You are on page 1of 10

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner dengan Metode Tri Parental Mating

Construction and transformation of binary plasmid Cry 1Ab gene carrier using triparental mating

Liberty1, M. Herman2, dan G.A. Watimena3

Key words : Cloning binary vector, Cry1Ab gene, transformation, tri parental mating. Kata kunci : vektor cloning binary, gen Cry 1Ab, transformasi, persilangan tiga tetua.
Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor pada bulan Agustus 2003 hingga Oktober 2004. Kloning DNA pada vektor plasmid meliputi kegiatan restriksi DNA, defosforilasi, ligasi, transformasi, dan isolasi plasmid. Transformasi plasmid biner ke dalam A. tumefaciens dilakukan dengan metode triparental mating. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transformasi E. coli dengan gen cry1Ab telah berhasil dilakukan dan diketahui ukuran fragmen gen cry1Ab yang diperoleh adalah 14.762 bp. Konstruksi gen cry1Ab berhasil diintroduksikan kedalam A. tumefaciens dengan metode triparental mating.

Abstract
In order to develop seed borer resistant soybean cultivar, the research to construct and transform binary plasmid Cry1Ab gene carrier into Agrobacterium tumefaciens were done in Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika and in Laboratorium Fasilitas Uji Terbatas Balai Besar dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor Indonesia from August 2003 to October 2004. The DNA cloning works were including DNA restriction, dephosphorilation, ligation, transformation, and plasmid isolation. Tri-parental mating method was used to transform binary plasmid into A. tumefaciens. 14.762 bp Cry1Ab gene fragment were transformed in to E. coli. Through tri-parental mating method, this gene construction was successfully introduced into A. tumefaciens.

Pendahuluan
Tanaman kedelai merupakan salah satu tanaman pangan penting di Indonesia setelah padi dan jagung, yang hingga saat ini masih perlu diimpor. Kebutuhan kedelai Indonesia terus meningkat sebesar 2.24 juta ton setiap tahunnya, padahal kapasitas produksi kedelai nasional hanya mencapai 1.19 juta ton dari luas areal tanam 967.002 ha (Badan Pusat Statistik, 2002). Kendala dalam peningkatan produksi tanaman kedelai adalah tingginya serangan penyakit dan hama tanaman, terutama hama penggerek polong kedelai yang disebabkan oleh Etiella zinkenella dari ordo Lepidoptera. Hama ini merupakan hama penting tanaman

Sari
Penelitian untuk mengkonstruksi plasmid biner pembawa gen cry1Ab dan mentransformasi plasmid biner tersebut ke dalam Agrobacterium tumefaciens dalam upaya merakit tanaman kedelai tahan penggerek polong dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika dan di Laboratorium Fasilitas Uji Terbatas Balai Besar dan
1) Universitas Islam Negeri Sunan Gunung Djati Bandung 2) Balai Besar Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian 3) Institut Pertanian Bogor

130 Zuriat, Vol. 19, No. 2, Juli-Desember 2008

tetapi juga gen marka untuk seleksinya. transformasi. yaitu pSBB (pembawa gen cry1Ab yang dikendalikan oleh promotor 35S CaMV dan terminator nos) dan pCambia 1301 (pembawa gen penyeleksi bakteri kanR. Gen cry1Ab tersebut harus dikonstruksi dalam suatu vektor plasmid untuk dapat ditransfer ke dalam suatu tanaman. ligasi. dan aman. 1998). al 1989). Dalam penelitian ini dilakukan konstruksi plasmid biner untuk mengatasi sulitnya menemukan sisi pemotongan yang unik dengan enzim restriksi pada plasmid Ti yang sangat besar (Loedin et al. Namun. gen gus. yaitu (1) tersedianya gen yang diinginkan. atau tanaman dari jenis lain (Bennet. karena sifat penyerangannya yang sulit dideteksi secara cepat dari luar (Soekarno dan Harnoto. Menurut Sudarsono (1994) teknik transformasi sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor. Plasmid yang digunakan untuk transformasi tanaman tidak hanya menggunakan gen dari karakter yang diinginkan. 1996). Konstruksi plasmid dan metode transfer yang tepat merupakan salah satu faktor penetu keberhasilan perakitan tanaman transgenik. Transformasi plasmid biner ke dalam A. Gen cry1Ab merupakan gen yang mengkode Bt toksin dan terbukti efektif mengatasi hama dari golongan lepidoptera. dan (3) tersedianya cara untuk meregenerasikan tanaman transgenik untuk mengekspresikan gen yang telah diintroduksikan tersebut. Restriksi plasmid pSBB dan pCambia 1301 dilakukan dengan menggunakan enzim HindIII. 1993). virus. Kloning DNA pada vektor plasmid meliputi kegiatan restriksi DNA. Defosforilasi dilakukan dengan metode calf intenstinal akaline phaspatase (CIP) terhadap vektor pCambia yg sudah dipotong dan diligasi Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 131 . dan multiple cloning site pada T-DNA).. yaitu belum ditemukannya sumber gen ketahanan di dalam plasma nutfah kedelai yang ada saat ini. Gen yang ditransfer ke dalam genom tanaman bisa berasal dari species lain seperti. Perakitan tanaman tahan dengan teknik rekayasa genetik dapat dilakukan untuk mengatasi masalah di atas. 2002). Penggunaan varietas kedelai tahan hama penggerek polong merupakan cara yang paling efektif. (2) tersedianya cara untuk mentransfer dan mengintegrasikan gen tersebut ke dalam sel tanaman. tumefaciens dilakukan dengan metode triparental mating. Perakitan tanaman transgenik melibatkan beberapa tahap dalam teknik biologi molekuler dan seluler (Herman. 1985).kedelai yang hingga saat ini masih sulit untuk diatasi. penyeleksi tanaman hph. dan isolasi plasmid (Sambrook et. Bahan dan Metode Penelitian dilakukan pada bulan Agustus 2003 hingga Oktober 2004 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetik Balai Besar Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-Biogen) Bogor. perakitan tanaman secara konvensional masih menemukan kendala. sehingga dapat digunakan untuk mengendalikan hama penggerek polong kedelai. defosforilasi. Teknik rekayasa genetik yang sering dipakai dan memberikan hasil yang memuaskan adalah melalui perakitan tanaman transgenik dengan teknik transformasi. Teknologi rekayasa genetik memberikan peluang bagi pemulia tanaman untuk memperoleh kelompok gen yang baru dan lebih luas (Herman. efisien. bakteri. Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah dua macam plasmid. serta Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 (koleksi Balai Penelitian Perkebunan (Balitbun) Bogor.

Pemotongan plasmid pSBB dengan enzim HindIII bertujuan untuk memisahkan fragment gen cry1Ab dari vektor awalnya (pSBB). (1989). Juli-Desember 2008 . Defosforilasi merupakan tahap yang paling penting dan dilakukan sebelum ligasi. Vol. HindIII diperoleh satu fragmen berukuran 11.837 kb dan pada plasmid pSBB diperoleh dua fragmen berukuran 2. 1 =pCambia 1301. 2 = pCambia 1301+HindIII. tumefaciens dilakukan dengan teknik PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk gen cry1Ab. coli DH5α dilakukan dengan metode kejutan panas dan isolasi DNA plasmid dari kultur cair bakteri dilakukan dengan metode lisis alkalis mengikuti metode Sambrook et al. Defosforilasi dapat mengurangi terbentuknya hasil ligasi sendiri.837 kb. Penyambungan kembali fragmen dapat menghambat penyisipan gen cry1Ab pada plasmid biner. 2.935 kb. a = pCambia ukuran 11. (1980). 4 = pSBB diencerkan 10 x. Proses defosforilasi pada umumnya dilakukan dengan menggunakan enzim akaline fosfatase seperti calf intestinal phasphatase (CIP). 3 = pSBB dan HindIII. No. Fragmen gen cry1Ab dan pCambia 1301 selanjutnya dielusi dari gel agarose untuk digunakan pada proses ligasi. 1989). Primer yang digunakan adalah : 5’-CGA CAT CTC CTT GTC CTT GAC AC-3’ dan 5’-ACA CCC TGA CCT AGT TGA GCA AC-3’. mengikuti Transformasi plasmid ke dalam E. tumefaciens LBA 4404 dilakukan dengan metode triparental mating mengikuti metoda yang dikemukakan oleh Ditta et al. dan λ = 50 ng/µl. Transformasi gen cry1Ab ke dalam A. 5 = pSBB.dengan fragmen cry1Ab metode GibcoBRL.74 kb.74 kb (Gambar 1). c = PGEM-4z ukuran 2. Pola restriksi pCambia 1301 dan pSBB M = Marka. 132 Zuriat. Proses defosforilasi ini dilakukan pada pCambia 1301 dan berfungsi untuk mencegah tersambungnya kembali fragmen tersebut. b = gen cry1Ab ukuran 2. Australia. Hasil dan Pembahasan Konstruksi plasmid biner diawali dengan pemotongan dua plasmid (pCambia 1301 dan pSBB) menggunakan enzim restriksi HindIII. Konfirmasi hasil integrasi gen cry1Ab ke dalam A. Ukuran fragmen-fragmen yang diperoleh tersebut sesuai dengan ukuran fragmen insersi pada peta plasmid yang dikeluarkan oleh Cambia Co. CIP sendiri merupakan glikoprotein yang berfungsi untuk memindahkan ikatan 5’-phasphatase dari DNA linear (Sambrook et al. 19. Hasil pemotongan pada plasmid pCambia 1301 dengan enzim restriksi Gambar 1.925 kb (fragmen gen cry1Ab) dan 2. Berdasarkan peta plasmid. pSBB memiliki gen cry1Ab yang lengkap dengan promotor dan terminatornya berada di antara dua sisi enzim restriksi HindIII tersebut.

837 bp dan fragmen cry1Ab 2. Gambar 2. Koloni bakteri hasil transformasi ke dalam E.Hasil penyambungan gen cry1Ab dengan fragmen pcambia 1301 (plasmid biner modifikasi) menggunakan enzim T4 DNA ligase diintroduksi dengan proses transformasi kedalam bakteri E. Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 133 . Proses ligasi antara DNA vektor pCambia 1301 dengan fragmen gen cry1Ab menghasilkan plasmid rekombinan pCambia-cry1Ab berukuran 14. coli (sel kompeten DH5α) dan ditumbuhkan pada media LB padat+kanR selama 16 jam pada suhu 37oC. Koloni-koloni yang terbentuk dari masing-masing perlakuan (Gambar 2) mengindikasikan keberhasilan konstruksi plasmid rekombinan yang telah membawa gen cry1Ab di bawah kontrol promotor 35S CaMV.762 bp (Gambar 3) yang merupakan gabungan dari vektor pCambia 11. 2 = Plasmid rekombinan ulangan 2. 3 = Plasmid rekombinan ulangan 3 Dari koloni-koloni yang terbentuk dapat diketahui bahwa konstruksi plasmid rekombinan dilakukan dengan menyisipkan gen cry1Ab di bawah kontrol promotor 35S CaMV ke dalam plasmid vektor pCambia 1301. Coli 1 = Plasmid rekombinan ulangan 1.935 bp.

coli melalui metode kejutan panas.925 bp (gambar 4) dimana fragmen pertama merupakan ukuran dari plasmid vektor pCambia 1301 dan fragmen kedua merupakan ukuran dari promotor 35S CaMV (800 bp). 2. coli yang mengandung plasmid biner (pCambia dengan fragmen gen cry1Ab) dilakukan dengan cara uji pola restriksi menggunakan enzim restriksi terhadap delapan sampel DNA plasmid dari koloni replika.845) dan terminator nos (280 bp). coli bertujuan untuk memperbanyak plasmid rekombinan. 19. gen cry1Ab (1.837 bp dan 2. Berdasarkan hasil restriksi terhadap DNA rekombinan yang berasal dari koloni 1.2 terdapat dua fragmen berukuran 11..3 dan 3. Transformasi ke dalam sel E. Pada tahap awal dilakukan deteksi pola plasmid rekombinan melalui pemotongan delapan sampel DNA plasmid dari koloni replika menggunakan enzim HindIII. Vol. Peta plasmid rekombinan pCambia-cry1Ab DNA rekombinan yang diperoleh kemudian ditransformasikan kedalam sel kompeten E. Dugaan awal dari kedua plasmid ini adalah pCambia 1301 yang telah tersisipi fragmen gen cry1Ab. No. Verifikasi terhadap E. Juli-Desember 2008 . 134 Zuriat.Gambar 3.

G = Koloni 3. λ2 = 200 ng/µl. 1 = 3.2+EcoRI. 5 = 3.5+BamHI+EcoRI.2.1. C = Koloni 1. Hasil restriksi plasmid rekombinan dengan enzim BamHI+EcoRI M = Marka. Gambar 5.5+EcoRI.5 yang diperkirakan rekombinan. Hasil pemotongan dengan enzim tersebut dapat dilihat pada Gambar 5.2.2 dan 3.2+HindIII Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 135 .2+BamHI+EcoRI. hasil restriksi plasmid rekombinan dengan HindIII M = Marka.5 dipotong dengan enzim BamHI+EcoRI. 6 = 3.3. 1 =pCambia 1301.925 kb. B = Koloni 1.2.3. A = Koloni 1. Berdasarkan hasil restriksi menggunakan enzim tersebut hanya koloni yang berasal replika 3.Gambar 4. b = fragmen berukuran 2. λ1 = 100 ng/µl. F = Koloni 2.1. λ3 = 300 ng/µl. D = Koloni 2. 2 = pCambia 1301+HindIII. 3 = cry1Ab. 4 = 3. a = fragmen berukuran 2. H = Koloni 3.5+HindIII. 2 = 3. E = Koloni 2.1.925 kb Tahap kedua dilakukan kembali deteksi pola plasmid rekombinan melalui pemotongan empat sampel DNA plasmid dari koloni replika menggunakan enzim hindIII. Selanjutnya DNA plasmid dari koloni 3. 3 = 3.

Perbedaan pada posisi ini disebabkan karena arah ekspresi gen cry1Ab.Berdasarkan pola restriksi menggunakan enzim EcoRI+BamHI plasmid rekombinan 3. Proses ini menggunakan tiga tetua. sedangkan pada gen cry1Ab2 posisinya berlawanan dengan arah jarum jam. Koloni yang tumbuh pada media seleksi selanjutnya di uji PCR untuk membuktikan bahwa fragmen gen cry1Ab telah masuk ke dalam A. Juli-Desember 2008 . 280 bp. Hasil transformasi tersebut ditandai dengan munculnya koloni pada media seleksi. Pada gen cry1Ab1 posisinya searah dengan jarum jam. rentan terhadap antibiotik rimpafisin dan resipien A.600 bp. dan E.2 mempunyai empat fragmen berukuran 1845 bp. Kemampuan tumbuh pada media seleksi dikarenakan adanya gen nptII (neomycine phosphotransferase) penyandi ketahanan terhadap antibiotik kanamisin pada plasmid pCambia 1301. enzim-enzim Plasmid rekombinan yang telah dicek pola restriksinya ditransformasikan ke dalam A. coli DH5α dengan gen cry1Ab yang terdapat dalam plasmid pCambia 1301 telah berhasil dilakukan. tumefaciens LBA 4404 (sebagai resipien) melalui konjugasi dengan bantuan E. Proses triparental mating telah berhasil mengintroduksikan plasmid pCambiacry1Ab ke dalam A. tumefaciens LBA 4404 resisten terhadap rimpafisin dan rentan terhadap kanamisin. tumefaciens. No.807 bp. Hal yang sama juga dilakukan pada plasmid rekombinan 3. Hal ini menunjukkan bahwa plasmid pCambia-cry1Ab1 dan pCambiacry1Ab2 memiliki pola restriksi seperti yang diharapkan. Plasmid yang mempunyai pola restriksi seperti yang diharapkan dapat digunakan untuk transformasi ke dalam A. 2. E. tumefaciens LBA 4404 melalui metode triparental mating. Keberhasilan transformasi ke dalam E. Plasmid pCambiacry1Ab yang terdapat pada E. tumefaciens (Gambar 5). 19. yaitu A. 830 bp. tumefaciens LBA 4404 (Gambar 6). coli DH5α yang mengandung plasmid rekombinan yang ditumbuhkan dalam media seleksi LB+50 mg/ l kanamisin+25 mg/ l rimpafisin untuk menyeleksi bakteribakteri donor.5 dan diperoleh empat fragmen berukuran 1845 bp. dan 11. coli DH5α hasil transformasi (sebagai donor) dipindahkan ke dalam A. Bakteri yang mampu tumbuh pada media seleksi ini hanya A. tumefaciens LBA 4404. coli HB 101 (pRK 2013) yang resisten terhadap antibiotik kanamisin. dan 12. coli DH5α ini dilakukan pengujian dengan menggunakan restriksi. coli DH5α yang tumbuh pada media seleksi yang mengandung 50 mg/ l kanamisin. Keberhasilan transformasi ini dapat dilihat dari transforman E. 37 bp. 280 bp. Vol. 136 Zuriat. Transformasi bakteri E. tumefaciens LBA 4404 yang telah mengandung plasmid pCambia-cry1Ab hasil triparental mating (resisten terhadap kanamisin dan rimpafisin). yang disebabkan karena kedua ujung DNA baik vektor maupun gen sisipan mempunyai sekuen pengenal yang sama (HindIII). coli HB 101. Dari hasil pemotongan menggunakan enzim restriksi diperoleh dua versi penyisipan gen cry1Ab dalam vektor pCambia 1301.

Transformasi triparental mating ke dalam A. Plasmid helper PRK2013. E. A. b. tumefaciens LBA 4404.tTumefaciens a. coli rekombinan.Gambar 6. Perkawinan dengan triparental mating. Triparental dalam media seleksi Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 137 . d. c. e.

Stanfield.5. Molecular Cloning A laboratory Manual (2nd ed. dan 5 = kontrol Kesimpulan Berdasarkan uji pola restriksi. Genetic Engineering. Helinski. 1993. 2 = triparental 3. Corbin. maniatis.Analisis PCR merupakan metode deteksi secara cepat untuk mengetahui keberadaan transgen di dalam jaringan tanaman putatif trangenik. coli dengan gen cry1Ab telah berhasil dilakukan dan diketahui ukuran fragmen gen cry1Ab yang diperoleh adalah 14. D. Rekayasa genetik untuk perbaikan tanaman. Hal ini menunjukkan bahwa A. Reaksi amplifikasi dilakukan berdasarkan metode Wang et al. 3 = plasmid 3.%. D. Nat. Vol. (1993) yang dimodifikasi dengan menggunakan mesi PCR MJ Research PCT-100.R. tumefaciens dengan metode triparental mating. Acad. Gambar 7. Proc. Hasil PCR triparental mating M = Marka. 4 = plasmid 3. J. Broad host range DNA cloning system for gram negative bacteria : construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Indonesia. Buletin AgroBio. Juli-Desember 2008 . Daftar Pustaka Badan Pusat Statistik. Statistika Indonesia. 1996.). 2002. tumefaciens telah membawa gen cry1Ab dan dapat ditransformasikan ke dalam genom tanaman. Hasil analisis PCR menunjukkan bahwa koloni dari triparental mating 3. Sci.S.. 2. 1980. Genese for crop improvement. Konstruksi gen cry1Ab berhasil diintroduksikan kedalam A. 1989. G. and T. 138 Zuriat. Bennet.762 bp.Statistical Year Book of Indonesia.2. 16 : 93-113. 1 = triparental 3.2 dan 3. USA. 1(1) : 24-34. 19. JEF Fritsch.5 positif membawa gen cry1Ab (Gambar 7). Keberadaan gen cry1Ab diindikasikan dengan produk PCR berukuran 100 bp. 77 : 7344-7351. transformasi E. Sambrook. Jakarta. Ditta. Herman.2. No.

New York. JIPI. Penggunaan protein pembungkus (coat protein) dari pathogen virus dan rekayasa genetik untuk memperoleh tanaman unggul tahan virus. 1985. Kedelai. Puslitbangtan. Manurung. Dalam S. Sumarno. Soekarno. S. Slater. Sudarsono. dan Harnoto. dan Yaswadi. Iowa. Somaatmadja. Mahyudi Syam. USA. Badan Litbang Pertanian.Cold Spring Harbor Laboratory press. Seeds. USA. Pengendalian Hama Kedelai. 1994. Halaman : 310-330. D.O. 1995. Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 139 . 4(2) : 34-39 Wang K. Mismunadji..