ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

------------------------------

NGÔ ĐỨC TRỌNG

NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NHÓM CHẤT CÓ TRONG CÂY CHÓ ĐẺ RĂNG CƯA (PHYLLANTHUS URINARIA L., EUPHORBIACEAE)

LUẬN V ĂN THẠ C SĨ HOÁ HỌC

THÁI NGUYÊN - 2008

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ---------------------------------

NGÔ ĐỨC TRỌNG

NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NHÓM CHẤT CÓ TRONG CÂY CHÓ ĐẺ RĂNG CƯA (PHYLLANTHUS URINARIA L., EUPHORBIACEAE)
Chuyên ngành : Hoá hữu cơ Mã số : 60.44.27

LUẬN V ĂN THẠ C SĨ HOÁ HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH

THÁI NGUYÊN - 2008

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS Phạm Văn Thỉnh - Người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn. Tôi xin chân trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Quyết Tiến, TS. Phạm Thị Hồng Minh, Th.S. Vũ Anh Tuấn, Th.S Hứa Văn Thao những người thầy đã động viên và giúp đỡ từng bước đi của tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn. Xin chân thành cảm ơn phòng hoạt chất sinh học của trường Đại học Y Thái Nguyên và cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm của Bác sĩ Hoàng Sầm, phòng nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa học đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu. Nhân dịp này, tôi cũng xin chân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo Khoa Hóa, Khoa Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này.

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2008 Tác giả

Ngô Đức Trọng

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

NGÔ ĐỨC TRỌNG

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

SKLM UV MS EI-MS LC-MS FT-IR NMR
1

: Sắc kí lớp mỏng : Ultraviolet spectrocopy : Mass Spectroscopy : Electron Impact Mass Spectroscopy : Liqud chromatography - Mass Spectroscopy : Fourier Transform Infrared Spectroscopy : Nuclear Magnetic Resonance : 1H-Nuclear Magnetic Resonance : 13C- Nuclear Magnetic Resonance : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer : Correlated Spectroscopy : Heteronuclear Spectroscopy- Quantum Coherence : Heteronuclear multiple - Bond Correlation : Human Immunodeficiency Virus : Đơn vị Cacbon

H-NMR C-NMR

13

DEPT COSY HSQC HMBC HIV đvC

DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Khối lƣợng chất tổng số đƣợc chiết từng phân đoạn của cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)…………………………...……….26 Bảng 2.2: Phát hiện các nhóm chất trong cây chó đẻ răng cƣa…………………27 Bảng 2.3: Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)…………………...………………...…..29 Bảng 2.4: Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của chất PH-1 trong cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)…………………...………...….30 Bảng 2.5: Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất PE-3…………..……………….32 Bảng 3.1: Số liệu phổ
13

C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của PH-1 trong cây chó đẻ

răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) và phổ của  -sitosterol [15]….…..40 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của PE-1 và số liệu phổ NMR trong phần mềm ACD/NMR của 5-hidroxymetylfufural................................................44 Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của PE-2 và số liệu phổ NMR trong phần mềm ACD/NMR của axit gallic....................................................................48 Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của PE-3 và số liệu phổ trong phần mềm ACD/NMR của chất kampherol...........................................................52

DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L, Euphorbiaceae............. 3 Hình 2.1: Đƣờng kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm) theo phƣơng phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch....................................................28 Hình 3.1: Phổ FT-IR của -sitosterol (PH-1).......................................................36 Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của -sitosterol (PH-1)..................................................37 Hình 3.3: Phổ 13C-NMR và ATP của  -sitosterol (PH-1)....................................38 Hình 3.4: Phổ 1H-NMR-DMSO của PE-1...........................................................42 Hình 3.5: Phổ 13C-NMR-DMSO của PE-1..........................................................43 Hình 3.6: Phổ 1H-NMR-DMSO của PE-2...........................................................46 Hình 3.7: Phổ 13C-NMR-DMSO của PE-2..........................................................47 Hình 3.8: Phổ 1H-NMR-AcetoneD6 của PE-3.....................................................50 Hình 3.9: Phổ 13C-NMR-AcetoneD6 của PE-3....................................................51

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu...................................................................26

MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục các chữ viết tắt dùng trong luận văn Danh mục các bảng Danh mục các hình và sơ đồ MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ................................................................................3

1.1. Mô tả thực vật ............................................................................................3 1.2. Tác dụng sinh học của chi Phyllanthus........................................................4 1.2.1 Một số công dụng của chi Phyllanthus ......................................................4 1.2.2 Một số tác dụng dƣợc lý của chi Phyllanthus .............................................5 1.3 Tình hình nghiên cứu hoá học thực vật của chi Phyllanthus ..........................6 1.3.1 Một số đại diện của nhóm tecpenoit ..........................................................6 1.3.2 Một số đại diện của khung axit..................................................................8 1.3.3 Một số đại diện của Lignan .......................................................................9 1.3.4 Một số đại diện của khung flavonoit........................................................11 1.3.5 Một số hợp chất phenolic khác ................................................................12 1.3.6 Một số hợp chất nhóm ankaloit ...............................................................15 1.4 Tình hình nghiên cứu hóa học của loài Phyllanthus urinaria L....................16
CHƢƠNG II. THỰC NGHIỆM..........................................................................23

2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................23 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu..............23 2.1.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết ..............................23 2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất ............24

2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ...................................................24 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất ..............................................................................24 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu................................................................................25 2.3. Các dịch chiết từ cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)..................25 2.3.1. Các dịch chiết .......................................................................................25 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết ............................................................27 2.3.3. Thử hoạt tính sinh học ...........................................................................27 2.4. Phân lập, tinh chế các chất từ ....................................................................29 2.4.1. Dịch chiết n-hexan ................................................................................29 2.4.2. Dịch chiết trong etylaxetat (PE) .............................................................31 2.4.2.1 Chất PE-1............................................................................................31 2.4.2.2 Chất PE-2............................................................................................31 2.4.2.3 Chất PE-3............................................................................................32
CHƢƠNG III. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................34

3.1. Nguyên tắc chung ....................................................................................34 3.2. Xác định định tính các nhóm chất thiên nhiên............................................34 3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất ..........................................................35 3.3.1. -sitosterol (PH-1).................................................................................35 3.3.2. 5-Hydroxymetylfufural (PE-1) ...............................................................41 3.3.3. Axit gallic (PE-2) ..................................................................................45 3.3.4. Kampherol (PE-3) .................................................................................49 3.4. Thử hoạt tính sinh học ..............................................................................53 KẾT LUẬN.................................................................................................... 55
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .... .56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................57 PHỤ LỤC .......................................................................................................62

1

MỞ ĐẦU
Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người. Từ trước khi có sự ra đời của thuốc tây, nhiều loài cây cỏ trong tự nhiên đã được sử dụng trong dân gian để chữa bệnh và rất có hiệu quả. Rất nhiều loại bệnh tật đã được chữa khỏi nhờ thảo dược. Ngày nay những hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v... Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh. Điều đó đã góp phần làm tăng tuổi thọ con người, song nhu cầu sử dụng cây cỏ để làm thuốc cũng ngày càng tăng lên, được khoa học hiện đại soi sáng, vì trong chúng có chứa những biệt dược rất khó tổng hợp. Mặt khác việc dùng thuốc nam hầu như không gây ra tác dụng phụ. Có nhiều bộ môn khoa học nghiên cứu về cây thuốc ra đời. Việc nghiên cứu cây thuốc đã giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần và cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí của cây thuốc. Trên cơ sở các nghiên cứu đó có thể tạo ra chất mới có hoạt tính sinh học cao như mong muốn để làm thuốc chữa bệnh. Cây chó đẻ răng cưa là một cây thuốc đã được sử dụng từ lâu trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Trong Y học dân tộc cây này được nhân dân dùng làm thuốc để chữa nhiều loại bệnh như: đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má, bệnh viêm gan,… rất có hiệu quả.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

2

Thực vật chó đẻ răng cưa có nhiều ứng dụng quan trọng nhưng gần đây mới được các nhà khoa học các nước quan tâm chọn làm đối tượng nghiên cứu, còn ở nước ta hiện có rất ít công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và dược lí học của cây chó đẻ răng cưa. Với mục đích nghiên cứu và tìm hiểu thành phần hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học của cây chó đẻ răng cưa, góp phần làm tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc phong phú và quý giá của Việt Nam. Chúng tôi chọn cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) làm đối tượng nghiên cứu cho công trình nghiên cứu này. Tên đề tài là: “Nghiên cứu hóa học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L., Euphorbiaceae)”.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

3 CHƢƠNG I

TỔNG QUAN
1.1 Mô tả thực vật Cây chó đẻ răng cưa còn gọi là diệp hạ châu, diệp hoè thái, lão nha châu, trân châu thảo, cam kiềm, rút đất, khao ham (Tày), prakphle (Campuchia). Tên khoa học là: Phyllanthus urinaria L, thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae). Phân bố địa lý: Cây chó đẻ răng cưa phân bố rộng khắp ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây chó đẻ răng cưa thường thấy mọc tự nhiên ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước, điển hình như: Thái Nguyên, Bắc Ninh, Nghệ An, Hà Giang,… Trên thế giới loại cây này mọc nhiều ở các nước Châu Á như: Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Inđonexia, Myanma, Thái Lan,… Châu Mĩ như: Brazil, Argentina,…[5].

Hình 1.1: Cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L, Euphorbiaceae)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

4

Đặc điểm sinh trưởng và phát triển: Cây chó đẻ răng cưa là một loại cỏ mọc hàng năm, cao chừng 30 cm, thân gần như nhẵn, mọc thẳng đứng, mang cành, thường có màu đỏ hơi tía. Cây có vị hơi ngọt. Lá mọc so le lưỡng hệ hay có cuống rất ngắn. Hoa mọc ở kẽ lá, đơn tính, màu đỏ nâu. Hoa đực và hoa cái cùng gốc. Hoa đực ở đầu cành, hoa cái ở cuối cành. Hoa không có cuống hoặc có cuống rất ngắn. Quả nang không cuống hình cầu hơi dẹt. Đường kính quả có thể đạt tới 2mm. Hạt ba cạnh hình trứng màu nâu nhạt có vân ngang [5]. 1.2. Tác dụng sinh học của chi Phyllanthus 1.2.1 Một số công dụng của chi Phyllanthus Các loài cây thuộc chi Phyllanthus (Euphorbiaceae) được sử dụng rộng rãi trong y học dân tộc của nhiều nước để chữa bệnh thận, bệnh tiểu đường, bệnh viêm gan B…[7]. Các loài được dùng làm thuốc nhiều hơn cả là 3 loài Phyllanthus urinaria L, Phyllanthus niruri L và Phyllanthus amarus Schum et Thonn [4]. Một số bài thuốc dùng cây chó đẻ đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn) [6]: Chữa viêm gan do virus: Chó đẻ đắng sao khô 20g, sắc nước 3 lần. Trộn chung các nước sắc. Thêm 50g đường, đun sôi cho tan đường. Chia làm 4 lần uống trong ngày. Khi kết quả xét nghiệm HBsAg (-) thì ngừng thuốc. Chữa xơ gan cổ trướng thể năng: Chó đẻ đắng sao khô 100g sắc nước 3 lần. Trộn chung nước sắc, thêm 150g đường, đun sôi cho tan đường, chia nhiều lần uống trong ngày (thuốc rất đắng), liệu trình 30-40 ngày. Khẩu phần ăn hàng ngày phải hạn chế muối, tăng đạm (thịt, cá, trứng, đậu phụ). Riêng cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) trong y học dân tộc được nhân dân dùng để chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da, lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má, chữa bệnh gan, sốt, rắn rết cắn rất có hiệu quả.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

5

Một số bài thuốc dùng cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) [5], [6]: Nhân dân ta thường dùng toàn cây hái về làm thuốc, mùa thu hái quanh năm nhưng tốt nhất là vào mùa hạ. Thường dùng tươi có khi phơi khô, ngày uống 20-40g cây tươi, sao khô, sắc đặc, uống thay nước. Chữa suy gan (do sốt rét, sán lá, lỵ amip, ứ mật, nhiễm độc): Chó đẻ răng cưa sao khô 20g, cam thảo đất sao khô 20g. Sắc nước uống hàng ngày. Đối với bệnh ngoài da: Cây tươi dã nát với một ít muối đắp ngoài da với liều lượng không hạn chế. 1.2.2 Một số tác dụng dƣợc lý của chi Phyllanthus Năm 1961, phòng Đông Y Viện Vi trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng kháng sinh của cây chó đẻ răng cưa thấy kết quả tác dụng kháng sinh như sau: Tụ cầu trùng (0,5 cm), Typhi (0,9 cm), Flexneri (1,1cm), Sonnei (0 cm), Shiga (1cm), Subtilis (0,4 cm), Coli (0 cm). Năm 1977, một nhóm bác sĩ Việt Nam, khoa Tiêu hoá, Gan, Mật đã sử dụng bài thuốc gia truyền của Lương y Trần Xuân Thiện gồm 3 vị là chó đẻ đắng, xuyên tâm liên, quả dành dành để điều trị cho những người có kết quả xét nghiệm HBsAg (+). Sau một thời gian điều trị, kết quả xét nghiệm âm tính được coi là khỏi. Tỷ lệ đạt 26/98 bệnh nhân. Ngoài ra, thuốc còn giúp cơ thể người dùng sản xuất kháng thể chống HBsAg (59/98 người). Liều điều trị trung bình 4-5 tháng [6]. Năm 1988 các tác giả Blunberg và Thiogarajan công bố đã điều trị 37 bệnh nhân viêm gan siêu vi B bằng chó đẻ răng cưa Phyllanthus amarus và Phyllanthus niruri đạt kết quả âm tính 22/37 bệnh nhân sau 30 ngày. Các tác giả còn chứng minh Phyllanthus amarus có chứa chất làm ức chế men pelymerase DNA của virus viêm gan siêu vi B [5].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

6

Năm 2002, Nguyễn Bá Kinh và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu lâm sàng tại Bệnh viện Thanh Nhàn (Hà Nội), đã sử dụng chế phẩm LIV/94 (chó đẻ răng cưa là một trong 3 thành phần chính của thuốc) điều trị cho các bệnh nhân viêm gan mãn tính trong 2 năm (2001-2002) đạt kết quả tốt. Thuốc có tác dụng làm giảm và sạch HBsAg của bệnh nhân [6]. Những công trình nghiên cứu hóa học gần đây về các loài Phyllanthus đã phát hiện một vài lignan, flavonoit và tanin thủy phân có tác dụng bảo vệ gan, có khả năng làm sạch phần lớn các kháng nguyên HBsAg, ức chế mạnh HIV transcriptase ngược [21]. Các thí nghiệm in vitro của cây chó đẻ với kháng nguyên HBsAg và với tổn thương gan do cacbontetraclorit gây nên đã chứng minh cây chó đẻ có khả chống virus viêm gan B. Cây chó đẻ răng cưa có tác dụng kháng khuẩn đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn Coli, Shigella dysenteriae, S. flexneri, S. shigae, Moraxella và kháng nấm đối với Aspergillus fumigatus [1]. 1.3 Tình hình nghiên cứu hoá học thực vật của chi Phyllanthus Cho đến nay người ta đã phát hiện chi Phyllanthus L. họ thầu dầu (Euphorbiaceae) có 700 loài, gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ. Thành phần hoá học của chi này rất phong phú và đa dạng [11]. Ở Việt Nam có 44 loài, các loài đáng được chú ý nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L. (chó đẻ răng cưa), Phyllanthus niruri L. (chó đẻ thân xanh) và Phyllanthus amarus Schum et Thonn (chó đẻ đắng hay diệp hạ châu đắng). 1.3.1 Một số đại diện của nhóm tecpenoit Từ loài Phyllanthus flexuosus đã phân lập được 5 tritecpen mới, cấu trúc được chỉ ra là: olean-12-en-3β,15α-diol; lup-20 (29)-en-3β,24-diol; olean-12-en-3β,24-diol; oleana-11:13(18)-dien-3β,24-diol và olean-12-en3β,15α,24-triol và hai chất đã biết là: tritecpen diol betulin [33]; lup-20(29)en-3β,15α-diol [41].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

7

Theo [39], từ loài Phyllanthus oxyphyllus đã tách được: 29-nor-3,4seco-friedelan tritecpen (axit 29-nor-3,4-seco-friedelan-4(23),20(30)-dien-3oic) và một secquitecpen mới là guaiane secquitecpen (5-hydroxy-6,9epoxyguaiane). Những hợp chất này được đánh giá là có khả năng chống oxi hóa tốt ở nồng độ thử nghiệm IC50 = 0.017 ± 0.001 mM.

O
HOOC

HO

1. 29-nor-3,4-seco-friedelane tritecpen

2. Guaiane secquitecpen

Từ loài Phyllanthus reticulates đã phân lập được một hợp chất mới là 21α-hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one và một vài triterpenoit khác, đã biết đó là: friedelin, sitosterol, friedelan-3β-ol, glochidonol và 21α-hydroxyfriedelan - 3 - on [47]. Theo tài liệu [46], từ loài Phyllanthus plyanthus ở Châu Phi các tác giả đã tìm ra được một số tritecpenoit: phyllanthol, phyllanthone, (20S)-3βacetoxy-24-methylenedammaran-20-ol, δ-amyrin acetate, lupenone và (20S)3α-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol.
HO H H

H CH3OCO H

3. (20S)-3β-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

8

Từ loài Phyllanthus acidus đã tách được hai pentacyclic tritecpenoit, đó là: phyllanthol và olean-12-en-3β-ol (β-amyrin) [35]. Từ loài Phyllanthus niruri đã tách được một acyclic tritecpen, cấu trúc của nó được dự đoán dựa trên các phương pháp phân tích phổ là: 3,7,11,15,19,23-hexamethyl-2Z,6Z,10Z,14E,18E,22E-tetracoshexen-1-ol [10]. Từ loài Phyllanthus watsonii đã tách được hợp chất tritecpen mới: 26Nor-D:A-friedooleanane tritecpen cùng với lupenyl palmitate, friedelin, epifriedelanol, glochidone, glochidonol, lupeol, lup-20(2) [29]. 1.3.2 Một số đại diện của khung axit Từ loài Phyllanthus amarus đã phân lập được axit thiobarbituric, axit ascorbic [42]. Từ dịch chiết n-hexan cũng của loài này ở Malaysia đã tách được axit oleanolic và axit ursolic [16], axit amariinic, axit repandusinic A, axit geraniinic B và một chất là 1-O-galloyl-2,4-dehydrohexahydroxydiphe noyl -glucopyranozơ elaeocarpusin [26]. Từ loài Phyllanthus emblica đã tách được axit phyllaemblic [52], axit ascorbic [23]. Từ loài Phyllanthus fraternus đã tách được axit indole-3-butyric, axit 1naphthaleneacetic [31] và axit trichadenic B có cấu trúc như axit 3β-hydroxyD: A-friedooleanan-27-oic, được xác định dựa vào phương pháp phân tích Xray [38].
HOOC

H

HO

4. Axit trichadenic B

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

9

1.3.3 Một số đại diện của Lignan Trong loài Phyllanthus discoides người ta đã tách được phyllanthin C14H17O2N, phyllantin C13H15O3N [27] và phyllantidin C 13H15O2N [20]. Trong loài Phyllanthus niruri L có phyllanthin C 24H34O6, hypophyllanthin C 24H30O7, niranthin C24H30O7 (cấu trúc của niranthin được chỉ ra là (+)3,4,3′,4′,9,9′-hexamethoxy-8:8′-butyrolignan), nirtetralin C24H30O7 và phyllteralin C24H34O6 [8]. Dựa trên các dữ liệu phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân, cấu trúc của nirtetralin và phyltetralin được chỉ ra là 1phenyl tetralins.
H RO CH2OCH3

H H3CO CH2OCH3

R1O H R2

CH2OCH3

H3CO H H

CH2OCH3

OCH3 OCH3

O O

OCH3

5 5a. Phyllanthin R= R 1 =CH3, R2 =H 5b. Niranthin R+R1= -CH2 -R2 = OCH3

6 Hypophyllantin

H
H O CH2OCH3

CH2OCH3

O H H

CH2OCH3

H3CO H OCH3 H

CH2OCH3

OCH3 OCH3

OCH3 OCH3

7. Nirtetralin

8. Phyllteralin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

10

Cũng từ phần dịch chiết n-hexan của loài này, người ta đã tách được triacontanal và triacontanol [40]. Các chất hypophyllanthin, phyllanthin cũng được phân lập trong cặn n-hexan bằng phương pháp sắc kí lỏng trung áp (MPLC) từ loài Phyllanthus niruri L ở vùng Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh nước ta [4], đây là hai lignan đã được chứng minh là có hoạt tính bảo vệ gan trên mô hình gây độc tế bào gan bằng CCl4 và D- GalN/ TNF- [3], [45]. Theo tài liệu [34], từ loài Phyllanthus niruri đã tách được 4 diarylbutane lignan mới, chúng được coi là sản phẩm chuyển hóa thuộc hệ thống 5′ -desmethoxy niranthin. Trong đó hai chất (9a) và (9b) là sản phẩm chuyển hóa từ axit veratrylidene piperonylidene succinic, (10a) được chuyển hóa từ axit veratrylidene 3,4,5-trimethoxy benzylidene succinic và (10b) được chuyển hoá từ (10a).
CH2OR

O

RO

CH2OMe

O

CH2OR

RO OMe

CH2OMe

OMe OMe
OMe

OMe

9a. R=H; 9b. R=CH3

10a. R=H; 10b. R=CH3

Từ loài Phyllanthus polyphyllus L đã tách được các lignan là arylnaphthalide, phyllamyricin C, justicidin B và diphyllin [51]. Từ loài Phyllanthus anisolobus đã tách được ichtyotoxic lignan justicidin B và lignan-glucozit phyllanthostatin A [43].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

11

1.3.4 Một số đại diện của khung flavonoit Từ dịch chiết etanol loài Phyllanthus emblica L đã phân lập được quecxetin và catechin. Đây là hai chất có hoạt tính chống oxi hóa tốt [49].
OH HO O OH

HO

O

* *
OH OH OH

OH

OH OH O

11. Quecxetin

12. Catechin

Cũng về vấn đề nghiên cứu khả năng chống oxi hóa, các nhà khoa học đã khảo sát khả năng này từ dịch chiết methanol của 5 loài phyllanthus đặc biệt từ Ấn Độ là: Phyllanthus debilis, Phyllanthus debilis, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus virgatus, Phyllanthus maderaspatensis, Phyllanthus amarus. Tất cả các dịch chiết này đều cho kết quả tốt [22]. Từ loài Phyllanthus sellowianus đã phân lập được rutin và isoquercitrin là hai flavonoit chiếm thành phần chủ yếu trong cây này [19].

OH HO O OH

HO

O

OH

OH
O -Ramnozo -glucozo OH O

OH

O

13. Rutin

14. isoquercitrin

Theo tài liệu [36], từ loài Phyllanthus niruri đã tách được 2 flavanon: 8-(3-metyl-but-2-enyl)-2-phenyl chroman-4-on (15) và 2-(4-hydroxyphenyl)-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

12

8-(3-metyl-but-2-enyl)-chroman-4-on (16). Hai chất trên được các tác giả nhận định là có khả năng làm thuốc chữa bệnh Gút (Gout) và bệnh thận.

3'' 3' 1''

3'' 3'

2''
1 8 8a
O

2' 1' 2 6'

4' 5'
7 6

1''

2'' 1 8 8a
O

OH

2' 1' 2 6'

4' 5'

7 6

4a 5

4

3

4a 5

4

3

O

O

15 1.3.5 Một số hợp chất phenolic khác

16

Từ loài Phyllanthus niruri Linn đã tách được một số hợp chất phenolic là: axit gallic, axit ellagic, ellagitannin, (−)-epicatechin, (+)-gallocatechin, (−)epigallocatechin, (−)-epicatechin 3-O-gallat và (−)-epigallocatechin 3-O-gallat [28]. Hợp chất ellagitannin cũng được tách từ loài Phyllanthus amarus [26]. Các tác giả Đài Loan đã phân lập và nhận dạng một số hợp chất phenolic và nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của các chúng từ loài phyllanthus emblica L [50]. Nguyên liệu sau khi làm khô được ngâm chiết trong metanol và sau đó được chiết lần lượt với etyl ete, etyl axetat, butanol và nước. Phân đoạn etyl axetat cho thấy có hàm lượng lớn nhất của hợp chất 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) so với cả bốn phân đoạn. Phân đoạn etyl axetat được tách bằng sephadex và thu được 6 hợp chất, chúng được nhận dạng là: geraniin, quercetin-3-β-D-glucopyranozit, kaempferol 3-β-Dglucopyranozit, isocorilagin, quercetin , và kaempferol. Một số hợp chất trên lần đầu tiên được tách từ loài Phyllanthus emblica. Các hợp chất đã tách, được làm sạch và đem khảo sát khả năng chống oxi hóa. Kết quả cho thấy trong số 6 chất trên thì geraniin là chất có khả năng chống oxi hóa tốt nhất (ở nồng độ IC50 = 4.7 và 65.7 μM, thử nghiệm sự oxi hóa lipit).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

13

Từ loài Phyllanthus amarus đã tách được axit shikimic (3- and 5-O-gallat), flavan-3-ol (epigallocatechin 3-gallat), proanthocyanidin và hydrolysable tannin (corilagin, casuariin, geraniin) [17], [14].
OH OH
COOH

HO

O OH

OH

O
HO OH OH

C O OH

OH

OH

17. Axit shikimic
OH HO

18. Epigallocatechin-3-gallat

HO

OH

HO

OH OH OC O O O OH CO

O

C O OH

OH

OH

19. Proanthocyanidins Theo L.Yeap Foo, Herbert Wong [24], cũng từ loài này đã tách được một sản phẩm từ tannin thủy phân (hay ellagitannin đặc biệt) đó là phyllanthusiin D có cấu trúc được xác định là: 1-galloyl-2,4-(acetonyldehydrohexahydroxydiphenoyl) -3,6-hexahydroxydiphenoylglucopyranozit. Theo tài liệu [25] cũng từ loài này đã tách được amariin, là một sản phẩm thủy phân của di-dehydrohexahydroxydiphenoyl (DHHDP), cấu trúc của nó được xác định là 1-galloyl-2,4: 3,6-bis-DHHDP-glucopyranosit trong đó phần

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

14

vòng cyclohexenetrione của DHHDP liên kết với nguyên tử O-3 và O-4 của phần đường glucozơ, cùng với: geraniin, corilagin, 1,6-digalloylglucopyranozit cũng như rutin và quercetin-3-O-glucopyranozit đã được phân lập từ Phyllanthus amarus. Cũng từ loài này tách được axit amariinic - là một dạng ellagitannin cùng với 1-O-galloyl-2,4-dehydrohexahydroxydiphenoyl-glucopyranozơ elaeocarpusin, axit repandusinic A và axit geraniinic B [26]. Cấu trúc của axit amariinic đã được chứng minh bằng chất oxi hóa mở phần vòng cyclohexentrione của DHHDP được gắn vào O-4 của phần đường glucozơ. Từ loài Phyllanthus polyphyllus L ở Đài Loan, Yew-Min Tzeng và các cộng sự đã tách được benzenoit, axit 4-O-methylgallic [51], hợp chất này chủ yếu được tạo thành từ sự chuyển hóa axit gallic và nó có nhiều trong rượu vang đỏ, chè, trong nhiều loại trái cây. Cũng từ loài này đã tách được 3 arylnaphthalide lignan có tên là: phyllamyricin C, justicidin B và diphyllin. Từ phần dịch chiết etylaxetat của loài Phyllanthus niruri L, ở Vùng Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh đã phân lập được hai chất là: 2,4,6xyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5-ethoxy-1-on (20) và 5,7,8 – trihidroxi9,10- peoxi- 4- ethoxy benzo[2,3-d] coumarin (21), hai chất này cho đến nay chưa thấy thông báo có mặt trong các loài Phyllanthus [4].
HO O O - CH2 -CH3 HO OH

20. 2,4,6- xyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5-ethoxy-1-on

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

15

OH HO

OCH2CH3

HO O O

O

O

21. 5,7,8 - trihidroxi-9,10- peoxi- 4- ethoxy benzo[2,3-d] coumarin Hoạt tính chống oxy hóa của 5,7,8 – trihidroxi-9,10- peoxi- 4- ethoxy benzo[2,3-d] coumarin cùng với quercetin làm đối chứng đã được thử bằng phương pháp Potterat trong cùng một điều kiện. Cho thấy chất này thể hiện hoạt tính chống oxy hóa yếu hơn so với quercetin (ở nồng độ 25 mg/l vẫn còn phản ứng dương tính) [4]. 1.3.6 Một số hợp chất nhóm ankaloit Từ loài Phyllanthus amarus đã tách được 2 ankaloit mới là isobubbialine và epibubbialine cùng với 3 ankaloit đã biết là phyllanthine, securinine và norsecurinine. Cấu trúc của chúng được xác định trên cơ sở phân tích các dữ liệu phổ UV, IR, phổ khối lượng và phổ NMR [30]. Từ loài Phyllanthus niruroides ở bang Florida nước Mĩ các tác giả: Babady-Bila, Thomas E. Gedris và Werner Herz, đã phân lập được một hợp chất mới thuộc nhóm ankaloit là niruroidine, cấu trúc của nó được làm sáng tỏ dựa trên các phương pháp phổ [9]. Từ loài Phyllanthus simplex lần đầu tiên đã phân lập được một ankaloit là simplexine (14-hydroxy-4-methoxy-13,14-dihydronorsecurinine) và một ankaloit đã biết là phyllanthine [32]. Chất này đã và đang được sử dụng làm thuốc Tây Y dạng viên nén (sản phẩm có tên là simplexin), phổ biến trên thị trường. Ngoài những nhóm hợp chất trên, từ loài Phyllanthus anisolobus đã tách được hai γ -lacton: menisdaurilide và aquilegiolide [43].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

16

1.4 Tình hình nghiên cứu hóa học của loài Phyllanthus urinaria L Từ loài Phyllanthus urinaria L. đã tách được một số triterpen như: stigmasterol, daucosterol, sigmasterol-3-O-  -glucosid,  -sitosterol, glucosid, lupeol acetat,  -amyrin, lup-20 (29)-en-3  -ol [5], [53]. Chất
 -sitosterol cũng được phân lập từ dịch chiết n-hexan của loài Phyllanthus

niruri L. ở tỉnh Bắc Ninh nước ta [4]. Cấu trúc một số hợp chất điển hình đã được xác định như sau:

HO

glucozo- O

22.  -Amyrin

23. Glucosid

HO

HO

24.  -Sitosterol

25. Stigmasterol

Từ loài Phyllanthus urinaria L đã tách được một số axit hữu cơ như: Axit succinic, axit ferulic, axit dotriancontanic, axit hecxacosanoic [11], [53].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

17

HO

O

HO

OH

H3CO

26. Axit ferulic Gần đây, cũng từ loài cây này, nhóm các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được 5 hợp chất, đó là: ester mono-[2-(4-carboxy-phenoxycarbonyl)vinyl] terephthalat, axit (E)-3-(5’-hydroperoxy-2,2’-dihydroxy[1,1’biphenyl]-4-yl)-2-propenoic, axit 3,4,5-trihydroxybenzoic, axit succinnic (hay axit butanedioic) và axit 2,3,4,5,6-pentahydroxybenzoic . Trong đó 25 và 26 là hai hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập từ loài Phyllanthus urinaria L [48].

O O O HO O O

O

OH

27
H3C O HO O

HO

OH

28 Từ loài Phyllanthus urinaria L đã phân lập được 4 lignan mớ i là 5-demethoxyniranthin (29a. C 23 H30 O 6 ), urinatetralin (30a.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

18

C 22 H24 O 6 ), dextrobursehernin (31a. C21H22O6), urinaligran (32. C22H24O7) , cùng với 9 lignan đã biết là: phyllanthin (29b), niranthin (33), phyltetralin (30b), hypophyllanthin (34), nitetralin (35), lintetralin (36), isolintetralin (37), heliobuphthalminlactone (31b) và virgatusin (38) [12].

R1O

R1O

OMe

OMe OMe R2O

OMe
R2O

OMe OMe
OR2

OR1

29a. R1 + R2 = CH2 29b. R1 = R2 =Me

30a. R1 + R2 = CH2 30b. R1 = R2 =Me
OMe MeO

O R1O O R2O

O O O

O O

O

O

31a. R1 = R2 =Me 31b. R1 + R2 = CH2

32

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

19
O
MeO

OMe OMe
O

OMe OMe

O OMe

O

OMe OMe
OMe

OMe

33
O OMe OMe O OMe

34
MeO OMe OMe MeO

OMe OMe

O O

35
O OMe OMe O

36

MeO

OMe

O
OMe OMe

OMe O

O

OMe

37

38

Cũng từ loài Phyllanthus urinaria L Zhang L. Z. và cộng sự đã tách được một chất mới là ellagitannin [54].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

20

Riêng loài Phyllanthus urinaria L được thu hái ở huyện Đô Lương, Nghệ An -Việt Nam các nhà khoa học Việt nam lần đầu tiên đã phân lập được 4’-methoxyscu tellarein. Chất này lần đầu tiên được phân lập từ cây Stachys. annua [7].
OCH3

HO

O

HO OH O

39. 4’-methoxyscutellarein Từ dịch chiết axeton của loài Phyllanthus urinaria L các nhà khoa học Đài Loan đã tách được geraniin và 1,3,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucozơ [13]. Các thí nghiệm in vitro đã chỉ ra hai chất này có hoạt tính chống lại vi rút bệnh mụn rộp ngoài da và không gây độc. Từ loài này người ta còn tách được axit ellagic, axit 3, 3’,4- triO- methylellagic, axit gallic , 4-O-brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6O-hexahydroxydiphenoyl-D- glucopyranozơ, methyl brevifolincarboxylate [5], [53].
OCH3 O

COOH
HO

OH O

O

HO OH

OH

HO O

40. Axit gallic

41. Methyl brevifolincarboxylate

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

21

Chất methyl brevifolin cacboxylat cũng được tách bằng phương pháp sắc kí cột từ dịch chiết n-butanol của cây này ở huyện Đô Lương, Nghệ An [7]. Theo tài liệu [37], từ loài Phyllanthus urinaria L ở Đài Loan đã tìm được các hợp chất sau: phyllanthin (42), phyltetralin (43), trimetyl3,4-dehydrochebulate (44), metylgallat (45), rhamnocitrin (46), methyl brevifolincarboxylat (47), β-sitosterol-3-O-β-d-glucopyranosid (48), quercitrin (49)và rutin (50).

H3C

O

8 9 7 6 5
OH

1
O

2'

3'
4'

2 3

1' 6' 5'

OH

10
C O

4

OH

46. Rhamnocitrin (hay kampferol-7-methylete) Cấu trúc các hợp chất (44) và (47) được xác minh bằng phương pháp phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ. Các hợp chất trên đã được nghiên cứu một cách kĩ lưỡng về khả năng chống oxi hóa và khả năng làm thuốc kháng viêm. Các chất (44), (45) và (47) có khả năng chống oxi hóa tốt (ở IC50 = 9.4, 9.8 và 8.9 μM, các lần thử nghiệm riêng rẽ). Còn trong các thí nghiệm in vitro khác về hoạt tính kháng viêm thì ngoại trừ (48), các chất còn lại đều có hoạt tính kháng viêm cao. Tài liệu này lần đầu tiên thông báo thử nghiệm về khả năng kháng viêm của loài Phyllanthus urinaria và do đó các chất đã được phân lập từ cây Phyllanthus urinaria có thể được sử dụng làm thuốc kháng viêm trong điều trị. Từ loài Phyllanthus urinaria L đã tách được phyllurine (51) [44], cấu trúc của phyllurine như sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

22
OH NH2

+
NH2

COO-

51. Phyllurine Chất này (51) được nhận dạng là tương tự như phyllanthurinolacton (52). Trên cơ sở đó các tác giả đã đề xuất giả thuyết có sự chuyển hóa qua lại giữa (51) và (52). Theo tài liệu [18], từ loài này đã phân lập được phyllanthurinolacton (52), cấu trúc của nó như sau:
CH2 H N O

5 OH
O H2N O O HO

NH O O OH

O

O

52. Phyllanthurinolacton

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

23 CHƢƠNG II

THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu gồm toàn bộ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa, thu hái vào tháng 11 năm 2007 tại vùng giáp ranh giữa Huyện Đồng Hỷ và Thành Phố Thái Nguyên. Cây chó đẻ răng cưa còn gọi là cây diệp hạ châu, dân địa phương gọi là diệp hòe thái, các nhà khoa học ở khoa Sinh trường ĐHSP Thái Nguyên xác định tên khoa học là “Phyllanthus urinaria L.”. Họ thầu dầu (Euphorbiaceae). Mẫu cây tươi sau khi thu hái gồm cả thân, lá và quả được đem sấy ở 800C trong 10 phút để diệt men, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 60 0C cho tới khi khô hoàn toàn. Mẫu khô được nghiền nhỏ và ngâm chiết trong etanol 90 o ở nhiệt độ phòng nhiều lần, liên tục trong 10 ngày. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô đến dưới dạng xirô được chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxetat, nbutanol, metanol. Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 500C dưới áp suất thấp. Các cặn thô được phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch . 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây chó đẻ răng cưa chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp các phương pháp gồm:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

24

- Sắc kí lớp mỏng (SKLM). - Sắc kí cột silicagen, thường dùng silicagen Merck 63- 200nm. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại. 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những hằng số vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H- NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối lượng (MS) và các phổ phân giải cao. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng. 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng, dùng để kết tinh lại là hoá chất loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc kí lớp mỏng dùng bản mỏng đế nhôm DC – Alufolien Kiesegel 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dich chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi khai triển SKLM: 1. n-Hexan – CHCl3 2. Cloroform – etylaxetat 3. Cloroform – metanol 4. Cloroform – metanol 5. Toluen – etylaxetat – axit formic 85:15 90:10 90:10 50:10 5:4:1 Hệ A Hệ B Hệ C Hệ D Hệ E

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

25

Các bản SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UVBIOBLOCK) ở bước sóng  = 254nm và 365nm. Thuốc thử để hiện màu là vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, sau đó sấy trên 1000C . Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức:
Rf =

chiều dài di chuyển của chất thử chiều dài di chuyển của dung môi

2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boetus (Đức), hoặc trên máy Eletronthermal IA–9200. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 dạng viên nén KBr. - Phổ LC/MS ghi trên máy ESI-LC/MS 1100 MSD Trap spectrometer. - Phổ khối ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm eletron (EI- MS) 70ev và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz, nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, DMSO, aceton-D6. 2.3. Các dịch chiết từ cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) 2.3.1. Các dịch chiết Toàn bộ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa đã phơi khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao khô, xác định khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexan, etylaxetat, đuổi hết nước và chiết bằng butanol, tiếp tục đuổi hết nước và chiết bằng metanol. Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 50 0 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. Như vậy từ toàn bộ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa đã thu nhận được 4 phân đoạn là n-hexan, etylaxetat,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

26

butanol và metanol với các ký hiệu tương ứng là: cặn trong n-hexan (PH), cặn trong etylaxetat (PE), cặn trong butanol (PB) và cặn trong metanol (PM). Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu
MẪU KHÔ

1. Etanol 2. Cặn trong nước n-Hexan
Cặn n-Hexan (PH)

EtOAc
Cặn EtOAc (PE)

BuOH
Cặn BuOH (PB)

MeOH
Cặn MeOH (PM)

PH-1

PE-1

PE-2

PE-3

Bảng 2.1: Khối lƣợng chất tổng số đƣợc chiết từng phân đoạn của cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) Khối lƣợng Khối lƣợng Khối lƣợng cặn chiết (g)

nguyên liệu khô cặn cồn tổng n-Hexan Etylaxetat n-Butanol Metanol số (g) (g) 1230 302,05 37,01 24,95 26,14 50,28

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

27

2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết Trên cơ sở dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao trong thực vật [2] chúng tôi thu được kết quả thử định tính với các nhóm chất, kết quả ấy được chỉ ra ở bảng 2.2: Bảng 2.2: Phát hiện các nhóm chất trong cây chó đẻ răng cƣa STT 1 2 3 4 5 6 7 8 Nhóm chất Đường khử Ankaloit Steroit Flavonoit Polifenol Cumarin Glycozit tim Saponin Thuốc thử đặc hiệu Felinh Dragendorf Liberman-Bourchard Xianidin FeCl3 Axit và kiềm Kelle-Kiliani Tạo bọt Hiện tƣợng Cho kết tủa màu đỏ gạch Màu vàng da cam Màu xanh vàng Từ hồng đến đỏ Xanh thẫm Kết tủa bông Không có hiện tượng gì Bọt bền trong axit Kết quả ++ + ++ ++ ++ ++ ++

Ghi chú: Dấu (+): Phản ứng dương tính, (++): Phản ứng dương tính rất rõ; (-): Không có. 2.3.3. Thử hoạt tính sinh học Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định. Thử định tính theo phương pháp khuyếch tán trên thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

28

Hình 2.1: Đƣờng kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm) theo phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

29

Các chủng vi sinh vật gồm đại diện các nhóm: * Vi khuẩn Gr(-) Escherichia coli * Vi khuẩn Gr(+) Staphylococcus auresu * Vi khuẩn: Salmonella typhi Chúng tôi đã tiến hành thử các ứng dụng làm thực phẩm chức năng của dịch chiết cây chó đẻ răng cưa tại Cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học cổ truyền Thái Nguyên. Tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của dược liệu tại bộ môn Vi Sinh trường Đại học Y Thái Nguyên. Kết quả thực nghiệm thu được (xem hình 2.1). Bảng 2.3: Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) Đƣờng kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm) Dịch chiết Staphylococcusauresu Cặn nước Cặn EtOAc 34 29 E.coli 23 18 Salmonella typhi 40 32

2.4. Phân lập, tinh chế các chất từ cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) 2.4.1. Dịch chiết n-hexan Từ 2g cặn dịch n-hexan của toàn bộ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa. Kí hiệu (PH) được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel. Hệ dung môi rửa giải là n-hexan : etylaxetat với tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực từ 0 đến 100% etylaxetat, kiểm tra các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi đã thu được chất sạch.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

30

* Chất PH-1 (β-Sitosterol) Tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexan etylaxetat (9:1). Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A, phát hiện nó bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, kết tinh lại trong n-hexan thu được 19 mg chất rắn, có nhiệt độ nóng chảy ở 139-1410C, Rf = 0,72 (trong hệ dung môi A). Tiến hành đo phổ chất PH-1 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ FT-IR (KBr);  (cm-1): Ở  max = 3450 (cm-1) cho một vân hấp thụ rộng (H32,C3); một vân hấp thụ ở 3010- 1650 (cm-1) (liên kết đôi). Phổ EI-MS; m/z(%): 414 [M+] (20); 413[M-H]+(41); 398(28); 397(100); 395(32); 383(11); 361(11); 257(3); 255(6,3); 151(5,6); 139(11). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 0,68 ppm (3H, s, CH3-18); 1,01 ppm (3H, s, CH3-19); 0,81 ppm (3H, d, j 7Hz, CH3-26); 0,88 ppm (3H, d, j 7Hz, CH3-27); 0,83 ppm (3H, t, 7,32Hz, CH3-29); 0,92 ppm (3H, d, j 10Hz, CH3-21); 3,52 ppm (1H, m, H-3); 5,42 ppm (1H, d, j 5Hz,H-6). Phổ NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): Xem bảng 2.4. Bảng 2.4: Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của chất PH-1 trong cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) STT của C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
13 13

C-

C-NMR (δ-ppm) t t d t s d t d d s t t s d t

37,2 31,7 71,8 42,3 140,8 121,7 31,9 31,9 50,1 36,5 21,1 39,8 42,3 56,8 24,3

STT của C 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 -

13

C-NMR (δ-ppm) t d q q d q t t d d q d t q -

28,3 56,2 11,9 19,4 36,2 18,8 33,9 26,1 45,8 29,2 19,1 19,4 23,1 11,9 -

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

31

2.4.2 Dịch chiết etylaxetat (PE) Từ 5g cặn chiết etylaxetat của cây chó đẻ răng cưa (ký hiệu PE) được tiến hành tách các chất trên sắc kí cột silicagel, rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi cloroform : metanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực, từ 0-100% metanol, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, thuốc thử phát hiện (FeCl3 + K3[Fe(CN)6]) 1% sau đó gộp các phân đoạn giống nhau, đuổi hết dung môi và kết tinh lại thu được 3 cặn thô. Tinh chế hai cặn đầu thu được hai chất: PE-1và PE-2. Cặn thứ ba được tách tiếp bằng hệ dung môi toluen : etylaxetat : axit formic (5:4:1) thu được chất PE-3. 2.4.2.1 Chất PE-1(5-hidroxymetylfurfural) Rửa giải cột bằng hệ dung môi cloroform : metanol (90:10). Những phân đoạn có cùng Rf =0,8 trong hệ dung môi C được gộp lại, thu được cặn thô. Tinh chế lại cặn này trong CHCl3 thu được 8 mg một chất dầu sệt mầu nâu. Tiến hành đo phổ chất PE-1 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ LC- MS; m/z(%): Cho pic M+ = 126,8. Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO);  (ppm): δ H = 7,48 ppm (1H,d, CH-3); δ H= 4,50 ppm (2H, d, CH 2 -6); δ H= 6,60 ppm (1H,d, J=3,6 Hz, CH-4); δ H= 9,54 ppm (1H,s,CHO-1). Phổ 13C- NMR (500MHz, DMSO);  (ppm): Cho các pic ở δC = 177,91 ppm (C1); δ C = 151,70 ppm (C 2 ); δ C = 124,33 ppm (C 3 ); δ C =109,62 ppm (C 4 ); δ C = 162,13 ppm (C5); δ C = 55,89 ppm (C6). 2.4.2.2 Chất PE-2 (axit gallic) Chất PE-2 cũng được tách từ cặn etylaxetat. Những phân đoạn tiếp theo giống nhau có cùng R f = 0,7 (trong hệ dung môi C) được gộp lại, đem cất đuổi dung môi thu được một chất rắn kết tinh. Tinh chế lại bằng cloroform thu được 40 mg tinh thể hình kim màu vàng có nhiệt độ nóng chảy ở 249-250oC. Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO);  (ppm): Cho một pic ở 6,91ppm. Phổ 13C-NMR (500MHz, DMSO);  (ppm): δ C = 120,48 ppm (C1);
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

32

δ C = 108,73 ppm (C 2 và C6); δ C = 145,40 ppm (C 3 và C5); δ C = 137,98 ppm (C4); δ C = 167,46 ppm (C7). 2.4.2.3 Chất PE-3 (Kampherol) Sau khi rửa giải cột bằng hệ cloroform : metanol (90:10) thu được hai chất PE-1 và PE-2. Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi chloroform : metanol (50:10), thu được một một hỗn hợp có màu vàng có cùng R f = 0,65 (trong hệ dung môi D). Hỗn hợp này cho màu đỏ cam với phản ứng xianiđin, màu xanh đen với dung dịch FeCl3 1% điều đó nói lên trong hỗn hợp này có flavonoit. Hỗn hợp này tiếp tục được phân chia bằng phương pháp sắc kí cột silicagel rửa giải bằng hệ dung môi toluen : etylaxetat : axit fomic (5:4:1) thu được 29mg chất rắn màu vàng (có R f =0,4 trong hệ E), nóng chảy ở 276278oC. Phổ LC- MS; m/z(%): Cho pic ion phân tử M+ ở m/z =286,9 và M- ở m/z =285,0. Các số liệu của phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO);  (ppm) và phổ 13CNMR (500MHz, DMSO);  (ppm) (xem bảng 2.5): Bảng 2.5: Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất PE-3 Vị trí C 2 3
13

C-NMR

1

H-NMR

Vị

13

C-NMR

1

H-NMR

(δ-ppm) 147,03 136,52

(δ-ppm, J-Hz) trí C __ __ 10 1/

(δ-ppm) 104,15 123,32

(δ-ppm, J-Hz) __ __

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

33

4

176,58

__

2/

130,44

8,15 (1H,dd, J=8,2; 2,2) 7,01(1H,dd, J=8,2;2,2) __

5

157,78

__ 6,26 (1H, d, J=2,1)

3/

116,32

6

99,17

4/

160,16

7

164,98

__

5/

116,32

7,01(1H,dd, J=8,2; 2,2) 8,15 (1H,dd, J=8,2; 2,2) __

8

94,49

6,52 (1H, d, J=2,1) __

6

/

130,44

9

162,30

__

__

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

34 CHƢƠNG III

THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Nguyên tắc chung Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp. Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau. 1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hỏa hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat, metanol hoặc etanol vv... 2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol : nước. Sau đó sàng lọc các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau. Việc chiết mẫu thực vật chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) được thực hiện theo phương án 2 (Sơ đồ 2.1). Các dịch chiết thô đem thử hoạt tính sinh học. Điều đó giúp cho việc định hướng tìm kiếm các hoạt chất trong những dịch chiết có hoạt tính mạnh với các chủng vi khuẩn đã thử nghiệm. 3.2. Xác định định tính các nhóm chất thiên nhiên Phân tích định tính các hợp chất hữu cơ thiên nhiên trong các mẫu nghiên cứu là việc làm cần thiết trước khi tiến hành phân lập và xác định cấu trúc của các chất cụ thể.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

35

Để xác định định tính các nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh lí cao có trong thực vật thường dùng hơn cả là phân tích bằng các phản ứng đặc trưng đối với mỗi nhóm chất đã nêu ra ở bảng 2.2. Từ kết quả chỉ ra ở bảng này có thể nhận thấy trong cây Phyllanthus urinaria L ít nhất có chưa tới 7 nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng đó là: đường khử, poliphenol, flavonoit, cumarin, steroit, saponintritecpen và ankaloit. Không phát hiện thấy glycozit tim có trong các mẫu thử. Từ kết quả phân tích định tính cũng sơ bộ cho thấy cây chó đẻ răng cưa là một loài thực vật chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao, có lợi cho sức khỏe con người. 3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây chó đẻ răng cƣa Các dịch chiết từ cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp, đã sử dụng các phương pháp sắc ký cột như: Cột với chất hấp phụ silicagel, với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phương pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ đó sẽ thu được các hợp chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các nhu cầu để khảo sát tính chất hóa lý và quang phổ của chúng. Đó là những yếu tố quan trọng trong quá trình nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất đã phân lập được từ các đối tượng nghiên cứu nói trên. Việc phân lập các thành phần hóa học từ cây chó đẻ răng cưa được thực hiện như sơ đồ 2.1 và đã thu được các hợp chất sạch gồm các nhóm chất: tritecpenoit, furan, axit gallic và flavonoit. 3.3.1. -sitosterol (PH-1) Từ cặn của dịch chiết n-hexan phân chia trên sắc ký cột silicagel, rửa rải bằng hệ dung môi n-hexan : etylaxetat (9:1) thu được chất PH-1 có Rf = 0,72.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

36

Hình 3.1: Phổ FT-IR của -sitosterol (PH-1)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

37

Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của  -sitosterol (PH-1)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

38

Hình 3.3: Phổ 13C-NMR và ATP của -sitosterol (PH-1)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

39

Chất PH-1 là những tinh thể hình kim, không màu, điểm nóng chảy ở 139-1410C. Khi trộn lẫn với chất chuẩn cho một hỗn hợp có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi. Chất PH-1 trong phổ EI-MS cho mảnh ion phân tử M+ = 414, như vậy có nghĩa khối lượng phân tử bằng 414 đvC sẽ ứng với công thức phân tử C29H50O. Trong phân tử có một nhóm OH thể hiện ở phổ FT-IR với vân hấp thụ rộng ở ν = 3380cm-1. Mặt khác phổ 1H-NMR cho δ = 3,52 ppm đặc trưng cho proton trong nhóm CH liên kết với nhóm hidroxyl. Phổ 13C-NMR cũng nhận thấy δ = 71,7 ppm đặc trưng cho cacbon liên kết trực tiếp với oxy của nhóm hidroxyl. Trong phân tử còn có một nối đôi thể hiện bởi các đặc trưng ở phổ FTIR có vân ở 3010 cm-1 đặc trưng cho dao động hoá trị của liên kết C-H và vân ở 1650 cm-1đặc trưng cho dao động hoá trị của liên kết đôi C=C. Trong phổ 1HNMR cũng nhận được tín hiệu δ = 5,35 ppm đặc trưng cho H trong liên kết =CH và tín hiệu của 2 cacbon mang nối đôi với δ = 140,7 ppm và δ = 121,5 ppm từ đó có thể quy kết hợp chất PH-1 có một nối đôi giữa vị trí C-5 và C-6. So sánh phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR của chất PH-1 với phổ của βSitosterol thấy hoàn toàn tương tự nhau (bảng 3.1). Từ các kết quả phân tích thành phần hoá học, tính chất vật lý, tính chất quang phổ nhất là dựa trên cơ sở so sánh các số liệu phổ của chất PH-1 với phổ của chất β-sitosterol hoàn toàn có thể cho phép quy kết chất PH-1 đã phân lập được từ cây chó đẻ răng cưa là β-sitosterol.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

40

Bảng 3.1: Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của PH-1 trong cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) và phổ của  -sitosterol [15] Chất PH-1 Vị trí C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 δ của 13C (ppm) 37,2 31,7 71,8 42,3 140,8 121,7 31,9 31,9 50,1 36,5 21,1 39,8 42,3 56,8 24,3 28,3 56,2 11,9 19,4 36,2 18,8 33,9 26,1 45,8 29,2 19,1 19,4 23,1 11,9 β-Sitosterol [15] Vị trí C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 δ của 13C (ppm) 37,2 31,6 71,7 42,3 140,7 121,7 31,9 31,9 50,1 36,5 21,2 39,8 42,3 56,7 24,3 28,2 56,1 11,9 19,4 36,1 18,9 34,0 26,1 45,8 29,2 19,8 19,5 23,0 12,0

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

41
28 21 19 12
11 20

29 27
25

22
23

24 26

17 13
14

16
15

18 1 2 HO 3 4 10 5 6 9 8 7

β-Sitosterol 3.3.2. 5-Hydroxymetylfufural (PE-1) Chất PE-1 được tách từ cặn etylaxetat có Rf= 0,8 (trong hệ dung môi cloroform : etylaxetat (9:1). Nó là chất dầu sệt màu nâu. Phổ LC-MS cho biết chất PE-1 có píc ion phân tử M+ = 126,8 điều này cho thấy chất PE-1 có khối lượng phân tử 126 đvC. Các dữ liệu phổ NMR cũng xác nhận những thông tin quan trọng. Phổ
13

C-NMR cho tín hiệu δ = 177,91 ppm, đó chính là độ chuyển dịch hóa học

của cacbon cacbonyl. Ở độ chuyển dịch hóa học δ = 124,31 ppm và δ = 109,62 ppm là độ chuyển dịch của hai nguyên tử cacbon chưa no liên kết với hiđro (=C-H), có thể quy kết δ = 124,31 ppm là C-3 còn δ = 109,62 ppm là của C-4. Từ phổ NMR kỹ thuật DEPT cho thấy có một số loại các bon như sau: hai cacbon bậc 4 ở độ chuyển dịch hóa học 151,70 ppm và 162,13 ppm đó là các nguyên tử cacbon C-2 và C-5. Có một nhóm CH2 với δ = 55,89 ppm. Có hai nhóm CH (metin) ở các độ dịch chuyển hóa học 109,62 ppm và 124,31 ppm. Theo phổ HSQC thì nguyên tử H-1 có độ dịch chuyển hóa học ở 9,54 ppm, các nguyên tử H-6a,b có độ dịch chuyển hóa học ở 4,50 ppm, nguyên tử H-3 có độ dịch chuyển hóa học ở 7,48 ppm. Còn nguyên tử H-4 có độ dịch chuyển hóa học ở 6,60 ppm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

42

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR-DMSO của PE-1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

43

Hình 3.5: Phổ 13C-NMR-DMSO của PE-1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

44

Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của PE-1 và số liệu phổ NMR trong phần mềm ACD/NMR của hidroxymetylfufural Phổ của chất PE-1 Vị trí C
13

Phần mềm ACD của hidroxymetylfufural. ACD/13C-NMR 179,55 156,33 121,65 112,74 160,22 56,63 ACD/1H-NMR 9,53 7,41 6,68 4,70

C- NMR (ppm)

1

H-NMR (ppm) 9,54 7,48 6,60 4,50

1 2 3 4 5 6

177,91 151,70 124,31 109,62 162,13 55,89

Phân tích phổ 1H-NMR, HMBC cho thấy tín hiệu H-1 (δ = 9,54 ppm) là độ chuyển dịch hóa học của hiđtro liên kết với nhóm C=O có tương tác xa với C-2 ở độ dịch chuyển hóa học ở 151,70 ppm và C-3 ở 124,31 ppm, H-3 (δ = 7,48ppm) có tương tác xa với các cacbon C-2 ở 151,70 ppm và C-4 ở 109,62 ppm, H-4 (1H, d, j=3,7Hz; δ = 6,60 ppm) có tương tác xa với C-3 và C-5 ở các độ dịch chuyển hóa học 124,31 ppm và 162,13 ppm. Còn các nguyên tử H-6a,b có tương tác xa với C-4 và C-5 ở các độ dịch chuyển hóa học 109,62 ppm và 162,13 ppm. So sánh phổ NMR của chất PE-1 với phần mềm ACD/1H-NMR và ACD/13C-NMR cho thấy sự tương tự gần như hoàn toàn với phổ của 5hidroxymetylfufural (xem bảng 3.2).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

45

Từ các kết quả phân tích các loại phổ của hợp chất PE-1như: phổ khối, phổ NMR với các kỹ thuật đo 1D và 2D, có so sánh với phần mềm mô phỏng ACD/NMR, có thể khẳng định chất PE-1 là 5-hidroxymetylfufural.
H 6 HO 4 3 5 O 2 1 C O

5-Hidroxymetylfufural Ngày nay chất 5-hidroxymetylfufural đã được phân lập từ một số cây thuốc dân gian khác như từ cây địa hoàng, cây trinh nữ hoàng cung nó có vai trò trong quá trình chuyển hoá chất trong cơ thể sinh vật. Trong cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria), chất 5-hidroxymetylfufural lần đầu tiên được phân lập và nhận dạng cấu trúc phân tử. 3.3.3. Axit gallic (PE-2) Chất PE-2 cũng được tách từ cặn etylaxetat, là chất rắn kết tinh, tinh thể hình kim màu vàng có nhiệt độ nóng chảy ở 249-250oC. Phổ 1H-NMR cho tín hiệu 7,092 ppm ứng với 2 proton đặc trưng cho độ chuyển dịch hóa học của các proton vòng thơm, được quy kết cho các proton ở các vị trí C-2 và C-6. Phổ
13

C-NMR cho thấy các độ chuyển dịch hóa học ở δ = 120,48

ppm, δ = 137,98 ppm và δ = 167,46 ppm, tương ứng với độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử cacbon C 1, C4 và C7 trong axit gallic. Có 2 tín hiệu ở δ = 108,73 ppm và δ = 145,40 ppm, mỗi tín hiệu ứng với 2 nguyên tử cacbon. Các tín hiệu này phù hợp với độ chuyển dịch hóa học của C 2 và C6 (δ = 108,73 ppm) và của C 3 và C5 (δ = 145,40 ppm).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

46

Hình 3.6: Phổ 1H-NMR-DMSO của PE-2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

47

Hình 3.7: Phổ 13C-NMR-DMSO của PE-2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

48

So sánh phổ NMR của chất PE-2 với phần mềm ACD/1H-NMR và ACD/13CNMR cho thấy sự tương tự gần như hoàn toàn với phổ của axit gallic (xem bảng 3.3). Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của PE-2 và số liệu phổ NMR trong phần mềm ACD/NMR của axit gallic

Như vậy, có thể quy kết chất PE-2 được tách ra từ dịch chiết etylaxetat của cây chó đẻ răng cưa được nhận dạng là axit gallic.
7 COOH 1 6 2 5 4 OH 3 OH

HO

Axit gallic Có thể coi axit gallic là một đơn phân để tham gia vào việc tạo ra các tanin thuỷ phân và tham gia vào các chuyển hoá khác tạo ra các lignan trong cây chó đẻ răng cưa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

49

3.3.4. Kampherol (PE-3) Chất PE-3. Từ cặn etylaxetat ngoài các chất PE-1 và PE-2 trình bày ở trên chúng tôi còn thu được một hỗn hợp có màu vàng, cho màu đỏ cam với phản ứng Xianiđin, màu xanh đen với dung dịch FeCl3 1% điều đó nói lên trong hỗn hợp này có flavonoit. Bằng phương pháp sắc kí cột silicagel hỗn hợp thu được này, rửa giải bằng hệ dung môi toluen : etylaxetat : axitfomic (5:4:1) thu được 29mg chất rắn màu vàng (có R f = 0,4 trong hệ dung môi E) và nóng chảy ở 276-278oC. Phổ khối lượng LC-MS cho pic ion phân tử M+ ở m/z =286,9 và M- ở m/z =285,0 ứng với M = 286 đvC và phù hợp với công thức C 15H10O6. Phân tích phổ 13C-NMR (DEPT) cho thấy hợp chất PE-3 có tổng cộng 15 nguyên tử cacbon trong đó có 9 C bậc 4, có 6 cacbon bậc 3 (có 6 nhóm CH), không chứa các cacbon bậc 1 và bậc 2. Có thể quy kết các tín hiệu δ = 176,58 ppm là của cacbon cacbonyl C-4; ở độ dịch chuyển hóa học δ = 147,03 ppm là của cacbon C-2; δ = 136,52 ppm là tín hiệu của C-3, đó là những nguyên tử cacbon olefin, C-2 liên kết với oxi ở vị trí số 1 còn C-3 liên kết với nhóm OH và nhóm C=O. Tín hiệu ở δ = 157,78 ppm và δ = 164,98 ppm tương ứng với độ chuyển dịch hoá học của C-5 và C-7, còn δ = 160,16 ppm là tín hiệu của C-4/ và 3 nguyên tử cacbon này liên kết trực tiếp với các nhóm hiđroxyl. Theo phổ HSQC của hợp chất PE-3 thì tín hiệu cộng hưởng proton tại 8,15 ppm (dd, J=8,2 và 2,2) là của H-2/ và H-6/ và tại 7,01 ppm (dd, J=8,2 và 2,2) là tính hiệu của H-3/ và H-5/, còn các tín hiệu δ = 6,26 ppm và 6,52 ppm là của các nguyên tử H-6 và H-8.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

50

Hình 3.8: Phổ 1H-NMR-AcetoneD6 của PE-3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

51

Hình 3.9: Phổ 13C-NMR-AcetoneD6 của PE-3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

52

Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của PE-3 và số liệu phổ trong phần mềm ACD/NMR của chất kampherol Phổ của chất PE-3 Vị trí C
13

Phần mềm ACD của chất kampherol ACD/13CNMR 146,45 135,60 175,80 157,63 98,25 163,90 93,45 159,13 103 121,65 129,40 115,35 159,10 115,35 129,40 ACD/1H-NMR 6,28 6,54 8,10 7,00 7,00 8,10

C- NMR (ppm)

1

H-NMR (ppm) 6,26 (1H, d, J=2,1) 6,52 (1H, d, J=2,1) 8,15 (1H, dd, J=8,2; 2,2) 7,01(1H, dd, J=8,2;2,2) 7,01(1H, dd, J=8,2; 2,2) 8,15 (1H, dd, J=8,2; 2,2)

2 3 4 5 6 7 8 9 10 1/ 2/ 3/ 4/ 5/ 6/

147,03 136,52 176,58 157,78 99,17 164,98 94,49 162,30 104,15 123,32 130,44 116,32 160,16 116,32 130,44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

53

Từ phổ HMBC cho thấy H-2’(δ = 8,15 ppm) có tương tác xa với các nguyên tử cacbon C-1’ (123,32 ppm) và C-3’ (116,32 ppm), H-3’(δ = 7,01 ppm) có tương tác xa với C-2’ (130,44 ppm) và C-4’(160,16 ppm), H-5’ tương tác xa với C-4’ (160,16 ppm) và C-6’ (130,44 ppm), H-6’ tương tác xa với C5’ (116,32 ppm) và C-1’ (123,32 ppm), H-6 có tương tác xa với C-5 (157,78 ppm) và C-7 (164,98 ppm). Còn H-8 có tương tác xa với C-7 (164,98 ppm) và C-9 (162,30 ppm). Qua việc phân tích các loại phổ của hợp chất PE-3 có so sánh với chương trình mô phỏng phổ ACD/1H-NMR và ACD/13CNMR cho thấy sự tương thích khá tốt với độ sai số cho phép có thể khẳng định hợp chất PE-3 chính là kampherol.
8 9 7 6 5 OH 10 C 4 O 3 OH
5'
6/

1 O 2
1'

2'

3'
4'

HO

OH

Kampherol hay 3,5,7,4/-tetrahidroxi flavon Kampherol là một flavonoit có trong nhiều thực vật, nó không độc và có tác dụng sinh học quan trọng. Lần đầu tiên chất này được phân lập từ cây chó đẻ răng cưa (phyllanthus urinaria) thu hái tại Thái Nguyên. 3.4. Thử hoạt tính sinh học Căn cứ vào thực tế đã và đang được ứng dụng làm thuốc của cây chó đẻ răng cưa, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính sinh học của dịch chiết của cây này tại bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y khoa – Đại học Thái Nguyên. Mẫu thử gồm có:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

54

Mẫu 1: Dịch chiết tổng số trong nước nóng. Mẫu 2: Dịch chiết trong EtOAc (đã loại bỏ hết phần chất tan trong n-hexan). Kết quả thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định của dịch chiết cây chó đẻ răng cưa nêu trong bảng 2.3, cho biết các dịch chiết thô đều có hoạt tính với vi sinh vật kiểm định. Cụ thể là: - Dịch chiết trong nước và dịch chiết etylaxetat của cây chó đẻ răng cưa đều có hoạt tính khá mạnh với các khuẩn Staphylococcusauresu (Tụ cầu vàng), E.coli (Thực khuẩn đường ruột) và Salmonella typhi (Thương hàn). - Dịch chiết nước có hoạt tính mạnh hơn so với dịch chiết etylaxetat. - Dịch chiết nước có hoạt tính mạnh nhất với khuẩn Salmonella typhi (Thương hàn).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

55

KẾT LUẬN
1. Lần đầu tiên, cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) mọc hoang tại Thái Nguyên được nghiên cứu sàng lọc hóa thực vật, đã thiết lập được quy trình ngâm chiết mẫu hợp lí thu được 4 dịch chiết chọn lọc. 2. Từ thân và lá cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L), bằng phương pháp phân tích định tính đã khẳng định trong cây chó đẻ răng cưa có những lớp chất: đường khử, ankaloit, steroit, flavonoit, poliphenol, cumarin và saponin. 3. Đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 4 hợp chất là: βSitosterol, 5-hidroxymetylfufural, axit gallic và kampherol. 4. Đã thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết tổng của cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) cho thấy có tác dụng kháng các khuẩn Staphylococcusauresu (Tụ cầu vàng), E.coli (Thực khuẩn đường ruột) và Salmonella typhi (Thương hàn).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

56

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

1. Ngô Đức Trọng, Phạm Văn Thỉnh (2008), “Nghiên cứu hóa học thực vật cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) mọc hoang tại Thái Nguyên (Chemical studies on the constituents of Phyllanthus urinaria L. growing wildly in Thai Nguyen province)”, Tạp chí Khoa học & Công nghệ Đại học Thái Nguyên, số 2 (46), tr 75-79.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

57

TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tài liệu tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội. 2. Nguyễn Văn Đàn (1997), Các phương pháp nghiên cứu cây thuốc, NXB YDược, Tp. Hồ Chí Minh. 3. Nguyễn Văn Đậu, Lưu Hoàng Ngọc, Nguyễn Đình Chung (2003), “Phân lập một số hoạt chất từ cây chó đẻ răng cưa”, Tạp chí Dược học, số 9 năm 43, tr.12-15. 4. Nguyễn Văn Đậu, Trần Thị Thu Hà (2007), “Ngiên cứu hóa thực vật cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus uticulatus niruri L)”. Tạp chí dược học, số 369 năm 47, tr.15-18. 5. Đỗ Tất Lợi (1997), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr.65-67. 6. Nguyễn Thượng Dong và đồng tác giả (2001), “Khảo sát công dụng làm thuốc của một số loài Phyllanthus ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 6 (2+3), tr.72-75. 7. Trần Đình Thắng và cộng sự (2007), “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất phenolic từ cây chó đẻ răng cưa”, Tạp chí Dược học, số 371 năm 47, tr.14-17. B. Tài liệu tiếng Anh 8. Anjaneyulu (1973), “A. S. R et al”, Tetrahedron, 29(1), p.1291. 9. Babady-Bila (1996), “Niruroidine, a norsecurinine-type alkaloid from Phyllanthus niruroides”, Phytochemistry, 41(5), p.1441-1443. 10. Bikram Singh, P.K. Agrawal and R.S. Thakur (1989), “An acyclic triterpene from Phyllanthus niruri”, Phytochemistry, 28(7), p.1980-1981.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

58

11. Calixto J. B., Santos A. R. (1998), “A review of the plants of the genus Phyllanthus”, Pharmacology, 4(18), p.225-258. 12. Chia-Chuan Chang, Yu-Chin Lien (2003), “Four lignans were isolated from Phyllanthus urinaria L”, Phytochemistry, 63(7), p.825-833. 13. Chien-Min Yang, Hua-Yew Cheng (2007), “Geraniin from Phyllanthus urinaria L”, Ethnopharmacology, 110(3), p.555-558. 14. Farah Naaz, Saleem Javed, M.Z. Abdin (2007), “Hepatoprotective effect of ethanolic extract of Phyllanthus amarus Schum. et Thonn”, Ethnopharmacology, 113(3), p.503-509. 15. Goat J.L., Akihisa T. (1997), “Analysis of steroit frest ed.”, Phytochemistry, p.324. 16. Hasenah Ali (2006), “α-Amylase inhibitory activity of some Malaysian plants used to treat diabetes”, Ethnopharmacology, 107(3), p.449-455. 17. Herbert Kolodziej (2005), “Tannins and related compounds induce nitric oxide synthase and cytokines gene expressions in Leishmania major”, Bioorganic, 13(23), p.6470-6476. 18. Hirotaka S., Masayoshi I. (2005), “Direct observation of a target cell of the leaf-closing factor by using novel fluorescence-labeled phyllanthurinolactone”, Tetrahedron Letters, 46(33), p.5537-5541. 19. Hnatyszyn, J. Miño, G. Ferraro (2002), “The hypoglycemic effect of Phyllanthus sellowianus fractions”, Phytomedicine, 9(6), p.556-559. 20. Horii Z. (1972), “Et all”, Tetrahedron Letters, p.1887. 21. Jangfang Quian-Cutrone (1996), “J. Nat.” Prod., (59), p.196-199. 22. Kumaran, Karunakaran (2007), “In vitro antioxidant activities of methanol extracts of five Phyllanthus species from India”, Food Science, 40(2), p.344-352.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

59

23. Kumar Roy, H. Dhir, A. Sharma (1992), “Modification of metal-induced micronuclei formation in mouse bone marrow erythrocytes", Toxicology Letters, 62(1), p.9-17. 24. L. Yeap Foo (1992), “Phyllanthusiin D, an unusual hydrolysable tannin from Phyllanthus amarus”, Phytochemistry, 31(2), p.711-713. 25. L. Yeap Foo (1993), “Amariin, a di-dehydrohexahydroxydiphenoyl hydrolysable tannin from Phyllanthus amarus”, Phytochemistry, 33(2), p.487-491. 26. L. Yeap Foo (1995), “Amariinic acid and related ellagitannins from Phyllanthus amarus”, Phytochemistry, 39(1), p.217-224. 27. Manske R. H. F (1973), “The Alkaloids chemistry and physiology”, Phytochemistry, (15), p.428. 28. Masturah Markom, Masitah Hasan (2007), “Extraction of hydrolysable tannins from Phyllanthus niruri L”, Technology, 52(3), p.487-496. 29. Matsunaga, Tanaka (1992), “26-Nor-D:A-friedooleanane triterpenes from Phyllanthus watsonii”, Phytochemistry, 32(1), p.165-170. 30. Peter J. Houghton, Tibebe Z. Woldemariam (1996), “Two securinega-type alkaloids from Phyllanthus amarus”, Phytochemistry, 43(3), p.715-717. 31. Rajasubramaniam, Pardha Saradhi (1997), “Rapid multiplication of Phyllanthus fraternus: a plant with anti-hepatitis viral activity”, Industrial Crops and Products, 6(1), p.35-40. 32. Rajkishor S. Negi, Thawra M. Fakhir (1998), “An alkaloid from Phyllanthus simplex”, Phytochemistry, 27(9), p.3027-3028. 33. Reiko Tanaka, Shunyo Matsunaga (1998), “Triterpenes from the stem bark of Phyllanthus flexuosus”, Phytochemistry, 27(11), p.3563-3567.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

60

34. Satyanarayana, Venkateswarlu (1991), “Isolation, structure and synthesis of new diarylbutane lignans from Phyllanthus niruri”, Tetrahedron, 47(42), p.8931-8940. 35. Sengupta, Mukhopadhyay (1966), “Terpenoids and related compoundsVII : Triterpenoids of Phyllanthus acidus skeels”, Phytochemistry, 5(3), p.531-534. 36. Shakil, Pankaj (2008), “Nematicidal prenylated flavanones from Phyllanthus niruri”, Phytochemistry, 63(3), p.759-764. 37. Shih-Hua Fang, Yerra Koteswara Rao (2008), “Anti-oxidant and inflammatory mediator's growth inhibitory effects of compounds isolated from Phyllanthus urinaria”, Ethnopharmacology, 116(2), p.333-340. 38. Shunyo Matsunaga, Reiko Tanaka, (1988), “Revised structure of trichadenic acid B”, Tetrahedron Letters, 29(37), p.4751-4754. 39. Sutthivaiyakit, Nakorn N. (2003), “ A new guaiane sesquiterpene from the roots of Phyllanthus oxyphyllus”, Tetrahedron, 59(50), p.9991-9995. 40. Syamasundar, Bikram Singh (1985), “Antihepatotoxic principles of Phyllanthus niruri herbs”, Ethnopharmacology, 14(1), p.41-44. 41. Tanaka, K. Masuda and S. Matsunaga (1993), “Lup-20(29)-en-3β,15αdiol and ocotillol-II”, Phytochemistry, 32(2), p.472-474. 42. Thales R. Cipriani, Caroline G. Mellinger (2008), “Acidic heteroxylans from medicinal plants and their anti-ulcer activity”, CarbohydratePolymers, 74(2), p.274-278. 43. Torben L. Bachmann, Felipe Ghia (1993), “Lignans and lactones from Phyllanthus anisolobus”, Phytochemistry, 33(1), p.189-191. 44. Toshimasa Ishida (1998), “Phyllurine, leaf-opening substance of a nyctinastic plant Phyllanthus urinaria L”, Tetrahedron Letters, 39(52), p.9731-9734.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

61

45. Van der B.D.A.(1991), “Viettlink A. J.”, Plant Biochemistry, 6, p.47-70. 46. Vuyelwa J. N., Neil R. C. (2008), “Triterpenoids from the African tree Phyllanthus polyanthus”, Phytochemistry Letters, 1(1), p.11-17. 47. Wai-Haan Hui, Man-Moon Li (1976), “ Tritecpenoit isolated from Phyllanthus reticulates ”, Phytochemistry, 5(15), p.797-798. 48. Wanxing Wei, Yuanjiang Pan (2005), “Carboxylic acids from Phyllanthus urinaria”, Chemistry of Natural Compounds, 41(1), p.17-20. 49. Xiaoli Liu, Chun Cui, M. Zhao (5/2008), “Antioxidant activity of methanolic extract of emblica fruit”, Journal of Food, 21(3), p.219-228. 50. Xiao Liu, Chun Cui, M. Zhao (8/2008), “Identification of phenolics in the fruit of emblica”, Food Chemistry, 109(4), p.909-915. 51. Yerra Koteswara Rao (2006), “Anti-inflammatory activities of constituents isolated from Phyllanthus polyphyllus”, Ethnopharmacology, 103(2), p.181-186. 52. Ying-Jun Zhang (2006). “A novel highly oxygenated norbisabolane from the roots of Phyllanthus emblica”, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Japan, p.1-14. 53. Zhang L. Z., Guo Y. J. (2000), “Studies on chemical constituents of Phyllanthus urinaria L”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 10(25), p.615-617. 54. Zhang L. Z., Guo Y. J. (2004), “Isolation and indentification of a novel ellagitannin from Phyllanthus urinaria L”, Yao Xue Xue Bao, 2(39), p.119-112.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

62

PHỤ LỤC
1. Phổ EI-MS của β-Sitosterol (PH-1) 2. Phổ FT-IR của β-Sitosterol (PH-1) 3. Phổ 1H-NMR của β-Sitosterol (PH-1) 4. Phổ 13C-NMR của β-Sitosterol (PH-1) 5. Phổ LC-MS của hydroxymetylfufural (PE-1) 6. Phổ 1H-NMR và ACD/1 H-NMR của hydroxymetylfufural (PE-1) 7. Phổ 13C-NMR và ACD/13C-NMR của hydroxymetylfufural (PE-1) 8. Phổ 13C-NMR và DEPT của hydroxymetylfufural (PE-1) 9. Phổ HMBC của hydroxymetylfufural (PE-1) 10. Phổ HSQC của hydroxymetylfufural (PE-1) 11. Phổ 1H-NMR và ACD/1H-NMR của axit gallic (PE-2) 12. Phổ 13C-NMR và ACD/13C-NMR của axit gallic (PE-2) 13. Phổ LC-MS của kampherol (PE-3) 14. Phổ 1H-NMR và ACD/1H-NMR của kampherol (PE-3) 15. Phổ 13C-NMR và ACD/13C-NMR của kampherol (PE-3) 16. Phổ 13C-NMR và DEPT của kampherol (PE-3) 17. Phổ COSY của kampherol (PE-3) 18. Phổ HMBC của kampherol (PE-3) 19. Phổ HSQC của kampherol (PE-3) 20. Kết quả xác định tính năng dược, kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết thô từ cây chó đẻ răng cưa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

63

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

64

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

65

Hình 3.2: Phổ 1 H-NMR của  -sitosterol (PH-1)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

66

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

67

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

68

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

69

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

70

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

71

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

72

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

73

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

74

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

75

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

76

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

77

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

78

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

79

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

80

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

81

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

82

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

83

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

84

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

85

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

86

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

87

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

88

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

89

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

90

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

91

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

92

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

93

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

94

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

95

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

96

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

97

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

98

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

99

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

100

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

101
TRƯỜNG ĐH Y KHOA TN

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

BỘ MÔN VI SINH

KẾT QUẢ KIỂM TRA DƢỢC TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA DƢỢC LIỆU

Ngày kiểm tra: 19/05/2008. Kết quả: Đƣờng kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm) Dƣợc liệu Staphylococcus aureus E.coli Salmonella typhi cặn EtOAc 34 23 40 (Trọng) cặn nƣớc 29 18 32 (Trọng) - Kết luận: Các dịch chiết thô đều có hoạt tính với vi sinh vật kiểm định. Cụ thể là: - Dịch chiết trong nước và dịch chiết etylaxetat của cây chó đẻ răng cưa đều có hoạt tính khá mạnh với các khuẩn Staphylococcusauresu (Tụ cầu vàng), E.coli (Thực khuẩn đường ruột) và Salmonella typhi (Thương hàn). - Dịch chiết nước có hoạt tính mạnh hơn so với dịch chiết etylaxetat. - Dịch chiết nước có hoạt tính mạnh nhất với khuẩn Salmonella typhi (Thương hàn).

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 05 năm 2008 Phó trƣởng bộ môn Vi sinh

Ts. Nguyễn Đăng Trung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful