas tradicionales
por lote, sin embargo, la industrial del tequila no ha explorado las posibles mejoras que las
fermentaciones en continuo podrían ofrecer. El sistema en cultivo continuo se caracteriza por
buscar la producción constante de células por un período largo de tiempo, el cual se consigue por
la adición de un volumen constante de sustrato al medio de cultivo y por la salida del mismo
volumen del fermentador. El flujo de alimentación y el de salida de sustrato deben de ser iguales
y diferentes de cero (Figura 1.3) (Çaylak & Vardar-Sukan, 1998; Hernández-Cortés et al., 2009).
Fent = Fsal ≠ 0
Figura 1.3 Cinética típica de un cultivo microbiano en reactor continuo.
El sistema continuo tiene la ventaja de ser un sistema sencillo de operar y controlar durante la
fase estacionaria, lo cual facilita la estandarización del proceso y permite mantener una misma
calidad del producto. Adicionalmente este sistema reduce la contaminación microbiana
manifestándose en mayores rendimientos en la conversión azúcar-etanol, aumenta la
productividad de etanol, incrementa la disponibilidad de espacios en fábricas, debido a que con
este sistema continuo se pueden fermentar grandes volúmenes de medio de cultivo, además de
reducirse los costos de operación del proceso global ya que se puede sincronizar esta etapa con
otras del proceso que también están en continuo, economizando la energía eléctrica y el vapor de
39
FUNDAMENTACIÓN
agua obtenida de la caldera (Virkajarvi, 2001). Hernández-Cortés et al., (2009) implementaron un

sistema de fermentación en continuo, donde se estudió el efecto del pH, la aireación y la
alimentación de medio no estéril sobre las capacidades fermentativas de dos cepas de S.
cerevisiae (S1 y S2) en la fermentación en continuo del jugo agave para la elaboración de tequila.
Encontrando que en los cultivos en continuo el pH (fijado a un setpoint de 4) no tuvo un efecto
significativo sobre la eficiencia de la fermentación en comparación a las fermentaciones en las
cuales el pH no se controló (pH 2.5 ± 0.3). Por otro lado, la aireación de los cultivos de ambas
cepas mejoró la producción de biomasa y el consumo de azúcares reductores y amonio y la
producción de etanol (pero sólo para el cultivo con S1). Además la alimentación de medio estéril
y no estéril, mostró no tener un efecto significativo en la producción de etanol en los cultivos de
S1 pero si un efecto en la síntesis de compuestos volátiles. Altas concentraciones de acetoina,
ácido succínico y diacetilo fueron encontrados en los cultivos alimentados con medios no
estériles. Concluyendo que es posible escalar la fermentación en continuo del jugo de agave para
la elaboración de tequila empleando la cepa S1, utilizando medio de cultivo no estéril sin
necesidad de controlar el pH, lo cual reduce los riesgos de contaminación por la alta acidez del
medio (pH≤2.5). No obstante a pesar de las grandes ventajas que ofrece las fermentaciones en
cultivo continuo, existen desventajas en su uso como son posibles mutaciones de la cepa utilizada
durante el proceso de fermentación y elevados costos de inversión (Virkajarvi, 2001).
El balance de materia de biomasa para una fermentación en continuo, se define como:
!" !
!"
= ! x! − x + µμ x (5)
Donde: F: flujo volumétrico de alimentación (l/h),

V: volumen de operación del biorreactor (l) y
Xo: concentración de biomasa en la alimentación (gL-1)
!"
Sin embargo, cuando se alcanza el estado estacionario !"
= 0 y x! = 0, de tal manera que se
obtiene:
!
!
x = µμx (6)
40
FUNDAMENTACIÓN
Definiendo la relación F/V como la tasa de dilución (D):
!
!
= D (7)
Bajo estas condiciones de estado estacionario, la velocidad especifica de crecimiento (𝜇) es

controlada por la tasa de dilución (D) y por lo tanto:
D = µμ (8)
1.5 Compuestos volátiles en bebidas alcohólicas fermentadas
En todas las etapas del proceso de tequila se generan compuestos volátiles que impactan en el
bouquet de la bebida final, sin embargo la etapa fermentativa juega un rol muy importante, ya
que ahí se sintetiza todo el etanol y la mayor parte de los compuestos volátiles y no volátiles por
acción de las levaduras; entre los compuestos no volátiles están involucrados: ácidos orgánicos,
aminoácidos y péptidos (Figura 1.4). Dentro de los compuestos volátiles se encuentran los
llamados mayoritarios y los minoritarios que incluyen acetales, ácidos, alcoholes, aldehídos,
ésteres, éteres, furanos, cetonas, fenoles, pirazinas, compuestos azufrados, terpenos, amidas y
aminas (Benn & Peppard, 1996).
41
FUNDAMENTACIÓN

Figura 1.4: Representación esquemática de la derivación de compuestos aromáticos activos provenientes del
metabolismo de los azúcares, aminoácidos y azufre en levaduras.

1.5.1 Compuestos volátiles
Durante la fermentación alcohólica en vinos y tequila, en adición al etanol y CO2 se generan

compuestos volátiles responsables de las propiedades aromáticas y sensoriales de la bebida como
son: alcoholes superiores, ésteres y ácidos orgánicos. Cada uno de estos compuestos tienen
umbrales de percepción diferentes y por lo tanto su concentración desempeña un papel
importante en el aroma, incluso en concentraciones pequeñas (Swiegers et al., 2005).
42
FUNDAMENTACIÓN
1.5.1.1 Alcoholes Superiores
Los alcoholes superiores también conocidos como alcoholes de fusel son metabolitos secundarios
de las levaduras, y pueden tener impactos positivos y negativos en el sabor y el aroma de las
bebidas alcohólicas. Concentraciones excesivas (> 400 mg L-1) de alcoholes superiores pueden
resultar en olores y sabores fuertes y picantes, mientras que a niveles menores (< 300 mg L-1)
imparten características frutales a la bebida. Los alcoholes superiores están divididos en dos
categorías: 1) Los alcoholes alifáticos que incluyen al n-propanol, alcohol isoamílico, isobutanol
y el alcohol amil activo y 2) Los alcoholes aromáticos que están constituidos por el 2-fenil etanol
y el tirosol. Varios factores afectan la concentración de alcoholes superiores como son: el uso de
diferentes cepas de levaduras durante la fermentación, la concentración de aminoácidos
(precursores de los alcoholes superiores) en el mosto, que aumenta con el incremento del
aminoácido correspondiente, la concentración de etanol, la temperatura de fermentación, el pH, la
composición del medio y la aireación (Swiegers & Pretorius, 2005). Se ha reportado que la
presencia de levaduras no-Saccharomyces durante la fermentación afecta significativamente la
concentración de alcoholes superiores, por ejemplo la fermentación en cultivo mixto de P.
fermentans y S. cerevisiae produce un sustancial incremento de alcoholes superiores tal como n-
propanol, n-butanol y 1-hexanol comparado con aquellas fermentaciones efectuadas solamente
con S. cerevisiae (Clemente-Jiménez et al., 2005). Sin embargo otros estudios como el realizado
por Zironi et al. (1993) mostraron que el empleo de levaduras no-Saccharomyces del género
apiculata en cultivo mixto y secuenciales con S. cerevisiae produce concentraciones de alcoholes
similares a las producidas por S. cerevisiae en cultivo puro. La mayoría de los compuestos
volátiles pueden ser producidos por las levaduras (Figura 1.5), por degradación exógena de
aminoácidos, ó por asimilación de azúcares a través de la síntesis de cetoácidos. La piruvato
descarboxilasa convierte al cetoácido resultante en el correspondiente aldehído de cadena
ramificada, y la alcohol deshidrogenasa cataliza la reducción del NADH-dependiente de este
aldehído en el correspondiente alcohol superior. De igual forma, los alcoholes superiores pueden
ser generados por degradación de los aminoácidos de cadena ramificada a través de la ruta de
Ehrilich. Durante este proceso, las levaduras utilizan al menos tres aminotransferasas, cinco
descarboxilasas y seis deshidrogenasas (Díaz-Montaño et al., 2009; Swiegers & Pretorius, 2005).
43
FUNDAMENTACIÓN
Figura 1.5: Representación esquemática de la síntesis de alcoholes superiores en levaduras
1.5.1.2 Glicerol
El glicerol conjuntamente con el etanol, juegan un papel muy importante en la fijación de aromas
que contribuyen a la viscosidad de las bebidas fermentadas. La síntesis de glicerol ocurre en una
reacción acoplada a la glucólisis a nivel del glicerladehido-3-fosfato (Figura 1.4). La formación
de etanol es posible solamente si el NAD+ es regenerado. La regeneración del cofactor
enzimático ocurre principalmente en la producción de glicerol. También, la producción de ácido
succínico y ácido acético restablecen el NAD+ a NADH. Algunos reportes sugieren que las
levaduras del género Kloeckera, producen este metabolito en el rango de 1.36 a 4.44 gL-1 y las
levaduras S. cerevisiae y H. guillermondii lo producen en el rango de 4.8 a 8.3 gL-1
respectivamente (Romano et al., 1997; Rojas et al., 2003; Díaz-Montaño et al., 2008).
44
FUNDAMENTACIÓN
1.5.1.3 Ácidos orgánicos
Cerca de 100 ácidos orgánicos se han reportado en bebidas alcohólicas, tales como acetatos,
succinatos, α- cetoglutarato, malato y citrato, los cuales son derivados del piruvato vía ciclo de
los ácidos tricarboxílicos y son producidos por las levaduras, por ejemplo el ácido palmítico,
ácido palmitoleico, ácido esteárico y ácido oleico; estos ácidos son importantes precursores de
ésteres en la producción de bebidas alcohólicas. Los ácidos orgánicos de cadena corta de carbono
describen la acidez volátil en ciertas bebidas como el vino, en donde su contenido se sitúa entre
los 500 y 1000 mg L-1 (10-15% del contenido total del ácido) y por esto, el ácido acético
constituye usualmente cerca del 90% de los ácidos volátiles. El resto de los ácidos volátiles,
principalmente el ácido propanoico y hexanoico son producidos como resultado del metabolismo
de ácidos grasos de levaduras y bacterias. El ácido acético es de particular importancia. A
elevadas concentraciones imparte notas a vinagre (concentraciones entre 0.7-1.1 gL-1), y en el
rango de 0.2-0.7 gL-1 contribuyen a la propiedades de aroma en la bebida. Ciertos reportes han
sugerido que la concentración de ácido acético varía en función de la cepa de levadura empleada
y las condiciones de fermentación (Erten, 2002; Bilbao et al., 1997; Díaz-Montaño et al., 2008,
Romano et al., 2003). Sin embargo otros estudios como el realizado por Rojas et al. (2003)
sugieren similares concentraciones de ácido acético entre diferentes géneros de levadura como H.
guilliermondii y S. cerevisiae en cultivos puros y mixtos, alcanzando concentraciones superiores
a las 900 ppm. Por otro lado Bilbao et al. (1997) observó diferencias en la concentración de ácido
acético con respecto a la temperatura, mostrando que para las levaduras del género Kloeckera la
concentración se sitúan entre 0.66 – 0.77 gL-1 y para S. cerevisiae en el rango de 0.02 – 0.04 gL-1.
Estudios efectuados en tequila por su parte, muestran que las levaduras del género Kloeckera
sintetizan ácido acético en el rango de 92.3±18 ppm y S. cerevisiae no se detectó el compuesto
bajo las condiciones de estudio (Díaz-Montaño et al., 2008).
1.5.1.4 Ésteres
Los ésteres son formados por las levaduras y bacterias a través de la fermentación alcohólica
(esterificación biológica) y una muy pequeña parte durante el añejamiento (esterificación
química). Su producción, puede tener un efecto significativo sobre los aromas y sabores frutales
de la bebida (Figura 1.6). Los ésteres más significativos que tiene un alto impacto sobre las
propiedades aromáticas de la bebida son: el acetato de etilo (aroma frutal y solvente), acetato de
45
FUNDAMENTACIÓN
isoamilo (aroma a pera), acetato de isobutilo (aroma a banana), hexanoato de etilo (aroma a
manzana) y acetato de fenetilo (aroma a miel, frutal y floral). Debido a que el etanol es el alcohol
más abundante, los ésteres de etilo son los que predominan, seguidos por los ésteres amílicos y
propílicos, por su parte el acetato de etilo es el que predomina en bebidas alcohólicas, y cuanto
está presente en altas concentraciones (> 50 mg L-1 en cerveza y >175 mg L-1 en whisky) confiere
malos olores. Los ésteres, especialmente el acetato de etilo, son producidos por las levaduras del
género Kloeckera, principalmente (Romano et al., 2003; Rojas et al., 2001 y Díaz-Montaño et al.,
2008). Otros autores por su parte han reportado que no existen diferencias significativas en su
concentración entre cultivos puros y mixtos de H. guillermondii, H. uvarum y S. cerevisiae
(Moreira et al., 2005). No obstante en cultivos mixtos, los niveles de acetato de etilo producido
podrían contribuir a las notas frutales y mejorar la complejidad general de la bebida. Rojas et al.
(2003) reportó que las fermentaciones en cultivo mixto de levaduras silvestres, tales como H.
guillermondii y P. anomala, con S. cerevisiae incrementan la concentración de ésteres de acetato,
en comparación con las fermentaciones efectuadas con S. cerevisiae en cultivo puro, sin afectar
significativamente la concentración de acetaldehído, ácido acético, glicerol y alcoholes superiores.
Erten (2002) por su parte encontró diferencias significativas en la concentración de acetato de
etilo, butirato de etilo, acetato de isoamilo y hexanoato de etilo en el rango de temperatura de 10
a 25 ºC en los cultivos mixtos de Kloeckera y Saccharomyces. Incrementándose su concentración
a bajas temperaturas.
Por otra parte Benn & Peppard (1996) identificaron más de 175 compuestos volátiles en tres tipos
de tequilas agrupándolos en ocho familias de compuestos, donde la mayor cantidad de
compuestos identificados estuvieron situados en el grupo de los ésteres, con aproximadamente 50
compuestos individuales detectados en los extractos. Siendo la mayoría ésteres de etilo, otros
ésteres de metilo, ésteres de isoamilo y ésteres de fenetilo, que incluían ésteres insaturados, ceto-
ésteres e hidroxiésteres. Todos ellos o su gran mayoría son productos del metabolismo de la
levadura ó son formados subsecuentemente durante el proceso de añejamiento por esterificación
de los ácidos grasos en la presencia de altas concentraciones de etanol.
46
FUNDAMENTACIÓN
Figura 1.6: Representación esquemática de la síntesis de acetato de etilo y acetato de isoamilo en levaduras
1.5.1.5 Grupos carbonilo
Los grupos carbonilo son compuestos que consisten de grupos aldehídos alifáticos, aromáticos y
cetonas: más de 200 miembros de este grupo han sido detectados en bebidas alcohólicas. Una
parte de los compuestos carbonilos se sintetizan por la acción metabólica de las levaduras, la
mayoría se producen por reacciones térmicas, que ocurren durante el procesamiento de la materia
prima y el sustrato, así como en la pasteurización y destilación del producto (Berry & Watson,
1991).
1.5.1.6 Aldehídos
El acetaldehído es el mayor compuesto carbonilo (constituye el 90% del total de aldehídos) y es

uno de los principales intermediarios metabólicos de la fermentación. Es formado a partir del
piruvato, el producto terminal de la glucólisis por acción de la enzima piruvato descarboxilasa,
después el acetaldehído es convertido a etanol por acción de la enzima alcohol deshidrogenasa.
Este paso es crucial para mantener el balance redox en la célula, como la reoxidación del NADH
a NAD+, que es requerido para la glucólisis (Berry & Watson, 1991). El acetaldehído se ha
47
FUNDAMENTACIÓN
encontrado en concentraciones en el rango de 10 a 75 mg L-1 y un valor de umbral sensorial de

100 mg L-1. Contribuye al sabor y aroma de la bebida (concentraciones < 100 mg L-1) aportando
descriptores a manzana y nuez, y su presencia puede ser un indicativo de cierta oxidación en la
bebida. Durante la fermentación, la rápida acumulación de acetaldehído en el mosto ocurre
cuando la velocidad de asimilación de carbono está en su máximo, y después cae a un nivel
menor al final de la fermentación y después lentamente se incrementa con el tiempo. Las
condiciones de fermentación tal como la composición del medio, la naturaleza de material
insoluble utilizado para clarificar el mosto, y la condiciones extremas aeróbicas de crecimiento
afectan grandemente las concentraciones de acetaldehído. En adición, la cantidad de acetaldehído
se incrementa, debido a la oxidación del etanol y al incremento en la temperatura de fermentación
(Romano et al., 1994). Sin embargo otros investigadores reportan que la mayor concentración de
acetaldehído se alcanza a bajas temperaturas (10 ºC) en los cultivos mixtos de Kloeckera y
Saccharomyces (Erten, 2002). Por otro lado la concentración de acetaldehído también puede
variar considerablemente, dependiendo del género de levadura. S. cerevisiae llega a presentar
concentraciones entre 0.5 – 286 ppm, K. apiculata concentraciones de 6 – 66 ppm y H.
guillermondii concentraciones de 10.5 – 28 ppm (Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova, 2009).
(Swiegers et al., 2005; Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova, 2009).
1.5.1.7 Cetonas
Las cetonas tienen baja volatilidad y alto umbral de sabor (suma de atributos sensoriales que
incluyen el gusto y las sensaciones trigeminales); el más abundante es el piruvato y el menos
abundante el ácido α − cetobutírico, tienen influencia en el sabor del vino y la cerveza. Los
niveles de piruvato son controlados por factores similares a los aldehídos, éstos son producidos
por las levaduras durante las fases activas de fermentación y son reabsorbidos más tarde si la
levadura permanece activa. Los niveles iniciales de piruvato están controlados por factores que
tienen influencia en la velocidad de fermentación y crecimiento de la levadura, la reabsorción es
controlada por los factores que influyen en la viabilidad celular y la actividad bioquímica (Berry
& Watson, 1991). Además del piruvato, otro compuesto importante involucrado en el bouquet de
las bebidas alcohólicas, es la acetoína un compuesto clave en síntesis de 2,3-butanediol y
diacetilo, producido de igual manera durante la fermentación por la actividad microbiana de
levaduras y bacterias. Su contribución al sabor y el aroma no es fácil de evaluar, ya que ni el 2,3-
48
FUNDAMENTACIÓN
butanediol y la acetoína producen olores fuertes, de hecho sus valores de umbral son muy altos
alrededor de los 150 mg L-1, sin embargo el diacetilo se ha asociado como un compuesto que
produce malos olores (a niveles de umbral < 8 mg L-1) (Romano et al., 1996). Este compuesto es
sintetizado a partir del ácido pirúvico a través de la condensación de una molécula de piruvato y
otra de acetaldehído activo que se combinan con el pirofosfato de tiamina (complejo
acetaldehído-TPP), formando el α-acetolactato. El diacetilo proviene de la descarboxilación
oxidativa del α-acetolactato. La acetoína puede ser formada por la descarboxilación no oxidativa
del ácido α-acetolactato o por la reducción del diacetilo (Romano et al., 1996). El principal
factor que afecta su producción es el tipo de levadura utilizada (Romano et al., 2003). Ciertos
reportes sugieren que la producción de acetoína es una característica distintiva de las levadura
apiculata (Romano et al., 1996; Romano et al., 2003; Ciani et al., 2006) alcanzando
concentraciones en el rango de 100 – 200 ppm (K. apiculata y H. guillermondii), por su parte
para S. cerevisiae, se ha asociado su presencia en las primeras etapas de la fermentación,
reduciendo su concentración hacia el final de la misma, posiblemente por su reducción a 2,3-
butanediol (Romano et al., 1996).
1.5.1.8 Compuestos azufrados
Cerca de 50 compuestos volátiles se han detectado en bebidas alcohólicas y tienen un profundo

efecto en el sabor; debido a su alta volatilidad, reactividad y potencia a bajos niveles de umbral.
Generalmente, las contribuciones aromáticas de la mayoría de estos compuestos están asociados a
descriptores negativos como: col, huevos podridos, azufre, cebolla y caucha, sin embargo algunos
contribuyen con aromas positivos como fresa, maracuyá y pomelo (Swiegers et al., 2005). La
mayoría de éstos compuestos no son sintetizados por las levaduras sino que provienen del
material crudo, particularmente de la malta y lúpulo en la elaboración de la cerveza y de la uva
para el caso del vino. Los mecanismo químicos y bioquímico involucrados en la formación de
compuestos azufrados resultan poco conocidos, sin embargo su desarrollo por las levaduras
incluyen 1) degradación de los aminoácidos que contienen azufre, 2) degradación de pesticidas
que contienen azufre y 3) liberación y/o metabolismo de precursores derivados de uvas que
contiene azufre. (Swiegers et al., 2005). Los mayores compuestos volátiles azufrados producidos
por la levadura son el SO2 y H2S. Producidos a partir de compuestos inorgánicos acumulados en
49
FUNDAMENTACIÓN
el mosto que contienen sulfuro, sulfato y sulfito (Como el sulfato de amonio o el fosfato
diamonico ) ó de compuestos orgánicos que contienen sulfuro como la cisteína y el glutatión. En
S. cerevisiae el H2S es el producto de una secuencia de reacciones de reducción del sulfato, que
actúa como un intermediario en la síntesis de aminoácidos que contiene azufre (Swiegers et al.,
2005). Existen pocos reportes sobre la producción de compuestos azufrados por levaduras no-
Saccharomyces, sin embargo los pocos disponibles sugieren que K. apiculata y H. guillermondii
producen concentraciones menores de 10 ppm de SO2, y en relación al H2S, K. apiculata produce
las mayores concentraciones (Romano et al., 1997). Por otra parte Moreira et al. (2005) encontró
que la producción de compuestos azufrados esta asociado al tipo de levadura empleada.
Encontrando que los cultivos puros y mixto de levaduras apiculatas como H. uvarum producen la
mayor concentración de estos metabolitos (metionol, ácido 3-metiltiopropionico y 2-metil-
tetrahidrofuran-3-ona).
1.5.1.9 Fenoles
Los compuestos fenólicos contribuyen favorablemente al aroma de algunos vinos confiriendo

sabores y olores dulces y alquitrados, sin embargo la mayoría promueven los malos olores y
sabores en la bebida, impartiendo notas medicinales, a corral, sudor, caballo, cuero, orina de
ratón, perro mojado, humo, picante, queso, rancio y metálico. La mayoría de los fenoles presentes
en las bebidas alcohólica se originan de las materias primas y de su procesamiento y son
conocidos por producir una barrera estable de olor si están presentes a altas concentraciones,
confiriendo un olor farmacéutico característico; derivándose de la descarboxilación oxidativa de
ácidos ferúlicos e ρ-hidroxicinnamicos por acción de levaduras y bacterias. Las levaduras no-
Saccharomyces de los géneros Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Hansenula, Rhodotorula
y Pichia se han asociado a la producción moderada de compuestos fenólicos (Swiegers et al.,
2005; Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova, 2009).
1.5.1.10 Terpenos
En la industria, la mayoría de los terpenos presentes en bebidas alcohólicas emanan de la materia

prima, sin embargo ciertos reportes indican que algunas levaduras los producen. Estos
compuestos imparten un olor agradable y son llamados precursores de aromas ya que son
susceptibles de ser transformados en compuestos volátiles responsables de los aromas de la
50
FUNDAMENTACIÓN
fermentación alcohólica (Swiegers et al., 2005; Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova, 2009). Su

transformación se realiza por hidrólisis de las enzimas levurianas: 1´α-L-rhamnopiranosidasa, β -
glucosidasa y 1´α -L-arabinofuranosidasa, localizadas entre la membrana plasmática y la pared
celular de S. cerevisiae. La hidrólisis enzimática es llevada acabo en dos etapas, en la primera
etapa las enzimas 1´α-L-rhamnopiranosidasa y 1´α-L-arabinofuranosidasa se unen al enlace 1,6-
glicosidico. En la segunda etapa, los monoterpenos liberan al mono-terpenilo-β-D-glucósido por
acción de la β–glucosidasa. Estos compuestos son particularmente interesantes por su gran
variedad de aromas. Por ejemplo, el aroma del geraniol y nerol es descrito como a rosas, el linalol
como a cilantro, el óxido de linalol como alcanfor y el óxido de nerol como a vegetal (Figura 1.7).
Ciertas cepas de S. cerevisiae posen actividad β-glucosidasa, que actúan liberando los terpenos
provenientes de la materia prima. Sin embargo, su actividad hacia los precursores glucósidos es
muy baja, debido a la inhibición de las enzimas por las altas concentraciones de substrato y etanol.
En base a este criterio, ha surgido la necesidad de buscar nuevos microorganismos con actividad
β-glucosidasa. Algunos reportes han sugerido que las levaduras no-Saccharomyces de los
géneros Brettanomyces, Candida, Debaryomyces, Hanseniaspora y Pichia presentan alta
actividad β-glucosidasa; permitiendo estimular así la liberación de estos compuestos y por ende
enriquecer los aromas de la bebida (Otero et al., 2003, Mateo et al., 1997; Villena et al., 2007).
Figura 1.7: Representación esquemática de la síntesis de esteroles y terpenos en levaduras
51
FUNDAMENTACIÓN
1.5.1.11 Amidas y aminas
Existe poca referencia de la producción de amidas y aminas por levaduras, estos compuestos
pueden afectar el sabor de las bebidas alcohólicas en cantidades pequeñas; confiriendo notas
dulces. Las aminas son posiblemente formadas por la descarboxilación de aminoácidos en la
fermentación y por transaminación de un aldehído (Berry & Watson, 1991).
1.6 Técnicas Instrumentales y sensoriales empleadas para la caracterización del sabor

de alimentos y bebidas
Por medio de técnicas instrumentales y sensoriales es posible caracterizar el sabor de alimentos y

bebidas que permiten correlacionar los compuestos volátiles (aromas) con descriptores
específicos que definen el perfil sensorial característico de cada alimento y bebida.
1.6.1 Técnicas Instrumentales
Las técnicas instrumentales más comúnmente utilizadas para la identificación y cuantificación de

compuestos volátiles de alimentos y bebidas se basan en cromatografía, siendo las más utilizadas
la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), la cromatografía de gases-
espectroscopía de infrarrojo (GC-IR), la espectrometría de masas-espectrometría de masas (MS-
MS). Algunos estudios que se han realizado en alimentos y bebidas para estudiar la composición
volátil de diversos tipos de bebidas alcohólicas como el tequila y los vinos y que hacen uso de las
técnicas anteriores, son los siguientes:
1) Prado et al. (2002) estudió los compuestos volátiles presentes en las diferentes etapas del
proceso de producción del tequila. Para la extracción de los compuestos volátiles se utilizó el
método de extracción líquido-líquido por lote y el extracto se analizó por cromatografía de gases
acoplada a masas (identificación) y cromatografía de gases con un detector de ionización de
flama (cuantificación). En este estudio se separaron 562 compuestos de las diferentes etapas del
proceso de elaboración del tequila, de los 562 se identificaron y cuantificaron 410.
2) Aguilar-Cisneros et al. (2003) evaluaron la autenticidad del tequila. En este estudio se utilizó
la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas con relación isotópica (SPME-
52
FUNDAMENTACIÓN
HRGC-IRMS) para comparar tequilas blancos, reposados y añejos auténticos con tequilas
comerciales y otro tipo de bebidas espirituosas. Por otro lado esta técnica les permitió saber el
origen del etanol, es decir, de cual materia prima provenía en base a la relación isotópica que
guardan los elementos carbono y oxígeno del etanol.
3) Vallejo-Córdoba et al. (2000) identificaron los compuestos volátiles de tequilas blancos,
reposados, añejos y extraañejos. La técnica utilizada para la extracción de compuestos volátiles
fue la microextracción en fase sólida acoplada a cromatografía de gases (SPME-CG-EM). El
método de identificación fue espectrometría de masas. Se identificaron 17 compuestos.
4) Benn & Peppard (1996) estudiaron el aroma característico de tres tipos de tequilas (blanco,
reposado y añejo). Los métodos de identificación que se utilizaron fueron: cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) y cromatografía de gases acoplada a olfatometría
(GC-O). Se analizaron diferentes clases de tequila: blanco, reposado y añejo, en donde el tequila
blanco presentó un mayor número de compuestos volátiles. Se identificaron alrededor de 175
compuestos volátiles. El análisis sensorial les permitió determinar los compuestos que tienen
mayor poder odoractivo en el tequila; estos son isovaleraldehído, alcohol isoamílico,
β−damascenona, 2-feniletanol y vainillina.
5) Estarrón-Espinosa (1997) identificó los principales compuestos volátiles que caracterizan al
tequila blanco 100% de Agave. Para la extracción de los compuestos volátiles se utilizó el
método de extracción líquido-líquido en continuo. Los extractos se analizaron por cromatografía
de gases-espectrometría de masas (identificación) y cromatografía de gases con detector de
ionización de flama (cuantificación).
1.6.2 Técnicas Sensoriales
La evaluación sensorial es una ciencia multidisciplinaria que comprende la medición,

interpretación y entendimiento de las respuestas humanas a las propiedades de alimentos y
bebidas percibidas por los sentidos tales como la vista, el olfato, el tacto, el gusto y el oído
(Martens, 1999), que permite determinar y conocer información relevante del producto como son:
sus propiedades sensoriales, su preferencia o desagrado, si es sensorialmente diferente de
productos similares por modificaciones debidas a la adición de un ingrediente, procesamiento,
almacenamiento o empaque, así como también para desglosar los matices de los componentes
53
FUNDAMENTACIÓN
que definen el perfil sensorial del producto en olor, gusto, aroma, textura y sensaciones
trigeminales (Meilgaard et al., 1999).
En función de la problemática que se quiera resolver, se definen las técnicas empleadas en la

evaluación sensorial, siendo las más utilizadas las siguientes:
A) Pruebas Hedónicas: la finalidad de estas pruebas es definir el agrado ó desagrado del

producto en función de sus características sensoriales percibidas por el consumidor.
B) Pruebas Discriminativas: su finalidad es determinar si existen diferencias significativas
entre muestras debidas a alguna modificación en el proceso, almacenamiento u
ingrediente, dependiendo de la cantidad de muestras a evaluar es la técnica a emplear,
siendo las más utilizadas la prueba de pares, la dúo trío, la triangular, la “ A” “No A” y,
Ranking.
C) Pruebas Descriptivas: su finalidad es describir en forma detallada las diferentes
características que definen el perfil sensorial del producto, siendo las más utilizadas: El
análisis descriptivo cuantitativo (QDA), el análisis descriptivo “Spectrum” y el Análisis
cualitativo (Meilgaard et al., 1999).
54
PROCEDIMIENTO Y
MÉTODO

PROCEDIMIENTO Y MÉTODO
2.- PROCEDIMIENTO Y MÉTODO.
2.1 Levaduras empleadas
Las levaduras utilizadas fueron: Saccharomyces cerevisiae (S1 y S2), Kloeckera africana (K1) y
Kloeckera apiculata (K2), ambas pertenecientes al banco de cepas del Centro de Investigación y
Asistencia Tecnológica y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ) y aisladas a partir de una
fermentación espontánea de jugo de Agave tequilana Weber var azul (Región central del valle de
Tequila y de la región de Los Altos) (Figura 2.1) (Díaz-Montaño et al., 2008).
Figura 2.1 Morfología de K. africana K1 (A), K. apiculata K2 (B), S. cerevisiae S1 (C) bajo anaerobiosis no estricta
en jugo de agave
2.1.1 Conservación de los microorganismos.
Las levaduras se conservaron a -70 °C. El método de preparación de muestras para la

conservación fue el siguiente: se realizó un cultivo de cada levadura del género Saccharomyces y
Kloeckera en 500 mL de medio de crecimiento preparado con jugo de agave diluido con agua
destilada a 3 ºBx (27 ± 2 gL-1 de azúcares reductores) y suplementado con 1 gL-1 de sulfato de
amonio para las levaduras del género Saccharomyces y 1 gL-1 de extracto de levaduras para las
levaduras del género Kloeckera y esterilizados a 121 ºC por 15 minutos. Estos cultivos se
crecieron en una incubadora orbital a 30 °C y 250 rpm, durante 12 h (tiempo en el que a estas
condiciones, estas levaduras llegan a la fase de desaceleración en el cultivo por lote, determinado
por sus cinéticas de crecimiento). Al fin de cada cultivo se alcanzó una concentración celular de
80 x 106 cel mL-1 para las levaduras del género Kloeckera y de 100 x 106 cel mL-1 para las
56
levaduras del género Saccharomyces. Estos cultivos se mezclaron en una proporción 1:1 con una
solución de glicerol (50% v/v), previamente esterilizada y se distribuyó en tubos Eppendorf (de 2
mL) 1 mL de cultivo; posteriormente, los tubos se conservaron en un criorefrigerador a -70 °C.
Jugo de agave utilizado. En todas las fermentaciones llevadas a cabo durante este estudio de
investigación se empleó un mismo lote de jugo de Agave tequilana Weber var. azul 100%
(conteniendo solamente los azúcares extraídos por cocción de las cabezas de agave) que fue
amablemente donado por la destilería de tequila “La Cava de Oro” (ubicada en la Región de
Tequila, Jalisco) y se almacenó a -20 °C en contenedores de 20 L. Previo a su uso, el jugo de
agave se descongeló, se filtró (presentando una concentración de 28-30 °Brix), se ajustó a la
concentración de azúcares deseada según fuera el medio de crecimiento ó fermentación
añadiendo agua destilada y se esterilizó.
2.2 Medios de cultivo y condiciones de fermentación
Para llevar a cabo el estudio cinético las levaduras seleccionadas en la fermentación de jugo de
agave, las cepas conservadas a -70 ºC se reactivaron como se menciona continuación. (Figura
2.2).
Conservación Crecimiento Fermentación
Figura 2.2 Metodología para iniciar una fermentación
2.2.1 Medio y condiciones de propagación
Inicialmente, las levaduras conservadas a -70 ºC en tubos Eppendorf se reactivaron siguiendo el

siguiente procedimiento, 1) El contenido de cada tubo previamente descongeladas en agua a 20
ºC se vació a unos matraces Erlenmeyer de 250 mL que contenían 50 mL de jugo de agave
ajustado con agua destilada a 3 °Brix (27 ± 2 gL-1 de azúcares reductores) y suplementado con 1
gL-1 (220 mgN/L) de sulfato de amonio. Los cultivos se incubaron a 30 °C y 250 rpm durante 24
h. 2) Se agregó el 10% (v/v) del cultivo crecido a un matraz Erlenmeyer de 500 mL que contenía
57
200 mL de jugo de agave ajustado con agua destilada a 3 ºBrix (27 ± 2 gL-1 de azúcares
reductores) adicionado con 1 gL-1 de sulfato de amonio (220 mg NL-1) para obtener el inóculo. El
cultivo se incubó a 30 ºC y 250 rpm durante 12 h (tiempo en el que a estas condiciones, las
levaduras seleccionadas llegan a la fase de desaceleración en el cultivo por lote, determinado en
la cinética mostrada en la Figura 2.3).
2.5
2.0
Biomasa gL-1
1.5
1.0
K1
0.5 K2
S1
S2
0.0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (h)
Figura 2.3 Cinéticas de crecimiento en lote de S. cerevisiae (S1 y S2) y K. africana (K1) y K. apiculata (K2) en el
medio de crecimiento (González, 2009).
2.2.2 Medio de fermentación
El jugo de agave se ajustó con agua destilada a una concentración inicial de azúcares reductores
de 100 ± 11 gL-1. En la mayoría de los casos, se adicionaron diferentes concentraciones de
nitrógeno orgánico e inorgánico según fuera el tratamiento, asimismo otros nutrientes como
ciertos factores de crecimiento fueron añadidos al medio de cultivo. El pH inicial del medio de
fermentación varió dependiendo de los nutrientes adicionados y de su concentración, pero en
58
general se mantuvo en el rango de 4.1-4.5. Las fermentaciones fueron llevadas a cabo en

matraces ó biorreactores, según fuera el experimento.
2.3 Sistemas de fermentación
Las fermentaciones se llevaron a cabo en dos sistemas de fermentación: matraz y biorreactor. La

selección del sistema dependió de la naturaleza de la prueba a realizar y del diseño experimental
planteado.
Los inóculos empleados se calcularon para alcanzar una densidad celular inicial de 3.5 x 106
cel/mL en cultivo puro y en cultivo mixto se utilizó una relación 1:1 de cada cepa para obtener la
concentración inicial deseada (es decir 1.75 x106 cel/mL de cada cepa de levadura).
2.3.1 Cultivo por lote
En cultivo por lote las fermentaciones se efectuaron a nivel matraz y biorreactor dependiendo del
experimento. En matraz se realizaron las fermentaciones de aquellos diseños experimentales en
los que se requerían de varias unidades experimentales, considerando la repetición de cada una de
éstas, como por ejemplo para la selección de las levaduras en cultivo puro y mixto (Figura 2.4-A).
Para llevar a cabo las fermentaciones, se emplearon matraces Erlenmeyer con capacidad de 500
mL que contenían 250 mL de medio de cultivo. Se sellaron con tapones de algodón para permitir
la entrada de oxígeno al medio y la salida de dióxido de carbono que se producía durante la
fermentación. En biorreactor se efectuaron las fermentaciones de los diseños experimentales en
los que se requería la obtención de mosto para destilar y caracterizar aromáticamente. Para
efectuar las fermentaciones se utilizó un biorreactor New Brunswick de 14 L con un volumen de
operación de 10 L. La temperatura y la velocidad de agitación fueron controladas por el mismo
sistema (Figura 2.4-B). Los matraces y biorreactores se esterilizaron y después se enfriaron a
20 °C para inocularlos e iniciar las cinéticas de fermentación respectivas. Los cultivos se
incubaron a 30 °C y 250 rpm durante 72 h. Estas condiciones se fijaron con ayuda de una
incubadora con agitación orbital y un árbol mecánico. En todas las fermentaciones, el pH fue
monitoreado pero no se controló su valor. Durante la operación en lote, únicamente se permitió la
salida del dióxido de carbono producido durante la fermentación.
59
Figura 2.4 Matraces (A) y Biorreactor New Brunswick de 14 L (B) empleados en las fermentaciones por lote
2.3.2. Cultivo en continuo
Las fermentaciones en continuo se realizaron en un sistema Applikon (Applikon, Holanda) de 3 L

con un volumen de operación de 1.5 L (Figura 2.5). El Biorreactor consiste de un recipiente de
vidrio con fondo redondo y una tapa, árbol mecánico de agitación con impulsores tipo Rushton y
mamparas de acero inoxidable. El Biorreactor de 3L se conectó a un panel de Bioconsola ADI
1035 y a un Biocontrolador ADI 1030 con el cual se monitoreó el pH y se controló la temperatura
y la velocidad de agitación (Figura 2.5). El pH se monitoreó con un potenciómetro conectado a
una sonda, la temperatura se monitoreó con un termopar conectado a otra sonda. Al inicio, el
cultivo mixto se operó por lote y al llegar las levaduras a la fase de desaceleración, comenzó la
alimentación del cultivo. Las fermentaciones se realizaron con ó sin suministro de oxígeno.
Cuando se empleó flujo de aire, el sistema de aireación consistió de un dispersor de gas situado al
final del eje del árbol de agitación. El dispersor procura que el gas se distribuya como burbujas
pequeñas, aumentando la superficie de contacto entre la fase gas y el medio de cultivo
distribuyéndose lo mejor posible en el medio de cultivo. El flujo de aire a la entrada del
60
biorreactor fue proporcionado por una bomba peristáltica (Cole-Parmer Company, Barrington IL,
EUA) sincronizada con la ayuda de un rotámetro.
Para realizar el cultivo en continuo se acoplaron dos bombas peristálticas: una que regulaba la
entrada del flujo del medio de alimentación al biorreactor y otra que regulaba la salida de mosto
fermentado. Ambos flujos fueron ajustados al mismo valor para mantener un volumen constante
de mosto en el fermentador. El flujo de entrada, se calibró y sincronizó meticulosamente con una
bomba peristáltica de caudal variable (Cole-Parmer Company, Barrington IL, EUA) con la que se
adicionó continuamente medio fresco al Biorreactor. Para mantener el volumen constante, se
retiró mosto con la acción de un sensor de nivel que al cerrar el circuito eléctrico con el mosto,
activaba una bomba peristáltica que retiraba el mosto excedente, así se mantenía el volumen en el
valor deseado (Figura 2.5). El valor del flujo de entrada dependió de la tasa de dilución probada.
El jugo del medio de entrada se preparó en contenedores de 10 L, los cuales fueron esterilizados.
El mosto retirado del fermentador se acumuló en un contendor de 1L sellado (Figura 2.6).
Figura 2.5 Biorreactor Applikon de 3 L conectado a una Bioconsola ADI 1035 utilizado en las fermentaciones en
continuo.
61
Figura 2.6 Cultivo continuo empleado en las fermentaciones en cultivo mixto.
2.4 Métodos Analíticos.
2.4.1 Análisis de biomasa y viabilidad celular.
La cuantificación de la biomasa de las levaduras del género Saccharomyces y Kloeckera en los

cultivos puros y mixtos tanto en los sistemas por lote y en continuo, se analizó por tres métodos:
2.4.1.1 Población Celular.
Para la cuantificación de levaduras se empleó una cámara de Neubauer. La cámara está dividida
en tres partes: dos laterales y una central.
La parte central es más baja que las dos laterales y cuenta con una cuadrícula de 1mm2 dividida
en 400 pequeños cuadros de 1/20 mm de lado. Estos 400 cuadros están agrupados en 25 cuadros
grandes (Figura 2.7).
62
Figura 2.7 Cámara de Neubauer y microscopio empleados.
Sobre la cámara se coloca un cubreobjetos dejando un espacio de 1 mm por el cual se coloca una
pequeña cantidad de muestra en la cámara con una micropipeta, la muestra entra a la cámara por
medio de capilaridad, posteriormente se hace una lectura en el microscopio (Olympus CH-2
modelo CHS) con el objetivo de 40X y se hace la lectura de la cantidad de células presentes en
cada cuadro. Con fines estadísticos, sólo se cuentan los cuadros que se encuentran en los
extremos de las esquinas y el del centro; teniendo de esta manera un total de diez cuadros. Para
garantizar un adecuado conteo celular con la cámara, se consideró que cuando había más de 30
células en cada cuadro de la cámara, se debería diluir la muestra.
La concentración de células por mililitro se determina con la siguiente ecuación:
N!
X = × D × 0.25 x 10!
N!
Donde:
X = Millones de células por mililitro

NC = Número de células contadas
NK = Número de cuadros contados
D = Dilución de la muestra
63
2.4.1.2 Peso Seco
La determinación de biomasa consiste en centrifugar las muestras a una velocidad de 10,000 rpm
durante 15 min, en una centrífuga SOLBAT C–600 (Figura 2.8); el sobrenadante se utiliza para
realizar los análisis de azúcares, compuestos volátiles y etanol, mientras que el precipitado se
lava con agua destilada y se centrifuga dos veces a una velocidad de 10,000 rpm durante un
tiempo de 15 minutos. A continuación se coloca la pastilla obtenida resuspendida en 5 mL de
agua destilada en un recipiente de plástico previamente secado y pesado, misma que se coloca en
una estufa a una temperatura de 51°C durante 24 horas. Finalmente el recipiente de plástico se
deja enfriar en un desecador y se pesa con la muestra seca (es importante el uso de pinzas para el
manejo de los vasos, para que de esta forma se evite la variación del peso). Con la diferencia de
peso se determina la biomasa generada en gL-1.
Figura 2.8 Centrifuga SOLBAT C- 600
Para cuantificar la biomasa producida durante la fermentación, fue necesario restar el peso inicial
de sólidos totales del jugo de agave, al peso de sólidos contenidos en él durante la fermentación,
de tal manera que la concentración de biomasa en gL-1 se determina con la siguiente ecuación:
(X! − X! ) − XS!
X =
V!
Donde:
X = Concentración biomasa gL-1

XF = Peso final con muestra (g)
Xo = Peso inicial sin muestra (g)
XSo= Peso de sólidos totales del jugo de agave (g)
Vm = Volumen de muestra (L)
64
2.4.1.3 Viabilidad Celular
La enumeración de levaduras se realizó por medio del método clásico de conteo en placa
reportado por Pérez et al. (2000) y tomando en consideración las especificaciones de la NOM-
092-SSA1-1994. Las muestras fueron tomadas asépticamente durante de la fermentación y
diluidas adecuadamente en agua destilada estéril. En cultivo puro el conteo de las levaduras se
obtuvo a través del uso de medio YEPD-agar (conteniendo 20 gL-1 glucosa, 20 gL-1 de peptona,
20 gL-1 de agar y 10 gL-1 de extracto de levadura y ajustado con HCl al 50% a un pH de 4.7). En
las fermentaciones en cultivo mixto, el conteo de las levaduras del género Kloeckera (K1 y K2)
fue obtenida por el empleo de medio YEPD-agar adicionado con 0.5 µg/ml de cycloheximida
(YEPD+CYH) (Fluka analytical) (Concentración mínima inhibitoria a la cual cesa el crecimiento
de S. cerevisiae) (Tabla 2.1). El número de células viables de las levaduras Saccharomyces (S1 y
S2) se estableció como la diferencia obtenida entre el número total de colonias en medio YEPD-
agar y el número total de colonias en medio YEPD+CYH. Las cajas con medio YEPD-agar y
YEPD+CYH fueron incubadas a 30ºC por 2 a 6 días y la cuenta se determinó hasta que no se
observaron incrementos en las unidades formadoras de colonia (UFC). Adicionalmente se utilizó
el medio Agar Nutriente WL (Biochemika for microbiology, composición en el ANEXO 1) para
la enumeración de levaduras de las fermentación en cultivo mixto, debido a que facilita su
examinación por permitir diferenciación morfológicas de las levaduras involucradas en el proceso,
al pigmentarlas de dos colores diferentes, para el caso de S. cerevisiae las colonias mostraron una
pigmentación blanca cremosa con forma ovalada y para K. africana las colonias mostraron una
pigmentación verde intensa y un menor tamaño (Tabla 2.2, Figura 2.9 y 2.10). La concentración
en unidades formadoras de colonia (UFC) por mililitro se determina con la siguiente ecuación:
N!
X = × D
V!
Donde:
X = UFC mL-1
NC = Número de colonias contadas en el rango de 30 a 300
Vm = Volumen de la muestra (mL)
D = Dilución de la muestra
65
Tabla 2.1. Concentración mínima inhibitoria de CYH en µg/mL obtenida para las levaduras K. africana (K1) y S.
cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto.
Concentración de CYH en µg/mL

Cepa de levadura 0 0.5 1 1.5 2
S1 14.5 ± 0.71 n.d n.d n.d n.d
K1 13 ± 1.41 11 ± 1.41 n.d n.d n.d
S1-K1 28 ± 2.83 11.5 ± 0.71 n.d n.d n.d
-1 6
La concentración celular está dada en UFC mL (10 ) y representa el promedio ± la desviación estándar de dos
determinaciones. n.d: no crecimiento detectado.
Tabla 2.2 Concentración celular obtenida para K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto en los
medios WL y YEPD.
UFC mL-1 (106)

Cepa de levadura
WL YEPD
S1-CPa 6.5 ± 0.71 7.5 ± 2.12
a
K1-CP 12.5 ± 2.12 11.5 ± 2.12
a
S1-CM 5.5 ± 0.71 7 ± 1.41
a
K1-CM 9.5 ± 0.71 9 ± 1.41
La concentración celular para S1 en cultivo mixto en medio YEPD se obtuvo de la diferencia entre el número total
de colonias en medio YEPD y el número total de colonias en medio YEPD+CHY y la concentración celular de K1
en cultivo mixto en medio YEPD fue obtenida del número total de colonias en medio YEPD+CHY. Cada valor
representa el promedio ± la desviación estándar de dos determinaciones. a No se encontraron diferencias
significativas en la concentración celular en UFC entre las cepas en cultivo puro y mixto en medio YEPD y WL.
66
Figura 2.9 Crecimiento en caja en unidades formadoras de colonia (UFC) en medio WL obtenidas de las
fermentaciones con S. cerevisiae (S1-A) y K. africana (K1-C) en cultivo puro (A y C) y mixto (B).
Figura 2.10 Crecimiento en caja en unidades formadoras de colonia (UFC) de los cultivos mixtos en medio YEPD
(A) y medio YPD+CHY (B) de las fermentaciones con S. cerevisiae (S1-C) y K. africana (K1-D) en cultivo puro.
67
2.4.2 Análisis de los sustratos y productos de la fermentación
Las concentraciones de azúcares reductores y nitrógeno inorgánico presentes en el jugo de agave,

y los sintetizados por las levaduras fueron analizados de acuerdo a las especificaciones que se
detallan en los siguientes apartados.
2.4.2.1 Análisis de azúcares reductores.
Para la cuantificación de azúcares reductores directos (ARD) se empleó la técnica de ácido

dinitrosalicílico (DNS). Para la preparación de la solución de DNS se utilizan los siguientes
reactivos (Miller, 1959):
Tabla 2.3 Composición de la solución de DNS
Reactivo Peso (gr en 1 L)

Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) 10
Tartrato doble de sodio y potasio 200
Hidróxido de sodio (NaOH) 10
Metabisulfito de Sodio 0.5
Fenol 2
Preparación de la solución de DNS.
Se disuelven 10 g de hidróxido de sodio, 200 g de tartrato de sodio y potasio, 0.5 g de

metabisulfito de sodio y 2 g de fenol en aproximadamente 600 mL de agua destilada, colocando
un agitador magnético para asegurar la correcta homogenización de la solución; a continuación se
agregan 10 g de ácido 3, 5 dinitrosalicílico, que se adiciona poco a poco (con el fin de evitar la
saturación de la solución), hasta lograr su completa disolución. Finalmente, se afora a un litro con
agua destilada y se almacena a 4°C en una botella ámbar para evitar su degradación por la luz.
68
Solución de Glucosa
La glucosa se seca previamente a una temperatura de 60°C durante 3 h y después se pasa a un

desecador por 3 h. Se pesa exactamente 1 g de glucosa y se diluye en 500 mL de agua destilada,
aforándose a 1000 ml.
Curva de Calibración.
De la solución de glucosa se hacen diluciones tomando alícuotas de 0, 200, 400, 600, 800 y 1000
µL en tubos de ensayo llevando luego el volumen en cada tubo a 1 mL con agua destilada. Estas
soluciones tienen una concentración de 0 a 2.0 gL-1 respectivamente, a estas muestras se les
determinan azúcares reductores libres.
Determinación de azúcares reductores directos.
Se colocan en tubos de ensaye 100 µL de muestra previamente diluida con 100 µL de solución
DNS, se agitan y posteriormente se colocan en un baño de agua a punto de ebullición durante 5
minutos. Los tubos se enfrían en un baño de hielo por 10 minutos, para después agregar 1 mL de
agua destilada y agitar. Un blanco del reactivo debe procesarse bajo el mismo procedimiento al
que se someten las muestras, pero éste tendrá agua destilada en lugar de mosto. Posteriormente se
agrega 100 µL de cada una de las muestras preparadas a un lector de microplacas y se lee la
absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm (Figura 2.11).
Nota: La absorbancia de las muestras debe de ser menor a la máxima obtenida en la curva de
calibración. Las absorbancias obtenidas en la curva de calibración, se someten a regresión lineal,
a fin de obtener una ecuación que prediga la concentración de azúcares reductores directos, en
una muestra de concentración desconocida. Para calcular la concentración de azúcares en las
muestras de las fermentaciones, se utiliza la ecuación obtenida de la regresión, se multiplica por
el factor de dilución y se obtienen las concentraciones en gramos/litro.
69
Figura 2.11 Espectrofotómetro y microplaca empleados para la técnica del DNS.
2.4.2.2 Análisis de amonio.
La concentración de nitrógeno inorgánico amoniacal se determinó por el método reportado por

Chaney et al. (1962). En esta técnica, el catión amonio (NH4+) reacciona con el fenol y el
hipoclorito presentes en la solución del reactivo, usando el nitroferrocianuro de sodio como
catalizador. Esta reacción propicia la formación de compuestos tipo indofenol que aportan el
color azul en un medio alcalino entre 10.4 < pH < 11.5, es realizado por la reacción de los iones
de amonio con el fenol y el hipoclorito en presencia de nitroferrocianuro de sodio como
catalizador. La intensidad de esa coloración es proporcional a la cantidad de nitrógeno amoniacal
en la muestra.
Protocolo:
Se tomaron 20 µl de muestra previamente diluida para garantizar que se encuentre dentro del
rango de la gama patrón. Se agregó 1 ml de coloreado de fenol, se agitó girando el tubo
horizontalmente. Inmediatamente después se adiciona 1 ml de hipoclorito alcalino, se agitó
horizontalmente y se dejó reposar 10 minutos. A continuación se agrega 8 ml de agua destilada.
Las mediciones se efectuaron en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 630 nm. Los
valores de absorbancia se compararon contra una curva patrón que comprende el rango de 0 a 1.0
gL-1 de sulfato de amonio.
70
El reactivo del coloreado de fenol se prepara de la siguiente forma: se disuelve 25 g de fenol en

400 ml de agua destilada. Al mismo tiempo por separado se disuelve 125 mg de nitroferrocianuro
de sodio en 50 ml de agua destilada y se añade a la solución de fenol, posteriormente se afora a
500 ml. Asimismo se prepara una solución de hipoclorito alcalino disolviendo 12.5 g de NaOH
en 400 ml de agua destilada, posteriormente se añade 20 ml de cloro comercial y se afora a 500
ml con agua destilada.
2.4.3 Análisis de etanol

La concentración de etanol presente en el mosto fermentado se determinó con la ayuda de un
equipo YSI modelo 2700 Select (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, Ohio), el cual
mide su concentración con un biosensor que contiene una enzima inmovilizada (Figura 2.12).
Este biosensor contiene tres membranas. La primera es una membrana porosa de policarbonato,
su función es limitar la difusión del sustrato hacia la segunda membrana. La segunda membrana
contiene la enzima etanol oxidasa. La tercera membrana está compuesta por acetato de celulosa,
la cual permite sólo el paso de moléculas pequeñas, tales como el peróxido de hidrógeno, y con
ello elimina muchos compuestos electroquímicamente activos, que puedan afectar la medición.
Figura 2.12 Equipo YSI modelo 2700 Select empleado para la determinación de etanol
Esta técnica se basa en dos reacciones: una de oxidación y otra electroquímica. La reacción de
oxidación consiste en la oxidación del etanol presente en la muestra, por medio de la enzima
etanol oxidasa, produciendo peróxido de hidrógeno y acetaldehído; en seguida, el peróxido de
71
hidrógeno pasa a través de la membrana de acetato de celulosa hacia el electrodo de platino en el

cual ocurre la segunda reacción electroquímica de oxidación. La corriente generada es
directamente proporcional a la cantidad de etanol inicial, ya que la corriente es directamente
proporcional a la cantidad de electrones, y esta cantidad a su vez, es proporcional a la cantidad de
peróxido de hidrógeno. Las reacciones que ocurren en el sistema son las siguientes:
C2H5OH + O2  H2O5 + CH3COH
H2O2  2H+ + 02 + 2e-
El método seguido para el análisis de las muestras fue el siguiente: se colocó 1mL de muestra en
un tubo Eppendorf a una concentración en un rango entre 0.2 y 3 gL-1. Cada 24 h de uso del
equipo, se preparó y se cambió una solución estándar de etanol a 2 gL-1, para efectuar la
autocalibración del equipo. A su vez, se lavó la cámara y las membranas con una solución buffer
cada vez que se terminaba de usar el equipo.
2.4.4 Destilación del mosto fermentado
Con el objetivo de analizar la bebida alcohólica que se obtendría a partir de las fermentaciones de
jugo de agave por lote y en continuo, los mostos fermentados, se destilaron y rectificaron en un
destilador de acero inoxidable con capacidad de 6 L, ensamblado a partir de material presente en
el taller del CIATEJ, el cual consistió de las siguientes partes (Figura 2.13):
a) Resistencia: Provee la energía necesaria para calentar y ebullir el líquido dentro del
destilador, el cual debe contener pequeños trozos de material poroso (cerámica, cobre)
para evitar sobresaltos repentinos por sobrecalentamiento.
b) Destilador: espacio de mayor tamaño donde se coloca el mosto por destilar.
c) Cabeza de destilación: lugar por donde salen los vapores de la mezcla.
d) Termómetro/Termopar: Instrumento que permite monitorear la temperatura interna del
líquido durante la destilación que oscila entre los 90-94 ºC durante la primera destilación
y entre 78-80 ºC durante la rectificación (segunda destilación).
e) Tubo refrigerante: permite la condensación de los vapores.
72
f) Entrada de agua: regula la entrada de agua al refrigerante para mantener la temperatura

del líquido condensado (≈ 4 ºC).
g) Salida de agua: regula la salida de agua del refrigerante para mantener la temperatura del
líquido condensado (≈ 4 ºC).
h) Salida de destilado: es el espacio de salida del refrigerante donde se recibe el destilado
que puede almacenarse en un matraz o vaso de precipitado.
i) Recirculador: permite estabilizar la temperatura de manera constante dentro del
refrigerante de tal manera que se permita la condensación del líquido durante la
destilación.
j) Regulador de frecuencia: Regula la intensidad de corriente eléctrica suministrada a la
resistencia interna del destilador (Manteniéndose entre 50-60 volts durante todo el
proceso de destilación).
Las destilaciones se realizaron siguiendo el protocolo empleado en la industria tequilera: la

primera fracción separada (0.5% del volumen inicial) llamada cabezas fue eliminada, mientras
que la segunda fracción fue acumulada hasta que el contenido de alcohol estuviese en el rango de
25-30 % v/v. Esta segunda fracción fue nuevamente destilada, separando el 0.5% del destilado
inicial (cabezas) y acumulando el destilado (cuerpo) hasta una concentración en volumen de
alcohol de 55% v/v (aproximadamente).
Figura 2.13 Destilador utilizado a nivel laboratorio.
73
2.4.5 Análisis de fructosa, glucosa y de compuestos producidos durante la fermentación
Las concentraciones de fructosa, glucosa, así como de etanol, glicerol, ácido succínico, ácido
acético, acetoína diacetilo y 2-3-butanediol fueron determinadas mediante el uso de
cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Se utilizó un cromatógrafo de líquidos Varian
ProStar (Palo Alto, California) acoplado a un detector de índice de refracción Varian ProStar 355
(Figura 2.14). Se empleó una columna de exclusión de iones Bio-Rad Aminex HPX-87H (9 µm,
300 x 7.8 mm), la cual se mantuvo a 40°C. La fase móvil consistió de una solución 0.005 M de
ácido sulfúrico, preparada con agua desmineralizada y desgasificada durante 20 min. El flujo de
la fase móvil, se ajustó a 0.4 mL min-1. El volumen de inyección fue de 20 µL. El tiempo de
análisis por cada muestra fue de 50 min
Los compuestos analizados fueron identificados mediante el tiempo de retención de los
estándares puros en la columna. La cuantificación, se basó en curvas de calibración de cinco
concentraciones conocidas de los metabolitos analizados. Las concentraciones de la curva patrón
estuvieron entre 0.2 y 1 gL-1 para 2-3-butanediol, diacetilo, ac. acético y ac. succínico; entre 0.4 y
2 gL-1 para acetoína, entre 1 y 5 gL-1 para glicerol y glucosa, y entre 4 y 20 gL-1 para etanol y
fructosa.
Figura 2.14 Equipo HPLC de Varian ProStar
2.4.6 Análisis de compuestos volátiles mayoritarios en mosto
Los compuestos volátiles en mosto fueron analizados por Cromatografía de Gases. El equipo
utilizado para la inyección de muestras fue un Head-space Hewlett Packard modelo 7694E,
74
acoplado a un cromatógrafo de gases HP-6890, equipado con un detector de ionización de flama

(FID) y una columna capilar J&W Scientific-INNOWAX de 60 mm 60 m x 0.32 mm x 0.25 µm
(Figura 2.15). La temperatura en el horno se programó con diferentes rampas: se inició con 35 ºC
por 10 min, posteriormente se aumentó a 3.5 ºC/min hasta 175 ºC manteniéndose por 2 min y
finalmente se incrementó a 7ºC/min hasta 250 ºC. El gas acarreador fue helio a un flujo de 1.5
mL/min. La temperatura del inyector y el detector fueron 240 y 260 ºC. El programa de
preparación de inyección de muestras en el equipo de head-space fue con las siguientes
condiciones: la temperatura del vial fue de 80ºC, la temperatura del loop fue de 110ºC y la
temperatura de la línea de transferencia fue de 115ºC. Los tiempos de las condiciones de head-
space fueron los siguientes: 41 min por ciclo del cromatógrafo de gases; 10 min de equilibrio del
vial; 0,2 min de presurización; 0,2 min de llenado de loop; 0.5 min de tiempo de equilibrio de
loop; 1 min de inyección y finalmente, un tiempo de agitación de 5 min. La cuantificación se
realizó en base a una estandarización externa, utilizando siete niveles de calibración para cada
uno de los compuestos analizados, conteniendo 0.05 - 2 mg L-1 de acetato de isoamilo, hexanoato
de etilo, octanoato de etilo y decanoato de etilo; 1 - 40 mg L-1 de n-butanol, acetaldehído y
acetato de etilo; 2 - 80 mg L-1 de n-propanol, isobutanol y 2-fenil etanol, 20 - 600 mg L-1 de
alcohol isoamílico y 10 - 400 mg L-1 de metanol. Las curvas de calibración para cada estándar
tuvieron un coeficiente de correlación (R2) mayor o igual a 0.99; las cuales se determinaron
usando un software HP Chemstation Rev. A.05.04. Las muestras fueron analizadas por duplicado
colocando 2 mL de mosto en viales para head- space de 20 mL.
Figura 2.15 Equipo de Cromatografía de gases acoplado a un Head space
75
2.4.7 Análisis de compuestos volátiles mayoritarios en destilado
Para la determinación de compuestos volátiles mayoritarios acetaldehído, metanol, 2-butanol, n-

propanol, isobutanol, n-butanol, alcohol isoamílico, alcohol amílico, lactato de etilo y acetato de
etilo regulados por la NOM-006-SCFI-2005 en los destilados, se utilizó un cromatógrafo Agilent
Technologies 6890N, provisto con un automuestreador y un detector de ionización de flama
(Figura 2.16). La separación fue efectuada en una columna HP-FFAP de 50 m × 0.2 mm × 0.30
µm, el volumen de inyección fue de 0.5 µL y se operó en modo split (relación 1:2). La
temperatura del inyector y del detector fueron 220 y 240 °C. Las condiciones de operación fueron
las siguientes: el gas acarreador fue helio un flujo de 1 mL min-1; la temperatura inicial del horno
fue de 55 ºC y se mantuvo por 6.5 min, después se incrementó a una razón de 10 ºC min-1 hasta
160 ºC y finalmente se incrementó a 30 ºC min-1 hasta 220 ºC manteniendo por 5 min.
La cuantificación fue basada en una estandarización interna utilizando 2-pentanol y disoluciones

de los compuestos puros (95-99 % de pureza SIGMA-ALDRICH) de acuerdo a las metodología
descrita en la norma NMX-V-005-NORMEX-2005.
Figura 2.16 Equipo de Cromatografía de gases acoplado a un detector de ionización de flama (FID).
76
2.4.8 Análisis de compuestos volátiles minoritarios en destilado
El análisis de compuestos volátiles minoritarios en el destilado fueron realizados por

cromatografía de gases (CG) acoplado a un espectrómetro de masas (EM) utilizado un
cromatógrafo de gases Agilent technologies 6890N, acoplado a un espectrómetro de masas
Agilent technologies 5975 (Figura 2.18). Un volumen de muestra de 1 µL fue inyectado en modo
splitless. Las separaciones se llevaron a cabo empleando una columna capilar J&W Scientific-
INNOWAX de 60 m x 0.25 mm x 0.25 mm. Las condiciones de operación fueron las siguientes:
el gas acarreador fue helio un flujo de 1.5 mL min-1; la temperatura inicial del horno fue de 60 ºC,
después se incrementó a una razón de 3 ºC min-1 hasta 180 ºC manteniendo por 2 min y
finalmente se incrementó a 15 ºC min-1 hasta 230 ºC y se mantuvo por 30 min. Las temperaturas
del inyector y el detector fueron 250 y 260 ºC respectivamente. El espectrómetro de masas fue
operado a 70 EV, escaneando las masas en un rango de 30-350 m/z. La identificación de los picos
se llevó acabo tanto por comparación de los espectros de masas utilizando el software MSD
Chemstation D.02.00.275 provisto de la base de espectros NIST/NIH version 2.D, como por los
tiempos de retención previamente identificados por inyección de una solución estándar. La
cuantificación se realizó empleando en base a una estandarización externa multinivel, con seis
niveles de calibración para cada uno de los compuestos analizados conteniendo 1 - 60 mg L-1 de
2-metiltetrahidrofuran-3-ona, acetoína, 1-hexanol, octanoato de etilo, 5-metilfurfural, 2-
acetilfuran, benzaldehído, linalol, ácido isobutírico, terpine-4-ol, levulinato de etilo, decanoato de
etilo, α-terpineol, ácido succínico, ácido hexánoico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido
dodecanoico y β-damascenona y 3 - 180 mg L-1 de acetato de fenetilo, 2-fenil etanol, acetato de
etilo. Las curvas de calibración reportaron un coeficiente de correlación (R2) mayor ó igual a 0.99
para cada compuesto. Para los compuestos identificados que no estuvieron dentro la curva de
calibración, la cuantificación se obtuvo a partir del compuesto con naturaleza química más
semejante, principalmente a partir de la misma familia de compuestos (Detalles de cada
compuestos y la forma en que se efectuó la cuantificación ver ANEXO 2). Cada muestra fue
inyectada por duplicado, de tal manera que dos puntos de cada condición de fermentación fueron
empleadas para determinar la concentración promedio de los compuestos y su desviación
estándar.
77
Figura 2.17 Equipo de Cromatografía de gases acoplado a un espectrómetro de masas.
2.4.9 Análisis sensorial
Para comparar el sabor (conjunto de atributos sensaciones que involucran el gusto, el olor y las
sensaciones trigeminales), el aroma y el nivel de agrado entre los destilados obtenidos de las
fermentaciones por lote y en continuo de los cultivos puros y mixtos, una prueba hedónica fue
implementada con al menos 30 consumidores (ANEXO 3). Por otro lado con la finalidad de
determinar diferencias significativas y propiedades sensoriales en los destilados, la prueba “A”
“No A” fue implementada. Un panel de 8 jueces entrenados (6 mujeres y 2 hombres) participaron
en las evaluaciones sensoriales, las cuales se efectuaron 3 veces por semana en un periodo de 15
a 20 minutos por sesión. Los jueces fueron seleccionados en base a su desempeño por estudios
previos efectuados en los laboratorios de evaluación sensorial del CIATEJ, todos ellos con
experiencia previa en evaluación sensorial con destilados de agave. Una lista con atributos de
sabor y aroma (creada por un estudio previo) se proporcionó a los jueces para desarrollar un
perfil sensorial cualitativo (frecuencia con la que los descriptores fueron mencionados) que
describiera a cada destilado evaluado (ANEXO 4). Se seleccionó a un destilado con una
78
característica especifica como la referencia, cada vez que se realizaron las pruebas. La prueba
discriminativa se efectuó por triplicado. Las sesiones se desarrollaron en atmósferas controladas
(30 ºC y desodorizadas) en el laboratorio de evaluación sensorial del CIATEJ (Figura 2.19). Las
muestras fueron ajustadas a 35 % (v/v) y colocadas en frascos ámbar de 80 mL y almacenadas en
la sala de evaluación sensorial al menos 2 h antes de que cada prueba diera inicio.
Figura 2.18 Panel de jueces efectuando evaluación sensorial en el laboratorio del CIATEJ.
79
2.5 Diseños Experimentales
Los diseños experimentales planteados, se propusieron en función de cada uno de los objetivos
de este trabajo, siendo los propuestos los siguientes:
2.5.1 Diseños unifactoriales
Tienen como objetivo el estudio del efecto de un sólo factor sobre una ó varias variables de
respuesta, éste diseño se aplicó en el siguiente objetivo:
Para estudiar las cinéticas de fermentación de cuatro cepas de levaduras del género Kloeckera y
Saccharomyces y caracterizar aromática y sensorialmente los productos de las fermentaciones en
cultivo puro y mixto.
Factor: Cepas de levadura del género Kloeckera y Saccharomyces en cultivo puro y mixto.
Variables de respuesta: Concentraciones de biomasa, UFC, etanol, nitrógeno, población,

consumo de azúcares, y concentración de compuestos volátiles en mosto y destilado.
Factores constantes: Temperatura (30°C), agitación (250 rpm), concentración de azúcares

iniciales (100 ± 11 gL-1), jugo de agave empleado, concentración de inóculo (3.5×106 cel mL-1),
pH sin control, 1 gL-1 de sulfato de amonio (medio basal), anaerobiosis no estricta, tiempo de
fermentación (72 h), métodos cromatográficos de análisis (CG-FID-HS, CG-FID, CG-EM) y
panelistas.
Unidades experimentales: Cepas de levaduras del género Kloeckera y Saccharomyces
2.5.2 Diseños Multifactoriales
Tienen como objetivo el estudio del efecto de varios factores sobre una ó varias variables de
respuesta, éste diseño se aplicó al siguiente objetivo:
En el estudio del efecto de la adición de ciertos factores de crecimiento sobre la supervivencia,

capacidad fermentativa y aromática de K. africana en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae
80
Factores: Cepas de levadura del género Kloeckera y Saccharomyces en cultivo puro y mixto y
el medio de fermentación (basal y reformulado).
Variables de respuesta: Concentraciones de biomasa, UFC, etanol, nitrógeno, población,

consumo de azúcares, y concentración de compuestos volátiles en mosto y destilado.
Factores constantes: Temperatura (30°C), agitación (250 rpm), concentración de azúcares

iniciales (100 ± 11 gL-1), jugo de agave empleado, concentración de inóculo (3.5×106 cel mL-1),
pH sin control, 570 µg L-1 de tiamina, 0.17 gL-1 de sulfato de amonio y 1.56 gL-1 de asparagina
(medio reformulado), anaerobiosis no estricta, tiempo de fermentación (72 h) y métodos
cromatográficos de análisis (CG-FID-HS, CG-FID, CG-EM).
Unidades experimentales: Cepas de levaduras del género Kloeckera y Saccharomyces
2.5.3 Diseños Factoriales
Tienen como objetivo el estudio del efecto de varios factores sobre varias variables de respuesta, ,
este diseño se aplicó al siguiente objetivo:
Para estudiar el efecto del oxígeno, la temperatura y los factores de crecimiento sobre la
supervivencia, capacidad fermentativa y aromática de K. africana en continuo en cultivo mixto
con S. cerevisiae, se utilizó un diseño factorial 23:
Factor 1: Medio de cultivo (jugo de agave) con dos niveles: N1: medio basal (suplementado con
sulfato de amonio a 1 gL-1) y N2: medio reformulado (enriquecido con 570 µg L-1 de tiamina,
0.17 gL-1 de sulfato de amonio y 1.56 gL-1 de asparagina) (Valle-Rodríguez et al. 2009)
Factor 2: Temperatura de fermentación con dos niveles: N1: 25 °C y N2: 35°C.
Factor 3: Aireación con dos niveles: N1: 0.00 vvm y N2: 0.03 vvm.
Variables de respuesta: Población celular, concentración de biomasa, UFC, etanol, nitrógeno,

consumo de azúcares, compuestos volátiles en mosto y destilado y propiedades sensoriales.
Factores constantes: agitación del reactor (250 rpm), concentración de azúcares iniciales (100 ±
11 gL-1), jugo de agave empleado, concentración de inóculo en una proporción 1:1 para tener (3.5
81
x106 cel/ml), pH sin control, D = 0.04 h-1, 5τ, volumen útil del reactor (1.5 L), métodos
cromatográficos de análisis (CG-FID-HS, CG-FID, CG-EM) y panelistas (Valle-Rodríguez et al.
2009; Morán-Marroquí et al. 2011).
Unidades experimentales: Cepas de levaduras del género Kloeckera y Saccharomyces.
82
2.6 Ecuaciones para el cálculo de los parámetros cinéticos, rendimientos, productividades y

eficiencia alcohólica
Se emplearon diferentes ecuaciones matemáticas para el cálculo de los parámetros cinéticos

instantáneos y específicos y de los rendimientos y las productividades. Estas ecuaciones fueron
obtenidas a partir de las definiciones de los términos y de los balances de masa en la
fermentación.
2.6.1 Cálculo de las variables en los cultivos por lote
En los cultivos por lote, se utilizaron diferentes ecuaciones que a continuación se describen:
2.6.1.1 Parámetros cinéticos en el cultivo por lote
En el sistema de fermentación por lote, los parámetros cinéticos dependieron de la fase de

crecimiento en que se encontraba la levadura.
El cálculo de las velocidades instantáneas y específicas se determinó con los datos del modelado
de los perfiles cinéticos de la formación de biomasa, consumo de sustrato y producción de etanol
empleando las ecuaciones mostradas en el ANEXO 4. Para la evolución de la biomasa, se empleó
el modelo cinético que mejor se ajustó a los datos experimentales.
2.6.1.1.1 Velocidades instantáneas en el cultivo por lote
En el sistema por lote, las velocidades instantáneas de formación de biomasa (rx), etanol (rp) y
consumo de azúcares (rs) se calcularon a partir de los incrementos ó decrementos en las
concentraciones de los productos ó sustratos con respecto al tiempo transcurrido. Se emplearon
las siguientes fórmulas:
∆!
r! = ∆! (1)
∆!"#$
r! = ∆!
(2)
∆!"#
r! = − ∆!
(3)
83
Estos valores se obtuvieron a partir de las derivadas instantáneas de las curvas de las cinéticas de
fermentación.
2.6.1.1.2 Velocidades específicas en el cultivo por lote
En el sistema por lote, las velocidades específicas de crecimiento (µ), de consumo de azúcares
(qs) y de producción de etanol (qp), se calcularon considerando las velocidades instantáneas entre
la media logarítmica de la concentración de biomasa (ya que la cinética de formación de biomasa
se describe con una función logarítmica). Las ecuaciones empleadas fueron:
!"
! !" !"
!"
µμ = ! !" ≅ !! !!!
(4)
!"
!! !! !! !"
!"
q! = ! ≅ ! = (5)
!" !! !!!
!"
!! !! !! !"
!"
q! = ! ≅ ! = (6)
!" !! !!!
2.6.1.2 Rendimientos en el cultivo por lote
Se determinaron los rendimientos de formación de biomasa (Yx/s) y de producción de etanol

(Yp/s) con respecto al consumo de azúcares reductores en base a las siguientes fórmulas:
!"!!"
Y !! = !! (7)
! !!"!
! !!
Y !! = !! ! !!"
!
(8)
! !
2.6.1.3 Productividades en el cultivo por lote
Las productividades de producción de etanol (PE) y de formación de biomasa (PX) se calcularon a

partir del cociente de la producción total y el tiempo transcurrido para su formación. Las
ecuaciones empleadas fueron las siguientes:
84
!! !!!
P! = !!
(9)
!! !!!
P! = !!
(10)
2.6.2 Cálculo de las variables en los cultivos en continuo
En el sistema de cultivo en continuo, las variables de respuesta (parámetros cinéticos y

rendimientos) se determinaron en los estados estacionarios por lo que estos valores se
mantuvieron constantes con el transcurso del tiempo, a diferencia del cultivo por lote.
2.6.2.1 Parámetros cinéticos en el cultivo en continuo
En el sistema de fermentación en continuo, las ecuaciones para el cálculo de los parámetros

cinéticos se determinaron por los balances de masa de biomasa, etanol y azúcares presentes en el
biorreactor. En el cultivo en continuo, el parámetro operacional clave es la tasa de dilución (D) ya
que ésta determina la velocidad de crecimiento celular (µ), y a su vez fija las velocidades de
consumo de sustrato y de producción de etanol y de otros metabolitos.
Velocidades y rendimientos en cultivo en continuo
En el cultivo en continuo, las velocidades son directamente proporcionales a la tasa de dilución

empleada (D) y a la concentración de biomasa, etanol y al consumo de azúcares. Las velocidades
específicas de azúcares (qs) y etanol (qp) son el cociente de las velocidades de azúcar (rx) y etanol
(rp) y la concentración final de biomasa (X). El rendimiento de biomasa (Yx/s) se obtiene del
cociente de la concentración final de biomasa y el consumo de azúcares y el rendimiento de
etanol (Yp/s) del cociente de la concentración final de etanol y el consumo de azúcares.
Las fórmulas empleadas fueron:
Velocidades:
r! = XD (11)
85
r! = AR ! − AR ! D (12)
r! = E! D (13)
Velocidades específicas:
!!
q! = !
(14)
!!
q! = !
(15)
y rendimientos de biomasa y etanol:
!
Y!/! = !" (16)
! !!"!
!!
Y!/! = !" (17)
! !!"!
Productividades en el cultivo en continuo
Las productividades de producción de etanol (PE) y de formación de biomasa (PX) son iguales a
las velocidades instantáneas por lo que también son directamente proporcionales a la
concentración y a la tasa de dilución. Las ecuaciones empleadas son las siguientes:
P! = r! = xD (18)
P! = r! = pD (19)

86
2.7 Programas de software empleados para cálculos, gráficas y análisis de datos
El manejo de datos y la creación de tablas y gráficas se realizó con el programa de software Microsoft
Office Excel 2011 para Macintosh©. De igual manera, con esta herramienta se determinaron las
concentraciones, rendimientos, eficiencias y porcentajes de los parámetros cinéticos específicos e
instantáneos. Las gráficas de las cinéticas de fermentación se realizaron con el programa SigmaPlot
Ver. 10.0 de Systat Software, Inc.©
Para el cálculo de los parámetros cinéticos, se realizó el modelado de las cinéticas de formación de
biomasa, consumo de sustrato y producción de etanol por medio del programa CurveExpert Ver.
1.38TM de Daniel Hyams (EBT Comm, Columbus, USA), el cual ajusta los datos cinéticos a varios
modelos matemáticos y matemático-fisiológicos que puedan describir la evolución de la fermentación.
En cada cinética se eligió el modelo con mejor ajuste a los datos experimentales. Los diseños
experimentales unifactorial y factoriales se analizaron con el programa de análisis estadístico y de
experimentos STATGRAPHICS Plus Ver. Centurion XV de Statistical Graphics Corp. El análisis de
componentes principales (PCA) y el análisis de cuadrados mínimos (PLS) se efectuó con el software
Simca (P7.01).
87
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Con la finalidad de estudiar el efecto del oxígeno, la temperatura y los factores de crecimiento en
la fermentación de jugo de agave en lote y en continuo para lograr una mayor prevalencia y
capacidad fermentativa de levaduras tequileras no-Saccharomyces del género Kloeckera al
trabajar en cultivo mixto con levaduras del género Saccharomyces. Se inició con el estudio de las
fermentaciones por lote en cultivo puro y mixto empleando dos cepas de levaduras del género
Kloeckera y dos levaduras del género Saccharomyces identificadas como: Kloeckera africana
(K1), Kloeckera apiculata (K2), Saccharomyces cerevisiae (S1) y Saccharomyces cerevisiae (S2)
para conocer sus capacidades fermentativas y aromáticas y seleccionar las mejores levaduras para
los posteriores análisis en cultivo mixto, este objetivo se efectuó por medio del diseño
experimental unifactorial (sección 2.5.1). Posteriormente se evaluó el efecto de la adición de
ciertos factores de crecimiento sobre la supervivencia, capacidad fermentativa y aromática de
Kloeckera en la fermentación del jugo de agave al trabajar en cultivo puro y mixto con S.
cerevisiae, este objetivo se llevó a cabo utilizando el diseño experimental multifactorial (sección
2.5.2). Finalmente se estudió el efecto del oxígeno, la temperatura y los factores de crecimiento
sobre la supervivencia, capacidad fermentativa y aromática de K. africana en la fermentación en
continuo en cultivo mixto con S. cerevisiae, este objetivo se realizó utilizando el diseño
experimental factorial (sección 2.5.3).
A continuación se presentan los resultados, discusiones y conclusiones de cada etapa en las

siguientes secciones.
3.1. Fermentación de jugo de agave por lote utilizando las levaduras del género
Saccharomyces (S1 y S2) y Kloeckera (K1 y K2) en cultivo puro y mixto
3.1.1 Análisis de las cinéticas de fermentación en cultivo puro
Las fermentaciones en cultivos puro de S. cerevisiae (S1 y S2), K. africana (K1) y K. apiculata
(K2) fueron llevados a cabo en jugo de agave a 100 ± 11 gL-1 de azúcares reductores, enriquecido
con 1 gL-1 de sulfato de amonio (medio basal) tal y como se efectúa en la industria tequilera, bajo
condiciones anaeróbicas de crecimiento. Los perfiles de formación de biomasa, unidades
formadoras de colonia (UFC), consumo de azúcares y producción de etanol de los cultivos puros
89
se muestran en la Figura 3.1 y sus parámetros cinéticos en la Tabla 3.1. Los comportamientos de
las cepas de levaduras de Saccharomyces y Kloeckera fueron diferentes. Por un lado las
levaduras del género Saccharomyces (S1 y S2) crecieron más rápido que las levaduras del género
Kloeckera (K1 y K2) alcanzando concentraciones de biomasa de 4.2 y 3.2 gL-1 en
aproximadamente 16 h de fermentación, mientras que las del segundo grupo (K1 y K2)
alcanzaron concentraciones de tan sólo 1.83 y 1.93 gL-1 en 20 h de fermentación respectivamente
(Figura 3.1-B, D, F, H). Por otro lado con respecto a la viabilidad celular (UFC), las levaduras
del género Saccharomyces (S1 y S2) permanecieron activas por mucho más tiempo alcanzando
concentraciones de 100 y 140 × 106 UFC ml-1 a las 16 h de fermentación, que las levaduras del
género Kloeckera (K1 y K2), las cuales exhibieron un bajo crecimiento con concentraciones
máximas de 74 y 62 × 106 UFC ml-1 a las 16 y 20 h de fermentación, reduciendo su crecimiento a
concentraciones próximas de 30 × 106 UFC ml-1 a las 72 h de fermentación (Figura 3.1-A, C, E,
G). Con respecto a los perfiles de consumo de azúcares y producción de etanol diferencias
significativas fueron observadas en ambos grupos de levaduras en cultivo puro (95% LSD). Por
ejemplo todas las cepas de levaduras de Saccharomyces (S1 y S2) consumieron completamente
toda su fuente de azúcares entre las 24 y 36 h de cultivo, produciendo altas concentraciones de
etanol (34 - 35 gL-1) comparadas con las levaduras del género Kloeckera (Figura 3.1-B, D). Las
levaduras Kloeckera K1 y K2 mostraron en general un bajo consumo de azúcares dejando de 40 a
50 gL-1 de azúcares reductores en el medio de cultivo a las 72 h de fermentación y alcanzado
bajas concentraciones de etanol próximas a los 10 gL-1 respectivamente (Figura 3.1-F, H).
Estudios previos efectuados en tequila, han reportado resultados similares. Díaz-Montaño et al.
(2008), observó que las levaduras del género Kloeckera presentan una baja capacidad
fermentativa en comparación con las levaduras del género Saccharomyces, posiblemente por una
baja disponibilidad de nutrientes en el medio de cultivo ó por la presencia de compuestos tóxicos
en el jugo de agave. Diferencias significativas (95% LSD) fueron encontradas en la velocidad
específicas de crecimiento máxima (µmax) y de producción de etanol máxima (qpmax), presentando
las levaduras de género Kloeckera valores menores, en el orden de 0.08-0.11 h-1 y de 0.14-0.15
g/g-h respectivamente. Las cepas de Saccharomyces, por su parte alcanzaron los mayores valores
en el rango de 0.18 a 0.27 h-1 para µmax y de 1.12 a 1.45 para qpmax. Conjuntamente, se pudo
observar que las cepas de Saccharomyces presentaron una mayor conversión de azúcares a etanol
(Yp/s) que las dos cepas de Kloeckera (0.10-0.18 g/g), presentando las primeras, los valores más
90
cercanos al teórico (0.33-0.34 g/g) (Tabla 3.1). Con respecto a las velocidades específicas de
consumo de sustrato (qsmax) diferencias significativas fueron observadas entre las cepas del
género Kloeckera y Saccharomyces. Obteniendo los valores mayores las cepas del género
Saccharomyces y los menores las cepas Kloeckera. Adicionalmente para los rendimientos de
conversión de sustrato a biomasa (Yx/s) no presentaron diferencias significativas entre cepas
(Tabla 3.1). Con estos resultados se confirma la baja capacidad fermentativa de las levaduras del
género Kloeckera, aun cuando se añadió suficiente cantidad de nitrógeno inorgánico al medio de
cultivo (1 gL-1); revelando que su limitado crecimiento posiblemente sea atribuido a la ausencia
de ciertos factores de crecimiento (vitaminas y aminoácidos) en el jugo de agave (Valle-
Rodríguez et al., 2011). En los siguientes apartados se discute el efecto de estos factores de
crecimiento sobre la prevalencia y capacidad fermentativa de Kloeckera en las fermentaciones en
cultivo puro y mixto con Saccharomyces.
91
180x106 120 5 50
Azucares reductores (g L-1)

160x106 A B
100 4 40
140x106
Biomasa (g L-1)
Etanol (g L-1)
UFC (ml-1)
120x106 80
100x106 3 30
60
80x106
2 20
60x106 40
40x106 1 10
20
20x106
0 0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80

180x106 120 5 50
160x106 C D
140x106 100 4 40
Biomasa (g L-1)
Etanol (g L-1)
120x106 80
UFC ml-1
100x106 3 30
80x106 60
2 20
60x106 40
40x106 1 10
20x106 20
0 0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
180x106 120 5 50
160x106 E F
140x106 100 4 40
Biomasa (g L-1)
Etanol (g L-1)
120x106 80
UFC ml-1
100x106 3 30
80x106 60
2 20
60x106 40
40x106 1 10
20
20x106
0 0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
180x106 120 5 50
160x106 G H
140x106 100 4 40
Biomasa (g L-1)
Etanol (g L-1)
120x106 80
UFC ml-1
100x106 3 30
60
80x106
2 20
60x106 40
40x106 1 10
20
20x106
0 0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h) Tiempo (h)
Figura 3.1. Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFC (A, C, E, G), biomasa (●), azúcares reductores (▲) y
etanol () de las fermentaciones en cultivo puro empleando las levaduras S1 ( ), S2 ( ), K1 ( ) y K2 ( ).
-1
Las fermentaciones se realizaron a 12 ºBrix suplementando con sulfato de amonio (1 gL ). Los valores son las
medias de los resultados obtenidos de dos fermentaciones. Las barras verticales representan la desviación estándar
del promedio de los datos de las dos fermentaciones.
92
Tabla 3.1 Comparación de los parámetros cinéticos para las diferentes cepas estudiadas en cultivo puro.
Cepa µ max (h-1) qsmax (g/g h-1) qpmax (g/g h-1) Yx/s (g/g) Yp/s (g/g)
K1 0.110 ± 0.002 2.940 ± 0.640 0.140 ± 0.010 0.027 ± 0.002 0.100 ± 0.016
K2 0.080 ± 0.005 2.790 ± 0.020 0.150 ± 0.020 0.034 ± 0.003 0.180 ± 0.038
S1 0.180 ± 0.030 4.820 ± 0.500 1.120 ± 0.030 0.031 ± 0.006 0.330 ± 0.005
S2 0.270 ± 0.030 3.640 ± 0.250 1.450 ± 0.440 0.028 ± 0.020 0.340 ± 0.010
µmax: velocidad específica de crecimiento máxima; qsmax: velocidad específica de consumo máxima; qpmax: velocidad
específica de producción de etanol máxima; Yx/s y Yp/s : rendimientos de biomasa y etanol; cada valor representa el
promedio ± la desviación estándar de dos fermentaciones.
3.1.2 Análisis de las cinéticas de fermentación en cultivo mixto
En adición a los cultivos puros, la Figura 3.2 y la Tabla 3.2 muestran los perfiles de formación de
biomasa, unidades formadoras de colonia (UFC), consumo de azúcares, producción de etanol y
parámetros cinéticos obtenidos de las fermentaciones en cultivo mixto usando las levaduras del
género Kloeckera (K1 y K2) y Saccharomyces (S1 y S2); divididos en tres grupos: Grupo 1
formado por K1+S1(G1), Grupo 2 formado por K2+S1(G2) y Grupo 3 formado por K2+S2 (G3).
Es importante señalar que de las combinaciones posibles en cultivo mixto, el Grupo 4 formado
por K1+S2 no fue posible efectuarlo, por la dificultad que generó al estimar la viabilidad celular
(UFC), al realizar las pruebas de inhibición con CHY. En las primeras ocho horas de cultivo las
levaduras del género Kloeckera (K1 y K2) y Saccharomyces (S1 y S2) presentaron velocidades
de crecimiento similares, posteriormente las cepas Saccharomyces crecieron mucho más
superando a las levaduras Kloeckera (Figura 3.2-A, C, E). Las levaduras Kloeckera (K1 y K2)
alcanzaron su máximo de crecimiento entre las 20 y 24 h de fermentación con concentraciones de
9.95, 7.5 y 13.2 × 106 CFU mL-1 (K1 del G1, K2 del G2 y K2 del G3) posteriormente su
crecimiento se redujo hasta llegar a concentraciones celulares menores de 6 × 106 UFC mL-1
(Figura 3.2). Por su parte las levaduras del género Saccharomyces (S1 y S2) fueron
caracterizadas por permanecer activas por mayor tiempo a lo largo de la fermentación que las
cepas Kloeckera, llegando a presentar concentraciones celulares máximas de 16.8, 10.9 y 17.1 ×
106 CFU mL-1 (S1 del G1, S1 del G2 y S2 del G3) en las primeras 24 h de cultivo
respectivamente (Figura 3.2). Es interesante observar que a pesar de que las levaduras
Saccharomyces permanecieron activas por mucho más tiempo que las cepas del género
93
Kloeckera, éstas levaduras empezaron a declinar su crecimiento después de 36 h en el G1, 24 h

en el G2 y 50 h en el G3 llegando a presentar concentraciones de 4.15, 4.95 y 15.8 × 106 CFU
mL-1 (S1 del G1, S1 del G2 y S2 del G3) a las 72 h de fermentación (Figura 3.2). El cultivo S2
del G2 fue caracterizada por reducir en menor concentración su población celular (Figura 3.2-C).
No se encontraron diferencias significativas (95% LSD) entre los tres grupos en cultivo mixto
con respecto a la formación de biomasa, consumo de azúcares y producción de etanol;
alcanzándose 4.66, 4.68 y 3.66 gL-1 de biomasa en 20 h de fermentación y 42.03, 50.7 y 50.75
gL-1 de etanol en 24 h de fermentación y agotándose completamente los azúcares a las 24 h de
cultivo en el grupo dos y a las 48 h en el grupo uno y tres (Figura 3.2-B, D, F). En relación a los
parámetros cinéticos, el análisis estadístico mostró que no existen diferencias significativas (95%
LSD) en la velocidad especifica de crecimiento máxima (µmax) entre los tres grupos (G1, G2 y
G3) alcanzándose valores de 0.22, 0.27 y 0.31 h-1 respectivamente (Tabla 3.2). Asimismo no se
presentaron diferencias significativas en los rendimientos de conversión de azúcar a etanol (Yp/s)
ni en los rendimientos de biomasa (Yx/s) entre los tres grupos probados (95% LSD) (Tabla 3.2).
Por otro lado con respecto a la velocidad especifica de consumo máxima (qsmax) y la velocidad
especifica de producción de etanol máxima (qpmax) diferencias significativas fueron encontradas
entre los tres grupos en cultivo mixto (95%LSD). Obteniendo el grupo 2 la mayor qsmax con
valores de 16.6 g/g h-1 que los grupos 1 y 3 que presentaron valores de 5.24 y 8.65 g/g h-1
respectivamente y finalmente para qpmax, el grupo 3 presentó el mayor valor con valores de 2.12
g/g h-1 que los grupos 1 y 2 que alcanzaron valores menores 0.91 y 0.78 g/g h-1 respectivamente
(Tabla 3.2).
94
20x106 120 7 50

A 6 B
100 40
Biomasa (g L-1)
15x106
Etanol (g L-1)
5
80
UFC ml-1
4 30
10x106 60
3 20
40
5x10 6 2
20 10
1
0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
20x106 120 6
C Azucares reductores (g L-1) D 50
6
100 5
15x10
Biomasa (g L-1)
40
Etanol (g L-1)
80 4
UFC ml-1
10x106 30
60 3
40 2 20
5x106
20 1 10
0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
20x106 120 6
E F 50
100 5
15x106
Biomasa (g L-1)
40
Etanol (g L-1)
80 4
UFC ml-1
10x106 30
60 3
40 2 20
5x106
20 1 10
0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h) Tiempo (h)
Figura 3.2 Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFC (A, C, E), biomasa (●), azúcares reductores (▲) y etanol
() de las fermentaciones en cultivo mixto formadas por las levaduras S1 ( ), S2 ( ), K1 ( ) y K2 ( ). en
tres grupos diferentes: Grupo 1 formado por K1 y S1 (A-B), Grupo 2 formado por las levaduras K2 y S1 (C-D) y el
Grupo 3 formado por las levaduras K2 y S2 (E-F). Las fermentaciones se realizaron a 12 ºBrix suplementando con
-1
sulfato de amonio (1 gL ). Los valores son las medias de los resultados obtenidos de dos fermentaciones. Las barras
verticales representan la desviación estándar del promedio de los datos de las dos fermentaciones.
95
Tabla 3.2 Comparación de los parámetros cinéticos para las diferentes cepas estudiadas en cultivo mixto.
Cultivos mixtos µ max (h-1) qsmax (g/g h-1) qpmax (g/g h-1) Yx/s (g/g) Yp/s (g/g)
Grupo 1a 0.220 ± 0.060 5.240 ± 0.340 0.910 ± 0.100 0.049 ± 0.005 0.370 ± 0.015
Grupo 2b 0.270 ± 0.060 16.60 ± 4.380 0.780 ± 0.240 0.037 ± 0.050 0.380 ± 0.010
Grupo 3c 0.310 ± 0.160 8.650 ± 6.970 2.120 ± 1.940 0.042 ± 0.010 0.480 ± 0.040
específica de producción de etanol máxima; Yx/s y Yp/s: rendimientos de biomasa y etanol; a Cultivo mixto formado
por K. africana (K1) y S.cerevisiae (S1); b Cultivo mixto formado por K. apiculata (K2) y S. cerevisiae (S1); c
Cultivo mixto formado por K. apiculata (K2) y S. cerevisiae (S2). Cada valor representa el promedio ± la desviación
estándar de dos fermentaciones.
Comparando los cultivos puros y mixtos, diferencias significativas fueron observadas (95 %
LSD). Por ejemplo, los cultivos puros de Saccharomyces y Kloeckera presentaron una mayor
estabilidad de cultivo a lo largo de la fermentación con concentraciones celulares altas, además
de permanecer activos por mayor tiempo que los cultivos mixtos; los cuales exhibieron un
comportamiento diferente en cada grupo en cultivo mixto, aún a pesar de la presencia de la
misma cepa de levadura en los diferentes grupos formados (Figura 3.2). Trabajos previos han
reportado resultados similares. Mendoza et al. (2007) encontró que los cultivos puros de
K.apiculata y S.cerevisiae alcanzan concentraciones celulares mayores que los cultivos mixtos,
sin embargo en estos cultivos, K. apiculata presentó una mayor estabilidad celular al permanecer
activa por mayor tiempo durante la fermentación, debido a mecanismos que no están
relacionados a la concentración de etanol, a la producción de toxinas killer y a la competencia por
compuestos de nitrógeno asimilables. Se ha observado que el limitado crecimiento de las
levaduras no-Saccharomyces, particularmente del género Kloeckera, se debe a la baja
disponibilidad de nutrientes en el jugo de agave (vitaminas y aminoácidos) y a la presencia de
sustancias inhibitorias formadas durante el cocimiento en el proceso de elaboración de tequila
(Compuestos de Maillard) entre otros (Díaz-Montaño et al., 2008). Los resultados anteriores se
limitan a trabajos en cultivo puro, sin embargo, los mecanismos implicados en cultivo mixto con
este mismo género de levaduras en la fermentación del jugo de agave, puede implicar fenómenos
de mayor complejidad. Por trabajos efectuados en vinos se sabe que la principal causa de la
muerte de la levaduras no-Saccharomyces en cultivo mixto con S. cerevisiae se debe a una baja
capacidad de tolerancia a etanol en comparación con S. cerevisiae. Diversos estudios están siendo
96
realizados con el objetivo de elucidar las posibles causas y los mecanismos implicados en este
fenómeno. Como por ejemplo los realizados por Hansen et al. (2001) y Nissen & Arneborg
(2003), concluyeron que la muerte temprana de K. thermotolerans y T. delbrueckii durante la
fermentación mixta con S. cerevisiae se debe principalmente, a la baja disponibilidad de oxígeno
en el medio de cultivo y a un mecanismo de contacto mediado por señales entre célula y célula
que paran el crecimiento de las levaduras presentes en menor concentración (no-Saccharomyces)
cuando S. cerevisiae está presente en alta concentración. Por otro lado Pina et al. (2004),
reportaron que algunas cepas de levaduras como H. guilliermondii y C. stellata pueden soportar
mayores concentraciones de etanol (22-25 % v/v), cuando el medio no es limitante en nutrientes
(ergosterol y Tween 80) y se trabaja dentro de ciertas condiciones operacionales principalmente
en aerobiosis. Adicionalmente, Bilbao et al. (1997) y Erten (2002) determinaron que el
crecimiento y la supervivencia de K. apiculata en la fermentación en cultivo mixto con S.
cerevisiae está fuertemente influenciado por la temperatura de fermentación, favoreciéndose a
temperaturas bajas (< 20ºC) su crecimiento y la síntesis de acetaldehído, acetato de etilo y acetato
de isoamilo. De igual manera Albergaria et al. (2003) y Díaz-Montaño et al. (2010), determinaron
que levaduras como H. guillermondii y K. africana en fermentaciones de jugo de uva y de agave,
respectivamente, presentan una pobre capacidad fermentativa debido a la deficiencia en el
consumo de azúcar, atribuido a una limitación nutricional más que a una intolerancia a etanol.
Los resultados del presente trabajo, fueron obtenidos bajo condiciones tradicionales de la
industria (jugo de agave a 100 gL-1 de azúcares reductores y 1 gL-1 de sulfato de amonio), donde
él único factor que se varió fue la cepa en cultivo puro y mixto. En la sección 3.3 de resultados
se discute el efecto de ciertos factores de crecimiento sobre la supervivencia y capacidad
fermentativa de las levaduras del género Kloeckera.
3.1.3 Análisis de compuestos volátiles de las fermentaciones en cultivo puro y mixto
Un criterio importante, además de las capacidades fermentativas para la selección de las

levaduras en cultivo puro y mixto, fue la síntesis de compuestos volátiles secundarios analizados
por cromatografía de gases (CG-FID-HS), siendo ésteres, ácidos y alcoholes superiores los que
constituyen el principal grupo de compuestos que impactan en el bouquet de la bebida final.
97
La Tabla 3.3 muestra los principales compuestos volátiles mayoritarios de las fermentaciones en
cultivo puro y mixto empleado las levaduras del género Kloeckera (K1 y K2) y Saccharomyces
(S1 y S2). Las levaduras del género Saccharomyces (S1 y S2) en cultivo puro y mixto se
caracterizaron por presentar altas concentraciones de isobutanol, alcohol isoamílico, 2-fenil
etanol y acetaldehído (Tabla 3.3). Por otro lado las levaduras del género Kloeckera (K1 y K2) en
cultivo puro, se distinguieron por producir altas concentraciones de acetato de etilo, acetato de
isoamilo y acetato de fenetilo (Tabla 3.3). El n-butanol fue producido en mayor concentración
por K. africana (K1) en cultivo puro (Tabla 3.3). Estos resultados concuerdan con estudios
previos reportados por otros autores. Zironi et al. (1993) publicó que S. cerevisiae en cultivo puro
y mixto con K. apiculata y H. guillermondii producen la mayor concentración de alcoholes
superiores que los cultivos puros de las levaduras no-Saccharomyces. En cambio los cultivos
puros de las levaduras no-Saccharomyces producen las mayores concentraciones de acetoína y 2-
3-butanediol. Díaz-Montaño et al. (2008), encontraron que los cultivos puros de S. cerevisiae se
distinguen por producir las mayores concentraciones de alcoholes superiores y acetaldehído que
los cultivos puros de K. africana y K. apiculata, estas cepas producen la mayor concentración de
acetato de etilo, acetato de fenetilo y ácido acético. K. africana se distinguió del resto de las
cepas estudiadas por detectarse en el medio de cultivo el n-butanol. Adicionalmente se ha
reportado que los alcoholes superiores pueden tener impactos positivos y negativos en el sabor y
el aroma, a concentraciones excesivas (> 400 mg L-1) pueden resultar en olores y sabores fuertes
y picantes, mientras que a niveles óptimos (< 300 mg L-1) imparten características frutales a la
bebida (Swiegers et al., 2005; Díaz-Montaño et al., 2010). La concentración de alcoholes
superiores depende del tipo de levadura empleada y de otros factores como: la temperatura, el pH
y la composición de aminoácidos del medio (Swiegers et al., 2005). El acetaldehído en cambio a
bajas concentraciones (< 100 mg L-1) contribuye a las propiedades sensoriales de la bebida
confiriendo notas a manzana, cítricas y nuez. Sin embargo, a concentraciones altas (> 100 mg L-
1
) confiere un olor picante e irritante (Schreier, 1976). Asimismo algunos autores han reportado
que las levaduras no-Saccharomyces del género Hanseniaspora, Candida y Kloeckera son
buenas productoras de ésteres, ácido acético, acetoína y son capaces de promover la liberación de
terpenos al medio. El uso de estas levaduras se ha recomendado en la fermentación en cultivo
mixto con S. cerevisiae, con la finalidad de mejorar las propiedades sensoriales de la bebida.
(Ciani & Picciotti, 1995; Díaz-Montaño et al., 2008; Díaz-Montaño et al., 2010; Romano et al.,
98
2003; Swiegers et al., 2005; Romano et al., 1996). Se ha reportado que cepas de levaduras de H.
guillermondii son capaces de esterificar varios alcoholes como etanol, geraniol, alcohol
isoamílico y 2-fenil etanol (Rojas et al., 2001). Por otra parte contenidos excesivos de acetato de
etilo (> 200 mg L-1) no mejoran el aroma de las bebidas fermentadas; sino que generan olores
desagradables, pero a concentraciones bajas (rango 50-80 mg L-1) realzan la composición
química de la bebida, aportando notas frutales (Zohre et al., 2002; Moreira et al., 2005). Los
resultados concuerdan con lo reportado, ya que las levaduras del género Kloeckera (K1 y K2) en
cultivo puro y mixto produjeron concentraciones considerables de acetato de etilo en el rango de
33.13 a 74.22 mg L-1 (Tabla 3.3). Para el acetato de isoamilo las levaduras del género Kloeckera
en cultivo puro produjeron las mayores concentraciones (2.97 y 1.43 mg L-1) aportando sabores
frutales como banana y descriptores dulces en un umbral < 1 mg L-1 (Swiegers et al., 2005;
Díaz-Montaño et al., 2010). Los demás ésteres (hexanoato, octanoato y decanoato de etilo)
fueron producidos en una baja concentración (< 0.10 mg L-1) en la mayoría de las cepas
estudiadas en cultivo puro y mixto (Tabla 3.3).
El análisis estadístico (95% LSD) determinó que no existen diferencias significativas en la

concentración de n-propanol y metanol entre las cepas estudiadas en cultivo puro y mixto. Con
respecto al metanol, su concentración fue similar en todos los tratamientos; debido a que es un
compuesto que se obtiene del cocimiento y no es sintetizado por las levaduras durante la
fermentación alcohólica; en todos los tratamiento la concentración de metanol fue menor a la
reportada en la industria (117-120 mg L-1) (Díaz-Montaño et al., 2008). El análisis de
componentes principales (PCA), agrupó los compuestos volátiles producidos por las levaduras
Kloeckera y Saccharomyces en cultivos puros y mixtos en dos componentes principales con una
varianza explicada del 73.8% (Figura 3.3 y Tabla 3.4). Siendo los compuestos con mayor peso
sobre el componente PC-1: acetato de isoamilo, acetato de fenetilo y n-butanol con pesos
negativos y acetaldehído, 2-fenil etanol, alcohol isoamílico e isobutanol con pesos positivos.
Mientras que para el PC-2 fueron: metanol y acetato de fenetilo con pesos negativos y el
decanoato de etilo con pesos positivos (Figura 3.3).
No obstante, a pesar de que no se encontraron diferencias significativas en las capacidades

fermentativas de los tres grupos formados en cultivo mixto, la selección del mejor grupo de
levaduras se realizó a partir de la síntesis de compuestos volátiles, prefiriendo aquel que
99
presentara la menor concentración de los compuestos de norma como alcoholes superiores y

acetaldehído. El grupo 1 formado por K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1), resultó el
seleccionado ya que presentó la menor concentración de alcoholes superiores y acetaldehído,
resultando además en adecuados perfiles de biomasa, UFC, consumo de sustrato y producción de
etanol.
100
Tabla 3.3 Concentración de compuestos volátiles producidas por las levaduras Kloeckera africana (K1), Kloeckera
apiculata (K2), Saccharomyces cerevisiae (S1) y Saccharomyces cerevisiae (S2) en cultivos puros y mixtos.
Cultivos puros Cultivos mixtos
Compuestos
(mg L-1) S1 S2 K1 K2 Group 1a Group 2b Group 3c
Σ Aldehídos 157.94 ± 2.71 170.72 ± 3.04 47.89 ± 5.06 46.73 ± 5.94 89.46 ± 2.31 101.04 ± 1.64 144.11 ± 1.45
Acetaldehído 157.94 ± 2.71 170.72 ± 3.04 47.89 ± 5.06 46.73 ± 5.94 89.46 ± 2.31 101.04 ± 1.64 144.11 ± 1.45
Alcoholes 64.18 ± 0.58 63.28 ± 1.15 58.94 ± 0.37 46.05 ± 2.73 66.82 ± 1.6 63.67 ± 1.58 64.99 ± 0.18
d
Metanol 64.18 ± 0.58 63.28 ± 1.15 58.94 ± 0.37 46.05 ± 2.73 66.82 ± 1.6 63.67 ± 1.58 64.99 ± 0.18
Σ Alcoholes
Superiores 284.92 ± 14.25 318 ± 4.99 122.51 ± 6.69 114.69 ± 7.88 247.3 ± 3.50 254.36 ± 9.40 307.28 ± 0.91
n-Propanol d 25.28 ± 2.03 32.18 ± 0.37 27.60 ± 1.35 29.38 ± 2.53 25.55 ± 0.23 23.97 ± 0.5 30.65 ± 0.02
n-Butanol 0.38 ± 0.02 0.77 ± 0.04 4.47 ± 0.18 1.03 ± 0.13 1.31 ± 0.01 0.75 ± 0.014 0.75 ± 0.02
Isobutanol 53.95 ± 3.34 56.74 ± 0.99 23.04 ± 0.28 29.08 ± 2.53 51.69 ± 0.56 54.64 ± 5.03 57.28 ± 0.2
Alcohol isoamílico 156.36 ± 7.15 162.44 ± 2.76 56.91 ± 3.57 42.98 ± 0.65 129.75 ± 1.68 127.91 ± 2.32 148.21 ± 0.25
2-fenil etanol 48.95 ± 1.71 65.87 ± 0.83 10.485 ± 1.31 12.22 ± 2.044 39.00 ± 1.014 47.09 ± 1.53 70.39 ± 0.67
Σ Ésteres 13.45 ± 2.29 14.37 ± 0.439 79.193 ± 1.78 67.74 ± 1.04 34.58 ± 0.914 47.91 ± 2.01 69.124 ± 1.735
Acetato de etilo 13.19 ± 2.26 14.11 ± 0.43 74.22 ± 1.42 65.37 ± 0.80 33.13 ± 1.33 46.44 ± 1.99 67.94 ± 1.64
Acetato de isoamilo 0.13 ± 0.03 0.08 ± 0.003 2.97 ± 0.28 1.43 ± 0.096 0.09 ± 0.001 0.28 ± 0.005 0.14 ± 0.001
Hexanoato de etilo 0.025 ± 0.002 0.030 ± 0.001 0.018 ± 0.001 0.031 ± 0.001 0.022 ± 0.003 0.014 ± 0.001 0.029 ± 0.003
Octanoato de etilo 0.041 ± 0.001 0.052 ± 0.002 nd 0.059 ± 0.006 0.050 ± 0.003 0.053 ± 0.001 0.052 ± 0.002
Acetato de fenetilo nd nd 1.92 ± 0.08 1.79 ± 0.07 1.25 ± 0.01 1.05 ± 0.01 0.91 ± 0.085
Decanoato de etilo 0.064 ± 0.003 0.096 ± 0.003 0.065 ± 0.001 0.061 ± 0.005 0.041 ± 0.001 0.069 ± 0.002 0.053 ± 0.001
nd: no detectado. Alcohol isoamílico: suma de alcoholes amílico activo e isoamílico. K1: cultivo puro de K. africana.
K2: cultivo puro de K. apiculata. S1: cultivo puro de S. cerevisiae. S2: cultivo puro de S. cerevisiae. a Cultivo mixto
formado por K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1). b Cultivo mixto formado por K. africana (K2) y S. cerevisiae (S1).
c
Cultivo mixto formado por K. africana (K2) y S. cerevisiae (S2). d Compuestos que no presentaron diferencias
significativas entre cepas en cultivo puro y mixto. Cada valor representa el promedio ± desviación estándar de dos
determinaciones.
101
0.60
dec etil
0.50 A
Cepas de Saccharomyces
0.40 prop
0.30
hex etil acet
0.20
ac isom
0.10 but
Cepas de Kloeckera alcalc
fenisom
p[2]
0.00
-0.10 isob
oct etil
-0.20
ac etil
ac fen
-0.30
Cultivos Mixtos
-0.40
met
-0.50
-0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30
p[1]
4
B
3
S2S2
1
K1
K1 S1
S1
0 K2 K2
t[2]
Grupo 33
Grupo
-1
Grupo 2
Grupo1 2
Grupo
Grupo 1
-2
-3
-4
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
t[1]
Figura 3.3. PCA de (A) compuestos volátiles y (B) las cepas de levaduras en cultivo puro y mixto. acet:
acetaldehído; met: metanol; ac-etil: acetato de etilo; hex-etil: hexanoato de etilo; oct-etil: octanoato de etilo; dec-etil:
decanoato de etilo; prop: n-propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-iso: alcohol isoamílico; alc-fen: 2-fenil
etanol; ac-isom: acetato de isoamilo y ac-fen: acetato de fenetilo. K1: Cultivo puro de K. africana; K2: Cultivo puro
de K. apiculata; S1: Cultivo puro de S. cerevisiae; S2: Cultivo puro de S. cerevisiae; Grupo 1: K1+S1; Grupo 2:
K2+S1; Grupo 3: K2+S2.
102
Tabla 3.4. PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada para cada componente
PC1 PC2
Varianza explicada (%) 58.8 Varianza explicada (%) 15
Acetato de isoamilo -0.3552 Metanol -0.4792
Acetato de fenetilo -0.3158 Acetato de fenetilo -0.2649
n-Butanol -0.3106 Acetato de etilo -0.2359
Acetato de etilo -0.2801 Octanoato de etilo -0.1812
n-Propanol -0.2031 Isobutanol -0.0888
Hexanoato de etilo 0.0768 2-Fenil etanol 0.0438
Decanoato de etilo 0.0801 Alcohol isoamílico 0.0534
Metanol 0.1703 n-Butanol 0.1089
Octanoato de etilo 0.2447 Acetato de isoamilo 0.1350
Acetaldehído 0.3265 Hexanoato de etilo 0.2270
2-Fenil etanol 0.3272 Acetaldehído 0.2339
Alcohol isoamílico 0.3436 n-Propanol 0.3997
Isobutanol 0.3536 Decanoato de etilo 0.5504
3.2 Caracterización de los compuestos volátiles en destilados obtenidos con las levaduras
de estudio S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto en medio basal
A partir de la selección de levaduras; se llevaron a cabo fermentaciones en cultivo puro y mixto

con las levaduras Kloeckera africana (K1) y Saccharomyces cerevisiae (S1) a nivel piloto
(reactor de 14 L) con jugo de agave a 100 ± 11 gL-1 de azúcares reductores adicionado con 1 gL-1
de sulfato de amonio (medio basal) bajo condiciones anaeróbicas de crecimiento a 250 rpm y 30
ºC y los mostos de cada fermentación se destilaron. Los destilados se analizaron por
cromatografía de gases y sensorialmente por pruebas hedónicas y discriminativas (“A” “no A”).
Para cubrir este objetivo se implementó el diseño unifactorial de la sección 2.5.1 de
procedimiento y método.
103
3.2.1 Análisis de compuestos volátiles mayoritarios
Los destilados se analizaron por CG-FID y en la Tabla 3.5 se reportan los compuestos volátiles
mayoritarios en mg/100 mL de alcohol anhidro producidos por las cepas del género K. africana
(K1) y S. cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto. El destilado del cultivo puro de S. cerevisiae y
el cultivo mixto mostraron un patrón similar en la síntesis de compuestos volátiles mayoritarios,
presentando la mayor concentración de acetaldehído, acetato de etilo, isobutanol y alcohol
isoamílico. Por su parte el cultivo puro de K. africana (K1) se distinguió por presentar una alta
concentración de ácido acético, n-butanol y furfural (Tabla 3.5). El análisis de varianza
(ANOVA) determinó diferencias significativas en la concentración de todos los compuestos
volátiles mayoritarios entre los tres destilados en cultivo puro y mixto (P < 0.05). El análisis de
rangos múltiples (95% LSD), determinó diferencias significativas en la concentración de acetato
de etilo, lactato de etilo, isobutanol, butanol y alcohol isoamílico entre los tres destilados (Tabla
3.5). Para el destilado de S. cerevisiae (S1) y el destilado del cultivo mixto no se encontraron
diferencias significativas en la concentración de acetaldehído, ácido acético y furfural (95% LSD).
Por su parte para el destilado de K. africana, diferencias significativas fueron encontradas en la

concentración de todos los compuestos (a excepción del metanol y n-propanol) con respecto a
los destilados de S. cerevisiae y el cultivo mixto (Tabla 3.5). Las diferencias encontradas son
debidas principalmente al tipo de levadura empleada, a las condiciones de fermentación y al
sistema de destilación implementado, sin embargo el género de levadura es el factor que más
influye, ya que existen varios reportes en vino y en tequila sobre la biodiversidad entre géneros
en la síntesis de compuestos volátiles (Romano et al. 2003; Díaz-Montaño et al. 2008). Algunos
de ellos han reportado que las cepas de levaduras del género Kloeckera son altas productoras de
acetato de etilo, ácido acético y n-butanol y las levaduras del género Saccharomyces sintetizan
altas concentraciones de isobutanol, alcohol isoamílico, 2-fenil etanol y acetaldehído. Los
resultados obtenidos están en relación con lo reportado. Sin embargo, el destilado de K. africana
presentó una baja concentración de acetato de etilo, ya que durante la destilación se separó la
fracción de cabezas (que contienen los compuestos volátiles con baja presión vapor como es el
caso del acetato de etilo) (Oliveira et al. 2005). Es importante remarcar que todos los compuestos
analizados estuvieron dentro de los límites permisibles por la norma oficial mexicana (Tabla 3.5).
104
Tabla 3.5: Concentración de compuestos volátiles mayoritarios producidos por K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1)
en cultivo puro y mixto.
Compuestos Cultivo puro Cultivo Mixto Limite
(mg/100 mL de alcohol anhidro) K1 S1 K1+S1 NOMa
Σ Aldehídos 4.52 ± 0.79 9.77 ± 1.58 8.70 ± 0.08 0 - 40

Acetaldehído* 4.52 ± 0.79 9.77 ± 1.58 8.70 ± 0.08
Σ Ácidos orgánicos 26.87 ± 0.63 12.00 ± 0.44 12.63 ± 1.29 Cn
Ácido acético* 26.87 ± 0.63 12.00 ± 0.44 12.63 ± 1.29
Σ Ésteres 4.55 ± 1.17 10.60 ± 0.33 4.94 ± 0.83 2 – 200
Acetato de etilo* 3.36 ± 0.19 7.28 ± 0.16 4.92 ± 0.81
Lactato de etilo* 1.79 ± 0.47 3.32 ± 0.24 0.03 ± 0.04
Σ Alcoholes 101.88 ± 1.23 123.03 ± 2.89 108.39 ± 6.46 30 – 300
Metanol 101.88 ± 1.23 123.03 ± 2.89 108.39 ± 6.46
Σ Alcoholes superiores 185.48 ± 0.8 345.84 ± 5.29 326.53 ± 2.78 20 - 500
n-Propanol 43.65 ± 2.30 43.33 ± 0.93 51.09 ± 1.38
Isobutanol* 35.56 ± 1.08 71.59 ± 1.00 68.23 ± 0.86
n-butanol* 1.20 ± 0.02 0.07 ± 0.01 0.05 ± 0.002
Alcohol isoamílico* 105.06 ± 0.24 230.83 ± 3.41 206.85 ± 1.75
Σ Furfural 3.92 ± 0.12 1.69 ± 0.29 1.63 ± 0.20 0-4
*: Compuestos con diferencias significativas entre los tres destilados; Cn: compuesto no incluido en la norma oficial
del Tequila. a: NOM: NMX-V-005-NORMEX-2005. Alcohol isoamílico: suma de los alcoholes amílico activo e
isoamílico. K1: destilado obtenido del cultivo puro de K. africana; S1: destilado obtenido del cultivo puro de S.
cerevisiae K1+S1: destilado obtenido del cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae. Cada valor representa el
promedio ± de dos determinaciones
Los tres destilados y sus compuestos volátiles fueron agrupados por el PCA en dos componentes
principales con una varianza explicada del 91.4% (Figura 3.4). Los destilados fueron claramente
distinguidos el uno del otro, siendo marcados por definidas locaciones en la Figura 3.4-B. Los
compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: ácido acético y furfural con pesos
negativos y acetaldehído, acetato de etilo, isobutanol y alcohol isoamílico con pesos positivos.
Mientras que para el PC-2 fueron: n-propanol con pesos negativos y el lactato de etilo con pesos
positivos (Tabla 3.6). La gran variabilidad observada entre los destilados en cultivo puro y mixto
es debida a factores tales como: el tipo de levadura empleada, las condiciones de fermentación, la
composición del mosto y el sistema de destilación empleado que marcadamente afecta la
105
composición final de compuestos volátiles en las bebidas alcohólicas. (Oliveira et al. 2005;
Romano et al. 2003; Díaz-Montaño et al. 2008).
0.60 A lact et
0.50
0.40
but
0.30
Destilado de S.cerevisiae met
Destilado de K. africana ac etil
0.20
0.10 furf
ac acet
p[2]
0.00 alc isom

acet
isob
-0.10
-0.20
-0.30
Destilado del cultivo mixto
-0.40
-0.50
-0.60 prop
-0.40 -0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40

p[1]
6
B
4
2 S1
S1
K1
0
t[2]
K1
M1
M1
-2
-4
-6
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
t[1]
Figura 3.4. PCA de (A) compuestos volátiles y de (B) los destilados obtenidos de cultivos puros y mixtos (M1) a
partir de K .africana (K1) y S .cerevisiae (S1). acet: acetaldehído; met: metanol; ac-acet: ácido acético; prop: n-
propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-isom: alcohol isoamílico; ac-etil: acetato de etilo; lact-et: lactato de
etilo y furf: furfural. K1: destilado obtenido del cultivo puro de K. africana; S1: destilado obtenido del cultivo puro
de S. cerevisiae K1+S1: destilado obtenido del cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae.
106
PC1 PC2
Varianza explicada (%) 63.6 Varianza explicada (%) 27.8
Ácido acético -0.3860 n-Propanol -0.5570
Furfural -0.3700 Isobutanol -0.0330
n-Butanol -0.1630 Acetaldehído -0.0240
Lactato de etilo 0.0540 Alcohol isoamílico 0.0060
n-Propanol 0.1110 Ácido acético 0.0690
Metanol 0.2960 Furfural 0.1260
Acetaldehído 0.3710 Acetato de etilo 0.1950
Acetato de etilo 0.3730 Metanol 0.3760
Isobutanol 0.3910 n-Butanol 0.3790
Alcohol isoamílico 0.3940 Lactato de etilo 0.5860
3.2.2 Análisis de compuestos volátiles minoritarios
La Tabla 3.7 muestra los compuestos volátiles minoritarios analizados por CG-MS. Benn &
Peppard (1996), analizaron más de 175 compuestos en 3 diferentes marcas de Tequila,
encontrando altas concentraciones de alcoholes superiores y menores de ésteres, acetales,
terpenos, furanos, ácidos, aldehídos, cetonas, fenoles y compuestos azufrados. Por su parte los
compuestos responsables del bouquet de las bebidas fermentadas son los alcoholes superiores,
ésteres, ácidos y el acetaldehído (Díaz-Montaño et al., 2008). Los compuestos volátiles de los
destilados fueron agrupados y divididos en seis familias de compuestos como: ácidos orgánicos,
alcoholes, ésteres, furanos, cetonas y terpenos. El análisis de rangos múltiples (95% LSD) mostró
que no existen diferencias estadísticas en la concentración de hexanoato de etilo, cis-óxido de
linalol y α-terpineol entre los destilados procedentes de los cultivos puros y mixtos de S.
cerevisiae y K. africana (Tabla 3.7). Diferencias significativas en la concentración de ácido
hexanoico, ácido propanoico, 2-etil-1-hexanol, alcohol furfurílico, propianato de fenetilo, acetato
de fenetilo, 2-acetil furan, 5-metil furfural y acetoína fueron encontradas en los destilados,
presentando las mayores concentraciones el destilado de K. africana, mientras que en el destilado
de S. cerevisiae se presentó la mayor concentración de ácido decanoico, 4-penten-1-ol, 2-fenil
etanol, isovalerato de fenetilo, octanoato de etilo, decanoato de etilo, dodecanoato de etilo y 9-
decenoato de etilo. El destilado del cultivo mixto presentó la mayor concentración de ácido
107
isobutírico y ácido octanoico (Tabla 3.7). Así como una concentración intermedia en la mayoría
de los compuestos evaluados, debido al efecto interactivo de K. africana y S. cerevisiae durante
la fermentación. Similares resultados han sido reportados por otros autores. Moreira et al. (2005),
reportó que H. guillermondii en cultivo puro y mixto produce la mayor concentración de acetato
de fenetilo y 2-fenil etanol que los cultivos puros y mixtos de S. cerevisiae y H. uvarum.
Asimismo Díaz-Montaño et al. (2008) reportó que las levaduras del género Kloeckera, producen
acetato de fenetilo en mayor concentración que S. cerevisiae, pudiendo su síntesis ser una
característica común de estas levaduras y representar una ventaja por la incorporación de aromas
especiales a la bebida (florales, frutales y a miel). Romano et al. (1996) estudió 96 cepas de K.
apiculata y H. guillermondii por su habilidad para producir acetoína en medio sintético y mosto,
confirmando que una gran cantidad de acetoína es una característica común de ambas levaduras.
La baja cantidad de acetoína encontrada en el destilado de S. cerevisiae y el destilado del cultivo
mixto, puede deberse al hecho de que S. cerevisiae asimila grandes cantidades del metabolito,
posiblemente para su posterior reducción a 2-3-butanediol (Zironi et al., 1993). Díaz-Montaño et
al. (2008) reportó que las cepas de S. cerevisiae producen la mayor concentración de 2-fenil
etanol que las levaduras del género Kloeckera. La alta concentración de 5 metil-furfural y furfural
en el destilado de K. africana, puede explicarse por el hecho de que estos compuestos resultan
tóxicos para el crecimiento celular de las levaduras por inhibición de ciertas enzimas glicolíticas
y el transporte de electrones (Palmqvist et al., 1999 y Díaz-Montaño et al., 2008). Sin embargo,
otros reportes han sugerido que S. cerevisiae puede reducir el furfural a alcohol furfurílico a
través de la alcohol deshidrogenasa, este hecho quizá explique el bajo contenido de furfural y 5-
metil-furfural en los destilados de S. cerevisiae en cultivo puro y mixto (Tablas 3.5 y 3.7). Como
era de esperarse, los destilados producidos por K.africana y S.cerevisiae en cultivo puro son
considerablemente diferentes de aquellos producidos en cultivo mixto; esto es posible observarlo
en la Fig. 3.5. De igual manera que para los compuestos volátiles mayoritarios, el análisis de
componente principales (PCA) explicó el 93.8% de la varianza en dos componentes principales
(Fig. 3.5). Los compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: acetato de fenetilo,
acetoína, propianato de fenetilo y ácido propionico con pesos negativos y el ácido decanoico y 2-
fenil etanol con pesos positivos. Mientras que para el PC-2 fueron: ácido isobutírico, 9-
hexadecenoato de etilo y el ácido octanoico con pesos negativos y el alcohol furfurílico,
α−terpineol y hexadecanoato de etilo con pesos positivos (Tabla 3.8).
108
Tabla 3.7: Concentración de compuestos volátiles minoritarios producidos por los destilados de K. africana (K1) y S.
cerevisiae (S1) en cultivos puros y mixtos
Compuestos Cultivo puro Cultivo mixto

(mg/100 mL de alcohol anhidro) K1 S1 K1+S1
Σ Ácidos orgánicos 0.60 ± 0.19 0.41± 0.01 1.55 ± 0.2
Ácido isobutírico nd nd 0.97 ± 0.09
Ácido hexanoico 0.35 ± 0.15 nd nd
Ácido propanoico 0.25 ± 0.04 nd nd
Ácido octanoico nd nd 0.25 ± 0.08
Ácido decanoico nd 0.41 ± 0.01 0.33 ± 0.03
Σ Alcoholes 7.96 ± 0.29 20.27± 0.418 17.43 ± 0.28
4-Penten-1-ol* 0.49 ± 0.01 0.94 ± 0.01 0.66 ± 0.03
2-Etil-1-hexanol* 0.34 ± 0.04 0.26 ± 0.01 0.18 ± 0.02
2-Fenil etanol* 6.65 ± 0.23 18.81 ± 0.388 16.59 ± 0.23
Alcohol furfurílico* 0.38 ± 0.01 0.26 ± 0.01 nd
Σ Ésteres 16.36 ± 0.51 3.18 ± 0.12 6.63 ± 0.15
Propionato de fenetilo 0.10 ± 0.01 nd nd
Isovalerato de fenetilo nd 0.09 ± 0.01 nd
Octanoate etilo nd 0.27 ± 0.02 nd
Decanoato de etilo nd 0.24 ± 0.01 nd
Dodecanoate de etilo nd 0.10 ± 0.01 nd
*
9-Decenoato de etilo nd 0.80 ± 0.04 0.18 ± 0.01
*
Acetato de fenetilo 16.05 ± 0.45 1.43 ± 0.02 6.17 ± 0.10
Hexadecanoato de etilo 0.20 ± 0.06 0.24 ± 0.01 0.13 ± 0.02
9-Hexadecenoato de etilo nd nd 0.15 ± 0.02
Σ Furanos 11.76 ± 0.34 6.15 ± 0.05 4.64 ± 0.11
2-Acetil furan* 0.37 ± 0.02 0.17 ± 0.01 0.23 ± 0.01
5-Metil furfural* 11.49 ± 0.32 5.98 ± 0.04 4.41 ± 0.10
Σ Cetonas 13.20 ± 0.33 nd 0.09 ± 0.04
Acetoína* 13.20 ± 0.33 nd 0.09 ± 0.04
Σ Terpenos 0.23 ± 0.05 0.19 ± 0.02 0.14 ± 0.02
cis −Óxido de linalol 0.08 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.07 ± 0.01
α −Terpineol 0.12 ± 0.04 0.12 ± 0.01 0.07 ± 0.01
*: Compuestos con diferencias significativas entre los tres destilados. nd: no detectado. Alcohol isoamílico: suma de
alcoholes amílico activo e isoamílico. K1: destilado obtenido del cultivo puro de K. africana; S1: destilado obtenido
del cultivo puro de S. cerevisiae K1+S1: destilado obtenido del cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae. Cada
valor representa el promedio ± de dos determinaciones
109
Destilado de S. cerevisiae
Destilado de K. africana
Destilado del cultivo mixto
10
B
8
4
S1
S1
2
K1
0 K1
t[2]
-2
M1
M1
-4
-6
-8
-10
-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

t[1]

Figura 3.5. PCA de (A) compuestos volátiles y (B) destilados obtenidos de cultivo puro y cultivo mixto (M1) de K.
africana (K1) y (S1) S. cerevisiae. iso-ac: ácido isobutírico, hex-ac: ácido hexanoico, prop-ac: ácido propanoico, oct-
ac: ácido octanoico, dec-ac: ácido decanoico, 4-pent-o: 4-penten-1-ol, etil-hex: 2-etil-1-hexanol, fen-alc: 2-fenil
etanol, fur-alc: alcohol furfurílico, fen-prop: propionato de fenetilo, fen-isov: isovalerato de fenetilo, oct-et:
octanoato de etilo, dec-et: decanoato de etilo, dod-et: dodecanoate de etilo, dec-9-et: 9-decenoato de etilo, fen-acet:
acetate de fenetilo, hexdec-et: hexadecanoato de etilo, hexdec-9-et: 9-hexadecenoato de etilo, acet-fur: 2-acetil furan,
5mf: 5-metil-furfural, acet: acetoína, lin-oxd: cis-óxido de linalol y terp: α−terpineol. K1: destilado obtenido del
cultivo puro de K. africana; S1: destilado obtenido del cultivo puro de S. cerevisiae K1+S1: destilado obtenido del
cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae.
110
PC1 PC2
Varianza explicada (%) 57 Varianza explicada (%) 36
Acetato de fenetilo -0.2736 Ácido isobutírico -0.3211
Acetoína -0.2699 9-Hexadecenoato de etilo -0.3203
Propionato de fenetilo -0.2688 Ácido octanoico -0.3122
Ácido propionico -0.2681 2-Acetil furan -0.1544
Ácido hexanoico -0.2552 Acetato de fenetilo -0.0408
5-Metil-furfural -0.2511 2-fenil etanol -0.0136
2-Acetil furan -0.2410 Ácido decanoico -0.0064
2-Etil-1-hexanol -0.2005 Acetoína 0.0666
cis-Óxido de linalol -0.1880 Propianato de fenetilo 0.0667
Alcohol furfurílico -0.1581 Ácido propionico 0.0749
α−terpineol -0.0566 Ácido hexanoico 0.0800
Hexadecanoato de etilo 0.0088 cis-Óxido de linalol 0.1035
9-Hexadecenoato de etilo 0.0843 5-Metil-furfural 0.1364
Ácido octanoico 0.0846 4-penten-1-ol 0.1482
Ácido isobutírico 0.0846 9-Decenoato de etilo 0.1999
Decanoato de etilo 0.1825 2-Etil-1-hexanol 0.2064
Octanoato de etilo 0.1838 Decanoato de etilo 0.2493
Isovalerato de fenetilo 0.1838 Dodecanoato de etilo 0.2534
Dodecanoato de etilo 0.1843 Octanoato de etilo 0.2543
9-Decenoato de etilo 0.2239 Isovalerato de fenetilo 0.2543
4-penten-1-ol 0.2476 Alcohol furfurílico 0.2781
Ácido decanoico 0.2739 α−terpineol 0.2948
2-fenil etanol 0.2746 Hexadecanoato de etilo 0.3106
3.2.3 Evaluación sensorial
Los destilados obtenidos fueron sometidos a diferentes evaluaciones sensoriales siendo la

primera una prueba de preferencia con consumidores del producto. Para esta evaluación el
número de personas que acudieron a la sesión fue de 37; se evaluó olor, aroma y sensaciones
táctiles con cinco niveles de agrado en una escala de -2, -1, 0, 1, 2 y 3 evaluando desde muy
desagradable hasta me gusta demasiado (ANEXO 3). La prueba discriminativa “A” “No-A” fue
implementada a los destilados, con la finalidad de confirmar las diferencias de la prueba a
consumidores y definir sus características sensoriales. El destilado obtenido del cultivo puro de K.
111
africana, fue seleccionada como la referencia (A) y se comparó contra los otros destilados:
destilado de S. cerevisiae y el destilado del cultivo mixto, así como contra el destilado de K.
africana. Los datos de las tres réplicas se analizaron a través del estadístico de prueba χ , con el
2
mismo estudio fue posible definir un perfil sensorial cualitativo en olor, aroma, gusto y
sensaciones trigeminales de las tres muestras tomando como referencia los descriptores
generados por Cantor-Solórzano et al. (1999) y Díaz-Montaño (Proyecto PROTECO No. 24547,
SEP-CONACYT) (ANEXO 4).
Los resultados de los niveles de aceptación obtenidos de los destilados para los atributos
sensoriales evaluados se muestran en la Figura 3.6. y los perfiles de olor, aroma, gusto y
sensaciones trigeminales en la Figura 3.7. Los destilados fueron significativamente diferentes en
aroma, gusto y sensaciones táctiles (P< 0.05). No se encontraron diferencias significativas con
respecto al aroma, olor y sensaciones táctiles entre los destilados del cultivo mixto y el destilado
de K. africana (95% LSD); sólo fue diferente el destilado de S. cerevisiae ya que resultó ser el
más agradable de los destilados evaluados (Figura 3.6). Por otro lado con respecto a la prueba
discriminativa “A” “No-A”; se confirmó que no existen diferencias significativas en sabor y
aroma entre los destilados de S. cerevisiae y K. africana (P> 0.05). Sólo fueron diferentes los
destilados de K. africana y el cultivo mixto (P < 0.05). Asimismo diferentes notas asociados al
sabor y aroma fueron distinguidas entre los destilados evaluados; particularmente el destilado del
cultivo puro de K. africana fue caracterizado por presentar notas de dulce, fermentado, frutal y
quemante; mientras que el destilado de S. cerevisiae se caracterizó por presentar notas de madera,
frutal, fermentado, humo, dulce y quemante. El destilado del cultivo mixto presentó notas a nuez,
dulce, salado, madera, frutal y quemante respectivamente (Figura 3.7). Los diferentes
descriptores asociados a cada destilado son resultado del metabolismo de la levadura, de las
condiciones de fermentación y del proceso de destilación (Romano et al. 2003; Díaz-Montaño et
al. 2008). A su vez cada descriptor está asociado a diferentes compuestos volátiles que
contribuyen a las cualidades aromáticas y sensoriales de la bebida. Por ejemplo los ésteres son
responsables de impartir notas frutales y florales; los alcoholes superiores a concentraciones
excesivas (> 400 mg L-1) imparten olores y sabores fuertes y picantes, mientras que a
concentraciones bajas (< 300 mg L-1) imparten características frutales a la bebida; los aldehídos
dan sabores frutales como manzana y nuez; los ácidos confieren aromas picantes y rancios como
112
el vinagre y los monoterpenos están asociados a las notas florales (Swiegers et al., 2005; Díaz-
Montaño et al., 2009).
S1 K1 Mixto
AROMA OLOR SENSACIONES

12 12 12 TACTILES
10 10 10
8 8 8
Juez
6 6 6
4 4 4
2 2 2
0 0 0
-2 -1 0 1 2 3 -2 -1 0 1 2 3 -2 -1 0 1 2 3
Nivel de aceptación Nivel de aceptación Nivel de aceptación
Figura 3.6. Niveles de aceptabilidad de los destilados obtenidos de S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo
puro y mixto.
OLOR AROMA GUSTO Y

S. TRIGEMINALES
Aceit Ac
Ag. Vin 2.50 Anís 5.0
Vin 3.00 Anís Solv 2.00 4.0
2.50 Barn Ast Am
T. Húm 2.00
Barn frut 1.50 3.0
1.50 1.00 2.0

Pic Car Plat Car
1.00 0.50 1.0
Paja
0.50
Ferm P. - Met - Dul
- Fen
hum
Nuez F. des Mant
Ferm
art
Man. F. Ferm Mad Que Sal
Frut
Res
Mad.R F. Sec Mad Hum
Mad Fru Pic
Mixto S1 K1
Figura 3.7. Perfiles sensoriales de olor, aroma, gusto y sensaciones trigeminales de los destilados de S. cerevisiae
(S1), K. africana (K1) y del Cultivo Mixto (K1+S1). Descriptores de Olor: Ag-coc: agave cocido; Anís: anís; Barn:
barniz; Car: caramelo; Ferm-avin: fermentado avinagrado; F-des: fruta descompuesta; F-ferm: fruta fermentada; F-
sec: fruta seca; Fru: frutal; Mad: madera; Mad-res: madera resinosa; Man-roja: manzana roja; Nuez: nuez; Paja-húm:
paja húmeda; Pic: picante; T.húm: trapo húmedo; Vin: vinagre. Descriptores de aroma: Aceit: aceituna; Anís: anís;
Barn: barniz; Car: caramelo; Fen: fenólico; Ferm: fermentado; Frut: frutal; Hum: humo; Mad: madera; Mad-res:
madera resinosa; Mant-art: mantequilla artificial; P-hum: paja húmeda; Plat: plátano; Solv-frut: solvente frutal; Vin:
vinagre. Descriptores de gusto y sensaciones trigeminales: Ac: ácido; Am: amargo; Dul: dulce; Sal: salado; Pic:
picante; Que: quemante; Met: metálico y Ast: astringente.
113
3.2.4 Conclusiones
Fermentaciones a nivel matraz en medio basal con K. africana (K1), K. apiculata (K2) y S.
cerevisiae (S1 y S2) en cultivos puros y mixtos fueron examinadas. Durante las fermentaciones a
nivel matraz, se observó que K. africana (K1) y K. apiculata (K2) en cultivo puro presentaron un
limitado crecimiento (concentraciones biomasa < 2 gL-1 y de UFC < 80×106 CFU mL-1), un bajo
consumo de azúcares (< 50 gL-1) y baja producción de etanol (< 11 gL-1) en comparación a las
cepas de S. cerevisiae (S1 y S2) que mostraron una alta eficiencia fermentativa; es decir una alta
formación de biomasa (> 3 g/L) y UFC (> 100×106 CFU mL-1), un completo consumo de
azúcares y una alta producción de etanol (> 35 gL-1). En cultivo mixto las levaduras del género
Kloeckera crecieron en menor concentración que las levaduras del género Saccharomyces,
mostrando los tres grupos formados en cultivo mixto patrones similares a los observados para S.
cerevisiae en cultivo puro, debido a la presencia y dominio de esta levadura durante la
fermentación. El análisis en la síntesis de compuestos volátiles en mosto mostró que las levaduras
del género Kloeckera en cultivo puro produjeron altas concentraciones de ésteres de acetato en
relación a las cepas Saccharomyces que mostraron las mayores concentraciones de acetaldehído y
alcoholes superiores. En los cultivos mixtos la influencia de S. cerevisiae y de las levaduras
Kloeckera fue evidente al producirse concentraciones considerables de acetaldehído, isobutanol,
alcohol isoamílico, 2-fenil etanol y acetato de etilo. La selección de levaduras se realizó a partir
del grupo en cultivo mixto que produjo la menor concentración de alcoholes superiores y
acetaldehído, seleccionándose el grupo uno formado por las cepas K. africana y S. cerevisiae.
Posterior a la selección de levaduras se caracterizó la composición aromática y sensorial de los

destilados procedentes de las fermentaciones en cultivo puro y mixto de K. africana y S.
cerevisiae. El análisis de compuestos mayoritarios mostró que los destilados de S. cerevisiae y el
cultivo mixto produjeron las mayores concentraciones de acetaldehído, acetato de etilo,
isobutanol y alcohol isoamílico que el destilado de K. africana que presentó la mayor
concentración de ácido acético, n-butanol y furfural; los compuestos analizados de los tres
destilados estuvieron dentro de los rangos límite establecidos por norma oficial del tequila.
Adicionalmente el análisis de compuestos minoritarios mostró que los destilados de S. cerevisiae
en cultivo puro y mixto generaron la mayor concentración de 4-penten-1-ol y 2-fenil etanol y el
destilado de K. africana presentó la mayor concentración de ácido hexanoico, ácido propanoico,
114
2-etil-1-hexanol, alcohol furfurílico, propianato de fenetilo, acetato de fenetilo, acetoína, 2-

acetylfuran y 5-metil furfural. En cultivo mixto la síntesis de compuestos volátiles presentó altas
concentraciones de 2-fenil etanol por efecto de S. cerevisiae y acetato de fenetilo por influencia
de K. africana. La evaluación sensorial de preferencia determinó diferencias significativas entre
los destilados, situando al destilado de S. cerevisiae con el mayor nivel de aceptación, pudiéndose
diferenciar claramente de los destilados de K. africana y el cultivo mixto, que fueron situados en
niveles similares de agrado (P > 0.05). Adicionalmente la evaluación “A” “No-A” terminó por
confirmar las diferencias entre los destilados, estableciendo que entre los destilados de K.
africana y S. cerevisiae no existen diferencias significativas, pero se encontraron diferencias
estadísticas entre el destilado de K. africana y el cultivo mixto. Las diferencias encontradas dan
evidencia del marcado efecto de la cepa empleada sobre la síntesis de compuestos volátiles y en
consecuencia sobre el bouquet de la bebida.
En el siguiente apartado se discute el efecto de algunos factores de crecimiento (vitaminas y

aminoácidos) adicionados al jugo de agave sobre la supervivencia y capacidad fermentativa y
aromática de K. africana (K1) durante la fermentación en cultivo puro y mixto con S.cerevisiae
(S1).
115
3.3 Efecto de ciertos factores de crecimiento sobre la supervivencia y capacidad

fermentativa de Kloeckera africana (K1) en cultivo puro y mixto con Saccharomyces
cerevisiae (S1).
Con el objetivo de estudiar el efecto de la adición de ciertos factores de crecimiento (vitaminas y

aminoácidos) al jugo de agave sobre la supervivencia y capacidad fermentativa de K. africana
(K1) durante la fermentación en cultivo puro y mixto con S.cerevisiae; se llevaron a cabo
fermentaciones a nivel matraz empleando el medio de cultivo optimizado por Valle-Rodríguez et
al. (2009), para cubrir este objetivo se utilizó el diseño experimental de la sección 2.5.2. El medio
consistió de jugo de agave a 100 ± 11 gL-1 de AR suplementado con tiamina, sulfato de amonio y
asparagina a una concentración de 570 µg L-1, 0.17 gL-1 y 1.56 gL-1 (medio reformulado)
respectivamente.
3.3.1. Análisis de las cinéticas de fermentación en cultivo puro y mixto en medio

reformulado
Los perfiles cinéticos de: formación de biomasa, unidades formadoras de colonias (UFC)
consumo de azúcares y producción de etanol en cultivo puro y mixto se muestran en la Figuras
3.8 y 3.9 respectivamente y los parámetros cinéticos en la Tabla 3.9. En la Figura 3.8 se observan
los perfiles cinéticos de las fermentaciones en medio reformulado en cultivo puro; por un lado S.
cerevisiae y K. africana en cultivo puro alcanzan la fase estacionaria en 20 h de fermentación con
concentraciones celulares de 410 y 160 × 106 UFC mL-1 respectivamente, reduciendo en un 5 y
22% su población celular a las 72 h de fermentación con concentraciones de 385 y 85.5 × 106
UFC mL-1 (Fig. 3.8). Por otro lado, en relación a la formación de biomasa, consumo de azúcares
y producción de etanol; se observa que S. cerevisiae presenta la mayor formación de biomasa con
valores de 6.8 gL-1 en 24 h de fermentación que K. africana que presenta una menor
concentración (3.25 gL-1); ambos cultivos consumieron los azúcares en 20 y 36 h de fermentación
y produjeron altas concentraciones de etanol (45.37 y 39.89 gL-1) respectivamente (Fig. 3.8). Se
observaron diferencias significativas en el cultivo mixto. S. cerevisiae y K. africana en cultivo
mixto alcanzaron la fase estacionaria en 20 h de fermentación con concentraciones celulares de
160 y 150 × 106 UFC mL-1 respectivamente. Se redujo en 19.43 y 68 % la población celular a las
72 h de fermentación con concentraciones de 123 y 47.5 × 106 UFC mL-1 para S. cerevisiae y K.
116
africana (Figura 3.9). De igual manera que en cultivo puro, S. cerevisiae en cultivo mixto con K.
africana mostraron altas concentraciones de biomasa y etanol (5.5 y 38.3 gL-1) y consumo total
de los azúcares del medio (Figura 3.9). Al comparar los parámetros cinéticos entre cultivos, se
observaron diferencias significativas (95% LSD). El cultivo puro de S. cerevisiae mostró la
mayor velocidad especifica de crecimiento máxima µmáx (0.328 h-1) que el cultivo puro de K.
africana y el cultivo mixto (0.22 y 0.168 h-1 respectivamente). Asimismo en relación a la máxima
velocidad especifica de consumo de sustrato máxima (qsmáx), el cultivo puro de S. cerevisiae
mostró mayor velocidad (8.02 g/g h-1) que el cultivo puro de K. africana y el cultivo mixto que
obtuvieron respectivamente 4.526 y 6.873 g/g h-1. Finalmente la máxima velocidad especifica de
producción de etanol (qsmáx) mostraron los mayores valores (6.219 y 5.298 g/g h-1) el cultivo puro
de K. africana y el cultivo mixto en comparación con el cultivo puro de S. cerevisiae (3.46 g/g h-
1) (Tabla 3.8). En relación a los rendimiento de biomasa (Yx/s) diferencias significativas fueron
observadas entre los tratamientos, obteniendo el cultivo puro de S. cerevisiae el mayor
rendimiento, mientras que para los rendimientos de etanol (Yp/s) no se encontraron diferencias
significativas entre cultivos (Tabla 3.8). Al comparar los resultados obtenidos con respecto al
medio basal se encontraron diferencias significativas. K. africana en cultivo puro en medio basal
presentó una baja capacidad fermentativa, debido al consumo incompleto de azúcares(> 40 gL-1),
la baja formación de biomasa y UFC (1.83 gL-1, < 10 × 106 UFC mL-1), así como de etanol (< 11
gL-1), posiblemente por una baja disponibilidad de nutrientes en el jugo de agave, ya que en
medio reformulado para esta misma levadura, se incrementó 1.2 veces la formación de biomasa,
4.27 veces la producción de etanol y 2.16 veces la viabilidad celular (UFC) en cultivo puro con
un consumo total de los azúcares (Figuras 3.2 y 3.8). Para S. cerevisiae en los dos medios
probados (basal y reformulado) en cultivo puro y mixto, se presentó en general una alta eficiencia
fermentativa.
117
500x106
A
6
400x10
UFC mL-1
300x106
200x106
100x106
0 10 20 30 40 50 60 70 80
120 8 50
B
Azucares reductores (gL-1)
100
40
6
Biomasa (gL-1)
80
Etanol (gL-1)
30
60 4
A 20
40
2
10
20
0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
120 5 50
C
100
4 40
Biomasa (gL-1)
80
Etanol (gL-1)
3 30
60
2 20
40
1 10
20
0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h)
Etanol
Azucares
Biomasa
Figura 3.8 Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFC (A), biomasa (●), azúcares reductores (▼) y etanol (■) de
las fermentaciones en cultivo puro empleando las levaduras S. cerevisiae
S1 S1 ( ) y K. africana K1 ( ). Las
-1
fermentaciones se realizaron a 12 ºBrix suplementando con sulfatoK1de amonio (0.17 gL-1), asparagina (1.56 gL ) y
-1
tiamina (570 µg L ). Los valores son las medias de los resultados obtenidos de dos fermentaciones. Las barras
verticales representan la desviación estándar de dos muestras.
118
180x106
160x106
A
140x106
120x106
100x106
UFC mL-1
80x106
60x106
40x106
20x106
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
120 7 50
6
B
100
40
5
Biomasa (gL-1)
80
Etanol (gL-1)
4 30
60
3 20
40
2
10
20 1
0 0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tiempo (h)

Figura 3.9 Perfiles cinéticos de: viabilidad celular en UFCBiomasa
(A), biomasa (●), azúcares reductores (▼) y etanol (■) de
las fermentaciones empleando las levaduras S. cerevisiae S1Azucares
( ) y K. africana K1 ( ) en cultivo mixto. Las
Etanol -1 -1
fermentaciones se realizaron a 12 ºBrix suplementando con sulfato de amonio (0.17 gL ), asparagina (1.56 gL ) y
-1
tiamina (570 µg L ), Los valores son las medias de los resultados obtenidos de dos fermentaciones. Las barras
K1
verticales representan la desviación estándar de dos muestras.
S1
119
Tabla 3.9 Comparación de los parámetros cinéticos para las diferentes cepas estudiadas en cultivo puro y mixto.
Cepa µ máx (h-1) qsmáx (g/g h-1) qpmáx (g/g h-1) Yx/s (g/g) Yp/s (g/g)
K1 a 0.22 ± 0.046 4.526 ± 0.64 6.219 ± 0.298 0.026 ± 0.001 0.393 ± 0.004
S1 b 0.328±0.048 8.02 ± 0.89 3.46 ± 0.054 0.059 ± 0.001 0.395 ± 0.005
K1+S1 c 0.168 ± 0.03 6.873 ± 1.351 5.298 ± 0.25 0.047 ± 0.004 0.343 ± 0.018
específica de producción de etanol máxima; Yx/s and Yp/s: rendimientos de biomasa y etanol; a Cultivo puro de K.
africana (K1); b Cultivo puro de S. cerevisiae (S1); c Cultivo mixto formado por K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1)
en medio reformulado. Cada valor representa el promedio ± la desviación estándar de dos fermentaciones.
Similares resultados han sido reportados por otros autores. Díaz-Montaño et al. (2010) estudiaron
el efecto de la adición de distintas fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico al jugo de agave
sobre las capacidades fermentativas de S. cerevisiae y K. africana en cultivo puro, encontrando
que S. cerevisiae es capaz de asimilar cualquier fuente de nitrógeno orgánico e inorgánico. K.
africana por su parte sólo es capaz de asimilar fuentes de nitrógeno orgánico como extracto de
levadura, aumentando con ello la capacidad fermentativa a valores similares a los de S. cerevisiae,
con concentraciones de biomasa de 3.20 gL-1, consumiendo de forma efectiva la fuente de
azúcares y alcanzando concentraciones de etanol superiores a los 35 gL-1; mostrando con ello que
el limitado crecimiento de esta levadura está asociado principalmente a la baja disponibilidad de
nutrientes en el jugo agave. Por otra parte Valle-Rodríguez et al. (2011) estudiaron las
necesidades nutricionales mínimas necesarias para lograr aumentar las capacidades fermentativas
de K. africana y la velocidad de la fermentación a valores cercanos a los obtenidos para S.
cerevisiae, optimizándose para ello el medio de cultivo con vitaminas, aminoácidos, y
oligoelementos, encontrando que esta levadura requiere de tiamina como vitamina, asparagina
como aminoácido y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno en concentraciones moderas
para estimular y favorecer su crecimiento.
Cabe resaltar que los resultados anteriores son la base del presente trabajo, el cual se enfoca en
analizar el efecto interactivo de las condiciones nutricionales y operacionales sobre la prevalencia
y la capacidad fermentativa de K. africana al trabajar en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae.
3.3.2 Análisis de los compuestos volátiles en mosto obtenidos en cultivo puro y mixto
Se evaluó la concentración de compuestos volátiles en mosto de las fermentaciones en medio

reformulado en cultivo puro y mixto. Los compuestos fueron: alcoholes superiores, acetaldehído
120
y algunos ésteres que constituyen el principal grupo de compuestos que producen el “bouquet de
la fermentación” (Benn & Peppard, 1996). La Tabla 3.10 muestra las concentraciones de
compuestos volátiles evaluados de las fermentaciones efectuadas en medio reformulado.
Diferencias significativas fueron encontradas entre las cepas en la concentración de acetaldehído,
acetato de etilo, isobutanol, acetato de isoamilo, alcohol isoamílico, hexanoato de etilo, octanoato
de etilo, decanoato de etilo, acetato de fenetilo y 2-fenil etanol (95% LSD). Por otro lado no se
encontraron diferencias significativas en la concentración de metanol, n-propanol y n-butanol
entre las cepas bajo las condiciones de estudio (95% LSD). Asimismo el cultivo puro de S.
cerevisiae presentó la mayor concentración de alcoholes superiores como alcohol isoamílico,
isobutanol y 2-fenil etanol que el cultivo puro de K. africana que produjo la mayor concentración
de acetaldehído, acetato de etilo y acetato de fenetilo (Tabla 3.10). El cultivo mixto presentó
concentraciones intermediadas de acetaldehído, acetato de etilo, acetato de isoamilo, hexanoato
de etilo, octanoato de etilo, decanoato de etilo, acetato de fenetilo, alcohol isoamílico y 2-fenil
etanol, pudiendo influir positivamente en el bouquet de la bebida al conferir aromas y sabores
únicos, debido al efecto interactivo de ambas cepas durante la fermentación. De igual manera que
los anteriores análisis efectuados a los compuestos volátiles producidos en los diferentes
tratamientos; los compuestos volátiles de los mostos obtenidos de las fermentaciones en cultivo
puro y mixto en medio reformulado con las levaduras K.africana y S.cerevisiae fueron agrupados
y separados en dos compontes principales (PCA) con una varianza explicada del 87.7% (Figura
3.10). Los compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: acetato de etilo y
acetato de fenetilo con pesos negativos y 2-fenil etanol, isobutanol, octanoato de etilo y acetato
isoamilo con pesos positivos. Mientras que para el PC-2 fueron: acetato de fenetilo con pesos
negativos y el metanol y acetaldehído con pesos positivos (Tabla 3.11). Comparando los
resultados de compuestos volátiles de las fermentaciones en medio reformulado para las cepas K.
africana, S. cerevisiae y el cultivo mixto contra aquellos obtenidos para las mismas cepas pero en
medio basal, diferencias significativas fueron encontradas (95%LSD). En medio basal el cultivo
puro de K. africana mostró una baja concentración de isobutanol, alcohol isoamílico, 2-fenil
etanol y acetaldehído, mientras que en medio reformulado presentó mayor concentración, debido
al efecto de los factores de crecimiento adicionados al medio de fermentación que lograron
incrementar la capacidad fermentativa de K. africana, sin embargo la concentración de acetato de
etilo y acetato de fenetilo en los dos medios fue alta, posiblemente a que es un compuesto
121
característico del metabolismo de esta cepa (Tabla 3.3 y 3.10). Por su parte para S. cerevisiae en
cultivo puro en los dos medios probados, al ser una levadura poco demandante de nutrientes y
con altas capacidades fermentativas, indistintamente del medio de fermentación, en todos los
tratamientos mostró altas concentraciones de isobutanol, alcohol isoamílico, 2-fenil etanol y
acetaldehído (Zironi et al., 1993; Díaz-Montaño et al., 2010). En medio basal el cultivo mixto
mostró concentraciones altas de isobutanol, alcohol isoamílico, 2-fenil etanol y acetaldehído,
debido al dominio de S. cerevisiae durante la fermentación (Tabla 3.3). Sin embargo a pesar del
corto periodo activo de K. africana durante la fermentación en cultivo mixto con S. cerevisiae en
medio basal se promovió la síntesis de acetato de etilo y acetato de fenetilo en concentraciones
considerables como para poder influir en la composición química del mosto. En medio
reformulado, el cultivo mixto presentó mayores concentraciones de n-propanol, acetato de etilo,
acetato de isoamilo y acetato de fenetilo que el cultivo mixto en medio basal debido a la mayor
prevalencia de K. africana durante la fermentación (Tabla 3.10).
Estudios previos han reportado similares resultados. Díaz-Montaño et al. (2008) efectuó
fermentaciones bajo condiciones similares a la realizadas en la industria tequilera (jugo de agave
suplementado con sulfato de amonio) encontrando bajo estas condiciones que las levaduras del
género Saccharomyces producen la mayor concentración de alcoholes superiores, acetaldehído y
algunos ésteres como el hexanoato de etilo en comparación con las levaduras del género
Kloeckera que produjeron una alta concentración de acetato de etilo, ácido acético, acetato de
fenetilo y n-butanol. Por otra parte Ugliano et al. (2010) sugirieron que el manejo de diferentes
concentraciones de fuentes de nitrógeno (fosfato diamónico en el rango de 200-400 mg L-1) en las
fermentaciones del jugo de uva así como el tipo de levadura, pueden ser herramientas poderosas
para modular y mejorar la composición aromática y sensorial de la bebida. Adicionalmente
reportaron que las variaciones en la concentración de fosfato diamónico (DAP), afectan la
formación de acetatos, etil ésteres de ácidos grasos, alcoholes superiores, sulfuro de hidrógeno,
mercaptano de etilo y mercaptano de metilo. Presentándose concentraciones altas de acetatos y
etil ésteres de ácidos grasos al aumentar la concentración de DAP (> 200 mg L-1), sin embargo
para los alcoholes superiores la concentración se redujo con el aumento de DAP. La carencia de
estos nutrientes en el medio de cultivo considerablemente reduce el crecimiento, la viabilidad
celular, el consumo de azúcares, la producción de etanol y los rendimientos de etanol y biomasa.
122
Las levaduras asimilan amonio para sintetizar glutamato y glutamina, que son utilizados como
precursores para otros aminoácidos y como compuestos clave en el metabolismo del nitrógeno y
carbono. Algunos aminoácidos (leucina, valina, isoleucina y treonina) siguen la ruta de Ehrlich
para ser convertidos en compuestos aromáticos (isobutanol, alcohol isoamílico, alcohol amílico y
n-propanol respectivamente), que participan activamente en el bouquet de las bebidas alcohólicas
(Díaz-Montaño et al., 2009). Asimismo además de las fuentes de nitrógeno y los factores de
crecimiento, otros reportes sugieren que el empleo de levaduras específicas como las no-
Saccharomyces del género Kloeckera puede ser significativo por la mayor producción de
compuestos volátiles que impactan sensorialmente como el acetato de etilo (frutal) y acetato de
fenetilo (rosas).
Tabla 3.10 Concentración de compuestos volátiles en mosto producidas por las levaduras Kloeckera africana (K1),
y Saccharomyces cerevisiae (S1) en cultivo puro y mixto.
Cultivo puro Cultivo mixto

-1
Compuestos (mg L ) K1 S1 K1+S1
Σ Aldehídos 130.40 ± 2.66 96.2 ± 5.88 54.72 ± 0.30
Acetaldehído* 130.40 ± 2.66 96.2 ± 5.88 54.72 ± 0.30
ΣAlcoholes 67.37 ± 3.01 71.17 ± 1.00 63.07 ± 0.78
Metanol 67.37 ± 3.01 71.17 ± 1.00 63.07 ± 0.78
Σ Alcoholes superiores 150.42 ± 6.49 292.09 ± 6.45 187.5 ± 6.84
n-Propanol 34.39 ± 1.49 37.84 ± 4.33 37.12 ± 0.58
n-Butanol 0.64 ± 0.05 0.68 ± 0.02 0.66 ± 0.02
Isobutanol* 34.39 ± 1.48 58.92 ± 0.47 37.29 ± 0.40
Alcohol isoamílico* 62.60 ± 2.74 158.14 ± 1.66 86.91 ± 2.33
2-Fenil etanol* 18.40 ± 0.80 36.51 ± 0.03 25.5 ± 3.51
Σ Ésteres 96.27 ± 3.874 15.24 ± 1.272 62.18 ± 0.218
Acetato de etilo* 90.23 ± 3.75 13.79 ± 1.13 59.55 ± 0.12
Acetato de isoamilo* 0.10 ± 0.002 0.25 ± 0.02 0.20 ± 0.002
Hexanoato de etilo * nd 0.06 ± 0.001 0.03 ± 0.003
Octanoato de etilo * nd 0.04 ± 0.001 0.01 ± 0.002
Acetato de fenetilo* 5.91 ± 0.12 0.99 ± 0.09 2.39 ± 0.09
Decanoato de etilo* 0.03 ± 0.002 0.11 ± 0.03 0.05 ± 0.001
*: Compuestos con diferencias significativas entre cepas en cultivo puro y mixto; cada valor representa el promedio
± de dos determinaciones. nd: no detectado. Alcohol isoamílico: suma de alcoholes amílico activo e isoamílicos. K1:
cultivo puro de K. africana; S1: cultivo puro de S. cerevisiae K1+S1: cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae.
.
123
acet
0.60 A
0.50
met
0.40 Cepa de K. africana
0.30
Cepa de S. cerevisiae
0.20
isob
0.10 dec etil
p[2]
ac etil alc isom

0.00 oct etil
-0.10 alc fen

prop
hex etil
-0.20 but
Cultivo mixto ac isom
-0.30
-0.40
ac fen
-0.50
-0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30
p[1]
6
B
2
K1 K1
S1
S1
0
t[2]
-2 M1
M1
-4
-6
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
t[1]

Figura 3.10. PCA de (A) compuestos volátiles y (B) las cepas de levaduras en cultivo puro (K1R, S1R) y mixto
(M1R) en medio reformulado. acet: acetaldehído; met: metanol; ac-etil: acetato de etilo; hex-etil: hexanoato de etilo;
oct-etil: octanoato de etilo; dec-etil: decanoato de etilo; prop: n-propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-iso:
alcohol isoamílico; alc-fen: 2-fenil etanol; ac-isom: acetato de isoamilo y acet-fen: acetato de fenetilo. K1: cultivo
puro de K. africana; S1: cultivo puro de S. cerevisiae K1+S1: cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae
124
PC1 PC2
Acetato de etilo -0.3289 Acetato de fenetilo -0.4528
Acetato de fenetilo -0.2294 Acetato de isoamilo -0.2329
Acetaldehído -0.0899 n-Butanol -0.1877
n-Butanol 0.1789 Hexanoato de etilo -0.1620
n-Propanol 0.1862 n-Propanol -0.1369
Metanol 0.2044 2-Fenil etanol -0.1234
Acetato de isoamilo 0.3094 Octanoato de etilo 0.0012
Hexanoato de etilo 0.3159 Acetato de etilo 0.0515
Decanoato de etilo 0.3175 Alcohol isoamílico 0.0534
2-Fenil etanol 0.3238 Decanoato de etilo 0.0915
Isobutanol 0.3246 Isobutanol 0.1443
Octanoato de etilo 0.3261 Metanol 0.4753
Acetato de isoamilo 0.3314 Acetaldehído 0.6203
3.4 Caracterización de los compuestos volátiles en destilados obtenidos con las levaduras
de estudio S. cerevisiae (S1) y K. africana (K1) en cultivo puro y mixto en medio
reformulado
De igual manera que en la sección 3.2; se llevaron a cabo fermentaciones en cultivo puro y mixto
con las levaduras Kloeckera africana (K1) y Saccharomyces cerevisiae (S1) a nivel piloto
(reactor de 14 L) empleando el medio de fermentación reformulado. Las fermentaciones se
efectuaron bajo condiciones anaeróbicas de crecimiento a 250 rpm y 30ºC y los mostos de cada
fermentación se destilaron. Dado que en la sección 3.1 y 3.3 se observó que el patrón de
producción de compuestos volátiles en mosto para S. cerevisiae (S1) en medio basal y
reformulado es muy similar y se inclina en su mayoría a la producción de alcoholes superiores y
acetaldehído, se decidió omitir su realización de las fermentaciones a nivel piloto (reactor de 14
L); caracterizándose aromáticamente sólo los destilados de las fermentaciones del cultivo puro
de K. africana (K1) y el cultivo mixto de ambas levaduras (K1+S1). Los compuestos
mayoritarios regulados por norma se analizaron por cromatografía de gases (CG-FID) y los
compuestos minoritarios por (CG-MS). Para cubrir este objetivo se implementó el diseño
multifactorial de la sección 2.5.2.
125
3.4.1 Análisis de compuestos volátiles mayoritarios
Los compuestos mayoritarios de los destilados del cultivo puro de K. africana (K1) y del cultivo
mixto (K1+S1) se muestran en la Tabla 3.12. El análisis de rangos múltiples (95% LSD)
determinó diferencias significativas entre los destilados de K. africana y el cultivo mixto en la
concentración de todos los compuestos volátiles evaluados, con excepción del lactato de etilo y
metanol. El destilado del cultivo puro de K. africana produjo la mayor concentración de ácido
acético, n-butanol y n-propanol que el destilado del cultivo mixto (K1+S1), que presentó altas
concentraciones de acetaldehído, acetato de etilo, isobutanol, alcohol isoamílico y furfural (Tabla
3.12). Los resultados de este estudio confirman que las principales diferencias entre los destilados,
son debidas al tipo de levadura empleada y a la composición del medio de cultivo (Romano et al.,
2003., Díaz-Montaño et al., 2008). Es interesante observar el efecto de la composición del medio
y del tipo de cultivo sobre la síntesis de compuestos volátiles, debido a que para una misma cepa
(K. africana) pero en medios de fermentación diferentes, la generación de compuestos volátiles
resultó modificada, inclinándose en un medio reformulado a producir altas concentraciones de
ésteres como acetato de etilo y lactato de etilo, alcoholes superiores como n-propanol, n-butanol
y alcohol isoamílico y acetaldehído y en un medio basal sólo a producir concentraciones altas de
ácido acético y furfural (Tabla 3.5 y 3.12). Estas diferencias son debidas como ya se había
mencionado a la composición del medio cultivo, que lograron incrementar la capacidad
fermentativa y aromática de K. africana. Asimismo un patrón semejante es observado con el
cultivo mixto, donde en medio basal el destilado se inclinó a producir como S. cerevisiae altas
concentraciones de n-propanol, isobutanol, alcohol isoamílico y acetaldehído, debido al mayor
dominio de S. cerevisiae durante la fermentación, por el contrario en medio reformulado el
destilado del cultivo mixto se caracterizó por producir además de isobutanol, alcohol isoamílico y
acetaldehído, altas concentraciones ácido acético, acetato de etilo y lactato de etilo (Tabla 3.5 y
3.12), posiblemente por la mayor prevalencia de K. africana durante la fermentación,
modificando de esta forma la composición química de la bebida y por tanto sus características
aromáticas y sensoriales. La concentración de compuestos volátiles mayoritarios de los destilados
en medio reformulado, se situaron dentro de los rangos permisibles establecidos por la norma
oficial del tequila, con excepción del acetaldehído del destilado del cultivo mixto que sobrepaso
los límites máximos (> 40 mg/100 mL de alcohol anhidro), debido posiblemente al efecto de S.
126
cerevisiae durante la fermentación en cultivo mixto y aun menor corte de cabezas durante la
destilación.
Tabla 3.12: Concentración de compuestos volátiles mayoritarios producidos por K. africana (K1) y S. cerevisiae
(S1) en cultivo puro y mixto.
Compuestos Cultivo puro Cultivo Mixto Límite
(mg/100 mL de alcohol anhidro) K1 K1+S1 NOMa

Σ Aldehídos 25.23 ± 0.58 99.14 ± 5.94 0 - 40
Acetaldehído* 25.23 ± 0.59 99.14 ± 5.94
Σ Ácidos orgánicos 29.86 ± 2.63 13.83 ± 0.90 Cn
Ácido acético* 29.86 ± 2.63 13.83 ± 0.90
Σ Ésteres 35.68 ± 1.65 96.74 ± 5.29 2 – 200
Acetato de etilo* 30.46 ± 1.51 91.72 ± 5.23
Lactato de etilo 5.22 ± 0.19 5.03 ± 0.07
Σ Alcoholes 118.22 ± 0.97 120.28 ± 4.41 30 – 300
Metanol 118.22 ± 0.97 120.28 ± 4.41
Σ Alcoholes superiores 383.28 ± 0.69 415.12 ± 4.84 20 - 500
n-Propanol* 78.43 ± 0.09 24.78 ± 1.98
Isobutanol* 35.65 ± 0.02 56.83 ± 1.14
n-Butanol* 8.34 ± 0.20 0.12 ± 0.17
Isoamil y amil alcoholes* 142.40 ± 0.27 212.93 ± 2.01
Σ Furfural* 2.70 ± 0.23 3.91 ± 0.93 0-4
*: Compuestos con diferencias significativas entre grupos; Cn: compuesto no incluido en la norma oficial del
Tequila. a: NOM: NMX-V-005-NORMEX-2005. Alcohol isoamílico: suma de alcohol amílico activo e isoamílico.
K1: destilado del cultivo puro de K. africana. K1+S1: destilado del cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae.
Cada valor representa el promedio ± de dos determinaciones.
127
Los dos destilados y sus compuestos volátiles fueron agrupados por el PCA en dos componentes
principales con una varianza explicada del 95.1% (Figura 3.11). Los destilados fueron
claramente distinguidos el uno del otro, siendo marcados por definidas locaciones en la Figura
3.11-B. Los compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: n-butanol, n-
propanol y ácido acético con pesos negativos y acetato de etilo, isobutanol, alcohol isoamilícos y
acetaldehído con pesos positivos. Mientras que para el PC-2 fueron: furfural con pesos negativos
y el lactato de etilo y metanol con pesos negativos (Tabla 3.13). La gran variabilidad observada
entre los destilados en cultivo puro y mixto además del tipo de levadura empleada y la
composición del medio, es debida a la materia prima y a las condiciones de fermentación y
destilación. Sin embargo, las levaduras y las condiciones de fermentación han sido señalados
como los factores que más influencia tienen sobre el sabor y aroma de las bebidas alcohólicas,
debido a que la mayoría de los compuestos volátiles son formados durante la fermentación
alcohólica (Oliveira et al., 2005; Romano et al., 2003; Arellano et al., 2008; Díaz-Montaño et al.,
2008).
128
met
0.70 A
0.60 lact-et
0.50 Destilado de Cultivo Mixto
0.40 Destilado de K.africana
0.30
p[2]
0.20
0.10 acet-et
alc-isom
0.00 prop acet
but isob
acet-ac
-0.10
-0.20
-0.30 furf
-0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30

p[1]
6
B
4
2
M1
K1
0
t[2]
K1
M1
-2
-4
-6
-10 0 10
t[1]
Figura 3.11 PCA de (A) compuestos volátiles y de los (B) destilados obtenidos del cultivo puro de (K1) K.africana
y del cultivo mixto (M1) en medio reformulado. acet: acetaldehído; met: metanol; acet-ac: ácido acético; prop: n-
propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-isom: alcohol isoamílico; acet-et: acetato de etilo; lac-et: lactato de
etilo y furf: furfural. K1: destilado del cultivo puro de K. africana. K1+S1: destilado del cultivo mixto de K.
africana y S. cerevisiae.
129
Tabla 3.13: PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada para cada componente
PC1 PC2
Varianza explicada (%) 85 Varianza explicada (%) 10.1
n-Butanol -0.3429 Furfural -0.2961
n -Propanol -0.3428 Ácido acético -0.0393
Ácido acético -0.3425 n-Butanol -0.0267
Lactato de etilo -0.2039 Isobutanol -0.0176
Metanol 0.2009 n-Propanol -0.0038
Furfural 0.3110 Acetaldehído 0.0092
Acetato de etilo 0.3419 Alcohol isoamílico 0.0485
Isobutanol 0.3424 Acetato de etilo 0.0774
Alcohol isoamílico 0.3426 Lactato de etilo 0.5932
Acetaldehído 0.3428 Metanol 0.7413
3.4.2 Análisis de compuestos volátiles minoritarios
La Tabla 3.14 muestra la concentración de compuestos volátiles minoritarios presentes en el

destilado del cultivo puro de K. africana y el destilado del cultivo mixto. El análisis de rangos
múltiples (95%LSD) determinó diferencias significativas entre los destilados en la concentración
de todos los compuestos analizados, con excepción del ácido propanoico y alcohol furfurílico
(Tabla 3.14). El destilado del cultivo puro de K. africana presentó la mayor concentración de
ácido octanoico, ácido decanoico, ácido hexadecanoico, 4-penten-1-ol, 3-etoxipropan-1-ol,
levulinato de etilo, decanoato de etilo, acetato de fenetilo, 9-hexadecenoato de etilo, 5-metil
furfural, acetoína, 1-hidroxy-2-propanona, cis-óxido de linalol, α-terpineol y trans-nerolidol que
el destilado del cultivo mixto que mostró la mayor concentración de 3-fenilpropanal, 2-fenil
etanol, propionato de fenetilo, dodecanoato de etilo, hexadecanoato de etilo y 2-acetil furan
(Tabla 3.14). Nuevamente, las principales diferencias entre los destilados son debidas al medio de
fermentación, al tipo de cultivo, a las condiciones de fermentación y destilación. Sin embargo, a
diferencia de los compuestos mayoritarios, en los compuestos volátiles minoritarios resultan
mayores las diferencias entres los destilados del cultivo puro de K. africana y el cultivo mixto,
debido a las características fisiológicas y metabólicas de las cepas participantes (S. cerevisiae y K.
africana) y a su interacción durante la fermentación (Ciani et al., 2010). Al comparar la síntesis
130
de compuestos volátiles entre destilados en diferentes medios de fermentación, diferencias

significativas fueron observadas (95% LSD). Los destilados del cultivo puro de K. africana en
medio basal y reformulado presentaron altas concentraciones de acetato de fenetilo, 5-metil
furfural y acetoína (Tablas 3.7 y 3.14). Compuestos característicos de las levaduras del género
Kloeckera con excepción del 5-metil furfural (Díaz-Montaño et al., 2008). Para el destilado del
cultivo mixto en medio basal y reformulado produjo altas concentraciones de 2-fenil etanol y
acetato de fenetilo, presentándose las mayores concentraciones en medio reformulado (Tabla
3.14), debido posiblemente la mayor dominio de K. africana y S. cerevisiae durante la
fermentación.
131
Tabla 3.14: Concentración de compuestos volátiles minoritarios producidos por los destilados de K. africana (K1) y
S.cerevisiae (S1) en cultivos puros y mixtos
Compuestos Cultivo puro Cultivo mixto

(mg/100 mL de alcohol anhidro) K1 K1+S1
Σ Ácidos orgánicos 1.42 ± 0.17 0.6 ± 0.03
Ácido propanoico 0.14 ± 0.01 0.10 ± 0.01
Ácido octanoico* 0.67 ± 0.12 0.24 ± 0.01
Ácido decanoico* 0.37 ± 0.02 0.26 ± 0.01
Ácido hexadecanoico* 0.25 ± 0.02 nd
Σ Alcoholes 9.72 ± 0.16 21.99 ± 2.4
3-Fenilpropanal* nd 0.13± 0.02
4-Penten-1-ol* 0.88 ± 0.01 0.78 ± 0.03
3-Etoxipropan-1-ol* 0.27 ± 0.04 nd
2-Etil-1-hexanol* 0.20 ± 0.01 0.17 ± 0.03
2-Fenil etanol* 7.88 ± 0.09 20.33 ± 2.22
Alcohol furfurílico 0.48 ± 0.01 0.69 ± 0.12
Σ Ésteres 17.43 ± 0.57 9.5 ± 0.43
Propionato de fenetilo* nd 0.10 ± 0.02
Levulinato de etilo* 0.12 ± 0.01 nd
Decanoato de etilo* 7.81 ± 0.25 0.17 ± 0.02
Dodecanoate de etilo* nd 0.22 ± 0.01
Acetato de fenetilo* 9.18 ± 0.29 8.68 ± 0.36
Hexadecanoato de etilo* 0.15 ± 0.01 0.24 ± 0.01
9-Hexadecenoato de etilo* 0.17 ± 0.01 0.09 ± 0.01
Σ Furanos 6.57 ± 0.13 3.54 ± 0.25
2-Acetil furan* 0.13 ± 0.01 0.29 ± 0.01
5-Metil furfural* 6.45 ± 0.12 3.58 ± 0.24
Σ Cetonas 6.35 ± 0.07 3.41 ± 0.04
Acetoína* 5.84 ± 0.01 3.41 ± 0.04
1-Hidroxy-2-propanona* 0.51 ± 0.06 nd
Σ Terpenos 0.3 ± 0.065 0.13 ± 0.011
cis −Óxido de linalol* 0.09 ± 0.001 0.05 ± 0.01
α −Terpineol 0.15 ± 0.06 0.11 ± 0.001
trans-Nerolidol* 0.06 ± 0.004 nd
*: Compuestos con diferencias significativas entre destilados. nd: no detectado. Alcohol isoamílico: suma de
alcoholes amílico activo e isoamílico. K1: destilado del cultivo puro de K. africana. K1+S1: destilado del cultivo
mixto de K. africana y S. cerevisiae. Cada valor representa el promedio ± de dos determinaciones.
132
Estudios similares han sido llevados a cabo previamente. Oliveira et al. (2005) estudió el efecto
de utilizar diferentes géneros de levaduras (seis cepas de S. cerevisiae y una de cada cepa de C.
apícola, H. occidentalis, P. subpelliculosa y S. pombe) sobre la composición y calidad sensorial
de diferentes destilados de cachaça producidos a escala piloto. Encontrando variaciones en la
concentración de los compuestos secundarios entre destilados, sin embargo estas variaciones no
resultaron significativas (P< 0.05) sobre los atributos sensoriales de olor, aroma e impresión
general. El destilado obtenido de S. pompe fue el más desagradable y considerado inadecuado
para la producción de cachaça. Sin embargo, los otros destilados resultaron adecuados para la
producción de cachaça, debido a que resultaron con atributos positivos en la evaluación sensorial.
Los compuestos minoritarios producidos por los destilados del cultivo puro y mixto de
K.africana y S. cerevisiae fueron separados en dos componentes principales (PCA) con una
varianza explicada del 95.5% (Tabla 3.15 y Figura 3.12). Los compuestos con mayor peso sobre
el componente PC-1 fueron: dodecanoato de etilo y hexadecanoato de etilo con pesos negativos y
el 5-metil furfural, decanoato de etilo, trans-nerolidol con pesos positivos. Mientras que para el
PC-2 fueron: ácido propanoico con pesos negativos y acetato de fenetilo, 2-etil-1-hexanol y 2-
fenil etanol con pesos positivos (Tabla 3.15).
133
Destilado de Cultivo Mixto Destilado de K. africana
6 B
A
4
2
M1
K1
0
t[2]
K1
M1
-2
-4
-6
-30 -20 -10 0 10 20 30

t[1]
Figura 3.12 PCA de (A) compuestos volátiles y de los (B) destilados obtenidos del cultivo puro de (K1) K.africana
y del cultivo mixto (M1) en medio reformulado. prop-ac: ácido propanoico, oct-ac: ácido octanoico, dec-ac: ácido
decanoico, hexdec-ac: ácido hexadecanoico, 3-fen-prop: 3-fenilpropanal, 4-pent-o: 4-penten-1-ol, et-prop: 3-
etoxipropan-1-ol, etil-hex: 2-etil-1-hexanol, fen-alc: 2-fenil etanol, fur-alc: alcohol furfurílico, fen-prop: propionato
de fenetilo, lev-et: levulinato de etilo, dec-et: decanoato de etilo, dod-et: dodecanoate de etilo, dec-9-et: 9-decenoato
de etilo, fen-acet: acetate de fenetilo, hexdec-et: hexadecanoato de etilo, hexdec-9-et: 9-hexadecenoato de etilo, acet-
fur: 2-acetil furan, 5mf: 5-metil-furfural, acet: acetoína, 1-hid-2-prop: 1-hidroxy-2-propanona, lin-oxd: cis-óxido de
linalol, terp: α−terpineol y nerol: trans-nerolidol. K1: destilado del cultivo puro de K. africana. K1+S1: destilado del
cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae.
134
Tabla 3.15: PCA factor loadings de los compuestos volátiles y su varianza explicada para cada componente
PC1 PC2
Dodecanoato de etilo -0.21588 Ácido propanoico -0.35468
Hexadecanoato de etilo -0.21552 Ácido octanoico -0.11931
2-Acetil furan -0.21485 Propionato de fenetilo -0.11804
Propionato de fenetilo -0.21227 1-Hidroxy-2-propanona -0.082289
2-Fenil etanol -0.21103 Levulinato de etilo -0.078059
3-Fenilpropanal -0.21067 Ácido hexadecanoico -0.073698
Alcohol furfurílico -0.18478 Hexadecanoato de etilo -0.052128
α−terpineol 0.11981 Ácido decanoico -0.041343
2-Etil-1-hexanol 0.1514 Decanoato de etilo -0.02751
Acetato de fenetilo 0.16606 trans-Nerolidol -0.01535
Ácido propanoico 0.19394 5-Metil-furfural -0.0086409
Ácido octanoico 0.20487 Dodecanoate de etilo 0.007543
4-penten-1-ol 0.2087 3-Etoxipropan-1-ol 0.013759
Ácido decanoico 0.2107 Acetoína 0.038434
cis-Óxido de linalol 0.21139 2-Acetil furan 0.077527
1-Hidroxy-2-propanona 0.21347 9-Hexadecenoato de etilo 0.088343
Levulinato de etilo 0.21383 2-Fenil etanol 0.16595
Ácido hexadecanoico 0.21417 cis-Óxido de linalol 0.16835
9-Hexadecenoato de etilo 0.21465 3-Fenilpropanal 0.1734
3-Etoxipropan-1-ol 0.2147 4-Penten-1-ol 0.20248
Acetoína 0.21537 α−terpineol 0.25008
trans-Nerolidol 0.21583 Alcohol furfurílico 0.39789
Decanoato de etilo 0.21593 2-Etil-1-hexanol 0.44157
5-Metil-furfural 0.21605 Acetato de fenetilo 0.51373
135
3.4.3 Conclusiones
Las cinéticas de fermentación de K. africana en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae fueron
examinadas en medio reformulado. Los resultados mostraron que K. africana en cultivo puro y
mixto con S. cerevisiae, es capaz de sobrevivir y aumentar su capacidad fermentativa por mayor
tiempo durante la fermentación, cuando el medio no es limitante en nutrientes. Incrementando 1.2
veces la formación de biomasa, 2.16 y 15 veces la viabilidad celular (UFC), reduciendo un 22 y
68% la población celular en cultivo puro y mixto al final de la fermentación y aumentando 4.24
veces la producción de etanol con un completo consumo de azúcares en comparación con las
fermentaciones efectuadas en medio basal. Con estos resultados, se confirma que el limitado
crecimiento de K. africana, esta asociado principalmente con la baja disponibilidad de nutrientes
en el medio de cultivo. El aumento en la capacidad fermentativa de K. africana, influyó
considerablemente sobre la síntesis de compuestos volátiles, debido al incremento en la
concentración de alcoholes superiores y acetaldehído, sin embargo no se dejaron de lado las
características propias de esta levadura como son alta producción de acetato de etilo y acetato de
fenetilo.
En relación a S. cerevisiae en cultivo puro y mixto presentó una alta eficiencia fermentativa,
mostrando altas concentraciones de biomasa, etanol, alcoholes superiores y acetaldehído y un
total consumo de azúcares, confirmando de esta manera la alta capacidad fermentativa
previamente reportada.
Diferencias significativas fueron encontradas en la concentración de los compuestos volátiles
sintetizados por K. africana en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae, debidas al efecto del tipo
de cepa, los nutrientes del medio de cultivo, al tipo de cultivo y a las condiciones de fermentación
y destilación. Mostrando el destilado de K. africana altas concentraciones de ácido acético, n-
butanol, n-propanol, ácido octanoico, decanoato de etilo, 5-metil furfural, acetoína y acetato de
fenetilo y el destilado del cultivo mixto altas concentraciones de acetaldehído, acetato de etilo,
isobutanol, alcohol isoamílico, furfural, 2-fenil etanol y acetato de fenetilo.
En el siguiente capitulo se examinará el efecto de las condiciones operacionales y nutrimentales
sobre las capacidades fermentativas y aromáticas de K. africana en la fermentación en cultivo
mixto con S. cerevisiae en sistema en continuo.
136
3.5 Efecto de las condiciones operacionales y nutrimentales sobre la supervivencia,

capacidad fermentativa y aromática de Kloeckera africana (K1) al trabajar en cultivo mixto
con Saccharomyces cerevisiae (S1) en cultivo continuo.
Con el objetivo de seleccionar las condiciones operacionales y nutrimentales que permitieran

obtener la mayor prevalencia y capacidad fermentativa de K. africana (K1) al trabajar en cultivo
mixto con S. cerevisiae (S1), así como un equilibrado perfil aromático en mosto y producto, se
llevaron a cabo fermentaciones en continuo siguiendo el diseño experimental que se presenta en
la sección 2.5.3 de procedimiento y método.
A continuación se resumen y discuten, los resultados de los efectos de cada uno de los factores
estudiados sobre las capacidades fermentativas y aromáticas de K. africana (K1) al trabajar en
cultivo mixto con S. cerevisiae (S1).
3.5.1 Efecto de las condiciones nutrimentales y operacionales sobre las capacidades

fermentativas de Kloeckera africana (K1) al trabajar en cultivo mixto con Saccharomyces
cerevisiae (S1) en cultivo continuo.
El efecto del medio de fermentación, la temperatura y el oxígeno sobre las capacidades

fermentativas de K. africana (K1) al trabajar en cultivo mixto con S. cerevisiae (S1) fueron
examinados. Se utilizaron dos medios de fermentación diferentes, los cuales consisten de: a)
Medio basal, suplementado con sulfato de amonio a una concentración de 1 gL-1, b) Medio
reformulado, suplementado con tiamina, asparagina y sulfato de amonio a una concentración de
570 µg L-1, 0.17 gL-1 y 1.56 gL-1 respectivamente. Se probaron dos condiciones de oxígeno 0 y
0.03 vvm y se utilizaron dos condiciones de temperatura 25 y 35ºC. En total se analizó el efecto
de nueve condiciones, incluyendo el punto central del diseño experimental que se efectuó a 30ºC,
0.015 vvm y empleando un medio de cultivo formulado a 0.585 gL-1 de sulfato de amonio, 285
µg L-1 de tiamina y 0.78 gL-1 de asparagina. Las condiciones estudiadas en base al diseño
experimental se muestran en la Tabla 3.15. Las fermentaciones se realizaron a nivel laboratorio
empleando el sistema ilustrado en la Figura 2.6.
137
Tabla 3.16 Condiciones experimentales y factores estudiados en la fermentación en continuo de K. africana (K1) en
cultivo mixto con S. cerevisiae (S1).
Condición Temperatura Oxígeno Medio de Fermentación

1 35 0 Medio reformulado
2 35 0.03 Medio reformulado
3 25 0.03 Medio reformulado
4 25 0 Medio reformulado
5 35 0 Medio basal
6 35 0.03 Medio basal
7 25 0.03 Medio basal
8 25 0 Medio basal
9 30 0.015 Medio reformulado + Medio basal
En la Figura 3.13 se muestran los perfiles cinéticos de formación de biomasa, unidades

formadoras de colonia (UFC), consumo de azúcares y producción de etanol y en las Tablas 3.17,
3.18 y 3.19 la concentración final de sustratos, producción de metabolitos y parámetros cinéticos
obtenidos de las fermentaciones en continuo efectuadas con K. africana (K1) en cultivo mixto
con S. cerevisiae (S1). El pH no fue controlado durante todo el cultivo en ninguna de las
condiciones estudiadas, debido a que de acuerdo con Hernández-Cortés et al. (2009) su variación
no repercute de forma significativa sobre la capacidad fermentativa de las levaduras involucradas
en la fermentación, siempre que el pH se sitúe en el rango de 2.5 a 4. Durante las condiciones
examinadas, en medio reformulado (condiciones 1 - 4), el pH del medio estuvo dentro del rango
de 3.75 - 3.86, en medio basal (condiciones 5-8) en el rango de 3.28 - 3.39 y en la condición 9 el
pH se situó en 3.54, manteniéndose en todo momento ácido con fluctuaciones mínimas entre
condiciones (Tablas 3.17 y 3.18).
Primeramente el reactor fue operado en cultivo por lote durante las primeras 14 h de
fermentación, tiempo después del cual las bombas de alimentación y extracción de medio fueron
activadas para dar inicio al cultivo en continuo, debido a que en este momento la actividad
metabólica de los microorganismo aún es alta (fase exponencial). Antes de entrar a estado
estacionario el cultivo, éste experimentó un estado transciente, donde el microorganismo se
adapta al nuevo sistema y al aumento en la concentración de sustrato. Al terminar este estado, la
velocidad de crecimiento celular iguala a la de la pérdida de células por el flujo de salida,
alcanzando en este punto el estado estacionario, donde la concentración de biomasa permanece
138
constante.
7 120 100
A
6
100
80
5
80
Biomasa (g L-1)
60
Etanol (g L-1)
4
60
3
40
40
2
20
20
1
0 0 0
1010
B
109
UFC mL-1
108
107
5τ 5τ 5τ 5τ 5τ 5τ 5τ 5τ 5τ
106
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Tiempo (h)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 CND
Azucares
Figura 3.13 Perfiles cinéticos (A y B) de: viabilidad celularEtanol
en UFC, biomasa (●), azúcares reductores (▼) y etanol
Biomasa
(■) de las fermentaciones en continuo en cultivo mixto empleando
S1 las levaduras S. cerevisiae S1 ( ) y K. africana
K1 ( ). Las fermentaciones se realizaron a 12 ºBrix (100 ±K111 gL-1 Azúcares reductores) y D = 0.04 h-1, probando
nueve condiciones de cultivo (CND) en medio reformulado (condiciones 1, 2, 3, 4) y medio basal (condiciones 5, 6,
7, 8), así como la condición en el punto al centro (condición 9). Los datos representan el promedio ± la desviación
estándar de tres muestras (3τ) para el etanol y cinco muestras (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada
condición de cultivo. τ = 25 h.
139
Para alcanzar el estado estacionario del cultivo, cinco tiempos de residencia fueron establecidos
en cada condición de fermentación. Las fermentaciones se efectuaron a una tasa de dilución
constante (D = 0.04h-1), debido a que en esta condición de acuerdo con Valle-Rodríguez et al.
(2011), K. africana presenta la mejor estabilidad y eficiencia fermentativa en comparación a las
fermentaciones efectuadas con tasas de dilución mayores (> 0.04h-1), mientras que para S.
cerevisiae la tasa de dilución resultó ser menor a las reportadas como óptimas para esta levadura
(Moran-Marroquí et al., 2011).
Durante el cultivo mixto de K. africana con S. cerevisiae, los cambios de temperatura, oxígeno y
el medio de fermentación mostraron tener un efecto significativo sobre la producción de biomasa
y UFC (P< 0.05). Encontrándose la mayor concentración de biomasa y UFC en la tercera
condición a 25ºC y 0.03 vvm en medio reformulado (Tabla 3.17). Durante esta condición la
concentración de biomasa fue de 5.85 gL-1 y de UFC para S. cerevisiae de 7855 × 106 UFC mL-1
y para K. africana de 1057.53 × 106 UFC mL-1 respectivamente (Tabla 3.17). Sin embargo a
pesar de que durante esta condición se aumentó significativamente la viabilidad y prevalencia de
K. africana, la concentración alcanzada en UFC fue menor a la obtenida para S. cerevisiae
posiblemente por efecto de otros factores que no son estudiados en este trabajo. Algunos estudios
han reportado que la muerte de las levaduras no-Saccharomyces en la fermentación en cultivo
mixto con S. cerevisiae está asociado además de los factores estudiados en este estudio, a otros
más. Como por ejemplo, Pérez-Nevado et al. (2003) reportó que la muerte de H. guillermondii y
H. uvarum en la fermentación por lote en cultivo mixto con S. cerevisiae, es debida a la presencia
de compuestos tóxicos (además del etanol) producidos por S. cerevisiae y Nissen & Arneborg
(2003) por su parte determinó que la detención del crecimiento de K. thermotolerans y T.
delbrueckii en la fermentación en cultivo mixto con S. cerevisiae se debe a un mecanismo de
contacto entre célula y célula en presencia de altas concentraciones celulares de S. cerevisiae.
Aunque pareciera que estas explicaciones aclaran parte de estos fenómenos, se requiere más
investigación en relación a los mecanismos implicados. Asimismo, hasta el momento la mayoría
de los estudios de fermentaciones en cultivo mixto han sido realizados en cultivo por lote, donde
el microorganismo experimenta diferentes estados fisiológicos y por tanto su respuesta a las
diferentes condiciones a lo largo de la fermentación es muy cambiante. Por el contrario en las
fermentaciones en cultivo continuo, debido a que el microorganismo experimenta un mismo
estado fisiológico, es posible asociar causa-efecto y asegurar en todo momento el 100% de
140
viabilidad celular. Cabe resaltar que a pesar de que la concentración celular (UFC) para K.
africana fue menor a la obtenida para S. cerevisiae, la concentración alcanzada resultó
significativa, y deja en evidencia el importante efecto de la temperatura, el oxígeno y el medio de
fermentación sobre la capacidad fermentativa de K. africana. Estudios previos efectuados en
cultivo por lote y continuo han observado similares resultados. Nagodawithana et al. (1974)
estudiaron el efecto del oxígeno disuelto (DO), la temperatura y la concentración de azúcar sobre
la viabilidad celular de S. cerevisiae en cultivo continuo. Encontrando que bajo condiciones de
aerobiosis (13% DO), altas concentraciones de azúcar (25ºBx) y bajas temperaturas (15ºC), S.
cerevisiae mejora significativamente su supervivencia y viabilidad celular (conservando
alrededor del 94%), produciendo además altas concentraciones de etanol (9.5 % (w/v)). Por otro
lado Valle-Rodríguez et al. (2011) determinó los requerimientos de aminoácidos que precisa K.
africana en la fermentación de jugo de agave en cultivo continuo, para lograr una fermentación
completa con alta producción de etanol. Encontrando que en presencia de asparagina K. africana
mejora significativa su capacidad fermentativa, consume completamente su fuente de azúcares y
alcanza altas concentraciones de etanol, pudiendo influir en el bouquet de la bebida por la gran
variedad de compuestos volátiles sintetizados. Asimismo Hernández-Cortés et al. (2009) estudió
el efecto del pH y la aireación en la fermentación en continuo del jugo de agave empleando dos
cepas de levaduras de S. cerevisiae (S1 y S2). Encontrando que bajo condiciones de
microaireación y D = 0.12 h-1 se mejora la producción de biomasa y el consumo de azúcares
reductores y amonio en ambas cepas. Incrementandose además la producción de etanol, pero
solamente en los cultivos de S1.
Estos reportes aunados a los resultados de este estudio, sugieren la importancia de estos factores
sobre el mejoramiento de las capacidades de fermentación de todas las especies participantes. Sin
embargo poca información asociada con mecanismos bioquímicos y moleculares implicados a
estos fenómenos está disponible, particularmente en cultivo mixto. No obstante el papel del
oxígeno y la temperatura en las fermentaciones alcohólicas ha sido previamente estudiada. Se ha
reportado que en presencia de oxígeno, el flujo de carbono en las levaduras es orientado a la
producción de biomasa por activación de las enzimas involucradas en la respiración celular
(Hernández-Cortés et al., 2009). Adicionalmente se ha asociado al oxígeno como un factor de
crecimiento que promueve la sintesis de ácido oleico y ergosterol en la membrana plasmática,
141
compuestos correlacionados con la capacidad de las células a tolerar altas concentraciones de

etanol. Bajo estas condiciones se permite mantener la viabilidad y actividad fermentativa de las
levaduras, particularmente de las más susceptibles como las no-Saccharomyces (Nagodawithana
et al., 1974; Pina et al., 2004).
Asimismo la temperatura es otro factor que parece estar asociado al mecanismo de tolerancia a
etanol, debido a que a temperaturas bajas (< 20ºC) se ha logrado aumentar significativamente el
crecimiento y supervivencia de levaduras no-Saccharomyces como K. apiculata y C. stellata
durante la fermentación en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae (Chongxiao & Fleet. 1988;
Bilbao et al., 1997; Erten, 2002). Sin embargo hasta el momento no existe una relación entre el
contenido de lípidos en la membrana plasmática y la temperatura de fermentación, que pudiese
dar explicación a la mayor viabilidad y actividad fermentativa de las levaduras no-
Saccharomyces. No obstante a pesar de no existir estudios previos en este rubro, por los
resultados obtenidos en este estudio se deduce la importancia del suministro de oxígeno y la
temperatura de fermentación sobre el crecimiento y la capacidad fermentativa de K. africana al
trabajar en cultivo mixto con S. cerevisiea durante la fermentación del jugo de agave.
Al comparar el crecimiento entre condiciones, es evidente el efecto del medio de fermentación

sobre la viabilidad y capacidad fermentativa de K. africana, debido a que en las condiciones en
medio reformulado, K. africana presentó la mayor concentración celular en UFC en comparación
con las obtenidas en medio basal (Figura 3.13 y Tablas 3.17 y 3.18). Sin embargo, como ya ha
sido mencionado, el oxígeno y la temperatura aunado al medio de fermentación resultaron ser
factores decisivos en el crecimiento de K. africana, favoreciendo en todo momento la viabilidad
al trabajar en condiciones de microaireación y bajas temperaturas (Tablas 3.17 y 3.18). Este
efecto no sólo se observó en términos de unidades formadoras de colonia (UFC), sino también
con la biomasa, presentándose la mayor concentración en las condiciones en medio reformulado
(1 - 4) y la menor en las condiciones en medio basal (5 - 8). La diferencia resulta de
aproximadamente 1.2 veces mayor en la formación de biomasa y de 3.5 veces mayor para S.
cerevisiae y 6.8 para K. africana en la formación de UFC en las condiciones en medio
reformulado (1 - 4) en comparación con las condiciones en medio basal (5 - 8) (Tablas 3.17 y
3.18).
142
Por otro lado en relación al etanol, el medio de fermentación y la temperatura fueron los
principales factores en presentar un efecto significativo sobre su producción (P< 0.05).
Observándose la mayor concentración de etanol en las condiciones efectuadas en medio
reformulado (Condiciones 1, 2, 3, 4 y 9) (Tabla 3.16). El oxígeno no mostró tener un efecto
significativo sobre la producción de etanol (P> 0.05). Es importante resaltar que indistintamente
de la condición de cultivo, la concentración producida de etanol fue alta, debido a la presencia y
mayor dominio de S. cerevisiae durante la fermentación. La alta concentración de etanol
presentada, se reflejó en los rendimientos de etanol (Yp/s), a través de éste es posible definir la
capacidad fermentativa del microorganismo, particularmente cuando se compara contra el valor
teórico (0.51), encontrándose que todos los cultivos en medio basal y reformulado mostraron una
alta eficiencia fermentativa (rendimientos muy cercanos al valor teórico).
Asimismo la temperatura, el oxígeno y el medio de cultivo resultaron tener un efecto

significativo sobre el consumo de azúcares (P< 0.05), encontrándose la menor concentración de
azúcares reductores (aproximadamente 3.97 gL-1) en la segunda condición en medio reformulado.
La cuarta condición junto con las condiciones en medio basal (Condiciones 5, 6, 7 y 8)
presentaron las mayores concentraciones de azúcares residuales (> 20 gL-1) (Tablas 3.17 y 3.18).
Esta incapacidad en el consumo de azúcares en cultivo mixto en medio basal podría explicarse
por la ausencia de factores de crecimiento como vitaminas y aminoácidos en el medio de cultivo,
que aceleran el consumo y favorecen una alta eficiencia fermentativa (Valle-Rodríguez et al.
2011, Díaz-Montaño et al. 2009). Sin embargo otros factores más pudiesen estar implicados,
debido a que en la cuarta condición a pesar de la presencia de factores de crecimiento y vitaminas,
la fermentación no fue completa, alcanzándose concentraciones similares de azúcares residuales a
las obtenidas en medio basal (Tablas 3.17 y 3.18). Con respecto a las fuentes de nitrógeno
amoniacal en todos las condiciones fuero agotadas (Tablas 3.17 y 3.18).
De igual modo se observó el efecto de los factores estudiados, sobre otros metabolitos producidos
durante la fermentación tales como: ácido succínico, glicerol, ácido acético, diacetilo, 2-3-
butanediol y acetoína (Tablas 3.17 y 3.18). Para el ácido succínico, el ácido acético y la acetoína,
la temperatura, el oxígeno y el medio de fermentación tuvieron un efecto significativo sobre su
producción (P< 0.05). Encontrándose la mayor concentración de ácido succínico en los cultivos
aireados (Condiciones 2, 3, 6, 7) posiblemente por la activación de la enzimas involucradas en la
143
respiración celular (Pretorios et al., 2000). La mayor concentración de ácido acético se presentó
en la primera, séptima y octava condición y de acetoína se obtuvó en la séptima condición
(Tablas 3.17 y 3.18). En trabajos efectuados en vinos, se ha reportado la importancia de la
acetoína, debido a que un compuesto clave en el bouquet del vino y en la síntesis de diacetilo y 2-
3-butanediol, siendo un metabolito producido en grandes cantidades por las levaduras apiculata
(Kloeckera/Hanseniaspora). Los factores que afectan su producción son el tipo de levadura, la
temperatura de fermentación, la aireación, la composición del medio, el tamaño de inóculo y el
pH (Romano et al., 1996). Estas observaciones se corroboran con los resultados obtenidos. Sin
embargo para el diacetilo y el 2-3-butanediol el oxígeno y el medio de fermentación fueron los
únicos factores en mostrar un efecto significativo sobre su producción (P< 0.05). El diacetilo fue
detectado únicamente en la primera condición (35ºC y 0 vvm en medio reformulado), siendo en
las demás condiciones no detectado, posiblemente por su conversión a acetoína ó 2-3-butanediol.
Por su parte el 2-3-butanediol, presentó la mayor concentración en la quinta y séptima condición.
Por otro lado, la composición del medio y la temperatura fueron los principales factores en
afectar la producción de glicerol (P< 0.05); presentándose la mayor concentración en la primera,
cuarta, quinta y séptima condición respectivamente (Tablas 3.17 y 3.18). Por estudios en vino y
tequila se ha reportado que el glicerol conjuntamente al etanol, juegan un papel importante en la
fijación de aromas contribuyendo a la viscosidad y al sabor de la bebida. En vino, su contribución
está relacionada a la dulzura de la bebida (Díaz-Montaño et al., 2009; Swiegers et al., 2005).
De igual manera el efecto de los factores nutrimentales y operacionales sobre los parámetros
cinéticos fueron estudiados. Para las velocidades de producción de etanol (rp) y consumo de
azúcares (rs), la temperatura y el medio de fermentación fueron los únicos factores en presentar
un efecto significativo (P< 0.05), contrariamente para la velocidad de producción de biomasa (rx),
los tres factores evaluados mostraron un tener efecto significativo (P< 0.05). Las mayores
velocidades de producción de biomasa (rx), etanol (rp) y consumo de azúcar (rs) fueron obtenidas
en la tercera condición a 25ºC y 0.03 vvm en medio reformulado. Con respecto a las velocidades
específicas de producción etanol (qp) y consumo de azúcares (qs) diferencias significativas fueron
observadas por efecto del oxígeno, la temperatura y el medio de fermentación (P< 0.05). Las
mayores velocidades específicas de producción etanol (qp) y consumo de azúcares (qs) se
presentaron en la quinta condición a 35ºC y 0 vvm en medio basal y en la sexta condición a 35ºC
y 0.03 vvm en medio basal, debido a que en estas condiciones se presentó la menor concentración
144
de biomasa (Tabla 3.18). Finalmente para los rendimientos de producción de biomasa y etanol
(Yx/s y Yp/s) diferentes comportamientos fueron observados (Tabla 3.19). Por un lado el oxígeno,
la temperatura y el medio de fermentación, mostraron tener un efecto significativo sobre el
rendimiento de producción de biomasa (Yx/s), presentándose el mayor rendimiento en la tercera
condición a 25ºC y 0.03 vvm en medio reformulado. Por otro lado con respecto al rendimiento de
producción de etanol (Yp/s), ninguno de los factores evaluados mostró tener un efecto
significativo (P> 0.05). El mayor rendimiento de producción de etanol (Yp/s), se presentó en la
novena condición 30ºC y 0.015 vvm en una mezcla equitativa de medio basal y reformulado. Sin
embargo, es importante mencionar que para todas las condiciones el rendimiento de producción
de etanol (Yp/s) fue alto, muy cercano al valor teórico (0.51), debido a la presencia y dominio de S.
cerevisiae durante la fermentación.
Durante la fermentación alcohólica las células de levaduras son expuestas a diferentes clases de
estrés que pueden resultar adversas para el crecimiento (estrés oxidativo, estrés osmótico y estrés
a etanol entre otros) y pueden causar cambios en su estado fisiológico, metabólico y bioquímico;
manifestándose en pérdida de viabilidad, actividad metabólica y fermentativa, así como en
cambios morfológicos entre otros (Pretorius 2000; Zuzuarregui & Del Olmo 2004). De esta
manera durante las condiciones de cultivo estudiadas en la fermentación en continuo de K.
africana y S. cerevisiae en cultivo mixto, debido al efecto de las condiciones operacionales y
nutrimentales diferentes cambios morfológicos en las células de las levaduras fueron observadas.
La Figura 3.14 muestra las diferentes morfologías adquiridas por K. africana y S. cerevisiae en la
fermentación en continuo en cultivo mixto. Por un lado se observa que bajo condiciones de
microaireación (0.03 vvm) y bajas temperaturas (25ºC), indistintamente del medio de cultivo
(condiciones 3 y 7), la morfología de las células adquirió una conformación alargada muy
semejante a la observada en los bacilos, posiblemente por la reducción parcial del oxígeno
durante la respiración celular, lo cual produce un incremento en la concentración intracelular de
especies reactivas de oxígeno (ROS) que ocasiona estrés oxidativo en la célula de levadura (Zuin
A. 2009). Sin embargo en los cultivos operados bajo las mismas condiciones de temperatura
(25ºC), pero en anaerobiosis (condiciones 4 y 8) este fenómeno no fue observado. Por último en
relación a las condiciones efectuadas en aerobiosis y anaerobiosis en medio basal y reformulado a
30 y 35ºC (Condiciones 1, 2, 5, 6 y 9), la morfología celular de las levaduras resultó en todo
145
momento circular y compacta, resultado posiblemente la morfología estable de las levaduras.

(Figura 3.14). No obstante más estudios en este punto son necesarios.
Tabla 3.17 Concentración final de sustratos, productos y producción de metabolitos obtenidos en los estados
estacionarios de las primeras cuatro condiciones probadas en las fermentaciones en continuo de K. africana y S.
cerevisiae en cultivo mixto en medio reformulado.
CONDICIONES
MEDIO REFORMULADO
0 vvm 0.03 vvm 0.03 vvm 0 vvm
35ºC 35ºC 25ºC 25ºC
Concentración final de sustratos 1 2 3 4
Biomasa (gL-1) 4.13 ± 0.09 3.95 ± 0.15 5.85 ± 0.15 4.24 ± 0.06
6 -1
S1 (UFC x 10 mL ) 1724.46 ± 24.04 3737.5 ± 213.94 7855 ± 208.27 4493.17 ± 249.9
6 -1
K1 (UFC x 10 mL ) 121.3 ± 13.4 812.94 ± 26.84 1057.53 ± 43.97 463.22 ± 23.36
Azúcares reductores residuales (gL-1) 6.07 ± 0.92 3.97 ± 0.34 7.55 ± 0.59 28.47 ± 2.2
Azúcares consumidos (gL-1) 103.20 ± 0.06 89.84 ± 0.12 105.86 ± 0.39 84.30 ± 0.07
Sacarosa (gL-1) 11.17 ± 0.36 7.68 ± 1.76 11.93 ± 0.08 12.87 ± 1.50
Glucosa (gL-1) 0.30 ± 0.03 0.30 ± 0.001 0.367 ± 0.029 0.467 ± 0.058
Fructosa (gL-1) 1.72 ± 0.19 0.73 ± 0.15 1.67 ± 0.13 27.37 ± 2.34
Nitrógeno amoniacal (gL-1) 0.09 ± 0.001 0.034 ± 0.004 0.013 ± 0.004 0.016 ± 0.006
Etanol (gL-1)* 50.75 ± 0.89 39.98 ± 4.35 51.31 ± 1.13 42.08 ± 0.52
pH (su) 3.75 ± 0.047 3.80 ± 0.045 3.86 ± 0.042 3.79 ± 0.039
Producción de metabolitos (gL-1)
Ácido succínico* 0.13 ± 0.03 0.17 ± 0.06 0.37 ± 0.08 0.1 ± 0.01
Glicerol* 2.2 ± 0.10 1.28 ± 0.33 0.88 ± 0.08 2.17 ± 0.15
Ácido acético* 0.34 ± 0.01 0.1 ± 0.09 nd nd
Diacetilo* 0.07 ± 0.03 nd nd nd
2-3-Butanediol* 0.12 ± 0.03 nd 0.12 ± 0.03 0.13 ± 0.06
Acetoína* 0.65 ± 0.00 nd 0.55 ± 0.09 1.03 ± 0.15
Cada valor representa el promedio ± la desviación estándar de cinco muestras en cinco tiempos de residencias
(5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo. * representa el promedio ± la desviación
estándar de tres muestras en cinco tiempos de residencias (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición
de cultivo. nd: no detectado bajo las condiciones de análisis. su: sin unidades
146
Tabla 3.18 Concentración final de sustratos, productos y producción de metabolitos en los estados estacionarios de
las últimas cinco condiciones probadas de las fermentaciones en continuo de K. africana y S. cerevisiae en cultivo
mixto en medio basal y el punto al centro.
CONDICIONES
MEDIO BASAL M.B+M.R
0 vvm 0.03 vvm 0.03 vvm 0 vvm 0.015 vvm
35ºC 35ºC 25ºC 25ºC 30ºC
Concentración final de sustratos 5 6 7 8 9
Biomasa (gL-1) 2.46 ± 0.08 2.28 ± 0.06 4.51 ± 0.12 3.29 ± 0.04 4.37 ± 0.04
S1 (UFC x 106 mL-1) 514.56 ± 78.19 688.76 ± 27.74 2354.02 ± 101.46 2135.77 ± 35.20 3216.51 ± 178.95
K1 (UFC x 106 mL-1) 92.20 ± 5.58 114.03 ± 10.16 155.48 ± 4.86 138.02 ± 7.62 289.65 ± 15.72
Azúcares reductores residuales
(gL-1) 21.68 ± 1.00 23.57 ± 2.39 29.48 ± 1.97 24.18 ± 1.31 7.59 ± 0.59
Azúcares consumidos (gL-1) 94.09 ± 0.76 90.83 ± 0.11 86.19 ± 0.48 75.64 ± 0.36 102.16 ± 0.09
Sacarosa (gL-1) 11.53±0.38 11.37 ± 0.06 12.67 ± 0.12 9.77 ± 1.71 12.02 ± 0.57
Glucosa (gL-1) 0.4±0 0.367 ± 0.011 0.50 ± 0.01 0.43 ± 0.012 0.33 ± 0.03
Fructosa (gL-1) 17.73± 2.3 14.9 ± 0.6 23.53 ± 0.47 20.83 ± 1.46 4.7 ± 0.94
Nitrógeno amoniacal (gL-1) 0.017±0.007 0.017 ± 0.006 0.017 ± 0.006 0.019 ± 0.006 0.018 ± 0.006
Etanol (gL-1)* 43.50 ± 0.50 40.20 ± 1.31 45.39 ± 0.79 36.81 ± 1.62 51.87 ± 1.04
pH (su) 3.39 ± 0.037 3.28 ± 0.034 3.36 ± 0.032 3.28 ± 0.030 3.54 ± 0.029
Producción de metabolitos (gL-1)
Ácido succínico* 0.13 ± 0.06 0.28 ± 0.03 0.3 ± 0.1 0.10 ± 0.00 nd
Glicerol* 2 ± 0.00 1.90 ± 0.10 2.03 ± 0.15 1.47 ± 0.06 1.85 ± 0.1
Ácido acético* nd nd 0.33 ± 0.06 0.33 ± 0.06 nd
Diacetilo* nd nd nd nd nd
2-3-Butanediol* 0.17 ± 0.01 0.12 ± 0.03 0.17 ± 0.06 0.1 ± 0.00 0.1 ± 0.05
Acetoína* 1.00 ± 0.10 0.93 ± 0.06 1.27 ± 0.06 0.9 ± 0.10 0.8 ± 0.09
Cada valor representa el promedio ± la desviación estándar de cinco muestras en cinco tiempos de residencias
(5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo. * representa el promedio ± la desviación
estándar de tres muestras en cinco tiempos de residencias (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición
de cultivo. nd: no detectado bajo las condiciones de análisis. su: sin unidades
147
Tabla 3.19 Parámetros cinéticos obtenidos en los estados estacionarios de las diferentes condiciones probadas de las
fermentaciones en continuo de K. africana y S. cerevisiae en cultivo mixto.
Parámetros cinéticos
Condición rx (gL-1-h-1) rs (gL-1-h-1) rp (gL-1-h-1) qp (g/g h-1) qs (g/g h-1) Yx/s (g/g) Yp/s (g/g)
1 0.17±0.0 4.15±0.04 2.03±0.04 0.49±0.003 1.005±0.022 0.040±0.001 0.489±0.007
2 0.16±0.006 3.59±0.014 1.60±0.174 0.41±0.035 0.91±0.033 0.044±0.002 0.446±0.046
3 0.23±0.006 4.23±0.023 2.08±0.048 0.37±0.014 0.74±0.016 0.054±0.001 0.489±0.013
4 0.17±0.002 3.42±0.088 1.68±0.021 0.40±0.015 0.81±0.021 0.050±0.001 0.481±0.013
5 0.01±0.003 3.76±0.04 1.74±0.02 0.69±0.02 1.53±0.055 0.026±0.001 0.464±0.009
6 0.09±0.002 3.50±0.09 1.61±0.05 0.69±0.04 1.53±0.06 0.026±0.001 0.472±0.009
7 0.18±0.005 3.55±0.08 1.82±0.03 0.41±0.004 0.79±0.03 0.051±0.002 0.501±0.012
8 0.13±0.002 3.09±0.05 1.47±0.06 0.45±0.02 0.94±0.02 0.043±0.001 0.472±0.024
9 0.17±0.03 4.10±0.02 2.07±0.04 0.48±0.01 0.94±0.01 0.043±0.001 0.503±0.01
Cada valor representa el promedio ± la desviación estándar de cinco muestras en cinco tiempos de residencia
(5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo. rx: velocidad de formación de biomasa; rs:
velocidad de consumo de sustrato; rp: velocidad de formación de etanol; qs: velocidad específica de consumo de
sustrato; qp: velocidad específica de producción de etanol; Yx/s y Yp/s: rendimientos de biomasa y etanol.
148
CONDICIONES DE CULTIVO
1) 35ºC, 0 vvm y Medio Reformulado 2) 35ºC, 0.03 vvm y Medio Reformulado 3) 25ºC, 0.03 vvm y Medio Reformulado
4) 25ºC, 0 vvm y Medio Reformulado 5) 35ºC, 0.00 vvm y Medio Basal 6) 35ºC, 0.03 vvm y Medio Basal
7) 25ºC, 0.03 vvm y Medio Basal 8) 25ºC, 0 vvm y Medio Basal 9) 30ºC, 0.015 vvm y Medio Ref + Basal
Figura 3.14 Morfología al microscopia (40×) de K. africana y S. cerevisiae en cultivo mixto bajo diferentes
condiciones de cultivo, en las fermentaciones del jugo de agave en cultivo continuo.
149
3.5.2 Análisis de compuestos volátiles en mosto de las fermentaciones efectuadas en cultivo

mixto en continuo de Kloeckera africana (K1) y Saccharomyces cerevisiae (S1)
La composición química del mosto de cada condición de cultivo fue analizada por cromatografía
de gases-FID acoplada a un head-space (CG-FID-HS). Los compuestos volátiles cuantificados
fueron: acetaldehído, acetato de etilo, metanol, n-propanol, isobutanol, acetato de isoamilo, n-
butanol, alcohol isoamílico, hexanoato de etilo, octanoato de etilo, decanoato de etilo, acetato de
fenetilo y 2-fenil etanol (Tablas 3.20 y 3.21). Las Tablas 3.20 y 3.21 muestran la concentración
de compuestos volátiles en las nueves condiciones de cultivo analizadas. Durante las condiciones
de cultivo en medio reformulado y basal diferentes concentraciones de los compuestos volátiles
fueron observadas. En la primera condición (35ºC y 0 vvm) se presentaron las mayores
concentraciones de 2-fenil etanol, decanoato de etilo y n-butanol, en la segunda condición (35ºC,
0.03 vvm) se presentó la mayor concentración de isobutanol y alcohol isoamílico, en la tercera
condición (25ºC, 0.03 vvm) se presentó la mayor concentración de n-propanol y en la cuarta
condición (25ºC y 0 vvm) se observó la mayor concentración de metanol, acetato de isoamilo,
hexanoato de etilo y octanoato de etilo; estas condiciones de cultivo fueron efectuadas en medio
reformulado. Por su parte en la quinta condición (35ºC, 0 vvm) se presentó la mayor
concentración de acetato de fenetilo, en la sexta y octava condición (35ºC, 0.03 vvm; 25ºC, 0
vvm) se presentó la mayor concentración de acetato de etilo y durante la séptima condición (25ºC,
0.03 vvm) se observó la mayor concentración de acetaldehído y acetato de etilo; estas
condiciones de cultivo fueron efectuadas en medio basal. Con respecto a la novena condición
(30ºC, 0.015 vvm) presentó sólo una alta concentración de acetaldehído (Tablas 3.20 y 3.21). La
alta concentración de n-propanol, isobutanol, n-butanol, alcohol isoamílico y 2-fenil etanol
(alcoholes superiores) presente en la primera y segunda condición en medio reformulado, podrían
explicarse por el efecto de la alta temperatura de fermentación (35ºC) y el medio de fermentación
(aminoácidos y vitaminas), que estimularon la producción de alcoholes superiores. Algunos
autores han reportados que la concentración de aminoácidos en el mosto influye sobre la
producción de alcoholes superiores, incrementándose conforme se incrementa la concentración
de aminoácidos en el medio (Swiegers et al., 2005; Valle-Rodríguez et al., 2011). Asimismo la
temperatura de fermentación es otro factor importante en la producción de alcoholes superiores,
presentándose las mayores concentraciones conforme se incrementa la temperatura de
150
fermentación (Erten et al., 2002). Sin embargo además de la temperatura y la composición del
medio, el aumento en la concentración de etanol y la microaireación del medio incrementan la
producción de alcoholes superiores (Swiegers et al., 2005; Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova,
2009; Morán-Marroquí et al., 2011). En relación al acetaldehído su concentración resultó
afectada por la composición del medio y las condiciones de aireación; presentándose las mayores
concentraciones en las condiciones en medio basal (5 - 8), sin embargo el mayor contenido se
presentó en la séptima condición, debido posiblemente a la baja temperatura de fermentación
(25ºC), la microaeración y la composición del medio de fermentación que fuertemente
estimularon su producción. Con respecto al metanol, su producción ha sido asociada a la etapa de
cocimiento en la elaboración de Tequila (Cedeño, 1995), sin embargo durante los cultivos en
medio basal y reformulado diferentes concentraciones de metanol fueron observados, debido
posiblemente a la síntesis de la enzima metil pectin esterasa en las levaduras durante la
fermentación. Los ésteres son compuestos que marcadamente afectan la composición aromática
de las bebidas alcohólicas, por la aportación de sabores y olores especiales (Romano et al., 2003;
Díaz-Montaño et al., 2008; Pretorius et al., 2000; Rojas et al., 2003 ). Se ha reportado que el
género de levadura es el principal factor que afecta la producción de ésteres, asociándose
principalmente a las levaduras no-Saccharomyces. Sin embargo otros estudios han sugerido que
un alto contenido de ácidos grasos insaturados en el medio de cultivo resultan en una reducción
en la producción de ésteres, mientras que una elevada temperatura de fermentación resulta en un
incremento de octanoato y decanoato de etilo, y en decremento de ésteres de acetato. Asimismo
un mayor contenido de C ó N en el medio está correlacionado con un incremento en la
producción de ésteres de acetato. Sin embargo el factor limitante en la producción de ésteres de
acetato es el nivel de precursores de ácidos grasos insaturados contenidos en el medio de cultivo
y las condiciones de cultivo altamente aireadas que inhiben la síntesis de la acetyltransferasa
(AATasa) (Saerens et al. 2008; Rojas et al. 2003). La mayor concentración de acetato de etilo se
presentó en la quinta y sexta condición en medio basal, de acetato de isoamilo en la cuarta
condición y de acetato de fenetilo en la quinta y octava condición de cultivo, debido a que no
existen una relación entre condiciones para los ésteres de acetato no es posible establecer el
principal factor que afecta su producción. Para los ésteres de etilo la mayor concentración se
presentó en las condiciones no aireados en medio basal (primera y cuarta condición).
151
A través del análisis de componentes principales (PCA) se analizó la variabilidad entre los
compuestos volátiles debidas a las condiciones de cultivo estudiadas en las fermentaciones en
continuo en cultivo mixto de K. africana y S. cerevisiae (Figura 3.15). A partir del PCA realizado
sobre las concentraciones de compuestos volátiles de los cultivos mixtos, se obtuvieron tres
componentes principales (PC) con un Eigen-valor mayor a 1, los cuales explican el 82.33 % de la
variabilidad de los datos originales (Tabla 3.23).
El ANOVA aplicado al PC-1, mostró diferencias significativas debidas a la temperatura, el

oxígeno y el medio de fermentación (P< 0.05). Por su parte el ANOVA aplicado al PC-2, mostró
diferencias significativas debidas a la temperaturas y el oxígeno (P<0.05), pero no por efecto del
medio de fermentación. Para el componente 3 (PC-3), las diferencias encontradas fueron debidas
a la temperatura, el oxígeno y el medio de fermentación (Tabla 3.22).
Los compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: el alcohol isoamílico, 2-fenil
etanol con pesos negativos y el acetato de etilo, el metanol y acetaldehído con pesos positivos.
Mientras que para PC-2 fueron: el isobutanol con pesos negativos y el hexanoato de etilo y el
octanoato de etilo con pesos positivos y en el PC-3 fueron: el acetaldehído con pesos negativos y
el acetato de fenetilo con pesos positivos (Tabla 3.22).
El medio de fermentación resultó ser el factor de mayor peso sobre la síntesis de compuestos
volátiles en mosto, debido a que fue el factor en permitir una completa separación de las
diferentes condiciones experimentales, esto es posible observarlo en la Figura 3.15-B del análisis
de componentes principales (PCA).
152
Tabla 3.20 Concentración de compuestos volátiles en mosto en medio reformulado de las fermentaciones en cultivo
mixto en continuo de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1).
Condiciones experimentales en cultivo continuo

-1
Compuestos (mg L ) 1 2 3 4
ΣAldehídos 33.10 ± 2.33 19.20 ± 1.66 50.76 ± 0.76 49.16 ± 2.70
Acetaldehído 33.10 ± 2.33 19.20 ± 1.66 50.76 ± 0.76 49.16 ± 2.70
ΣAlcoholes 154.21 ± 4.41 105.81 ± 1.54 166.76 ± 0.98 196.82 ± 5.01
Metanol 154.21 ± 4.41 105.81 ± 1.54 166.76 ± 0.98 196.82 ± 5.01
ΣAlcoholes superiores 349.71 ± 7.94 428.21 ± 11.22 287.03 ± 7.38 195.1 ± 9.09
n-Propanol 94.39 ± 1.84 94.68 ± 2.32 103.58 ± 2.21 66.08 ± 2.55
Isobutanol 53.18 ± 1.87 131.54 ± 2.92 37.17 ± 1.83 19.61 ± 2.17
n-Butanol 2.23 ± 0.31 0.74 ± 0.04 0.74 ± 0.02 1.05 ± 0.07
Alcohol Isoamílico 174.98 ± 3.20 180.74 ± 4.18 134.78 ± 2.29 101.22 ± 3.27
2-Fenil etanol 24.93 ± 0.72 20.51 ± 1.76 10.76 ± 1.03 7.14 ± 1.03
ΣÉsteres 11.32 ± 0.3 5 ± 0.55 9.82 ± 1.17 19.22 ± 0.32
Acetato de Etilo 9.45 ± 0.15 4.43 ± 0.43 8.79 ± 1.04 16.66 ± 0.09
Acetato de Isoamilo 0.26 ± 0.01 0.11 ± 0.03 0.20 ± 0.02 1.23 ± 0.05
Hexanoato de etilo 0.18 ± 0.01 0.04 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.21 ± 0.04
Octanoato de etilo 0.20 ± 0.04 0.08 ± 0.02 0.10 ± 0.01 0.23 ± 0.07
Decanoato de etilo 0.89 ± 0.05 0.13 ± 0.01 0.25 ± 0.05 0.44 ± 0.03
Acetato de fenetilo 0.34 ± 0.04 0.21 ± 0.02 0.40 ± 0.04 0.45 ± 0.04
Cada valor representa representan el promedio ± la desviación estándar de tres muestras en cinco tiempos de
residencias (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo. Alcohol isoamílico: suma de
alcoholes amílico activo e isoamílico. Condiciones de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03
vvm) y 4 (25ºC, 0 vvm) en medio reformulado.
153
Tabla 3.21 Concentración de compuestos volátiles en mosto en medio basal y punto al centro de las fermentaciones
en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1).
Condiciones experimentales en cultivo continuo

Compuestos (mg L-1) 5 6 7 8 9
ΣAldehídos 41.84 ± 3.86 38.10 ± 1.65 76.21 ± 1.42 28.35 ± 2.28 63.68 ± 0.87
Acetaldehído 41.84 ± 3.86 38.10 ± 1.65 76.21 ± 1.42 28.35 ± 2.28 63.68 ± 0.87
ΣAlcoholes 152.14 ± 1.65 148.02 ± 1.20 178.85 ± 3.97 145.32 ± 2.31 176.86 ± 2.55
Metanol 152.14±1.65 148.02 ± 1.20 178.85 ± 3.97 145.32 ± 2.31 176.86 ± 2.55
ΣAlcoholes superiores 171.95 ± 8.68 202.21 ± 7.83 17079 ± 2.07 130.38 ± 9.46 225.4 ± 9.51
n-Propanol 51.56 ± 1.67 62.02 ± 1.70 52.31 ± 0.61 46.33 ± 3.92 58.98 ± 2.65
Isobutanol 23.42 ± 2.58 36.27 ± 1.32 38.46 ± 1.02 20.10 ± 1.10 33.96 ± 1.58
n-Butanol 1.20 ± 0.01 1.25 ± 0.11 0.46 ± 0.02 0.67 ± 0.02 0.59 ± 0.08
Alcohol isoamílico 89.09 ± 4.25 95.85 ± 4.38 73.13 ± 0.28 60.68 ± 3.97 120.51 ± 2.34
2-Fenil etanol 6.68 ± 0.17 6.82 ± 0.32 6.43 ± 0.14 2.60 ± 0.45 11.36 ± 2.86
ΣÉsteres 9.6 ± 1.681 20.26 ± 1.2 17.66 ± 1.543 8.47 ± 0.79 11.64 ± 0.362
Acetato de etilo 8.48 ± 1.62 19.43 ± 1.09 17.11±1.49 7.27 ± 0.65 10.85 ± 0.30
Acetato de isoamilo 0.13 ± 0.01 0.11 ± 0.04 0.08 ± 0.001 0.13 ± 0.03 0.23 ± 0.01
Hexanoato de etilo 0.040 ± 0.001 0.04 ± 0.01 0.04 ± 0.01 0.11 ± 0.02 0.05 ± 0.001
Octanoato de etilo 0.07 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.05 ± 0.001 0.14 ± 0.01 0.08 ± 0.001
Decanoato de etilo 0.23 ± 0.02 0.17 ± 0.01 0.12 ± 0.001 0.19 ± 0.01 0.19 ± 0.01
Acetato de fenetilo 0.65 ± 0.02 0.44 ± 0.04 0.26 ± 0.04 0.63 ± 0.07 0.24 ± 0.04
Cada valor representa representan el promedio ± la desviación estándar de tres muestras en cinco tiempos de
residencias (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo. Alcohol isoamílico: suma de
alcoholes amílico activo e isoamílico . Condiciones de cultivo: 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03
vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio basal y 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al centro)
154
hex-et
A oct-et
0.40 acet-iso
dec-et
met
0.30
but
0.20
acet-et
fen-acet
0.10
p[2]
acet
0.00 fen-alc prop
isom
-0.10
-0.20
isob
-0.30
-0.40 -0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30
p[1]
5
4
B 4
4
4
3 1
1
2 1
0 8
t[2]
33 88
3 69 55
9 6956
-1 7 77
-2
-3 22
2
-4
-5
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
t[1]
Figura 3.15 PCA de (A) compuestos volátiles de los (B) mostos obtenidos de las diferentes condiciones de cultivo
probadas en las fermentaciones en continuo de K. africana (K1) y S .cerevisiae (S1) en cultivo mixto. acet:
acetaldehído; met: metanol; acet-et: acetato de etilo; prop: n-propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-isom:
alcohol isoamílico; fen-alc: 2-fenil etanol; fen-acet: acetato de fenetilo; isom-acet: acetato de isamilo; hex-et:
hexanoato de etilo; oct-et: octanoato de etilo; dec-et: decanoato de etilo. Condiciones de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2
(35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm); 4 (25ºC, 0 vvm) en medio reformulado; 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm),
7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio basal y 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al
centro).
155
PC1 PC2 PC3

Varianza explicada (%) 37.6 Varianza explicada (%) 30.1 Varianza explicada (%) 14.554
Alcohol isoamílico -0.4263 Isobutanol -0.2753 Acetaldehído -0.5086
2-Fenil etanol -0.4233 Alcohol isoamílico -0.0361 Metanol -0.3293
n-Propanol -0.3714 2-Fenil etanol -0.0052 Acetato de Etilo -0.3000
Isobutanol -0.3269 n-Propanol -0.0025 n-Propanol -0.1909
Etil decanoato -0.2600 Acetaldehído 0.0523 Alcohol isoamílico -0.1871
n-Butanol -0.2536 Acetato de fenetilo 0.1302 2-Fenil etanol -0.1723
Etil octanoato -0.1426 Acetato de etilo 0.1816 Isobutanol -0.1141
Etil hexanoato -0.1244 n-Butanol 0.2632 Acetato de isoamilo -0.1134
Acetato de isoamilo 0.0217 Metanol 0.3333 Etil decanoato 0.0107
Acetato de fenetilo 0.1688 Etil decanoato 0.3610 Etil hexanoato 0.0545
Acetato de etilo 0.2418 Acetato de isoamilo 0.3968 Etil Octanoato 0.1016
Metanol 0.2472 Etil octanoato 0.4342 n-Butanol 0.1648
Acetaldehído 0.2793 Etil hexanoato 0.4622 Acetato de fenetilo 0.6126
Tabla 3.23. Análisis de varianza (ANOVA) de los puntajes de los componentes principales (PC) de los cultivos
mixtos, debidos a la temperatura, oxígeno y medio de fermentación.
PC-1 PC-2 PC-3

Varianza acumulada (%) 37.6 67.774 82.328
Varianza explicada (%) 37.6 30.1 14.554
Factores P value
Temperatura 0.0000 0.0000 0.0006
Oxígeno 0.0000 0.0000 0.0000
Medio de fermentación 0.0000 0.5237 0.0000
3.5.3 Análisis de compuestos volátiles mayoritarios de los destilados obtenidos de las

fermentaciones en cultivo mixto en continuo de Kloeckera africana (K1) y Saccharomyces
cerevisiae (S1)
Los mostos obtenidos de cada condición experimental fueron destilados bajo las condiciones de
destilación mencionadas en la sección 2.4.4 y analizados por cromatografía de gases con
detección de ionización de flama (FID). Además de las condiciones operacionales, nutrimentales
156
y de destilación, el tipo de levadura resultó ser un factor clave en la síntesis de compuestos

volátiles. Por esa razón en este estudio efectuamos fermentaciones en cultivo mixto con levaduras
no-Saccharomyces del género Kloeckera y S. cerevisiae en la fermentación del jugo de agave,
dado que existe evidencia de que éstas levaduras sintetizan concentraciones considerables de
compuestos sensorialmente importantes como acetato de etilo, acetoína y acetato de fenetilo entre
otros (Romano et al., 1996; Díaz-Montaño et al., 2008). Las Tablas 3.24 y 3.25 muestran la
concentración de compuestos volátiles mayoritarios y el límite permitido por la norma oficial
mexicana (NOM-006-SCFI-2005). Los compuestos analizados fueron: acetaldehído, acetato de
etilo, ácido acético, lactato de etilo, metanol, n-propanol, isobutanol, n-butanol, alcohol
isoamílico y furfural.
La concentración de compuestos volátiles mayoritarios de las diferentes condiciones

experimentales estuvieron dentro del rango límite permitido por la norma oficial del Tequila
(Tablas 3.24 y 3.25) con expeción del furfural. El análisis de varianza aplicado al acetaldehído,
metanol y furfural mostró que su producción no dependente de la temperatura, el oxígeno y el
medio de fermentación (P> 0.05). Sin embargo se ha reportado que la producción de acetaldehído
depende de factores tales como la composición del medio y las condiciones de fermentación; el
metanol y el furfural por su parte su formación ha sido asociada a la etapa de cocimiento en la
elaboración de tequila (Cedeño, 1995; Mancilla-Margalli & López 2002), no obstante otros
estudios han reportado que las levaduras son capaces de producirlos (metanol) y reducirlos a
otros metabolitos (furfural a alcohol furfurilico) (Palmsvist et al., 1998). Por ejemplo Díaz-
Montaño et al. (2008) reportó que las altas concentraciones de metanol reportadas en la
fermentación es debido posiblemente a que ciertas cepas de levaduras son capaces de producir la
enzima metil pectin esteresa que libera el metanol de las pectinas del bagazo. En este estudio en
la cuarta condición a 25ºC y 0 vvm en medio reformulado se presentó la mayor concentración de
metanol; sin embargo en la mayoría de las condiciones de cultivo el metanol fue producido
dentro de un rango de concentración constante (aproximadamente 180 mg/100 ml alcohol
anhídro). En relación al furfural la mayor concentración se presentó en la cuarta (25ºC, 0 vvm en
medio reformulado) y sexta condición de cultivo (35ºC, 0.03 vvm en medio basal), debido
posiblemente a que es un compuesto tóxico que afecta el crecimiento de las levaduras al inhibir
parte de las enzimas glicolíticas e interfirir el transporte de electrones (Díaz-Montaño et al.,
157
2008; Palmsvist et al., 1998). Sin embargo debido a que el furfural puede ser consumido por
ciertas cepas levaduras, la alta concentración presente en este estudio puede deberse a otros
factores que requieren mayor investigación.
El ácido acético, es un compuesto que actúa como intermediario en la formación de piruvato a

acetil-CoA. La concentración final de éste metabolito, depende principalmente de la temperatura
de fermentación y el tipo de levadura. Sintetizándose las mayores concentraciones a temperaturas
altas y por el empleo de levaduras no-Saccharomyces del género apiculata
(Kloeckera/Hanseniaspora) (Romano et al., 2003; Díaz-Montaño et al., 2008). Sin embargo en
este estudio, el oxígeno y el medio de fermentación fueron los principales factores que afectaron
la producción de ácido acético (P< 0.05), presentándose las mayores concentraciones en la quinta
y sexta condición efectuadas a 35ºC, 0 y 0.03 vvm en medio basal, debido posiblemente a que
durante estos cultivos se presentaron las menores concentraciones celulares de K. africana, lo
cual pudo haber promovido una reducción en la enzima acetyl-CoA sintetasa y por ende en el
contenido de acetyl-CoA necesario para la síntesis de lípidos (Díaz-Montaño & Ramírez-Córdova,
2009).
Por otra parte con respecto al acetato de etilo, el factor que más influye en su producción es el
tipo de levadura empleada, sintentizando las mayores concentraciones las levaduras no-
Saccharomyces (Romano et al., 2003; Díaz-Montaño et al., 2008; Rojas et al., 2001). En este
estudio, el medio de fermentación fue el único factor de mayor peso en afectar su concentración
(P< 0.05). Encontrándose la mayor concentración en la sexta condición (35ºC, 0.03 vvm y medio
basal). Nuevamente se observa un patrón semejante al presentado en la sexta condición en mosto,
confirmando con ello que la alta concentración de acetato de etilo en esta condición puede
deberse a otros factores que no son estudiados en este trabajo de tesis, debido a que por estudios
previos, se ha reportado que en presencia de oxígeno inhibe el gen ATFI que codifica la
acetyltransferasa, enzima responsable de la síntentis de ésteres de acetato (Saerens et al., 2008).
Para el lactato de etilo, solamente el oxígeno mostró tener un efecto significativo sobre su
formación (P< 0.05). La mayor concentración de lactato de etilo se presentó en la primera
condición (35ºC, 0 vvm y medio reformulado).
158
En relación al n-propanol y alcohol isoamílico, fueron afectados significativamente por la

temperatura, el oxígeno y el medio de fermentación (P< 0.05). Favorenciéndose la mayor
concentración en la segunda condición (35ºC, 0.03 vvm en medio reformulado), debido a la alta
concentración celular de S. cerevisiae y K. africana (3737.5 y 812.94 × 106 UFC mL-1), al
consumo completo de los azúcares del medio, a la composición de vitaminas y aminoácidos del
medio cultivo y a la alta temperatura de fermentación (35ºC) que fuertemente estimularon su
producción. Para el n-butanol e isobutanol, la temperatura y el oxígeno fueron los principales
factores en presentar un efecto significativo sobre su producción (P< 0.05), presentándose las
mayores concentraciones en la primera y segunda condición (35ºC, 0 y 0.03 vvm en medio
reformulado), debido posiblemente además de los factores que afectaron la concentración de n-
propanol y alcohol isoamilico a la aireación del cultivo. Ciertos reportes han sugerido que en las
fermentaciones anaerobias, el tipo de levadura, la relación carbono/nitrógeno y la temperatura de
fermentación son los principales factores que afectan la producción de n-propanol, isobutanol,
alcohol isoamílico y n-propanol (Pinal et al., 1997). En este estudio se incluyó el efecto de la
microaeración, el cual fue un factor importante en la síntesis de n-butanol, isobutanol y alcohol
isoamílico.
Adicionalmente varios autores han reportado el efecto de las condiciones operacionales y

nutrimentales sobre la capacidad de síntesis de compuestos volátiles de levaduras no-
Saccharomyces en la fermentación del jugo de uva y agave en cultivo puro y mixto con S.
cerevisiae. Erten (2002) y Bilbao et al. (1997) reportaron que temperaturas menores de 20ºC en la
fermentación de jugo de uva y manzana, K. apiculata en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae
incrementa considerablemente la de sintesís de acetato de etilo y acetaldehído. Por otro lado
Valle-Rodriguez et al. (2011) reportó que K. africana aumenta significativamente la síntesis
alcoholes superiores, acetaldehído y acetato de etilo en las fermentaciones suplementadas con
asparagina que en comparación con las fermentaciones adicionadas con sulfato de amonio.
Es importante mencionar que además de las condiciones operacionales y nutrimentales, la

concentración de compuestos volátiles resulta fuertemente influenciada por las condiciones de
destilación (Oliveira et al., 2005). En este estudio las condiciones de destilación se mantuvieron
constantes para no tener variaciones en la concentración de volátiles por efecto del sistema de
destilación, este hecho se constata por la concentración constante de metanol ya que es un
159
compuesto que se genera principalmente en la etapa de cocimiento en la elaboración de Tequila

(Tablas 3.24 y 3.25). En el siguiente apartado se analiza a detalle la composición de compuestos
volátiles minoritarios obtenidos de los destilados de las fermentación en cultivo mixto de K.
africana y S. cerevisiae.
Por medio del análisis de componentes principales (PCA) se analizó la variabilidad entre los
compuestos volátiles debidas a las condiciones experimentales probadas para los cultivos mixtos
(Figura 3.16). A partir del PCA realizado sobre las concentraciones de compuestos volátiles
obtenidos de los destilados de los cultivos mixtos, se obtuvieron tres componentes principales
(PC) con un Eigen-valor mayor a 1, los cuales explican el 84.87% de la variabilidad de los datos
originales (Tabla 3.27).
El ANOVA aplicado al PC-1, mostró diferencias significativas debidas al oxígeno y el medio de

fermentación (P< 0.05) pero no por efecto de la temperatura (P> 0.05). Por otro lado El ANOVA
aplicado al PC-2, mostró diferencias significativas debidas a la temperatura, pero no al medio de
fermentación ó el oxígeno. Para el componente 3, las diferencias encontradas fueron debidas
solamente al oxígeno y al medio de fermentación (P< 0.05), pero no a la temperatura (Tabla 3.26).
Los compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: isobutanol, alcohol
isoamílico con pesos negativos y ácido acético, furfural y acetato de etilo con pesos positivos.
Mientras que para PC-2 fueron: ácido acético con pesos negativos y el alcohol isoamílico, n-
propanol y n-butanol con pesos positivos. Para el PC-3 fueron: lactato de etilo con pesos
negativos y el acetato de etilo y acetaldehído con pesos positivos (Tabla 3.26).
160
Tabla 3.24: Concentración de compuestos volátiles mayoritarios obtenidos en medio reformulado de las
fermentaciones en cultivo mixto en continuo de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1)
Compuestos Condiciones experimentales en cultivo continuo Límite
(mg/100 mL de alcohol
NOMa
anhidro) 1 2 3 4
ΣAldehídos 16.09 ± 0.24 6.30 ± 0.30 12.90 ± 0.01 12.90 ± 0.03 0 - 40
Acetaldehído 16.09 ± 0.24 6.30 ± 0.30 12.90 ± 0.01 12.90 ± 0.03
ΣÁcidos orgánicos 4.71 ± 1.79 1.74 ± 0.18 1.56 ± 0.18 5.92 ± 0.80 Cn
Ácido acético 4.71 ± 1.79 1.74 ± 0.18 1.56 ± 0.18 5.92 ± 0.80
Σ Ésteres 12.75 ± 0.78 4.50 ± 0.19 9.05 ± 0.19 14.34 ± 0.20 2 – 200
Acetato de etilo 10.93 ± 0.18 3.68 ± 0.16 7.83 ± 0.12 12.80 ± 0.19
Lactato de etilo 1.82 ± 0.60 0.81 ± 0.03 1.22 ± 0.07 1.54 ± 0.02
Σ Alcoholes 192.78 ± 1.20 178.92 ± 1.32 181.68 ± 1.16 207.12 ± 2.60 30 – 300
Metanol 192.78 ± 1.20 178.92 ± 1.32 181.68 ± 1.16 207.12 ± 2.60
Σ Alcoholes superiores 370.18 ± 2.43 489.74 ± 3.89 346.60 ± 0.27 233.48 ± 2.36 20 - 500
n-Propanol 118.88 ± 0.39 145.09 ±1.78 116.93 ±0.19 80.16 ±0.91
Isobutanol 72.84 ± 0.27 128.58 ± 0.17 51.84 ± 0.02 24.58 ± 0.27
n-butanol 2.09 ± 0.12 1.11 ± 0.001 0.84 ± 0.01 1.15 ± 0.001
Alcohol isoamílico 176.38 ± 1.65 214.95 ± 1.95 176.98 ± 0.06 127.59 ± 1.19
Σ Furfural 5.57 ± 0.41 2.99 ± 0.07 4.06 ± 0.09 6.28 ± 0.12 0-4
Cada valor representa representan el promedio ± la desviación estándar de dos muestras obtenidas de la destilación
de los mostos en cinco tiempos de residencias (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo. a:
NOM: NMX-V-005-NORMEX-2005. Alcohol isoamílico: suma de alcoholes amílico activo e isoamílico.
Condiciones de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm) y 4 (25ºC, 0 vvm) en medio
reformulado
161
Tabla 3.25: Concentración de compuestos volátiles mayoritarios obtenidos en medio basal y en el punto al centro de
las fermentaciones en cultivo mixto de K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1) en reactor continuo.
Compuestos Condiciones experimentales de cultivo continuo Límite

(mg/100 mL de alcohol
NOMa
anhidro) 5 6 7 8 9
Σ Aldehídos 10.07 ± 0.17 20.76 ± 0.19 19.49 ± 0.78 14.50 ± 0.44 9.19 ± 0.15 0 - 40
Acetaldehído 10.07 ± 0.17 20.76 ± 0.19 19.49 ± 0.78 14.50 ± 0.44 9.19 ± 0.15
Σ Ácidos orgánicos 8.88 ± 0.29 8.71 ± 0.05 5.69 ± 0.20 6.43 ± 0.42 2.93 ± 0.18 Cn
Ácido acético 8.88 ± 0.29 8.71 ± 0.05 5.69 ± 0.20 6.43 ± 0.42 2.93 ± 0.18
Σ Ésteres 10.26 ± 0.23 22.46 ± 0.05 16.92 ± 0.94 13.41 ± 0.12 6.92 ± 0.18 2 – 200
Acetato de etilo 9.15 ± 0.19 21.40 ± 0.02 15.94 ± 0.93 12.29 ± 0.10 6.13 ± 0.14
Lactato de etilo 1.11 ± 0.04 1.06 ± 0.03 0.98 ± 0.01 1.12 ± 0.82 0.79 ± 0.04
Σ Alcoholes 181.36 ± 2.25 196.38 ± 0.13 187.91 ± 2.43 183.49 ± 0.79 178.08 ± 3.76 30 – 300
Metanol 181.36 ± 2.25 196.38 ± 0.13 187.91 ± 2.43 183.49 ± 0.79 178.08 ± 3.76
Σ Alcoholes superiores 216.61 ± 1.45 296.63 ± 1.07 210.26 ± 2.08 180.58 ± 0.53 241.22 ± 3.05 20 - 500
n-Propanol 70.99 ±0.48 94.42 ±0.64 65.782 ±0.80 63.73 ±0.25 69.36 ±0.65
Isobutanol 28.19 ± 0.14 53.31 ± 0.09 47.40 ± 0.13 30.53 ± 0.001 35.15 ± 0.27
n-butanol 1.59 ± 0.05 1.78 ± 0.01 0.59 ± 0.06 0.86 ± 0.14 0.77 ± 0.12
Alcohol isoamílico 115.85 ± 0.78 147.12 ± 0.33 96.50 ± 1.10 85.46 ± 0.15 135.94± 2.09
Σ Furfural 4.47 ± 0.19 6.23 ± 0.09 3.76 ± 0.27 5.46 ± 0.01 2.60 ± 0.04 0-4
de los mostos en cinco tiempos de residencias (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo. a:
NOM: NMX-V-005-NORMEX-2005. Alcohol isoamílico: suma de alcoholes amílico activo e isoamílico.
Condiciones de cultivo: Condiciones de cultivo: 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0
vvm) en medio basal y 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al centro).
162
A prop
but
alc-isom
0.40
isob
0.30 met furf
lac-et
0.20
p[2]
0.10 acet
et-acet
0.00
acet-ac
-0.10
-0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40
p[1]
4 B
3
1
1
2
2 66
1 2 4
4
3
3
0
t[2]
5
-1 5
8
78
7
-2 9
9
-3
-4
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6
t[1]
Figura 3.16 PCA de (A) compuestos volátiles mayoritarios de los (B) destilados obtenidos de las diferentes
condiciones de cultivo probadas en las fermentaciones en continuo de K. africana (K1) y S .cerevisiae (S1) en
cultivo mixto. acet: acetaldehído; met: metanol; acet-ac: ácido acético; prop: n-propanol; but: n-butanol; isob:
isobutanol; alc-isom: alcohol isoamílico; et-acet: acetato de etilo; lac-et: lactato de etilo y furf: furfural. Condiciones
de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm); 4 (25ºC, 0 vvm) en medio reformulado; 5 (35ºC,
0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio basal y 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio
basal y reformulado (Punto al centro).
163
PC1 PC2 PC3

Isobutanol -0.3110 Ácido Acético -0.0319 Lactato de etilo -0.5161
Alcohol Isoamílico -0.3078 Acetato de Etilo 0.0487 Furfural -0.1267
n-Propanol -0.2779 Acetaldehído 0.0717 n-Butanol -0.1064
n-Butanol 0.1401 Metanol 0.2675 Metanol -0.0858
Lactato de etilo 0.2001 Furfural 0.2750 Ácido Acético 0.0152
Metanol 0.3228 Isobutanol 0.3276 Alcohol Isoamílico 0.0881
Acetaldehído 0.3516 Lactato de etilo 0.3698 n-Propanol 0.1552
Furfural 0.3753 Alcohol Isoamílico 0.4232 Isobutanol 0.3899
Ácido Acético 0.3805 n-Butanol 0.4577 Acetato de Etilo 0.4908
Acetato de Etilo 0.3977 n-Propanol 0.4601 Acetaldehído 0.5234
PC-1 PC-2 PC-3

Varianza explicada (%) 47.634 27.613 9.619
Varianza acumulada (%) 47.634 75.247 84.866
Factores P value
Temperatura 0.0573 0.0169 0.3004
Oxígeno 0.0095 0.6908 0.0000
Medio de fermentación 0.0023 0.7166 0.0000
3.5.4 Análisis de compuestos volátiles minoritarios de los destilados obtenidos de las

fermentaciones en cultivo mixto en continuo de Kloeckera africana (K1) y Saccharomyces
cerevisiae (S1)
Como en las anteriores secciones, se efectuó el análisis de compuestos volátiles minoritarios en

los destilados obtenidos de las fermentaciones en cultivo mixto de K. africana (K1) y S.
cerevisiae (S1). Las tablas 3.28 y 3.29 muestran la concentración de compuestos volátiles
minoritarios. Los compuestos analizados fueron agrupados y separados en siete familias de
compuestos que consisten de: acetales, ácidos, alcoholes, cetonas, ésteres, furanos y terpenos.
Fueron identificados y cuantificados 41 compuestos dentro de las siete familias de compuestos.
En términos del número de compuestos identificados, los ésteres representan el mayor grupo, con
164
quince compuestos identificados y cuantificados que incluyen ésteres de etilo, metilo, isoamilo y
feniletilo entre otros; siendo el 9-hexadecenoato de etilo el compuestos producido en mayor
concentración (Tablas 3.28 y 3.29). Estos compuestos son producidos por el metabolismo de la
levadura durante la fermentación, aunque otros pueden formarse durante el añejamiento de la
bebida (Romano et al., 2003; Díaz-Montaño et al., 2009; Swiegers et al., 2005). Los Furanos
representan otro grupo de compuestos, con siete compuestos identificados y cuantificados que
incluyen al 5-metil furfural, acetyl furan y 2-fenil etanol entre otros; siendo el 5-metil furfurl el
compuestos producido en mayor concentración en este grupo. Estos compuestos además de los
aldehídos y cetonas pueden ser producidos durante las etapas de comiento y/o la destilación en la
elaboración de Tequila (Cedeño, 1995; Mancilla-Margalli & López, 2002; Benn & Peppard,
1996). Los terpenos representan otro grupo de compuestos identificados y cuantificados en los
destilados con cinco compuestos que incluyen al cis-óxido de linalol, α-terpineol, trans-nerolidol,
dihidrofarnesol y trans-Farnesol, los cuales fueron detectados en bajas concentraciones en la
mayoría de las condiciones probadas. Los terpenos provienen en su mayoría de la planta del
agave ó pueden ser liberados por las levaduras no-Saccharomyces por medio de enzimas
específicas como β−glucosidasas (Cordero et al., 2003; Díaz-Montaño et al., 2009). Para los
acetales sólo fue identificado y cuantificado el furfural dietil acetal, siendo no detectado en las
condiciones en medio reformulado. En el grupo de los ácidos cuatro compuestos fueron
identificados y cuantificados, siendo el ácido hexadecanoico el compuesto producido en mayor
concentración. Para los alcoholes cinco compuestos fueron cuantificados, representando el 2-fenil
etanol el compuesto en mayor concentración. En el grupo de las cetonas se identificaron y
cuantificaron cuatro compuestos siendo la acetoína el compuesto en mayor concentración (Tablas
3.28 y 3.29). Igualmente que los ésteres, la mayoría de ácidos, acetales y alcoholes son
producidos durante la fermentación alcohólica, aunque también pueden provenir del cocimiento,
la destilación o el añejamiento en la elaboración de Tequila (Cedeño, 1995).
De acuerdo al análisis de componentes principales (PCA) aplicado a la familia de compuestos

volátiles minoritarios (Figura 3.17), se observó que las condiciones experimentales efectuadas en
medio reformulado (Condiciones 1, 2, 3 y 4), tienen un mayor peso sobre la síntesis de ésteres,
ácidos y alcoholes (Figura 3.17-A), mientras que las condiciones experimentales realizadas en
medio basal (Condiciones 5, 6, 7 y 8) y la condición con punto al centro, tienen un mayor peso
165
sobre la síntesis de furanos, cetonas, terpenos y acetales (Figura 3.17-A). Estas diferencias son
debidas en su mayoría al medio de fermentación ya que es el factor de mayor peso en la mayoría
de los compuestos volátiles evaluados y el que permite una completa separación de las
condiciones experimentales. Además otra explicación a este fenómeno podría ser que en la
mayoría de las condiciones estudiadas en medio reformulado, la cantidad de azúcares residuales
fue menor a 10 gL-1, lo que garantiza una alta conversión de azúcar a etanol y por lo tanto de
otros metabolitos como alcoholes superiores y ácidos orgánicos. Este mismo mecanismo podría
explicar lo que ocurre con los ésteres, es decir al aumentar la presencia de alcoholes superiores y
ácidos orgánicos en el medio, se podría favorer la esterificación y por tanto el aumento en la
concentración de ésteres (Swiegers et al., 2005; Díaz-Montaño et al., 2009). No obstante a pesar
de que estás pudiesen ser explicaciones preliminares de lo que ocurre dentro de la célula, otros
mecanismos más de tipo bioquímico y molecular convergen.
Igualmente que con los compuestos volátiles mayoritarios, por medio del análisis de
componentes principales (PCA) se analizó la variabilidad entre los compuestos volátiles debidas
a las condiciones experimentales (Figura 3.17). A partir del PCA realizado sobre las
concentraciones de compuestos volátiles minoritarios de los destilados de los cultivos mixtos, se
obtuvieron cuatro componentes principales (PC) con un Eigenvalor mayor a 1, los cuales
explican el 79.23 % de la variabilidad de los datos originales (Tabla 3. 31).
El ANOVA aplicado al PC-1 y PC-2, mostró diferencias significativas debidas principalmente al

oxígeno y el medio de fermentación (P< 0.05). Por otro lado el ANOVA aplicado al PC-3,
mostró diferencias significativas debidas a la temperatura y el medio de fermentación (P< 0.05).
Para el PC-4, las diferencias encontradas fueron debidas solamente al oxígeno (P< 0.05) (Tabla
3.30). En general parece que el medio de fermentación y el oxígeno son los factores con mayor
peso sobre la síntesis de compuestos volátiles minoritarios, debido a que son factores
significativos en un mayor número de compuestos.
Los compuestos con mayor peso sobre el componente PC-1 fueron: trans-nerolidol, 5-metil-2-
(5H)-furanona y trans-Farnesol con pesos negativos y el decanoato de isoamilo, ácido
hexadecanoico y oleato de etilo con pesos positivos. Mientras que para el componente PC-2
fueron: dihidrofarnesol con pesos negativos y 5-metil furfural, el linoleato de etilo, tetradecanol,
166
2-acetil furan, dodecanoato de etilo, hexadecanoato de etilo y el tetradecanoato de etilo con

pesos positivos (Tabla 3.30). Para el PC-3 fueron: acetato de fenetilo, ciclopent-4-ene-1,3-dione,
cis-óxido de linalol y ácido decanoico con peso negativos y 4-Penten-1-ol con pesos positivos
(Tabla 3.30).
Es interesante señalar que en cuanto a la cantidad de compuestos volátiles identificados en los

destilados de las fermentaciones en continuo, se lograron identificar y cuantificar 41 compuestos
(Tablas 3.28 y 3.29), mientras que para los mismos cultivos pero en sistemas de fermentación por
lote 25 compuestos fueron identificados y cuantificados (Tablas 3.7 y 3.14). Estas diferencias son
debidas principalmente al tipo de sistema de fermentación y a las condiciones de fermentación
que marcadamente afectan la composición de compuestos volátiles en las bebidas alcohólicas.
Sin embargo a pesar de que en las fermentaciones por lote la cantidad de compuestos volátiles
identificada y cuantificada fue menor, la concentración de compuestos sensorialmente como el
acetato de fenetilo fue mayor que la observada en las fermentaciones en continuo, esto es de
esperarse debido a los diferentes estados fisiológicos que el microorganismo experimenta durante
las fermentaciones por lote lo cual facilita la producción de metabólitos primarios y sencundarios,
aún así en las fermentaciones en continuo la concentración de otros ésteres de cadena larga fue
promovida y aumentada, pudiendo de algún modo modificar la composición química de la bebida
y por ende sus propiedades aromáticas y sensoriales.
167
Tabla 3.28: Concentración de compuestos volátiles minoritarios obtenidos en medio reformulado de las
Compuestos Condiciones experimentales en cultivo continuo

(mg/100 mL de alcohol anhidro) 1 2 3 4
Acetales nd nd nd nd
Furfural dietil acetal nd nd nd nd
Ácidos 2.015±0.329 1.316±0.256 1.463±0.081 2.08±0.170
Ácido isobutírico nd 0.369±0.014 nd nd
Ácido octanoico nd nd nd nd
Ácido decanoico nd nd 0.427±0.002 1.100±0.032
Ácido hexadecanoico 2.015±0.329 0.948±0.113 1.036±0.080 0.980±0.137
Alcoholes 9.522±1.310 6.455±0.448 5.51±0.302 5.719±0.065
2-Fenil etanol 8.362±1.211 5.702±0.409 4.687±0.223 4.877±0.016
4-Penten-1-ol 0.448±0.012 0.505±0.005 0.526±0.058 0.480±0.011
3-Etoxipropan-1-ol 0.131±0.035 0.111±0.030 0.157±0.017 0.071±0.003
Octan-3-ol 0.388±0.050 0.138±0.004 0.144±0.003 0.141±0.001
Tetradecanol 0.194±0.002 nd nd 0.149±0.035
Cetonas 1.158±0.090 0.646±0.023 2.019±0.102 1.882±0.149
Acetoína 0.394±0.060 0.193±0.010 1.261±0.068 0.945±0.104
1-Hidroxi-2-propanona nd nd nd 0.102±0.024
Ciclopent-2-en-1-one 0.764±0.030 0.453±0.013 0.758±0.033 0.780±0.018
Ciclopent-4-ene-1,3-dione nd nd nd 0.054±0.004
Ésteres 17.221±1.278 8.889±0.195 18.49±1.473 18.057±0.411
Octanoato de etilo 1.153±0.062 0.351±0.003 1.101±0.052 1.100±0.016
levulinato de etilo nd nd nd nd
Decanoato de etilo 4.459±0.266 0.791±0.010 4.104±0.161 6.330±0.077
3-Metilbutil octanoato 0.163±0.025 nd 0.065±0.009 0.083±0.001
Dec-9-enoate de etilo 0.586±0.002 0.238±0.035 1.212±0.022 0.186±0.001
Acetato de fenetilo 0.173±0.027 0.119±0.013 0.151±0.010 0.362±0.011
Dodecanoato de etilo 2.630±0.278 0.346±0.040 1.456±0.097 4.145±0.024
Decanoato de isoamilo 0.448±0.001 0.088±0.010 0.353±0.008 0.291±0.002
Tetradecanoato de etilo 0.218±0.003 nd 0.140±0.010 0.330±0.106
Hexadecanoato de etilo 1.549±0.113 1.052±0.004 0.168±0.003 2.144±0.092
9-Hexadecenoato de etilo 4.059±0.379 4.80±0.013 8.364±0.485 1.614±0.038
Octadecanoato de etilo 0.100±0.013 0.069±0.025 0.063±0.003 0.077±0.088
Oleato de etilo 0.432±0.041 0.284±0.018 0.321±0.021 0.219±0.011
Linoleato de etilo 1.099±0.062 0.666±0.015 0.533±0.026 1.051±0.019
Linolenato de etilo 0.152±0.016 0.085±0.009 0.057±0.002 0.122±0.005
Furanos 8.903±0.539 4.636±0.273 7.802±0.42 10.687±0.375
2-Metil tetrahidro-3-furanona 2.264±0.082 1.317±0.032 2.427±0.093 2.990±0.195
5-Metil-2(3H)-furanona nd 0.229±0.001 0.311±0.062 0.414±0.062
2-Acetil furan 0.561±0.061 0.429±0.012 0.581±0.034 0.702±0.018
2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona nd 0.148±0.017 nd nd
5-Metil-furfural 4.968±0.212 1.684±0.016 2.949±0.127 5.322±0.071
Alcohol furfurílico 1.110±0.184 0.679±0.174 1.368±0.091 1.120±0.026
5-Metil-2(5H)-furanona nd 0.149±0.021 0.167±0.015 0.139±0.002
Terpenos 0.1089±0.0157 0.1498±0.0071 0.1593±0.0135 0.220±0.022
cis-Óxido de linalol nd nd nd 0.0580±0.001
α-Terpineol 0.0371±0.0003 0.0357±0.0007 0.0378±0.0014 0.0547±0.0048
trans-Nerolidol nd nd nd nd
Dihidrofarnesol 0.0714±0.0154 0.0706±0.0010 0.0705±0.0039 0.0511±0.0030
168
trans-Farnesol nd 0.0435±0.0054 0.0510±0.0082 0.0482±0.0050

de los mostos en cinco tiempos de residencias (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo.
nd: no detectado bajo las condiciones de análisis. Condiciones de cultivo: Condiciones de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2
(35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm) y 4 (25ºC, 0 vvm) en medio reformulado.
Tabla 3.29: Concentración de compuestos volátiles minoritarios obtenidos en medio basal y punto al centro de las
Compuestos Condiciones experimentales en cultivo continuo

(mg/100 mL de alcohol anhidro) 5 6 7 8 9
Acetales 0.0421±0.0019 0.0459±0.0021 0.061±0.0068 0.0626±0.0015 0.0321±0.0120
Furfural dietil acetal 0.0421±0.0019 0.0459±0.0021 0.061±0.0068 0.0626±0.0015 0.0321±0.0120
Ácidos 1.436±0.082 1.33±0.095 1.234±0.076 1.152±0.071 1.608±0.057
Ácido isobutírico nd nd nd nd nd
Ácido octanoico nd nd nd nd 0.153±0.006
Ácido decanoico 0.577±0.041 0.626±0.020 0.575±0.031 0.532±0.001 0.500±0.016
Ácido hexadecanoico 0.859±0.040 0.704±0.075 0.658±0.045 0.620±0.070 0.955±0.035
Alcoholes 4.99±0.317 5.447±0.282 4.883±0.057 4.103±0.131 5.937±0.065
2-Fenil etanol 3.845±0.254 4.123±0.106 3.999±0.054 3.259±0.078 5.303±0.029
4-Penten-1-ol 0.759±0.033 0.954±0.155 0.601±0.001 0.501±0.038 0.437±0.026
3-Etoxipropan-1-ol 0.102±0.005 0.134±0.007 0.144±0.001 0.024±0.001 0.054±0.001
Octan-3-ol 0.140±0.009 0.142±0.001 0.139±0.001 0.151±0.012 0.110±0.006
Tetradecanol 0.145±0.006 0.093±0.014 nd 0.169±0.001 0.033±0.002
Cetonas 1.851±0.159 2.491±0.317 2.790±0.160 1.242±0.043 1.743±0.050
Acetoína 1.294±0.122 1.657±0.216 2.181±0.070 0.714±0.026 1.094±0.014
1-Hidroxi-2-propanona nd 0.216±0.001 0.127±0.001 nd 0.118±0.022
Ciclopent-2-en-1-one 0.558±0.037 0.618±0.100 0.449±0.081 0.500±0.010 0.499±0.010
Ciclopent-4-ene-1,3-dione nd nd 0.033±0.008 0.028±0.006 0.032±0.004
Ésteres 11.46±0.731 10.533±0.757 6.364±0.582 12.274±0.256 4.636±0.073
Octanoato de etilo 0.374±0.005 0.795±0.058 0.584±0.062 1.328±0.042 0.294±0.010
levulinato de etilo 0.052±0.010 nd 0.043±0.002 0.035±0.001 0.0323±0.001
Decanoato de etilo 2.791±0.121 2.838±0.221 1.733±0.143 3.314±0.079 1.918±0.014
3-Metilbutil octanoato nd nd nd 0.101±0.012 nd
Dec-9-enoate de etilo 0.273±0.011 0.274±0.024 0.510±0.068 0.362±0.005 0.060±0.003
Acetato de fenetilo 0.147±0.004 0.115±0.005 0.331±0.034 0.178±0.008 0.274±0.009
Dodecanoato de etilo 2.183±0.123 1.757±0.104 0.480±0.058 2.111±0.032 0.242±0.005
Decanoato de isoamilo 0.196±0.029 0.192±0.011 0.135±0.008 0.136±0.017 0.059±0.001
Tetradecanoato de etilo 0.402±0.065 0.313±0.033 nd 0.313±0.003 0.030±0.003
Hexadecanoato de etilo 2.443±0.134 1.857±0.118 0.693±0.067 1.657±0.005 0.335±0.001
9-Hexadecenoato de etilo 1.021±0.159 1.138±0.080 1.487±0.103 1.611±0.017 0.723±0.001
Octadecanoato de etilo 0.100±0.012 0.065±0.015 0.044±0.001 0.051±0.004 0.021±0.002
Oleato de etilo 0.169±0.014 0.142±0.011 0.062±0.005 0.109±0.002 0.156±0.009
Linoleato de etilo 1.166±0.033 0.931±0.051 0.261±0.022 0.842±0.028 0.441±0.003
Linolenato de etilo 0.144±0.013 0.116±0.026 nd 0.126±0.001 0.050±0.012
Furanos 15.794±0.635 17.896±1.118 13.318±0.956 16.375±1.394 7.529±0.189
2-Metil tetrahidro-3-furanona 2.567±0.509 1.671±0.176 2.419±0.059 2.072±0.111 1.525±0.110
5-Metil-2(3H)-furanona 0.128±0.002 1.203±0.021 1.268±0.165 0.998±0.046 0.602±0.027
2-Acetil furan 0.677±0.007 0.625±0.058 0.563±0.081 0.540±0.035 0.555±0.003
2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona nd nd nd nd nd
169
5-Methyl-furfural 10.703±0.063 12.980±0.755 7.533±0.555 11.620±1.198 3.371±0.004

Alcohol furfurílico 1.033±0.008 0.829±0.073 0.925±0.095 0.672±0.002 1.189±0.043
5-Metil-2(5H)-furanona 0.686±0.045 0.587±0.036 0.610±0.002 0.472±0.003 0.287±0.002
Terpenos 0.2423±0.0303 0.3103±0.0206 0.3114±0.0237 0.1867±0.0193 0.2769±0.0120
cis-Óxido de linalol nd nd 0.0241±0.0038 0.0353±0.0034 0.0194±0.0009
α-Terpineol 0.0739±0.0125 0.0919±0.0023 0.0525±0.0048 0.0612±0.0079 0.0393±0.0058
trans-Nerolidol 0.0417±0.0081 0.0527±0.0041 0.0481±0.0035 0.0237±0.0035 0.0379±0.0003
Dihidrofarnesol 0.0270±0.0028 0.0323±0.0012 0.0856±0.0106 0.0313±0.0020 0.0982±0.0013
trans-Farnesol 0.0997±0.0069 0.1334±0.0131 0.101±0.0010 0.0353±0.0025 0.0821±0.0038
de los mostos en cinco tiempos de residencias (5τ) tomadas en el estado estacionario de cada condición de cultivo.
nd: no detectado bajo las condiciones de análisis. Condiciones de cultivo: Condiciones de cultivo: 5 (35ºC, 0 vvm); 6
(35ºC, 0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio basal y 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio basal y
reformulado (Punto al centro).
170
Estadist.M1 (PC), Untitled, Work set

Loadings: p[1]/p[2]
Esteres Furanos
0.50
A
Cetonas
Acidos
0.40
0.30
p[2]
0.20
0.10 Terpenos
Alcohole
0.00
Acetales
-0 . 4 0 -0 . 3 0 -0 . 2 0 -0 . 1 0 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50

p[1]
Simc a-P 7.01 by Umetri AB 2011-08-18 10:49
3
B
2
4
4
6
1
1
6
3 5
1 5
3
0
t[2]
77
88
-1
9 9
-2 2
-3
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
t[1]
Figura 3.17 PCA de (A) familias de compuestos volátiles minoritarios de los (B) destilados obtenidos de las
diferentes condiciones de cultivo probadas en las fermentaciones en continuo de K. africana (K1) y S .cerevisiae
(S1) en cultivo mixto. Condiciones de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm); 4 (25ºC, 0
vvm) en medio reformulado; 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio
basal y 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al centro).
171
0.30 tet-et
A acf
hexd-et
ttdol
dod-et
5mf lin-et
terp dec-et
0.20 dca mttona linto-et
oct-etocdec-et
pol ciona
mfne linox dod-isom
0.10 mboct
fda
tner ac cidna
tfar hyona
mfona lev-et fen-ac ocol
p[2]
0.00 alc-fuf
hxa
dec9-et
ole-et
etol
alc-fen
-0.10
oca
9-hexdec
-0.20 isa
mttfona
dhfar
-0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20

p[1]
8
B
6
4 4
5
6 5
2 6 88
1
0 1
t[2]
7
-2 7 33
9 9
-4
2
-6 2
-8
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
t[1]
Figura 3.18 PCA de (A) compuestos volátiles minoritarios de los (B) destilados obtenidos de las diferentes
condiciones de cultivo probadas en las fermentaciones en continuo de K. africana (K1) y S .cerevisiae (S1) en
cultivo mixto. fda: furfural dietil-acetal; isa: ácido isobutírico; oca: ácido octanoico; dca: ácido decanoico; hxa: ácido
hexadecanoico; alc-fen: 2-fenil etanol; pol: 4-Penten-1-ol; etol: 3-etoxipropan-1-ol; ocol: octan-3-ol; ttdol:
tetradecanol; ac: acetoína; hyona: 1-hidroxi-2-propanona; ciona: ciclopent-2-en-1-one; cidna: ciclopent-4-ene-1,3-
dione; oct-et: octanoato de etilo; lev-et: levulinato de etilo; dec-et: decanoato de etilo; mboct: 3-metilbutil octanoato;
dec-9-et: dec-9-enoate de etilo; fen-ac: acetato de fenetilo; dod-et: dodecanoato de etilo; dod-isom: decanoato de
isoamilo; tet-et: tetradecanoato de etilo; hexd-et: hexadecanoato de etilo; 9-hexdec-et: 9-hexadecenoato de etilo;
ocdec-et: octadecanoato de etilo; ole-et: oleato de etilo; lin-et: linoleato de etilo; linto-et: linolenato de etilo; mttona:
2-metil tetrahidro-3-furanona; mfona: 5-metil-2(3H)-furanona; acf: 2-acetylfuran; mttfona: 2-metil tetrahidrotiofene-
3-ona; 5mf: 5-metil-furfural; alc-fuf : alcohol furfurílico; mfne: 5-metil-2(5H)-furanona; linox: cis-óxido de linalol;
terp: α-Terpineol; tner: trans-nerolidol; dhfar: dihidrofarnesol y tfar: trans-farnesol. Condiciones de cultivo: 1 (35ºC,
0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm); 4 (25ºC, 0 vvm) en medio reformulado; 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC,
0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio basal y 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio basal y
reformulado (Punto al centro).
172
PC1 PC2 PC3

trans-Nerolidol -0.2432 Dihidrofarnesol -0.2426 Acetato de fenetilo -0.3699
5-Metil-2(5H)-furanona -0.2352 2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona -0.1981 Ciclopent-4-ene-1,3-dione -0.3465
trans-Farnesol -0.2330 Ácido isobutírico -0.1928 cis-Óxido de linalol -0.3056
Furfural dietil acetal -0.2296 9-Hexadecenoato de etilo -0.1355 Ácido decanoico -0.2222
5-Metil-2(3H)-furanona -0.2166 Ácido octanoico -0.1231 Alcohol furfurílico -0.2117
Acetoína -0.1915 2-Fenil etanol -0.0895 Dihidrofarnesol -0.2113
Levulinato de etilo -0.1754 3-Etoxipropan-1-ol -0.0695 Decanoato de etilo -0.1873
1-Hidroxi-2-propanona -0.1655 Oleato de etilo -0.0594 2-Metil tetrahidro-3-furanona -0.1847
α-Terpineol -0.1473 Dec-9-enoate de etilo -0.0413 Ácido octanoico -0.1652
5-Metil-furfural -0.1381 Ácido Hexadecanoico -0.0212 2-Acetil furan -0.1075
4-Penten-1-ol -0.1334 Alcohol furfurílico -0.0014 Octanoato de etilo -0.1018
Ácido decanoico -0.1136 Acetato de fenetilo 0.0323 Ciclopent-2-en-1-one -0.0991
Ácido octanoico -0.0786 Octan-3-ol 0.0326 Acetoína -0.0981
Ciclopent-4-ene-1,3-dione -0.0731 5-Metil-2(3H)-furanona 0.0348 3-Metilbutil octanoato -0.0905
Acetato de fenetilo -0.0527 Levulinato de etilo 0.0359 1-Hidroxi-2-propanona -0.0875
cis-Óxido de linalol -0.0397 trans-Farnesol 0.0483 Dodecanoato de etilo -0.0745
2-Acetil furan -0.0150 1-Hidroxi-2-propanona 0.0513 5-Metil-2(3H)-furanona -0.0644
Dihidrofarnesol 0.0209 trans-Nerolidol 0.0626 Decanoato de isoamilo -0.0374
Hexadecanoato de etilo 0.0317 Ciclopent-4-ene-1,3-dione 0.0634 Dec-9-enoate de etilo -0.0299
Ácido isobutírico 0.0321 Acetoína 0.0647 Levulinato de etilo -0.0196
2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona 0.0329 Furfural dietil acetal 0.0801 Ácido Hexadecanoico 0.0002
Tetradecanoato de etilo 0.0343 3-Metilbutil octanoato 0.0959 2-Fenil etanol 0.0032
3-Etoxipropan-1-ol 0.0503 5-Metil-2(5H)-furanona 0.1090 9-Hexadecenoato de etilo 0.0306
2-Metil tetrahidro-3-furanona 0.0693 Decanoato de isoamilo 0.1118 Furfural dietil acetal 0.0366
Alcohol furfurílico 0.0977 cis-Óxido de linalol 0.1124 Tetradecanol 0.0425
Tetradecanol 0.1018 4-Penten-1-ol 0.1341 Octan-3-ol 0.0551
Dec-9-enoate de etilo 0.1182 Ciclopent-2-en-1-one 0.1344 Oleato de etilo 0.0593
Linoleato de etilo 0.1235 Octadecanoato de etilo 0.1452 trans-Nerolidol 0.0637
Dodecanoato de etilo 0.1329 Octanoato de etilo 0.1529 trans-Farnesol 0.0697
Linolenato de etilo 0.1335 2-Metil tetrahidro-3-furanona 0.1937 Tetradecanoato de etilo 0.0932
Octanoato de etilo 0.1402 Ácido decanoico 0.1991 3-Etoxipropan-1-ol 0.0999
Decanoato de etilo 0.1569 Linolenato de etilo 0.2015 5-Metil-2(5H)-furanona 0.1169
Octadecanoato de etilo 0.1611 Decanoato de etilo 0.2107 5-Metil-furfural 0.1462
9-Hexadecenoato de etilo 0.1769 α-Terpineol 0.2174 Hexadecanoato de etilo 0.1561
Ciclopent-2-en-1-one 0.1987 5-Metil-furfural 0.2297 α-Terpineol 0.1583
Octan-3-ol 0.2043 Linoleato de etilo 0.2305 Linoleato de etilo 0.1657
2-Fenil etanol 0.2116 Tetradecanol 0.2441 Ácido isobutírico 0.1846
3-Metilbutil octanoato 0.2189 2-Acetil furan 0.2499 Linolenato de etilo 0.1853
173
Decanoato de isoamilo 0.2268 Dodecanoato de etilo 0.2614 Octadecanoato de etilo 0.1861

2-Metil tetrahidrotiofene-3-
Ácido Hexadecanoico 0.2353 Hexadecanoato de etilo 0.2620 0.1917
ona
Oleato de etilo 0.2652 Tetradecanoato de etilo 0.2889 4-Penten-1-ol 0.2344

PC-1 PC-2 PC-3 PC-4

Varianza explicada (%) 30.964 24.492 13.731 10.045
Varianza acumulada (%) 30.964 55.455 69.186 79.231
Factores P value
Temperatura 0.3883 0.245 0 0.4845
Oxígeno 0.0291 0.0004 0.085 0.0009
Medio de fermentación 0.03 0.0024 0.0093 0.462
174
3.5.5 Evaluación sensorial
Los destilados de las fermentaciones en continuo en cultivo mixto, fueron evaluados

sensorialmente a través de pruebas hedónicas, para esta evaluación el número de personas que
acudieron a la sesión fue de 35; se evaluó olor, aroma y sensaciones táctiles con cinco niveles de
agrado en una escala de -2, -1, 0, 1, 2 y 3 evaluando desde muy desagradable hasta me gusta
demasiado (ANEXO 3). La prueba de preferencia se llevó a cabo en cuatro sesiones, utilizando el
destilado del punto al centro del diseño experimental como la referencia durante las evaluaciones.
Durante la primera sesión se evaluaron los destilados de las condiciones uno y cinco, en la
segunda sesión se evaluaron los destilados de las condiciones dos y seis, en la tercera sesión se
evaluaron los destilados de las condiciones tres y siete y en la cuarta sesión los destilados de las
condiciones cuatro y ocho, considerando en cada sesión el destilado de referencia (condición
nueve), de tal manera que se asegurara un total de tres destilados a analizar en cada prueba.
Los resultados de los niveles de aceptación obtenidos de los destilados para los atributos
sensoriales evaluados se muestran en la Figura 3.19. El análisis de varianza mostró que no
existen diferencias significativas entre los destilados con respecto al olor y las sensaciones
táctiles (P> 0.05), pero si se presentaron diferencias estadísticas entres los destilados con respecto
al aroma (P< 0.05). Adicionalmente por medio del análisis de rangos múltiples (95% LSD) fue
posible determinar el nivel de agrado de los destilados en los atributos evaluados. Con respecto al
olor los destilados de las condiciones tres, cuatro y cinco fueron los más agradables y en el aroma
y las sensaciones táctiles, las condiciones tres, cuatro y nueve fueron las más agradables, debido a
la mayor media obtenida en la prueba de rangos múltiples (LSD). Asimismo con la misma prueba
fue posible asociar las medias de la prueba rangos múltiples (LSD) de los niveles de agrado
promedio de olor, aroma y sensaciones táctiles a los compuestos volátiles mayoritarios y
minoritarios de los destilados evaluados por medio de la prueba de cuadrados mínimos parciales
(PLS) (Figura 3.20 y Tabla 3.32). De igual manera por medio de la prueba de preferencia se
generó una lista de frecuencias mencionadas de descriptores en olor, aroma y sensaciones táctiles
de los destilados, los cuales nuevamente fueron asociados a los compuestos volátiles mayoritarios
y minoritarios por medio de la prueba de cuadrados mínimos parciales (PLS), donde los datos de
las frecuencias de los niveles de agrado promedio de olor, aroma y sensacionales fueron
175
ordenados en el eje “Y” y los compuestos volátiles en el eje “X” del análisis (Figura 3.21 y Tabla
3.33).
El modelo obtenido del análisis PLS aplicado a las medias de los niveles de agrado promedio de
olor, aroma y sensaciones táctiles y los compuestos volátiles explicó el 42% de la varianza de los
datos en el eje “X” y el 70.8% en el eje “Y”. Los compuestos volátiles (eje “X”) que presentaron
la mayor variación entre los destilados en el primer componente (WC-1) fueron: n-butanol,
octan-3-ol y linoleato de etilo con puntos negativos y el alcohol furfurílico y ácido decanoico con
puntos positivos. Mientras que para el segundo componentes (WC-2) fueron: furfural dietil acetal
y trans-nerolidol con puntos negativos y el alcohol furfurílico, ciclopent-2-en-1-one, 9-
hexadecenoato de etilo, dec-9-enoato de etilo y decanoato de etilo con puntos positivos (Tabla
3.32). Finalmente los pesos de los componentes de los niveles de agrado promedio de olor, aroma
y sensaciones táctiles (eje “Y”) fueron distinguidos por presentar puntos positivos en ambos
componentes (Tabla 3.32).
Adicionalmente a través de la prueba PLS fueron correlacionadas las medias de los niveles de
agrado de olor con el ácido decanoico, 2-metil-tetrahidro-3-furanona y el 2-acetil furan, mientras
que las sensaciones táctiles y el aroma estuvieron asociados con el alcohol furfurílico de los
destilados tres y cuatro, debido a que fueron los destilados que más impactaron en el nivel de
agrado de los atributos evaluados (Figura 3.20).
De forma similar fue realizado el análisis de cuadrados mínimos parciales (PLS) de los
compuestos volátiles con las frecuencias de descriptores de los niveles de agrado promedio de
olor, aroma y sensaciones táctiles (Tabla 3.33 y Figura 3.21). El modelo explicó el 53.9% de la
varianza de los datos en el eje “X” de los compuestos volátiles y el 34.7% en el eje “Y” de los
descriptores sensoriales. Los compuestos volátiles (eje “X”) que presentaron la mayor variación
entre los destilados en el primer componente (WC-1) fueron: trans-farnesol con puntos negativos
y el octanoato de etilo, dec-9-enoato de etilo, 3-metilbutil octanoato, decanoato de isoamilo y 9-
hexadecenoato de etilo con puntos positivos. Mientras que para el segundo componentes (WC-2)
fueron: 5-metil furfural, α-terpineol, 4-Penten-1-ol, tetradecanoato de etilo, ácido acético y
furfural con puntos negativos y dihidrofarnesol con puntos positivos (Tabla 3.33). Finalmente los
descriptores sensoriales (eje “Y”) que presentaron la mayor variación entre los destilados en el
176
primer componente (WC-1) fueron: dulce con pesos negativos y astringente con pesos positivos.
Para el segundo componente (WC-2) fueron: dulce con pesos negativos y frutal con pesos
positivos (Tabla 3.33).
El análisis PLS asoció los descriptores sensoriales humo y quemante a los compuestos volátiles
ácido octanoico y 2-metil tetrahidrotiofene-3-ona. Asimismo el descriptor suavidad fue asociado
al compuesto levulinato de etilo, los descriptores madera, solvente y picante al compuesto cis-
óxido de linalol, la nota dulce al 1-hidroxi-2-propanona y trans-nerolidol, el descriptor frutal al
dihidrofarnesol, la nota amarga con el 2-fenil etanol, el descriptor caramelo se asoció con el
alcohol furfurílico, el ácido hexadecanoico y el oleato de etilo y finalmente el descriptor
astringente al octan-3-ol (Figura 3.21). Ciertamente éstas asociaciones son debidas a la influencia
de los destilados de las diferentes condiciones de cultivo, siendo los destilados de la primera,
tercera y cuarta condición caracterizados por presentar descriptores frutal, amargo, caramelo y
astringente. Por su parte los destilados de la segunda, séptima y novena condición caracterizados
por presentaron notas a humo, quemante, madera y solvente. Finalmente los destilados de las
quinta, sexta y novena condición por presentar la mayor suavidad y estar asociados a los
descriptores dulce y picante (Figura 3.21). Sin duda alguna estas características sensoriales de los
destilados son debidas en su mayoría al metabolismo asociado de K. africana y S. cerevisiae
durante la fermentación y a las condiciones de fermentación que fuertemente influyeron sobre la
síntesis de compuestos volátiles mencionado anteriormente. Adicionalmente muchas de las
propiedades del sabor en la bebida pueden ser producto de otras etapas en la elaboración del
tequila, como el cocimiento, la destilación y el añejamiento (Benn & Peppard 1996). Sin
embargo la etapa de mayor importancia es la fermentación, debido a la gran cantidad de
compuestos secundarios producidos.
177
OLOR AROMA SENSACIONES TÁCTILES

20 20 20
18 18 18
16 16 16
14 14
14
12 12
12
Juez
10 10
10
8 8
8
6 6
6
4 4
4
2 2
2
0 0
0
-2 -1 0 1 2 3 -2 -1 0 1 2 3
-2 -1 0 1 2 3
Nivel de agrado Nivel de agrado Nivel de agrado
CND 1 CND 2 CND 3 CND 4 CND 5

CND 6 CND 7 CND 8 CND 9
Figura 3.19. Niveles de aceptabilidad de los destilados obtenidos de las fermentaciones en continuo de los cultivos
mixtos de S.cerevisiae (S1) y K.africana (K1). Cada destilado fue obtenidos en diferentes condiciones de cultivo:
CND 1 (35ºC, 0 vvm); CND 2 (35ºC, 0.03 vvm), CND 3 (25ºC, 0.03 vvm); CND 4 (25ºC, 0 vvm) en medio
reformulado; CND 5 (35ºC, 0 vvm); CND 6 (35ºC, 0.03 vvm), CND 7 (25ºC, 0.03 vvm), CND 8 (25ºC, 0 vvm) en
medio basal y CND 9 (30ºC, 0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al centro).
178
0.30 9-hexdec
ciona
ole-et alc isom dec9-et alc-fuf
0.20 prop dod-isom dec-et sens tac
lac et
oct-et
0.10 dod-et etol aroma
hxa mboct mttona
ocdec-et
alc-fen
isob met acf olor
isa
mttfona dhfar dca
linto-et lin-et furf tet-et
wc[2]
0.00
but
ocol linox
hexd-et oca fen-ac
cidna
ttdol pol
-0.10 hyona ac
acet tfar
acet et
terp
mfona
-0.20 5mf ac
acet
mfne
tner lev-et
fda
-0.30
-0.30 -0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30
wc[1]
6
3
4 4
2 1
t [2 ]
0
2
9
-2 5 7
8
6
-4
-6
-8
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
t[1]
Figura 3.20 PLS de (A) los compuestos volátiles y niveles de agrado promedio de olor, aroma y sensaciones táctiles
de los (B) destilados obtenidos de las diferentes condiciones de cultivo probadas en las fermentaciones en continuo
de K. africana (K1) y S .cerevisiae (S1) en cultivo mixto. Compuestos volátiles mayoritarios: acet: acetaldehído;
met: metanol; acet-ac: ácido acético; prop: n-propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-isom: alcohol isoamílico;
acet-et: acetato de etilo; lac-et: lactato de etilo y furf: furfural. Compuestos volátiles minoritarios: fda: furfural dietil-
acetal; isa: ácido isobutírico; oca: ácido octanoico; dca: ácido decanoico; hxa: ácido hexadecanoico; alc-fen: 2-fenil
etanol; pol: 4-Penten-1-ol; etol: 3-etoxipropan-1-ol; ocol: octan-3-ol; ttdol: tetradecanol; ac: acetoína; hyona: 1-
hidroxi-2-propanona; ciona: ciclopent-2-en-1-one; cidna: ciclopent-4-ene-1,3-dione; oct-et: octanoato de etilo; lev-et:
levulinato de etilo; dec-et: decanoato de etilo; mboct: 3-metilbutil octanoato; dec9-et: dec-9-enoate de etilo; fen-ac:
acetato de fenetilo; dod-et: dodecanoato de etilo; dod-isom: decanoato de isoamilo; tet-et: tetradecanoato de etilo;
hexd-et: hexadecanoato de etilo; 9-hexdec-et: 9-hexadecenoato de etilo; ocdec-et: octadecanoato de etilo; ole-et:
oleato de etilo; lin-et: linoleato de etilo; linto-et: linolenato de etilo; mttona: 2-metil tetrahidro-3-furanona; mfona: 5-
metil-2(3H)-furanona; acf: 2-acetylfuran; mttfona: 2-metil tetrahidrotiofene-3-ona; 5mf: 5-metil-furfural; alc-fuf :
alcohol furfurílico; mfne: 5-metil-2(5H)-furanona; linox: cis-óxido de linalol; terp: α-Terpineol; tner: trans-
nerolidol; dhfar: dihidrofarnesol y tfar: trans-farnesol. Atributos sensoriales: olor, aroma, sens tactls: sensaciones
táctiles. Condiciones de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm); 4 (25ºC, 0 vvm) en medio
reformulado; 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio basal y 9 (30ºC,
0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al centro).
179
Tabla 3.32. PLS factor loadings de los compuestos volátiles (variable en X) y niveles de agrado promedio de olor,
aroma y sensaciones táctiles (variables en Y) y su varianza explicada para cada componente.
WC1 WC2
n-Butanol -0.2829 Furfural dietil acetal -0.2957
Octan-3-ol -0.2783 trans-Nerolidol -0.2385
Linolenato de etilo -0.2373 5-Metil-furfural -0.2230
Tetradecanol -0.2130 Levulinato de etilo -0.2130
2-Fenil etanol -0.2027 Ácido acético -0.2069
Linoleato de etilo -0.1959 5-Metil-2(5H)-furanona -0.1819
Ácido Hexadecanoico -0.1938 Octan-3-ol -0.1781
Isobutanol -0.1820 Tetradecanol -0.1633
Octadecanoato de etilo -0.1784 5-Metil-2(3H)-furanona -0.1608
Hexadecanoato de etilo -0.1409 n-Butanol -0.1439
3-Metilbutil octanoato -0.1366 Acetaldehído -0.1311
Oleato de etilo -0.1237 Acetato de Etilo -0.1267
n-Propanol -0.1184 α-Terpineol -0.1115
Ácido isobutírico -0.1067 Isobutanol -0.0975
2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona -0.1067 Linolenato de etilo -0.0852
Ácido acético -0.1028 Hexadecanoato de etilo -0.0751
5-Metil-furfural -0.0994 4-Penten-1-ol -0.0701
Furfural -0.0957 2-Fenil etanol -0.0661
Alcohol isoamílico -0.0827 Ácido isobutírico -0.0541
Tetradecanoato de etilo -0.0640 2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona -0.0541
Decanoato de isoamilo -0.0453 1-Hidroxi-2-propanona -0.0461
Acetaldehído -0.0417 Linoleato de etilo -0.0442
α-Terpineol -0.0376 Ácido Hexadecanoico -0.0285
4-Penten-1-ol -0.0347 trans-Farnesol -0.0251
Acetato de Etilo -0.0317 Ácido octanoico -0.0162
Octanoato de etilo -0.0216 Furfural -0.0036
Dodecanoato de etilo -0.0192 3-Metilbutil octanoato 0.0053
Furfural dietil acetal -0.0191 Octadecanoato de etilo 0.0103
Metanol 0.0021 Tetradecanoato de etilo 0.0283
trans-Nerolidol 0.0085 Dihidrofarnesol 0.0361
3-Etoxipropan-1-ol 0.0215 Acetoína 0.0389
Lactato de etilo 0.0273 Ciclopent-4-ene-1,3-dione 0.0452
5-Metil-2(5H)-furanona 0.0314 Acetato de fenetilo 0.0603
Levulinato de etilo 0.0338 cis-Óxido de linalol 0.0644
Ciclopent-2-en-1-one 0.0544 Metanol 0.0689
5-Metil-2(3H)-furanona 0.0677 Octanoato de etilo 0.1042
9-Hexadecenoato de etilo 0.0728 n-Propanol 0.1076
180
Decanoato de etilo 0.0788 3-Etoxipropan-1-ol 0.1183

1-Hidroxi-2-propanona 0.0841 Dodecanoato de etilo 0.1312
Ácido octanoico 0.0872 Alcohol isoamílico 0.1424
Dihidrofarnesol 0.0930 Oleato de etilo 0.1437
Dec-9-enoate de etilo 0.1182 Decanoato de isoamilo 0.1821
trans-Farnesol 0.1252 2-Acetil furan 0.1859
2-Acetil furan 0.1419 Lactato de etilo 0.2020
cis-Óxido de linalol 0.1499 Ácido decanoico 0.2032
2-Metil tetrahidro-3-furanona 0.1505 2-Metil tetrahidro-3-furanona 0.2116
Ciclopent-4-ene-1,3-dione 0.1793 Decanoato de etilo 0.2573
Acetato de fenetilo 0.1936 Dec-9-enoate de etilo 0.2720
Acetoína 0.2039 9-Hexadecenoato de etilo 0.3081
Alcohol furfurílico 0.2227 Ciclopent-2-en-1-one 0.3120
Ácido decanoico 0.2549 Alcohol furfurílico 0.3614
WC1 WC2
Olor 0.2115 Olor 0.0877
Sensaciones táctiles 0.2619 Aroma 0.1241
Aroma 0.2978 Sensaciones táctiles 0.1709
181
dhfar
fru
0.20
oca
humo
que fen-ac amargo alc-fen
isa
mttfona
0.10 cidnaisob alc isom hxa
alc-fuf ole-et
linox prop
car 9-hexdec
ast
0.00 lev-et mad solv ocol
wc[2]
suavd mboct
pic
etol dec9-et
dulce hyona mttona ciona dod-isom
dec-et
-0.10 dca met lac et
ac mfona ocdec-et dod-et
tfar tner fda oct-et
but ttdol
acf lin-et linto-et
mfne acet
-0.20 hexd-et
acet et furf
acet ac tet-et
pol
terp 5mf
-0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20 0.30

wc[1]
10
5 2
9
3
t [2 ]
0 7 1
8 4
5
-5 6
-1 0
-1 0 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10
t[1]
Figura 3.21 PLS de (A) los compuestos volátiles y frecuencias de descriptores en olor, aroma y sensaciones táctiles
de los (B) destilados obtenidos de las diferentes condiciones de cultivo probadas en las fermentaciones en continuo
de K. africana (K1) y S .cerevisiae (S1) en cultivo mixto. Compuestos volátiles mayoritarios: acet: acetaldehído;
met: metanol; acet-ac: ácido acético; prop: n-propanol; but: n-butanol; isob: isobutanol; alc-isom: alcohol isoamílico;
acet-et: acetato de etilo; lac-et: lactato de etilo y furf: furfural. Compuestos volátiles minoritarios: fda: furfural dietil-
acetal; isa: ácido isobutírico; oca: ácido octanoico; dca: ácido decanoico; hxa: ácido hexadecanoico; alc-fen: 2-fenil
etanol; pol: 4-Penten-1-ol; etol: 3-etoxipropan-1-ol; ocol: octan-3-ol; ttdol: tetradecanol; ac: acetoína; hyona: 1-
hidroxi-2-propanona; ciona: ciclopent-2-en-1-one; cidna: ciclopent-4-ene-1,3-dione; oct-et: octanoato de etilo; lev-et:
levulinato de etilo; dec-et: decanoato de etilo; mboct: 3-metilbutil octanoato; dec9-et: dec-9-enoate de etilo; fen-ac:
acetato de fenetilo; dod-et: dodecanoato de etilo; dod-isom: decanoato de isoamilo; tet-et: tetradecanoato de etilo;
hexd-et: hexadecanoato de etilo; 9-hexdec-et: 9-hexadecenoato de etilo; ocdec-et: octadecanoato de etilo; ole-et:
oleato de etilo; lin-et: linoleato de etilo; linto-et: linolenato de etilo; mttona: 2-metil tetrahidro-3-furanona; mfona: 5-
metil-2(3H)-furanona; acf: 2-acetylfuran; mttfona: 2-metil tetrahidrotiofene-3-ona; 5mf: 5-metil-furfural; alc-fuf :
alcohol furfurílico; mfne: 5-metil-2(5H)-furanona; linox: cis-óxido de linalol; terp: α-Terpineol; tner: trans-
nerolidol; dhfar: dihidrofarnesol y tfar: trans-farnesol. Descriptores sensoriales: solv: solvente, amargo, ast:
astringente, car: caramelo, dulce, fru: frutal, humo, mad: madera, pic: picante, que: quemante y suavd: suavidad.
Condiciones de cultivo: 1 (35ºC, 0 vvm); 2 (35ºC, 0.03 vvm), 3 (25ºC, 0.03 vvm); 4 (25ºC, 0 vvm) en medio
reformulado; 5 (35ºC, 0 vvm); 6 (35ºC, 0.03 vvm), 7 (25ºC, 0.03 vvm), 8 (25ºC, 0 vvm) en medio basal y 9 (30ºC,
0.015 vvm) en medio basal y reformulado (Punto al centro).
182
Tabla 3.33. PLS factor loadings de los compuestos volátiles (variable en X) y frecuencia de descriptores sensoriales
(variables en Y) y su varianza explicada para cada componente.
WC1 WC2
trans-Farnesol -0.2274 5-Metil-furfural -0.2631
trans-Nerolidol -0.1981 α-Terpineol -0.2625
1-Hidroxi-2-propanona -0.1691 4-Penten-1-ol -0.2410
5-Metil-2(5H)-furanona -0.1568 Tetradecanoato de etilo -0.2366
Ácido octanoico -0.1363 Ácido acético -0.2314
4-Penten-1-ol -0.1291 Furfural -0.2274
Levulinato de etilo -0.1276 Acetato de Etilo -0.2197
Ácido isobutírico -0.1208 Hexadecanoato de etilo -0.1976
2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona -0.1208 Acetaldehído -0.1818
α-Terpineol -0.1187 5-Metil-2(5H)-furanona -0.1613
Ácido acético -0.1078 Linoleato de etilo -0.1602
Furfural dietil acetal -0.0932 Linolenato de etilo -0.1513
Ácido decanoico -0.0661 2-Acetil furan -0.1450
Acetoína -0.0650 n-Butanol -0.1417
Acetato de fenetilo -0.0563 Tetradecanol -0.1372
Hexadecanoato de etilo -0.0548 Octanoato de etilo -0.1296
Ciclopent-4-ene-1,3-dione -0.0525 Dodecanoato de etilo -0.1294
5-Metil-2(3H)-furanona -0.0510 Furfural dietil acetal -0.1195
5-Metil-furfural -0.0388 Octadecanoato de etilo -0.1183
Isobutanol -0.0298 trans-Farnesol -0.1126
2-Acetil furan -0.0208 trans-Nerolidol -0.1074
Dihidrofarnesol -0.0064 Lactato de etilo -0.1029
cis-Óxido de linalol -0.0049 Metanol -0.1025
n-Butanol -0.0004 5-Metil-2(3H)-furanona -0.1009
Acetato de Etilo 0.0063 Acetoína -0.0946
Linoleato de etilo 0.0088 Ácido decanoico -0.0875
Metanol 0.0257 Decanoato de etilo -0.0816
Alcohol isoamílico 0.0282 Decanoato de isoamilo -0.0751
Linolenato de etilo 0.0405 Ciclopent-2-en-1-one -0.0716
Tetradecanoato de etilo 0.0444 2-Metil tetrahidro-3-furanona -0.0657
Octadecanoato de etilo 0.0607 1-Hidroxi-2-propanona -0.0625
3-Etoxipropan-1-ol 0.0682 Dec-9-enoate de etilo -0.0472
2-Fenil etanol 0.0732 3-Etoxipropan-1-ol -0.0440
Tetradecanol 0.0735 3-Metilbutil octanoato -0.0239
n-Propanol 0.0809 Octan-3-ol -0.0063
Acetaldehído 0.1037 Levulinato de etilo 0.0076
Dodecanoato de etilo 0.1115 9-Hexadecenoato de etilo 0.0417
183
Furfural 0.1179 cis-Óxido de linalol 0.0481

Alcohol furfurílico 0.1210 n-Propanol 0.0546
2-Metil tetrahidro-3-furanona 0.1298 Oleato de etilo 0.0620
Ácido Hexadecanoico 0.1425 Alcohol furfurílico 0.0726
Octan-3-ol 0.1747 Ácido Hexadecanoico 0.0768
Oleato de etilo 0.1786 Alcohol isoamílico 0.0908
Decanoato de etilo 0.1934 Isobutanol 0.0983
Lactato de etilo 0.1990 Ciclopent-4-ene-1,3-dione 0.1004
Ciclopent-2-en-1-one 0.2137 Ácido isobutírico 0.1219
9-Hexadecenoato de etilo 0.2500 2-Metil tetrahidrotiofene-3-ona 0.1219
Decanoato de isoamilo 0.2611 2-Fenil etanol 0.1326
3-Metilbutil octanoato 0.2896 Acetato de fenetilo 0.1385
Dec-9-enoato de etilo 0.3107 Ácido octanoico 0.1762
Octanoato de etilo 0.3191 Dihidrofarnesol 0.2654
WC1 WC2
Dulce -0.2201 Dulce -0.0772
Humo -0.1761 Picante -0.0376
Quemante -0.1618 Suavidad -0.0048
Suavidad -0.1428 Madera -0.0040
Picante -0.0612 Solvente 0.0012
Madera -0.0584 Astringente 0.0187
Solvente -0.0259 Caramelo 0.0481
Frutal 0.0161 Quemante 0.1299
Amargo 0.0369 Amargo 0.1389
Caramelo 0.1640 Humo 0.1475
Astringente 0.1791 Frutal 0.2377
184
3.5.6 Conclusiones
Las cinéticas de fermentación en continuo de K. africana en cultivo mixto con S. cerevisiae

fueron estudiadas. Se examinó el efecto del oxígeno, la temperatura y el medio de fermentación
sobre la supervivencia y capacidad fermentativa de K. africana al trabajar en cultivo mixto con S.
cerevisiae. De las condiciones probadas, el medio de fermentación fue el factor de mayor peso
sobre la supervivencia y capacidad fermentativa de K. africana y S. cerevisiae debido a que
durante las condiciones en medio reformulado, éstas levaduras presentaron la mayor estabilidad y
viabilidad celular (5 y 3 veces mayor) en comparación con las cinéticas de fermentación
efectuadas en medio basal. Asimismo, la temperatura y el oxígeno resultaron ser factores críticos
sobre el crecimiento de K. africana y S. cerevisiae, promoviéndose el mayor crecimiento y
viabilidad celular durante la tercera condición (25ºC, 0.03 vvm y medio reformulado). Sin
embargo, S. cerevisiae durante todas las condiciones fue la levadura dominante, presentando en
todo momento una alta eficiencia y capacidad fermentativa. Durante las condiciones examinadas,
se alcanzaron altos rendimientos de etanol muy cercanos al teórico, debido al mayor dominio de
S. cerevisiae. La producción de metabolitos como acetoína, ácido acético y ácido succínico
resultó afectada por la temperatura, el oxígeno y el medio de fermentación. El diacetilo y el 2-3-
butanediol, resultaron afectados por el oxígeno y el medio de fermentación, el glicerol por su
parte se vio afectado por el medio de fermentación y la temperatura. En relación a la composición
de compuestos volátiles el medio de fermentación fue el factor de mayor peso, debido a la
separación de las condiciones de cultivo. Durante las condiciones en medio reformulado (1 - 4) se
presentaron las mayores concentraciones alcoholes superiores, ácidos y ésteres y en las
condiciones en medio basal (5 - 8) se presentaron la mayores concentraciones de acetales,
cetonas, furanos, terpenos y aldehídos. Por su parte, el destilado del punto al centro presentó una
composición aromática muy semejante a la observada con los destilados en medio basal. La
evaluación sensorial de los destilados de los cultivos mixtos, determinó que no existen
diferencias significativas entre los destilados en los niveles de agrado promedio de olor y
sensaciones táctiles (P> 0.05), pero si se presentaron diferencias en el aroma entre los destilados
(P< 0.05). Asimismo los destilados de las condiciones tres, cuatro y nueve fueron seleccionados
como los más agradables en olor, aroma y sensaciones táctiles, debido a que durante estas
condiciones se encontraba una mayor prevalencia de K. africana (Figura 3.19). Por medio del
185
análisis de cuadrados mínimos parciales (PLS) fue posible asociar los compuestos volátiles de los
destilados con los niveles de agrado promedio de olor, aroma y sensaciones táctiles. Los
destilados de las primera, tercera y cuarta condición se distinguieron por influir sobre las notas
frutal, amargo, caramelo y astringente; los destilados de la segunda, séptima y novena condición
por presentar descriptores a humo, quemante, madera y solvente y los destilados de la quinta,
sexta y octava condición por presentar la mayor suavidad y estar asociados a las notas picante y
dulce.
186
DISCUSIÓN GENERAL

DISCUSIÓN GENERAL
DISCUSIÓN GENERAL
Del presente estudio de investigación, una serie de resultados fueron obtenidos, los cuales
explican el efecto del oxígeno, la temperatura y algunos factores de crecimiento (vitaminas y
aminoácidos) en la fermentación del jugo de agave en cultivo por lote y continuo para lograr una
mayor prevalencia y capacidad fermentativa de levaduras no-Saccharomyces del género
Kloeckera al trabajar en cultivo mixto con levaduras del género Saccharomyces. Para lograr este
objetivo diferentes cinéticas de fermentación en cultivo por lote y continuo fueron llevados a
cabo. En cultivo por lote se probó el efecto del medio de fermentación sobre la capacidad
fermentativa y aromática de las levaduras del género Kloeckera y Saccharomyces en mosto y
producto. Por su parte en las cinéticas de fermentación en cultivo continuo se observó el efecto
además del medio de fermentación, de las condiciones operacionales específicamente del flujo de
oxígeno y la temperatura sobre la supervivencia y capacidad fermentativa de K. africana al
trabajar en cultivo mixto con S. cerevisiae. De los resultados en cultivo por lote se observó que el
medio de fermentación es un factor que impacta en el crecimiento de las levaduras del género
Kloeckera, debido a que en medio basal éstas levaduras presentaron un bajo crecimiento y
capacidad fermentativa en cultivo puro; en cultivo mixto este mismo fenómeno se observó con
mayor detalle, debido a que ambas levaduras tanto Saccharomyces como Kloeckera redujeron
drásticamente su crecimiento en comparación con las cinéticas de fermentación efectuadas en
cultivo puro en medio basal. Por el contrario en medio reformulado un comportamiento diferente
fue observado, favoreciéndose el crecimiento y la capacidad fermentativa en ambos cultivos
(puro y mixto) de Kloeckera y Saccharomyces. Por ejemplo, K. africana en medio reformulado
aumentó 2.16 veces su población celular (UFC), 1.2 veces su formación de biomasa y 4.27 veces
su producción de etanol que en medio basal, consumiendo en todo momento los azúcares del
medio. En relación a S. cerevisiae indistintamente del medio de fermentación presentó una alta
eficiencia fermentativa, produciendo altas concentraciones de biomasa, UFC, etanol y un
completo consumo de azúcares. Con respecto a la síntesis de compuestos volátiles, de igual
manera que con las cinéticas de fermentación entre levaduras y cultivos, diferentes
comportamientos fueron observados. Por un lado las levaduras del género Kloeckera en cultivo
puro y mixto se caracterizaron por producir la mayor concentración de acetato de etilo, acetato de
fenetilo y acetato de isoamilo que las levaduras del género Saccharomyces que produjeron la
188
DISCUSIÓN GENERAL
mayor concentración de alcoholes superiores y acetaldehído en medio basal y reformulado. Al

analizar la composición de compuestos volátiles en destilado de los cultivos puros y mixto de K.
africana y S. cerevisiae en medio basal y reformulado, se observó a detalle la composición
aromática y sensorial de los destilados. Por un lado el destilado del cultivo puro de K. africana
presentó altas concentraciones de ácido acético, acetoína, cis-óxido de linalol y 5 metil furfural
en medio basal y reformulado, diferenciándose entre medios en la concentración de n-butanol,
furfural, acetato de fenetilo y 2-acetil furan principalmente. En relación a los destilados del
cultivo mixto en medio basal y reformulado, presentaron diferente composición de compuestos
volátiles, en medio basal los compuestos aromáticos diferenciadores fueron el n-propanol, el
ácido isobutírico y octanoico y el hexadecenoato-9-de etilo. Por su parte en medio reformulado
los compuestos característicos del destilado del cultivo mixto fueron el propionato de fenetilo,
hexadecanoato de etilo, dodecanoato de etilo, acetato de fenetilo, 2-acetil furan, 2-fenil etanol, 3-
fenil propianato y alcohol furfurílico. El destilado de S. cerevisiae por su parte se distinguió por
presentar de igual manera que en mosto la mayor concentración de alcoholes superiores como
alcohol isoamílico, acetaldehído y ésteres de cadena corta como octanoato, decanoato,
dodecanoato e isovalerato de fenetilo. Las diferencias observadas en la composición aromática de
los destilados en medio basal y reformulado, fue debida principalmente a la composición del
medio de cultivo y a las características propias de la cepa de levadura empleada (Romano et al.,
2003; Díaz-Montaño et al., 2008; Valle-Rodríguez et al., 2011). Las diferencias anteriores, se
confirman por la evaluación sensorial aplicada a los destilados, por medio de la prueba
discriminativa χ se observó que entre los destilados del cultivo puro de K. africana y el destilado
2
del cultivo mixto, existen diferencias significativas (P< 0.05), mientras que entre el destilado del
cultivo puro de K. africana y el destilado del cultivo puro de S. cerevisiae no se encontraron
diferencias significativas (P> 0.05). Asimismo a través de esta prueba, fue posible asociar
determinados descriptores en olor, aroma y sensaciones trigeminales a los destilados evaluados,
distinguiéndose el destilado de K. africana por presentar notas a dulce, fermentado, frutal y
quemante y el destilado de S. cerevisiae por presentar descriptores a frutal, madera, fermentado,
humo, dulce y quemante y el destilado del cultivo mixto, por su parte por presentar notas a nuez,
dulce, salado, madera, frutal y quemante.
189
DISCUSIÓN GENERAL
Una vez concluida la etapa de fermentaciones por lote, a partir de la selección de levaduras en
cultivo mixto, se realizaron fermentaciones en continuo empleado las cepas de levadura K.
africana y S. cerevisiae, con la finalidad de observar el efecto de las condiciones operacionales y
nutrimentales. Durante las condiciones estudiadas, en medio reformulado K. africana presentó la
mayor concentración de biomasa y viabilidad celular en comparación con las cinéticas efectuadas
en medio basal. Además del medio de fermentación, la temperatura y el oxígeno, mostraron ser
factores determinantes en el crecimiento de K. africana, favoreciéndose el mayor crecimiento en
la tercera condición (25ºC, 0.03 vvm y medio reformulado). Sin embargo a pesar de que K.
africana logró aumentar significativamente su crecimiento bajo estas condiciones de cultivo, S.
cerevisiae fue la levadura dominante durante todo el cultivo en las nueve condiciones probadas.
Asimismo que K. africana, la tercera condición de cultivo significativamente estimuló el
crecimiento de S. cerevisiae. La alta formación de biomasa y UFC de S. cerevisiae y K. africana
puede explicarse porque en presencia de oxígeno, una parte del flujo de carbono en la célula es
orientado a la producción de biomasa por activación de las enzimas involucradas en la
respiración celular y el transporte de electrones. Además el oxígeno actúa como factor de
crecimiento en la célula al estimular la síntesis de ácidos grasos insaturados (ácido oleico) y
esteroles (ergosterol) en la membrana plasmática, compuestos que están directamente
relacionados con la capacidad de la célula a tolerar altas concentraciones de etanol (Pina et al.
2004). En adición al oxígeno, las bajas temperaturas igualmente favorecen el crecimiento y
supervivencia de las levaduras particularmente de las no-Saccharomyces como K. africana
(Bilbao et al., 1997; Erten, 2002).
Durante las condiciones de cultivo en continuo, las levaduras estimularon la producción de

compuestos no volátiles y volátiles como respuesta a factores operacionales y nutrimentales. La
producción de ácido succínico, acetoína y ácido acético resultó fuertemente influenciados por la
temperatura, el oxígeno y el medio de fermentación (P< 0.05), produciéndose las mayores
concentraciones en la tercera, cuarta, séptima y octava condición de cultivo. Por su parte el
diacetilo y el 2-3-butanediol resultaron afectados por el oxígeno y el medio de fermentación (P<
0.05), presentándose las mayores concentraciones en la primera y quinta condición de
fermentación. El glicerol sólo resultó afectado por la temperatura y el medio de fermentación,
con la mayor concentración en la primera y cuarta condición. Sin duda alguna la composición del
190
DISCUSIÓN GENERAL
medio resultó ser el factor de mayor peso en la capacidad fermentativa y de síntesis de

compuestos volátiles de los cultivos mixtos, debido a que fue el factor que estuvo presente en un
mayor número de componentes durante el análisis de varianza y al hecho de que separó en dos
grupos principales las condiciones. De esta manera durante el análisis de compuestos volátiles en
mosto, durante las condiciones de cultivo en medio reformulado, se produjeron las mayores
concentraciones de 2-fenil etanol, n-propanol, alcohol isoamílico, n-butanol, hexanoato de etilo,
octanoato de etilo, decanoato de etilo y acetato de isoamilo y en las condiciones en medio basal
se encontraron las mayores concentraciones de metanol, acetato de fenetilo, acetaldehído y
acetato de etilo. En destilado, los compuestos volátiles mayoritarios como alcohol isoamílico y n-
propanol resultaron afectados por la alta temperatura, la microaireación y el medio de
fermentación, mientras que el isobutanol y el n-butanol sólo resultaron afectados por la alta
temperatura y el oxígeno, para el ácido acético, el oxígeno y el medio de basal fueron los factores
de mayor peso sobre su producción, el acetato de etilo resultó afectado por el medio basal, el
lactato de etilo por el oxígeno y el metanol, acetaldehído y furfural no resultaron afectados por
ninguno de los factores probados. Asimismo en el análisis de compuestos volátiles minoritarios,
el efecto del medio de fermentación fue nuevamente observado, debido a que estuvo presente en
un mayor número de componentes durante el análisis de varianza. De esta manera durante las
condiciones en medio reformulado (1 - 4) los destilados se inclinaron fuertemente a producir la
mayor concentración de ésteres, ácidos y alcoholes, mientras que durante las condiciones en
medio basal (5 - 8) los destilados influyeron en su mayoría a la producción de furanos, cetonas y
terpenos. Igualmente este hecho resulto ser un factor significativo en las cualidades sensoriales de
la bebida. Por pruebas de preferencia, se determinó el nivel de agrado de los destilados en olor,
aroma y sensaciones táctiles, resultando los destilados de las condiciones tres, cuatro y nueve los
más agradables en olor, aroma y sensaciones táctiles (Figura 3.19). El análisis de cuadrados
mínimos parciales (PLS) asoció los compuestos volátiles de los destilados con definidos atributos
sensoriales. Por un lado los destilados de la primera, tercera y cuarta condición presentaron
descriptores a astringente, caramelo, madera, amargo, frutal. Los destilados de la segunda,
séptima y novena condición presentaron notas a humo, quemante, madera y solvente y los
destilados de la quinta, sexta y octava condición presentaron la mayor suavidad e influyeron en
los descriptores picante y dulce. Sin duda alguna, las principales diferencias observadas en las
diferentes condiciones de cultivo, son debidas en su mayoría a las condiciones operacionales y
191
DISCUSIÓN GENERAL
nutrimentales, sin embargo no hay que dejar de lado las características aportadas por las
levaduras participantes, como son la alta eficiencia fermentativa característica de S. cerevisiae
(Swiegers et al., 2005) y la alta producción de compuestos sensorialmente importantes como
acetato de etilo, acetoína y acetato de fenetilo de K. africana (Romano et al., 1996; Romano et al.,
2003; Díaz-Montaño et al., 2008).
192
CONCLUSIONES
GENERALES

CONCLUSIONES GENERALES
Se identificó que las levaduras del género Kloeckera presentan un menor crecimiento (UFC y
biomasa) y capacidad fermentativa que las levaduras del género Saccharomyces en la
fermentación del jugo de agave en medio basal, debido a una limitación nutricional. Durante
estas fermentaciones, K. africana (K1) y S. cerevisiae (S1) fueron seleccionadas como las
mejores levaduras, debido a que presentaron las mejores cinéticas de fermentación y la menor
concentración de alcoholes superiores y acetaldehído en cultivo mixto. Posteriormente se estudió
el efecto de ciertos factores de crecimiento en la fermentación del jugo de agave sobre el
crecimiento y la capacidad fermentativa de K. africana en cultivo puro y mixto con S. cerevisiae.
Encontrándose que K. africana en medio reformulado aumentó 1.2 veces la formación de
biomasa, 2.16 y 15 veces la formación de UFC en cultivo puro y mixto, 4.27 veces la producción
de etanol y agotó completamente los azúcares del medio en comparación con las cinéticas de
fermentación obtenidas para la misma cepa en medio basal. Con estos resultados se confirma que
el limitado crecimiento y capacidad fermentativa de K. africana esta asociado principalmente a la
baja disponibilidad de nutrientes del jugo de agave. En relación a S. cerevisiae indistintamente
del medio de fermentación presentó una alta eficiencia fermentativa con altas producción de
alcoholes superiores y acetaldehído. K. africana en medio basal y reformulado presentó la mayor
concentración de ésteres de acetato, n-butanol, ácido acético, acetoína, 2-acetil furan y 5-metil
furfural, diferenciándose entre medios en la concentración de acetato de isoamilo, ácido
hexanoico, propanoico, octanoico, decanoico, hexadecanoico, acetaldehído, 1-hidroxy-2-
propanona, levulinato y decanoato de etilo. En cultivo mixto la aportación de ambas levaduras
fue evidente, debido a la presencia de compuestos volátiles característicos de cada cepa. En
medio basal el cultivo mixto se caracterizó por presentar concentraciones similares de alcoholes
superiores, acetaldehído y ésteres de etilo a las producidos por S. cerevisiae en cultivo puro y por
producir concentraciones intermediadas de ésteres de acetato, debido a la presencia de K.
africana durante la fermentación y por producir la mayor concentración de ácido isobutírico y
octanoico. En medio reformulado por su parte se distinguieron concentraciones similares de
acetato de isoamilo y 2-fenil etanol a las producidas por S. cerevisiae y concentraciones de n-
propanol, isobutanol, alcohol isoamílico y 2-acetil furan similares a las producidas por K.
africana, adicionalmente se produjeron concentraciones intermedias de ésteres de acetato, etilo y
194
acetoína debido al metabolismo asociado de ambas levaduras y se sinterizaron las mayores

concentraciones de hexadecanoato de etilo. En adición a la caracterización aromática, las
propiedades sensoriales de los destilados fueron evaluadas, encontrándose que no existen
diferencias significativas en el sabor y el aroma entre los destilados del cultivo puro de S.
cerevisiae y K. africana (P> 0.05), caracterizándose el destilado de S. cerevisiae por ser el más
agradable en olor, aroma y sensaciones táctiles y por presentar descriptores a frutal, madera,
fermentado, humo, dulce y quemante y el destilado de K. africana por presentar descriptores a
dulce, fermentado, frutal y quemante y niveles de agrado similares a los reportados para el
destilado del cultivo mixto, el cual se distinguió por presentar notas a nuez, dulce, salado, madera,
frutal y quemante.
Debido a que K. africana declinó su concentración celular en las fermentación por lote en medio
reformulado en cultivo puro y mixto, se analizó el efecto de los factores operacionales (oxígeno y
temperatura) y nutrimentales sobre la supervivencia y capacidad fermentativa de K. africana en
la fermentación en continuo en cultivo mixto con S. cerevisiae. El medio de fermentación fue el
factor de mayor peso sobre la capacidad fermentativa y aromática de los microorganismos
estudiados en cultivo mixto, debido a que durante las condiciones en medio reformulado (1, 2, 3,
4 y 9) se presentó la mayor prevalencia y capacidad fermentativa de K. africana y S. cerevisiae
por un aumentó de 1.45 veces mayor en la formación de biomasa, 3.13 y 4.9 veces mayor en la
formación de UFC en S. cerevisiae y K. africana respectivamente, 1.12 veces mayor en la
producción de etanol y alrededor del 90% de consumo de los azúcares en comparación con las
condiciones en medio basal (5, 6, 7 y 8). Sin embargo la condición que favoreció el mayor
crecimiento y capacidad fermentativa de K. africana y S. cerevisiae fue la tercera condición
(25ºC, 0.03 vvm y medio reformulado), donde se alcanzaron concentraciones de biomasa de 5.85
gL-1, de UFC de 1057.53 y 7855×106 UFC mL-1 para K. africana y S. cerevisiae respectivamente,
de etanol de 51.31 gL-1 y se consumieron completamente los azúcares reductores, debido a la
presencia del oxígeno que estimuló la síntesis de ácido oleico y ergosterol (compuestos asociados
a la estabilidad de la membrana), lo que permitió mantener la viabilidad y actividad fermentativa
de K. africana aumentando la tolerancia al etanol. En la composición aromática durante las
condiciones en medio reformulado (1, 2, 3, 4 y 9) se observaron las mayores concentraciones de
alcoholes superiores, ésteres de etilo de cadena larga como el 9-hexadecenoato de etilo y en las
195
condiciones en medio basal (5, 6, 7 y 8) se presentaron las mayores concentraciones de ésteres de

acetato, acetaldehído, ácido acético, furanos, cetonas, terpenos y acetales, por efecto de la
composición en nutrientes del medio de cultivo, la temperatura de fermentación y el oxígeno. La
caracterizaron sensorialmente de los destilados mostró que los destilados de las condiciones tres,
cuatro y nueve fueron los más agradables en olor, aroma y sensaciones táctiles, posiblemente por
el mayor dominio de K. africana. Asimismo los destilados de la segunda, séptima y novena
condición fueron asociados a los descriptores humo, quemante, madera y solvente; los destilados
de la quinta, sexta y octava condición a las notas dulce, picante y suavidad y los destilados de las
la primera, tercera y cuarta condición a los descriptores frutal, caramelo y astringente, debido a
los compuestos volátiles sintetizados durante las condiciones de cultivo, que marcadamente
modificaron la composición aromática y sensorial de la bebida.
Los resultados del presente trabajo dan evidencia de que bajo las condiciones adecuadas de
fermentación y en presencia de un medio rico en nutrientes, K. africana es capaz de aumentar su
prevalencia y capacidad fermentativa durante la fermentación del jugo de agave en cultivo mixto
con S. cerevisiae, por lo que su contribución en la composición aromática y sensorial de la bebida
podría resultar una ventaja en el mercado de nuevas marcas de Tequila por la incorporación de
olores y sabores especiales. Asimismo la implementación del sistema en continuo en la
fermentación del jugo de agave en cultivo mixto podría representar una alternativa tecnológica
por el aumento en la productividad y por la incorporación de compuestos volátiles importantes
como los ésteres, debido a que durante éstos cultivos más de 41 compuestos volátiles
minoritarios fueron identificados y cuantificados en comparación con los sistemas por lote donde
se identificó una menor cantidad (cerca de 24 compuestos), sin embargo, son necesarios un
mayor número de estudios en torno a la utilización de otras fuentes de crecimiento que garanticen
un proceso más económico y rentable.
196
PERSPECTIVAS

PERSPECTIVAS
PERSPECTIVAS
De los resultados y conclusiones del presente trabajo de investigación se pueden señalar las
siguientes perspectivas:
• Validar el efecto de las mejores condiciones operacionales y nutrimentales encontradas en

el sistema continuo en una fermentación por lote, para observar su impacto sobre el
crecimiento y la capacidad fermentativa de K. africana.
• Estudiar a detalle el efecto de la microaireación sobre la composición de lípidos de la
membrana plasmática de las levaduras no-Saccharomyces cuando es expuesta a altas
concentraciones de etanol.
• Realizar un estudio a detalle de otros factores en términos bioquímicos, genéticos y
moleculares que pudiesen estar implicados con la muerte de las levaduras no-
Saccharomyces durante la fermentación del jugo de agave en cultivo mixto con S.
cerevisiae.
• Analizar el efecto de los factores operacionales y nutrimentales en otras levaduras no-
Saccharomyces en la fermentación del jugo de agave en cultivo mixto con S. cerevisiae.
• Validar el escalamiento del proceso a nivel piloto para analizar su posible incorporación
al sector industrial.
• Analizar el efecto de suplementar el jugo de agave con otras fuentes de nitrógeno
orgánico y factores de crecimiento provenientes de desechos para reducir costos de
proceso.
• Realizar un estudio más complejo de la huella aromática de los compuestos volátiles
minoritarios de los destilados obtenidos de las mejores condiciones en reactor continuo,
por medio de extracción líquido-líquido y análisis en CG-EM.
• Realizar un perfil sensorial en olor, aroma, gusto y sensaciones trigeminales de los
destilados que tuvieron el mayor nivel de agrado de la prueba a consumidores, para poder
asociar los compuestos volátiles minoritarios de los extractos con definidos descriptores
sensoriales.
198
BIBLIOGRAFÍA

BIBLIOGRAFÍA
BIBLIOGRAFÍA
Aguilar-Cisneros, B.O., López, M.G., Richling, E., Heckel, F. and Schreier, P. (2002). Tequila
authenticity assessment by headspace SPME-HRGC-IRMS analysis of 13C/12C and 18O/16O
ratios of ethanol. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(26), 7520-3.
Albergaria, H., Torrao, A.R., Hogg, T. and Girio, F. (2003). Physiological behaviour of
Hanseniaspora guillermondii under aerobic glucose-limited continuous cultures. FEMS Yeast
Research, 3(2), 211-216.
Amaral, H.G. Fermentación Alcohólica, C. GEPLACEA, Editor. 1989. p. 11, 35. México, DF.
Arellano, M., Pelayo, C., Ramírez, J. and Rodríguez, I. (2008). Characterization of kinetic
parameters and the formation of volatile compounds during the tequila fermentation by wild
yeasts isolated from agave juice. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 35(8),
835-41.
Bely, M., Stoeckle, P., Masneuf-Pomaréde, I., and Dubourdieu, D. (2008). Impact of mixed
Torulaspora delbrueckii-Saccharomyces cerevisiae culture on high-sugar fermentation.
International Journal of Food Microbiology, 122(3), 312-20.
Benn, S. M., and Peppard, T.L. (1996). Characterization of Tequila Flavor by Instrumental and
Sensory Analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(2), 557-566.
Berry, D.R. and Watson, D.C. (1991). Production of Organoleptic Compounds. In: Yeast
Biotechnology. Berry, D.R., Russell, I. and Stewart, G.G. eds. Allen & Unwin. London.
Bilbao, A., Irastorza, A., Dueñas, M. and Fernández, K. (1997). The effect of temperature on the
growth of strains of Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae in apple juice
fermentation. Letters in Applied Microbiology, 24(1), 37-9.
Bisson, L.F., and Karpel, J.E. (2010). Genetics of Yeast Impacting Wine Quality. Annual Review
of Food Science and Technology - (new in 2010), 1(1), 139-162.
200
BIBLIOGRAFÍA
Black, J.G. (1996). Microbiology: Principles and Applications. Third Edition. Prentice Hall.
Upper Saddle River, New Jersey. pp. 136-140, 151-153.
Brown, C.M., Campbell I. and Priest F.G. (1989). "Sistemas Microbianos". Introducción a la
Biotecnología. Editorial Acribia. p. 11. México, DF.
Cantor-Solórzano, E. (1999) Evaluación de los compuestos volátiles representativos del olor del
Tequila, correlación de mediciones instrumentales y mediciones sensoriales. Centro Universitario
de Ciencias Exactas e Ingenierías (CUCEI). Universidad de Guadalajara. Guadalajara, Jalisco.
Çaylak, B. and Vardar Sukan, F. (1998). Comparison of different production processes for
bioethanol. Turkish Journal of Chemistry, 22, 351–360.
Cedeño, M. (1995). Tequila production. Critical reviews in Biotechnology, 15(1), 1-11.
Chaney, L and Marbach, P. (1961). Modified Reagents of Urea and for Determination Ammonia.
Clinical Chemistry, 8(2), 130-132.
Chongxiao, G. and Fleet, G.H. (1988). The effects of temperature and pH on the ethanol
tolerance of the wine yeasts, Saccharomyces cerevisiae, Candida stellata and Kloeckera
apiculata. Journal of Applied Microbiology, 65(5), 405-409.
Ciani, M., Beco, L. and Comitini, F. (2006). Fermentation behaviour and metabolic interactions
of multistarter wine yeast fermentations. International Journal of Food Microbiology, 108(2),
239-45.
Ciani, M., Comitini, F., Mannazzu, I. and Domizio, P. (2010). Controlled mixed culture
fermentation: a new perspective on the use of non-Saccharomyces yeasts in winemaking. FEMS
Yeast Research, 10(2), 123-33.
Ciani, M. and Fatichenti, F. (1999). Selective sugar consumption by apiculate yeasts. Letters in
Applied Microbiology, 28(3), 203-206.
Ciani, M. and Picciotti, G. (1995). The growth kinetic and fermentation behaviour of some non-
Saccharomyces yeast associated with wine-making. Biotechnology Letters, 17(ll), 1247-1250.
201
BIBLIOGRAFÍA
Clemente-Jiménez, J.M., Mingorance-Cazorla, L., Martínez-Rodríguez, S., Heras-Vázquez,

F.J.L., and Rodríguez-Vico, F (2005). Influence of sequential mixtures on wine fermentation.
International Journal of Food Microbiology, 98: 301–308.
Cordero-Otero, R., Ubeda-Iranzo, JF., Briones-Pérez, N., Villena, M.A., Pretorius, I.S. and Van
Rensburg P. (2003). Characterization of the β-Glucosidase Activity Produced by Enological
Strains of non-Saccharomyces Yeasts. Food Microbiology & Safety, 68(8), 2564-2569.
Díaz-Montaño, D.M. and Ramírez-Córdova, J.J (2009). The Fermentative and Aromatic Ability
of Kloeckera and Hanseniaspora Yeast. Yeast Biotechnology: Diversity and Applications.
Satyanarayana T and Kunze G. (Eds), First Edition, 281-305. Springer Publishers. N. Delhi.
Díaz-Montaño, D.M., Favela-Torres, E. and Córdova, J. (2010). Improvement of growth,

fermentative efficiency and ethanol tolerance of Kloeckera africana during the fermentation of
agave tequilana juice by addition of yeast extract. Journal of the Science of Food and Agriculture,
90(2), 321-8.
Díaz-Montaño, D.M., Délia, M.L., Estarrón-Espinosa, M. and Strehaiano, P. (2008).

Fermentative capability and aroma compound production by yeast strains isolated from Agave
tequilana Weber juice. Enzyme and Microbial Technology, 42(7), 608-616.
Díaz-Montaño, D.M. (2004). Estudio fisiológico y cinético de dos cepas de levadura involucradas
en la etapa fermentativa de la elaboración de tequila. Doctorat de L’I.N.P.T. et de L’Université
de Guadalajara: Guadalajara Jalisco, México.
Díaz-Montaño, D.M (2007-2010). Estudio de la producción de biomasa, etanol y compuestos

aromáticos en cepas de levadura tequileras del genero Kloeckera y Saccharomyces
cultivadas en continuo. Proyecto de fondo SEP-CONACYT: Proyecto PROTECO No. 24547.
Convocatoria 2005 Ciencia Básica Joven Investigador.
Erten, H. (2002). Relations between elevated temperatures and fermentation behaviour of

Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed
cultures. Journal of Microbiology, 373-378.
202
BIBLIOGRAFÍA
Estarrón-Espinosa, M.E (1997). Identificación de los principales compuestos volátiles que

caracterizan al Tequila 100% de agave. Tesis de maestría en Procesos Biotecnológicos,
Universidad de Guadalajara. Guadalajara Jalisco, México.
Fleet, G.H. (2003). Yeast interactions and wine flavour. International Journal of Food
Microbiology, 86(1-2), 11-22.
González-Robles, I.W. (2009). Estudio del efecto de la fermentación de jugo de agave en cultivos
mixto sobre las cualidades aromáticas del producto final. Proyecto de Residencias Ingeniería
Bioquímica. Instituto Tecnológico de Jiquilpan. Jiquilpan, Michoacán, Junio del 2009.
Hernández-Cortés, G., Córdova-López, J.A, Herrera-López, E.J., Morán-Marroquín, G.A., Valle-

Rodríguez, J.O. and Díaz-Montaño, D.M. (2010). Effect of pH, aeration and feeding non-
sterilized agave juice in a continuous agave juice fermentation. Journal of the Science of Food
and Agriculture, 90(9), 1423-8.
Hansen, H., Nissen, P., Sommer, P., Nielsen, J. C. and Arneborg, N. (2001). The effect of oxygen
on the survival of non-Saccharomyces yeasts during mixed culture fermentations of grape juice
with Saccharomyces cerevisiae. Journal of Applied Microbiology, 91(3), 541-7.
Lachance, M. (1995). Yeast communities in a natural tequila fermentation. Antonie van

Leeuwenhoek, 68(2), 151-60.
Ludovico, P., Sousa, M. J., Silva, M. T., Leão, C., and Côrte-Real, M. (2001). Saccharomyces
cerevisiae commits to a programmed cell death process in response to acetic acid. Journal of
Microbiology, 147: 2409-15.
Mancilla-Margalli, N.A and López, M.G. (2002). Generation of Maillard compounds from inulin
during the thermal processing of agave tequilana Weber Var. azul. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 50(4), 806-12.
Martens, M. (1999). A philosophy for sensory science. Food Quality and Preference, 10(4-5),
233–244.
203
BIBLIOGRAFÍA
Mateo, J.J and Stefano, R.D. (1997). Description of the β-glucosidase activity of wine yeasts.
Journal of Food Microbiology. 14(6), pp. 583-591.
Meilgaard, M., Civille, G.V. and Carr, B.T. (1999). Sensory Evaluation Techniques (pp. 37-41).
CRC Press.
Mendoza, L.M., Nadra, M. C.M. and Farías, M.E. (2007). Kinetics and metabolic behavior of a
composite culture of Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae wine related strains.
Biotechnology Letters, 29(7), 1057-63.
Miller, G.L. (1959). Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar.
Analytical Chemistry, 31(3), 426-428.
Morán-Marroquín, G.A., Córdova, J., Valle-rodríguez, J.O., Estarrón-espinosa, M. and Díaz-

Montaño, D.M. (2011). Effect of dilution rate and nutrients addition on the fermentative
capability and synthesis of aromatic compounds of two indigenous strains of Saccharomyces
cerevisiae in continuous cultures fed with Agave tequila juice. International Journal of Food
Microbiology.
Moreira, N., Mendes, F., Hogg, T. and Vasconcelos, I. (2005). Alcohols, esters and heavy
sulphur compounds production by pure and mixed cultures of apiculate wine yeasts. International
Journal of Food microbiology, 103(3), 285-94.
Moreno, J. J., Millán, C., Ortega, J. M. and Medina, M. (1991). Analytical differentiation of wine
fermentations using pure and mixed yeast cultures. Journal of Industrial Microbiology, 7(3), 181-
189.
Nagodawithana, T. W., Castellano, C. and Steinkraus, K. H. (1974). Effect of dissolved oxygen,

temperature, initial cell count, and sugar concentration on the viability of Saccharomyces
cerevisiae in rapid fermentations. Applied microbiology, 28(3), 383-91.
Nissen, P. and Arneborg, N. (2003). Characterization of early deaths of non-Saccharomyces

yeasts in mixed cultures with Saccharomyces cerevisiae. Archives of microbiology, 180(4), 257-
63.
204
BIBLIOGRAFÍA
Norma Oficial Mexicana NOM-006-SCFI-2005. (2005). Bebidas alcohólicas-Tequila-

Especificaciones. Secretaría de Comercio y Fomento Industrial. Dirección General de Normas.
Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994. (1994). Método para la cuenta de bacterias

aerobias en placa. Dirección General de Normas.
Oliveira, E.S., Cardello, H. M. A. B., Jerónimo, E. M., Souza, E. L. R. and Serra, G. E. (2005).
The influence of different yeasts on the fermentation, composition and sensory quality of
cachaça. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21(5), 707-715.
Otero, R.C., Iranzo, J.F.U., Briones-Pérez, A.I., Potgieter, N., Villena, M.A. and Pretorius, I.S.
(2003). Characterization of the Beta-Glucosidase Activity Produced by Enological Strains of
Non-Saccharomyces Yeasts. Journal of Food Microbiology and Safety, 68(8), 2564-2569.
Palmqvist, E., Almeida, J.S. and Hahn-Hägerdal, B. (1999). Influence of furfural on anaerobic
glycolytic kinetics of Saccharomyces cerevisiae in batch culture. Biotechnology and
Bioengineering, 62(4), 447-54.
Pelczar, M., Reid, R.D. and Chan, E.C.S. (1990). Microbiología. McGraw Hill, México.
Pérez-Nevado, F., Albergaria, H., Hogg, T. and Girio, F. (2006). Cellular death of two non-
Saccharomyces wine-related yeasts during mixed fermentations with Saccharomyces cerevisiae.
International Journal of Food Microbiology, 108(3), 336-45.
Pérez, F., Regodón, J. A., Valdés, M.E., De Miguel, C. and Ramírez, M. (2000). Cycloheximide
resistance as marker for monitoring yeast in wine fermentations. Food Microbiology, 17 (2),
119-128.
Pérez, F., Ramírez, M. and Regodón, J.A. (2001). Influence of killer strains of Saccharomyces
cerevisiae on wine fermentation. Antonie van Leeuwenhoek, 79: 393-9.
Pina, C., Santos, C., Couto, J. A., and Hogg, T. (2004). Ethanol tolerance of five non-
Saccharomyces wine yeasts in comparison with a strain of Saccharomyces cerevisiae—influence
of different culture conditions. Food Microbiology, 21(4), 439-447.
205
BIBLIOGRAFÍA
Pinal, L., Cornejo, E., Arellano, M., Herrera, E., Nuñez, L. and Arrizon, J (2009). Effect of
Agave tequilana age, cultivation field location and yeast strain on tequila fermentation process.
Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 36(5), 655-61.
Prado, M.N., (2002) Estudio de los compuestos volátiles en las diferentes etapas del proceso de
producción del tequila. Tesis de doctorado en procesos biotecnológicos. Universidad de
Guadalajara, Jalisco, México
Pretorius, I.S. (2000). Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to the
ancient art of winemaking. Yeast, 16(8), 675-729.
Quintero Rodolfo (1993). Ingeniería Bioquímica: Teoría y Aplicaciones, Ed. Alambra Mexicana,
Capítulo 5. México.
Rojas, V., Gil, J.V., Piñaga, F. and Manzanares, P. (2001). Studies on acetate ester production by
non-Saccharomyces wine yeasts. International Journal of Food Microbiology, 70(3), 283-9.
Rojas, V., Gil, J.V., Piñaga, F. and Manzanares, P. (2003). Acetate ester formation in wine by
mixed cultures in laboratory fermentations. International Journal of Food Microbiology, 86(1-2),
181-188.
Romano, P., Fiore, C., Paraggio, M., Caruso, M. and Capece A. (2003). Function of yeast
species and strains in wine flavour. International Journal of Food Microbiology, 86(1-2), 169-180.
Romano, P., Suzzi, G., Biologia, D. and Agro-forestali, D.B. (1996). Minireview: origin and
production of Acetoin during wine yeast fermentation. Journal of Applied and Enviromental
Microbiology, 62(2), 309-315.
Romano, P., Suzzi, G., Comi, G., Zironi, R. and Maifreni, M. (1997). Glycerol and other
fermentation products of apiculate wine yeasts. Journal of Applied Microbiology, 82(5), 615-8.
Romano, P., Suzzi, G., Turbanti, L. and Polsinelli, M. (1994). Acetaldehyde production in
Saccharomyces cerevisiae wine yeasts. FEMS Microbiology Letters, 118(3), 213-218.
206
BIBLIOGRAFÍA
Saerens, S.M.G., Delvaux, F., Verstrepen, K.J., Van Dijck, P., Thevelein, J.M. and Delvaux, F.
R. (2008). Parameters affecting ethyl ester production by Saccharomyces cerevisiae during
fermentation. Applied and Environmental Microbiology, 74(2), 454-61.
Schreier, P. (1979) Flavour composition of wines. CRC Critical Reviews in Food Science and
Nutrition, 59–111.
Swiegers, J.H. and Pretorius, I.S. (2005). Yeast modulation of wine flavor. Advances in Applied
Microbiology, 57(05), 131-75.
Swiegers, J.H., Bartowsky, E.J., Henschke, P.A and Pretorius, I.S. (2005). Yeast and bacterial
modulation of wine aroma and flavour. Australian Journal of Grape and Wine Research, 11(2),
139-173.
Ugliano, M., Travis, B., Francis, I.L. and Henschke, P.A. (2010). Volatile Composition and
Sensory Properties of Shiraz Wines As Affected by Nitrogen Supplementation and Yeast
Species: Rationalizing Nitrogen Modulation of Wine Aroma. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, (16), 12417-12425.
Vallejo-Cordoba, B., González-Córdova, A.F. and Estrada-Montoya, M. (2004). Tequila volatile

characterization and ethyl ester determination by solid phase microextraction gas
chromatography/mass spectrometry analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
52(18), 5567-71.
Valle-Rodríguez Juan Octavio, Estarrón Espinoza Mirna, Morán Gabriel Alonso, Hernández
Cortés Guillermo y Díaz - Montaño Dulce María (2009). Influencia de las fuentes de nitrógeno
orgánico e inorgánico en la fermentación de jugo de agave con una levadura no convencional
(Kloeckera africana). Bebidas Mexicanas, 2009. p. 11 - 16.
Valle-Rodríguez, J.O., Hernández-Cortés, G., Córdova, J., Estarrón-Espinosa, M. and Díaz-

Montaño, D.M. (2011). Fermentation of Agave tequilana juice by Kloeckera africana: influence
of amino-acid supplementations. Antonie van Leeuwenhoek. doi:10.1007/s10482-011-9622-x
Valle-Rodríguez, J.O. (2009). Estudio Fisiológico y de los requerimientos nutricionales de

Kloeckera africana implicados en una fermentación alcohólica eficiente del jugo de Agave
207
BIBLIOGRAFÍA
tequilana Weber var. Azul. Posgrado CIATEJ. Centro de Investigación y Asistencia en

Tecnología y Diseño del estado de Jalisco, A.C. Guadalajara Jalisco. p. 186.
Villena, M., Iranzo, J. and Pérez, A. (2007). Glucosidase activity in wine yeasts: Application in
enology. Enzyme and Microbial Technology, 40(3), 420-425.
Virkajarvi, I. (2001). Feasibility of continuous main fermentation of beer using immobilized

yeast. VTT publications, technical research centre of Finland Espoo.
Zohre, D.E. and Erten, H. (2002). The influence of Kloeckera apiculata and Candida
pulcherrima yeasts on wine fermentation. Process Biochemistry, 38(3), 319-324.
Zironi, R., Romano, P., Suzzi, G., Battitutta, F. and Comi, G. (1993). Volatile metabolites
produces by mixed and sequential cultures of Hanseniaspora guillermondii or Kloeckera
apiculata and Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Letters, 15: 235-238.
Zuin Alice. (2009). Estrés oxidativo endógeno en la levadura Schizosacchaormyces pombe: su

papel en la regulación del envejecimiento cronológico y en la activación de la quinasa Sty1. Tesis
Doctoral. Universitat Pompeu Fabra. Barcelona, España
Zuzuarregui, A., and del Olmo, M. (2004). Analyses of stress resistance under laboratory
conditions constitute a suitable criterion for wine yeast selection. Antonie van Leeuwenhoek,
85(4), 271-80.
208
ANEXOS

ANEXOS
ANEXOS
ANEXO 1
Composición del medio agar nutriente WL de Fluka Analytical
Ingredientes gL-1
Hidrolizado enzimático de caseína 5
Extracto de levadura 4
Destroza 50
Monopotasio de fosfato 0.55
Cloruro de potasio 0.425
Cloruro de calcio 0.125
Sulfato de magnesio 0.125
Cloruro férrico 0.0025
Sulfato de manganeso 0.0025
Verde de bromocresol 0.022
Agar 20
pH final 5.5±0.2 a 25ºC
210
ANEXOS
ANEXO 2
Compuestos minoritarios calibrados y homólogos (familia química) cuantificados a partir

del estándar puro
Compuesto de la Curva Compuesto Cuantificado Familia de Compuestos

1) Ácido isobutírico Ácido isobutírico
2) Ácido hexanoico Ácido hexanoico
3) Ácido octanoico Ácido octanoico Ácidos
4) Ácido decanoico Ácido decanoico
Ácido hexadecanoico
3-Etoxi-1-propanol
5) 1-Hexanol
2-Etil-1-hexanol Alcohol
6) 2-fenil etanol 2-fenil etanol
Acetoína
7) Acetoína
1-hidroxi-2-propanona Cetona
8) β−Damascenona β-Damascenona
9) Octanoato de etilo Octanoato de etilo
10) Lactato de etilo Lactato de etilo
Decanoato de etilo
9-Decenoato de etilo
Dodecanoato de etilo
Decanoato de isoamilo
11) Decanoato de etilo
Miristato de etilo
Hexadecanoato de etilo Ester
9-Hexadecenoato de etilo
Etil octadecanoato
Oleato de etilo
12) Succinato de etilo Linoleato de etilo
Linolenato de etilo
13) Levulinato de etilo Levulinato de etilo
14) Acetato de fenetilo Acetato de fenetilo
2-Metil tetrahidrofuran-3-ona
15) 2-Metil tetrahidrofuran-3-ona 5-Metil-2(3H)-Furanona
5-Metil-2(5H)-Furanona
Furano
2-Acetil furan
16) 2-Acetil furan
Furfural
17) 5-Metil furfural 5-Metil furfural
18) Linalol cis-Óxido de linalol Terpeno
211
ANEXOS
19) 4-terpineol 4-terpineol

α-Terpineol
trans-Nerolidol
20) α-Terpineol
Dihydro-farnesol
trans-Farnesol
212
ANEXOS
ANEXO 3
Cuestionario de evaluación sensorial empleado para las pruebas hedónicas
Nombre: ____________________________________________________ Fecha: ___________
Edad: 18 – 25 ___________ 26 – 30 ___________ 30 -35 ___________ 36 – adelante ______
Instrucciones:
Conteste las siguientes preguntas:
1. Acostumbra consumir Tequila: SI _______ NO _______

Indique la frecuencia de consumo: Una vez por semana _______
Una vez por mes _______
Esporádicamente _______
2. Pruebe las siguientes muestras de TEQUILAS codificadas con el número correspondiente;

e indique el nivel de agrado en cuanto a olor, poniendo el código correspondiente sobre la línea
bajo la carita a la cual corresponda su percepción.
_______ _______ _______ _______ _______ _______

e indique el nivel de agrado en cuanto aroma en boca, poniendo el código correspondiente sobre
la línea bajo la carita a la cual corresponda su percepción.
_______ _______ _______ _______ _______ _______
213
ANEXOS

e indique el nivel de agrado en cuanto a sensaciones táctiles: astringente (sequedad en boca),
quemante, amargor, suavidad y viscosidad poniendo el código correspondiente sobre la línea bajo
la carita a la cual corresponda su percepción.
_______ _______ _______ _______ _______ _______
5. Mencione la(s) propiedad(es) sensoriales que consideró para determinar el nivel de agrado de
las muestras
_________________________________________________________________
Gracias por su participación!!!
_____________________________
FIRMA
214
ANEXOS
ANEXO 4
Cuestionario “A” “No-A” y descriptores sensoriales de olor, aroma, gusto y sensaciones

táctiles
Nombre: ______________________________________Fecha: ___________No. Cubículo: ___________
Instrucciones:
A continuación encontrara tres muestras de TEQUILA codificadas, compárela contra la

referencia etiquetada como A y conteste lo que se le pide.
1.- Antes de tomar la prueba, familiarícese con el olor, aroma y gusto de las muestras “A” y “No
– A” que están disponibles.
2.- Pruebe las muestras de izquierda a derecha. Después de cada muestra, anote su respuesta en la
tabla de abajo, enguaje su paladar con agua y espere un momento entre muestra y muestra.
3.- Para cada muestra, indique si es semejante o no a la referencia (A).
Muestra Código A No A
1
2
3
4.- Como dato adjunto encontrará una lista de descriptores, trate en la medida de lo posible de
identificar aquellos que están presentes en las muestras codificadas y anótelos en la tabla de abajo.
5.- Asimismo si percibe algún otro descriptor en la muestra que no se encuentre en la lista, por
favor anótelo en la hoja mencionando si lo percibe en: olor, aroma, gusto y/o sensaciones
trigeminales.
Recuerda que es absolutamente necesario que expreses solo tu primera impresión.
Muestra Código Descriptores

1
2
3
Gracias por tu participación!!!
_____________________________
FIRMA
215
ANEXOS
DESCRIPTORES
Olor Aroma Gusto S. Trigeminales
Agave Cocido Aceituna Ácido Picante
Almendra Anís Amargo quemante
Anís Astringente Dulce Metálico
Barniz Barniz Salado Astringente
Café Caramelo
Caramelo Eucalipto
Ciruela Fenólico
Cítrico Fermentado
Coco rancio Frutal
Fermentado avinagrado Humo
Floral Madera
Fruta descompuesta Madera resinosa
Fruta Fermentada Mantequilla artificial
Fruta Seca Mentol
Frutal Paja húmeda
Madera Picante
Madera resinosa Pino
Manzana Roja Plátano
Nuez Plátano fermentado
Paja húmeda Resina de pino
Picante Salado
Piloncillo Soda
Trapo húmedo solvente frutal
Vainilla Vinagre
Vinagre

216
ANEXOS
ANEXO 5
Modelos matemáticos y matemático-fisiológicos para la cinética de fermentación
Modelo cinético para la

formación de biomasa Fórmula
𝑑𝑥
Exponencial = 𝜇! 𝑋
𝑑𝑡
𝑑𝑥 𝑋
= 𝜇! 𝑋(1 − )
Logístico 𝑑𝑡 𝑋!
Marquard (Quimiad) 𝑑𝑥 𝑆
= 𝜇! 𝑋
𝑑𝑡 𝐾! + 𝑆
Grompertz 𝑑𝑥 !!"# )
= 𝑋! 𝑏𝜇! 𝑒 !(!! !!!"
𝑑𝑡
Morgan-Mercer-Flodin (MMF) 𝑎𝑏 + 𝑐𝑡 !
𝑋=
𝑏 + 𝑡!
Richards 𝑋!
𝑋= !!!"#
(1 + 𝑒 )!/!
Weibull
!
𝑋 = 𝑋! − 𝑏𝑒 !!"!
! 𝜇! 𝑡 !
Cúbico 𝑋 = (𝑋𝑜 ! + )
3
217
ANEXOS
Modelo cinético para el consumo de

sustrato Fórmula
1 𝑚𝑋! 𝑋! − 𝑋!
𝑆 = 𝑆! − 𝑋 − 𝑋! − ln ( )
Ecuación de Pirt 𝑌! 𝜇! 𝑋! − 𝑋
!
Modelo cinético para la producción

de etanol Fórmula
𝛽𝑋! 𝑋! − 𝑋!
𝑃 = 𝑃! +∝ 𝑋 − 𝑋! + ln ( )
Ecuación de Luedeking y Piret 𝜇! 𝑋! − 𝑋
218
ANEXOS
ANEXO 6
Cartas de Aceptación Congresos Nacionales e Internacionales
219
ANEXOS
220
ANEXOS
221
ANEXOS
222

Ivonne Wendolyne González Robles

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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN

ESTUDIO DE LA FERMENTACIÓN DEL JUGO DE

IBQ. IVONNE WENDOLYNE GONZÁLEZ ROBLES

GUADALAJARA, JAL. ENERO 2012.

Guadalajara, Jalisco a 6 de Enero del 2012

Dr. Guillermo Rodríguez Vilomara

Nombre y firma Nombre y firma

Dr. Guillermo Rodríguez Vilomara

Nombre y firma Nombre y firma

Nombre y firma Nombre y firma

Índice de Contenido …………………………………………………………………... I

1.3.2 Capacidades fermentativas y producción de aromas de levaduras 28

1.4.3.2 Fases del crecimiento microbiano por lote ………………………... 36

2.4.1.2 Peso Seco ………………………………………………………… 64

2.4.6 Análisis de fructosa, glucosa y de compuestos producidos durante la 74

2.6.2.1 Parámetros cinéticos en el cultivo en continuo ………...... 85

2.7 Programas de software empleados para cálculos, gráficas y análisis de datos …. 87

3.1.1 Análisis de las cinéticas de fermentación en cultivo puro ………………... 89

3.1.2 Análisis de las cinéticas de fermentación en cultivo mixto ……................. 93

3.4.1 Análisis de compuestos volátiles mayoritarios …………………………... 126

Anexo 4. Modelos matemáticos y matemático-fisiológicos para las cinéticas ……… 217

Tabla 1.1 Productos secundarios de las fermentaciones llevadas a cabo por K.

y mixto ………………………………………….......................................................... 124

S. cerevisiae (S1) …………………………………………........................................... 154

Tabla 3.31 Análisis de varianza (ANOVA) de los puntajes de los componentes

Tabla 3.32 PLS factor loadings de los compuestos volátiles (variable en X) y

Figura 1.1 Proceso de producción del Tequila ……………………………………….. 25

cerevisiae y K. africana en cultivo puro ……………………………………………... 67

cultivo mixto ……………………………………………………................................. 172

Figura 3.19 Niveles de aceptabilidad de los destilados obtenidos las fermentaciones

“A” “no A” Prueba discriminativa "A" "No A"

CG-MS Cromatógrafo de gases con acoplamiento espectrometría de masas

hex-ac Ácido hexanoico

Ks Constante de saturación o de afinidad (gL-1)

lact-et Lactato de etilo

qpmáx Velocidad específica máxima de producción de etanol (g/g-h)

rpmáx Velocidad instantánea máxima de formación de producto (g/l-h)

rxmáx Velocidad instantánea máxima de formación de biomasa (g/l-h)

S Sustrato residual presente en el medio (gL-1)

Rendimiento de formación de producto respecto al consumo de sustrato

Saccharomyces cerevisiae. However, in most distilleries, fermentation occurs spontaneously. The

dominated by alcohol-tolerant S. cerevisiae. The growth of these non-Saccharomyces yeasts is

survival and fermentative capacity of non-Saccharomyces yeasts belonging to the Kloeckera

high fermentative capacity. Furthermore, Kloeckera produced higher concentrations of acetate

intermediate concentrations of acetate esters similar to the concentrations obtained with K.

phenyl ethanol similar to S. cerevisiae in pure culture.

fermentative capability of K. africana in continuous culture fermentations with S. cerevisiae were

Actualmente en las fermentaciones tradicionales de jugo de uva y agave se ha cobrado particular

Una correcta elección de los microorganismos en las fermentaciones alcohólicas, es un punto

Estudiar el efecto del oxígeno, la temperatura y los factores de crecimiento en la fermentación de

1) Determinar las condiciones operacionales y nutrimentales en cultivo por lote y

2) Comparar los perfiles de compuestos volátiles generados durante la fermentación

3) Caracterizar sensorialmente los tequilas seleccionados de las fermentaciones en

Contribuir a un mejor conocimiento de los requerimientos nutricionales de una levadura

Formación de recursos humanos

Titulación de un estudiante de maestría

El establecimiento de las condiciones nutrimentales para fermentar jugo de agave en cultivos

Con la utilización de cultivos mixtos de levaduras Kloeckera con Saccharomyces, se obtendrá un

Fortalecimiento a la industria de bebidas alcohólicas a partir de agave, obtener un producto con

1.1 Proceso y elaboración del tequila.

El tequila es una bebida alcohólica mexicana obtenida de la destilación y rectificación de la

Figura 1.1 Proceso de producción del Tequila

1.2 Fermentación alcohólica.

El proceso simplificado, de la fermentación así como su balance energético es: