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PCR em Tempo Real

Dr Robson Francisco Carvalho


rfcarvalho@ibb.unesp.br

Departamento de
Morfologia

PCR em Tempo Real

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

O que há de errado com os géis de agarose?

* Pobre precisão

* Baixa sensitividade

* Curta extensão dinâmica (< 2 logs)

* Baixa resolução

* Não automatizado

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

O que há de errado com os géis de agarose?

* Resultados não são expressos em números

* Colorações não são muito quantitativas

* Pós-processamento do produto da PCR

* Contaminação (brometo)

* Discriminação baseada apenas no tamanho do fragmento

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real
PCR tradicional x PCR tempo real:

Fluorescence
Starting
Template

PCR
Round 1

2X
Template Cycle
PCR tradicional
Análise Real-time
Deteção do produto
Constante detecção e
PCR no gel de agarose
Round 2 monitoramento dos
produtos de amplificação
durante toda corrida
4X (emissão de fluorescência)
Template

30-40 ciclos
PCR em tempo real

Sistemas de detecção

PCR em tempo real:

→ Sistema baseado na detecção e quantificação de um sinal fluorescente

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

Vantagens do PCR em tempo real:

→ Não é influenciado por amplificação não-específica (sondas)

→ Amplificação pode ser monitorada em tempo real

→ Ciclos mais rápidos

→ Detecção de alteração menor que 2x

5x

Gel de agarose

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Vantagens do PCR em tempo real:

→ Maior extensão dinâmica (de até 1010 x)

→ Requer 1000x menos DNA que demais ensaios

(3 picogramas = 1 genoma)

→ confirmação da amplificação específica (análise da curva de melting)

→ MAIS ESPECÍFICO, SENSÍVEL e REPRODUZÍVEL

→ Não é muito mais caro que a PCR convencional

(exceção: preço do equipamento)

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real
FASES DA PCR:

→ Exponencial: Dobro do produto é acumulado em cada ciclo (eficiência da reação


~100%). Reação específica e precisa.

→ Linear: Alta variabilidade (consumo dos componentes da reação)

→ Platô: Detecção por gel para os métodos tradicionais. Produtos não são mais
produzidos e começam ser degradados

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real


FASES DA PCR:

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

Desvantagens do PCR em tempo real:

→ Não é ideal para multiplex

→ Utilização requer alta habilidade técnica e suporte

→ Alto custo do equipamento

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real


Sistema Tempo Real:

→ Sistema óptico

→ Termociclador

→ Hardware

→ Software

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real

2. Laser excita a
sonda fluorescente
1. Polimerase encontra o primer. do primer.

… ...
F
T

… ... 3. Florescência
é absorvida
pela molécula
inibidora Q.

4. Detector registra “no reaction”.

PCR em Tempo Real

5. Primer estendido pela Polimerase.

… ...
F
T

….

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PCR em Tempo Real

6. Extensão continua até a


polimerase encontrar a molécula
fluorescente.
Q

… ...
F
T

. . .… .
…. . . …
7. polimerase quebra o primer
marcado. A sonda fluorescente e a
molécula inibidora são liberadas.

PCR em Tempo Real


F
Q

8. O PCR continua, os primers F


marcados são degradados e
moléculas fluorescentes “livres”
são acumuladas. T

… . . . …
… .. . … ...
… . . .
F Q

9. O detector grava a fluorescência


como medida do progresso de
amplificação.

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PCR em Tempo Real
Análise

- SNPs - Carga viral


- Patógenos - Expressão gênica
- Transgênicos

Endpoint Tempo Real

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real


Análise

Endpoint Tempo Real

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real
Montagem da reação:

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real
Terminologia:

→ Baseline: fluorescência do amplicon = fluorescência do meio


(ruído liberado pela reação-background)
- ciclo da PCR com poucas mudanças no sinal de fluorescência

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real


Terminologia:

PCR em tempo real

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PCR em Tempo Real
Terminologia:

→ Rn: sinal do alvo normalizado pelo sinal da referência passiva (ex. ROX)
ROX: fluorescência presente no meio (correção do volume)
Normalização: fluorescência total- fluorescência ROX

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Terminologia:

→ ∆Rn: magnitude do sinal gerado pela PCR (Rn – Baseline)


- Normalização do “reporter” pelo background

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PCR em Tempo Real
Terminologia:

→ Threshold: nível de ∆Rn (determinado automaticamente ou


manualmente), utilizado para a determinação do CT
→ Acima do Baseline e dentro da fase exponencial da curva

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Terminologia:

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PCR em Tempo Real
Terminologia:

PCR em tempo real

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Terminologia:

Diluição de uma
threshold
mesma amostra

CT

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Terminologia:

CT: cycle threshold: ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (threshold)

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