BIOLOŠKA KEMIJA

Praktikum

Jerka Dumić Sanja Dabelić Olga Gornik Gordana Maravić Vlahoviček Ruđer Novak Sandra Šupraha Goreta

Farmaceutsko-biokemijski fakultet Sveučilišta u Zagrebu Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju Zagreb, 2010.

Urednik

Prof. dr. sc. Jerka Dumić

Recenzenti
Prof. dr. sc. Karmela Barišić Prof. dr. sc. Jasna Lovrić

J. Dumić i sur., Biološka kemija Praktikum; ur. J. Dumić, izdavač Sveučilište u Zagrebu, Farmaceutsko-biokemijski fakultet, Zagreb 2010.

ISBN 978-953-6256-61-7
CIP zapis dostupan u računalnom katalogu Nacionalne i sveučilišne knjižnice u Zagrebu pod brojem 744598
Slika na naslovnici: prostorna struktura ljudskog deoksihemoglobina pri rezoluciji 1,74 Å. Slika preuzeta iz proteinske baze podataka RCSB PDB.

Umnožavanje, preslike ili pretisak nisu dopušteni bez odobrenja autora.

BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM

Sadržaj (sekvenciranje
Vježba 1. Potenciometrijska titracija aminokiselina ............................................................... 1 Vježba 2. Gel-filtracija hemoglobina ....................................................................................... 10 Vježba 3. Pročišćavanje imunoglobulina G iz humanog seruma ....................................... 15 Vježba 4. Enzimska kinetika .................................................................................................... 24 Dodatak: Enzimska kinetika ..................................................................................................... 30 Vježba 5. Ugljikohidrati ............................................................................................................ 39 Vježba 6. Lipidi. ......................................................................................................................... 46 Vježba 7. Termička denaturacija DNA ................................................................................... 51

BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM

Vježba 1. Potenciometrijska titracija aminokiselina (sekvenciranje
1.1 Aminokiseline Aminokiseline su α-amino-α-karboksilne kiseline. Na Cα-atom je uz amino (-NH2) i karboksilnu skupinu (-COOH) vezan vodikov atom (-H) te bočni ogranak (-R) (Slika 1.1). Upravo stoga sve aminokiseline osim glicina (kojem je R = H) imaju asimetrični Cαatom, a u organizmu su prisutne samo lijeve (L) aminokiseline. Bočni ogranci aminokiselina strukturno su raznoliki, od jednostavnih alifatskih struktura (alanin, valin, leucin), aromatskih (fenilalanin, tirozin, triptofan), do cikličkih (prolin, koji ujedno jedini od aminokiselina sadrži sekundarnu amino skupinu), ili pak onih koje u bočnom ogranku sadrže sumpor (metionin, cistein), kisik (treonin, serin, tirozin), dušik (asparagin, glutamin, arginin, histidin) ili karboksilnu skupinu (asparaginska i glutaminska kiselina) (Tablica 1.1). Upravo je strukturna raznolikost aminokiselina ključan preduvjet raznolikosti polipeptida (proteina) koji nastaju povezivanjem aminokiselina peptidnom vezom. Peptidna veza, koja je zapravo amidna veza, nastaje uvijek povezivanjem α-karboksilne skupine jedne s α-amino skupinom druge aminokiseline. Time su polipeptidni lanci kao i sve biološke molekule usmjerene molekule (od N-kraja prve prema C-kraju posljednje amninokiseline u lancu), dok su peptidne veze smjera C-kraj – N-kraj (Slika 1.2). Svi do danas otkriveni proteini izgrađeni su od 20 aminokiselina koje stoga nazivamo proteogenim aminokiselinama.
R H3N
+

Cα H

COOH

Slika 1.1 Opća strukturna formula aminokiselina pri pH 1. Preuzeto i

prilagođeno iz (1).
Slika 1.2 Stvaranje peptidne veze.

Preuzeto i prilagođeno iz (1).

1.2 Fizikalno-kemijska svojstva aminokiselina Aminokiseline, a time i proteini kao i neke druge biološke molekule, primjerice nukleinske kiseline, poliprotonske su kiseline. Svaka skupina koja može disocirati (-COOH, -NH3+, =NH2+, -OH, -SH) opisana je konstantom disocijacije Ka, odnosno pKa (-log Ka). Sve aminokiseline u svojoj strukturi imaju najmanje dvije takve skupine: αamino (pKa ∼2,2) i α-karboksilnu skupinu (pKa ∼9,4). To znači da će pri pH > 3,5 αkarboksilna skupina biti gotovo u potpunosti deprotonirana, dok će α-amino skupina pri pH < 8 biti protonirana, odnosno da su i α-amino i α-karboksilna skupina svih aminokiselina u fiziološkom pH području u potpunosti ionizirane (Slika 1.3).
1

41 Polarne neutralne (nenabijene) aminokiseline Serin Ser S Treonin Thr T Asparagin Asn N Glutamin Gln Q Cistein Cis C Tirozin Tyr Y 2 105.1 2.1 Popis proteogenih aminokiselina (struktura.78 8.10 132.1 2.07 .28 115.2 2.2 1.02 8. Preuzeto i prilagođeno iz (1).74 131. Ime.46 9.2 2.29 2.09 9.1 2.2 2.95 10.2 2.76 149.33 2.21 9.8 146.71 10.87 117.2 2.11 10.1 1.34 9.13 121.78 89.15 119.1 2.13 9.2 9.1 2.35 9.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Tablica 1.20 9.32 2.2 2.33 181.31 204.2 2. pKa vrijednosti funkcionalnih skupina).1 2.64 165. Mr.17 9.74 131. troslovni i jednoslovni simbol Nepolarne aminokiseline Glicin Gly G Alanin Ala A Valin Val V Leucin Leu L Izoleucin Ile I Metionin Met M Prolin Pro P Fenilalanin Phe F Triptofan Trp W Strukturna formula a Mr pKa1 α-COOH pKa2 α-NH3+ pKaR bočni ogranak 75.

u kojem molekula ima skupine suprotnih naboja nazivamo dipolarnim ionima ili "zwitterionima“. dok se polarne još dijele na nenabijene (neutralne) i nabijene.1).5. prije svega disocijacijskih svojstava bočnih ogranaka.0 146.17 9.1 2. odnosno amfolitima.0 12.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Tablica 1. primjerice hidroksilnu (-OH) – serin.48 Prikazani ionski oblici prevladavaju pri pH 7. koje mogu biti ili kisele ili bazične (Tablica 1.95 10.09 9.1 (nastavak) Ime.19 9. aminokiseline su podijeljene na nepolarne i polarne.1 2.2 2. Preuzeto i prilagođeno iz (1). a pri fiziološkom pH su u obliku „zwitteriona“. ali i otpustiti proton (baze) aminokiseline smatramo amfoternim molekulama.17 6. tirozin.2 1. Slika 1.2 2.53 174. uz iznimku bočnog ogranka metionina koji sadrži sumpor (R = -CH2-CH2-S-CH3) i triptofana koji sadrži dušik u indolnom prstenu.86 147.67 4. Asp D Glutaminska kis.82 3. Na temelju fizikalno-kemijskih. Takav oblik.3 Opća strukturna formula aminokiselina pri fiziološkom pH. Cα-atomi (osim u glicinu) i oni označeni zvjezdicom su kiralni centri. treonin. Polarne amninokiseline u bočnom ogranku sadrže polarne skupine.82 9. troslovni i jednoslovni simbol Strukturna formula Mr pKa1 α-COOH pKa2 α-NH3+ pKaR bočni ogranak Polarne nabijene aminokiseline Kisele aminokiseline Asparaginska kis.25 155. amidnu skupinu (-CO-NH2) – asparagin i glutamin. Bočni ogranci nepolarnih aminokiselina izgrađeni su isključivo od ugljika i vodika. Zbog tog svojstva da istovremeno mogu primiti proton (kiseline). Izoelektrična točka (pH vrijednost pri kojoj je ukupni naboj molekule jednak nuli) tih aminokiselina je oko 5. 3 .18 8. ili sulfhidrilnu skupinu (-SH) – cistein. Glu E Bazične aminokiseline Histidin His H Lizin Lys K Arginin Arg R a 133.

poliprotonske kiseline. Aminokiseline su.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Skupine u bočnom ogranku dviju od ovih aminokiselina (tirozin i cistein).95 10. dodajemo kiselinu doći će do protoniranja.18 8. ili imidazolni prsten – histidin) na temelju toga što su im pI vrijednosti u kiselom. 4 . dakle. Otapanjem izoelektričnog oblika aminokiseline u vodi pH takve otopine imat će pH koji odgovara pI te aminokiseline. Preuzeto i prilagođeno iz (2). pa ako takvoj molekuli. Polarne nabijene aminokiseline podijeljene su na kisele (u bočnom ogranku sadrže karboksilnu skupinu – asparaginska i glutaminska kiselina) i bazične (u bočnom ogranku sadrže ili amino skupinu – lizin. ili guanidino skupinu – arginin.5. odnosno ako dodajemo lužinu. primjerice lizinu (R = -CH2CH2CH2CH2NH3+).0 pK2 pI 2.0 mol NaOH / mol AK 3.0 2.46. odnosno konjugirane kiseline.37). doći će do niza protonskih disocijacija (disocijacija protona aminokiseline lizina prikazana je na slici 1.53 AK2+ AK+ AK0 AK- Slika 1. u lužnatom mediju mogu disocirati (pKa fenilne skupine –C6H4OH tirozina iznosi 10. odnosno bazičnom području. pH 14 12 pK3 10 8 6 4 pK1 2 0 0 1. a sulfidrilne skupine –SH cisteina 8. a pri fiziološkom pH su konjugirane baze. a njihova izoelektrična točka (pI) je oko 5.4 Titracija lizina jakom lužinom.4. Pri fiziološkom su pH ipak sve polarne aminokiseline neutralne (bočni ogranak im je nenabijen).

dakle. očekujemo da će svaki disocijacijski korak stvoriti svoje pufersko područje.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM U tom se primjeru pKa (-log Ka) vrijednosti (2. tada će smjesa HA i A. čime se puferska otopina opire promjeni pH. Nagib titracijske krivulje je minimalan pri dodatku 0. Glicin je amfoterni elektrolit jer do disocijacije protona dolazi i u kiseloj i u bazičnoj sredini. Tako glicin ima karboksilnu skupinu (pKa = 2. Ka= [H+] [A-] [HA] . a jednaki su samo kada je pH = pKa i tada on ima maksimalnu vrijednost (maksimalni puferski kapacitet). 1. Puferi su prema definiciji smjese slabih kiselina ili baza i pripadajućih im soli.5 odnosno 2. Kod aminokiselina postupna se ionizacija zbiva na kemijski različitim skupinama. U tim točkama dodatak baze izaziva najmanju promjenu pH. prilikom dodatka OH. 5 . Ako je pKa za disocijaciju protona 6. što su koncentracije [HA] i [A-] veće. Otopina koja se opire promjeni pH poznata je kao puferska otopina. Puferski kapaciteti nekog pufera u kiselom i u baznom smjeru mogu biti različiti.iona dolazi do preuzimanja protona od strane HA pri čemu nastaju H2O + A.5 ekvivalenta baze. Taj pH poznat je pod imenom izoelektrična točka. ako znamo pKa1 i pKa2. odnosno [AK+] = [AK0]. 8.ione. Djelovanje pufera sastoji se.34 pKa1 + NH3CH2CO2– "zwitterion" 9. Puferski kapacitet definira se kao broj molova H+ ili OH.biti dobar pufer oko neutralnog pH.iona da preuzmu dodane H+ ione i stvore HA te na taj način ublaže promjenu pH.78 pKa2 NH2CH2CO2– -1 ukupan naboj 0 Titriracijom glicina doći će do disocijacije protona u dva koraka.34) i amino skupinu (pKa = 9.53) dovoljno razlikuju da titracijska krivulja jasno pokazuje pojedinačne disocijacijske korake. S druge pak strane. Očekujemo da će pri određenom pH koncentracija pozitivnih i negativnih naboja biti jednaka. Možemo je izračunati.iona koji dodani sustavu smanjuju ili povećavaju pH za jednu jedinicu. promjena pH izazvana dodatkom određene količine kiseline ili lužine bit će to manja. dakle što je puferska otopina koncentriranija. u sposobnosti A. S obzirom na to da pKa odgovara onoj vrijednosti pH pri kojoj je količina disociranog i nedisociranog oblika jednaka.78).95 i 10. + NH3CH2CO2H +1 2. To slijedi izravno iz definicije konstante disocijacije izražene u logaritamskom obliku koji je poznat pod imenom Henderson-Hasselbalchova jednadžba. odnosno pH= pKa + log [A-] [HA] Kapacitet pufera ovisi i o njegovoj koncentraciji.5. Kod neutralnog pH glicin je u "zwitterionskom" obliku.8. Uz isti omjer koncentracija HA i A-. odnosno [AK0] = [AK-].18. Tada je [AK2+] = [AK+].

23. Izoelektrična točka nalazit će se u onom području pH.34 + 9.+ H+ 3 2 2 NH2CH2CO2 + H+ Ka 2 = [NH 2 CH 2 CO -2 ][H + ] [ + NH 3CH 2 CO -2 ] Ka 1 × Ka 2 = [ + NH 3CH 2CO -2 ][H + ] [NH 2 CH 2 CO -2 ][H + ] × + [ + NH 3CH 2CO 2 H] [ NH 3CH 2 CO -2 ] - U izoelektričnoj točki [ NH3CH2CO2H] = [NH2CH2CO2 ]. odnosno (pKa1 + pKaR) / 2. pI biti 3.3 Zadaća Titrirajte otopinu izoelektrične aminokiseline kiselinom. disocijacija protona odvija se u više koraka. Iz grafa očitajte pKa vrijednosti. a potom i bazom. To se može lako dokazati (učinite to za vježbu!). pI vrijednost te ekvivalente dodane kiseline. Kod glutaminske će kiseline. 6 . pa je + Ka 1 × Ka 2 = [H + ]2 log Ka 1 + log Ka 2 = log [H + ]2 (pKa1 + pKa 2 ) = pI 2 pH = pH izoelektrične točke obično označavamo simbolom pI. pI će kao i u prethodnom primjeru biti jednak onom pH kod kojeg je koncentracija molekularnog oblika s jednim pozitivnim nabojem jednaka koncentraciji molekulske vrste s jednim negativnim nabojem. Ako molekula ima više od dvije ionizacijske skupine. u kojem je zwitterionski oblik molekule dominantna vrsta. Udio dvostruko negativnog molekularnog oblika pri tom je pH zanemariv. Općenito možemo reći da je pI jednak aritmetičkoj sredini pKa vrijednosti onih disocijacijskih reakcija u kojima izravno sudjeluje zwitterionski oblik. 1.06. Na temelju krivulje dobivene potenciometrijskom titracijom uzorka odredite o kojoj se aminokiselini radi.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ +NH C H C O H 3 2 2 +NH CH CO 3 2 2 Ka 1 = [ + NH 3CH 2 CO -2 ][H + ] [ + NH 3CH 2CO 2 H] +NH C H C O .78) / 2 = 6. odnosno lužine na osnovi kojih ćete izračunati Mr nepoznate aminokiseline iz uzorka. primjerice. pI za glicin je prema tome (2.

2 M otopinom NaOH iz birete. Postavite čašu na magnetsku miješalicu tako da se magnet lagano okreće.2 M otopinom NaOH te je postavite tako da možete titrirati uzorak u koji je uronjena elektroda u čaši na miješalici. Nakon svakog dodatka lužine pričekajte da se pH ustali. Lužinu dodajte u malim obrocima (0. • Po završetku titracije izvadite elektrodu i magnet iz čaše. • Napunite biretu od 25 mL 0. isperite je destiliranom vodom.5 Pribor • • • • • • • • • • • • pH-metar kombinirana elektroda magnetska miješalica magnet bireta za HCl (25 mL) bireta za NaOH (25 mL) stalak za birete s nastavkom pipete čaša od 100 mL odmjerne tikvice staničevina milimetarski papir 1. ali tako da je magnet ne može udariti. vodi otopina izoelektrične aminokiseline (3 g/L destilirane vode) 1. • Titrirajte sadržaj u čaši 0.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM 1. 1. odnosno čim kraće vrijeme ostavljati na zraku. • Kombiniranu elektrodu prethodno uključenog i baždarenog pH-metra izvadite iz zasićene otopine KCl.4 Reagencije • • • 0. što se očituje kao promjena pH otopine aminokiseline.1-0. kako bi grafički prikaz titracije sadržavao što više eksperimentalnih točaka.7 Postupak • U čašu od 100 mL dodajte 40 mL uzorka (otopina izoelektrične aminokiseline.2 M otopinom HCl.2 M HCl u dest. • Na već opisani način titrirajte uzorak 0. odnosno deprotoniranja njenih funkcionalnih skupina. Pazite da elektrodu uronite dovoljno duboko u otopinu. vodi 0. Elektrodu isperite vodom i obrišite te je potom uronite u čistu čašu u koju ste stavili novih 40 mL uzorka i magnet i postavili je na miješalicu. lagano obrišite staničevinom i uronite u čašu s uzorkom.2 mL). 3 g/L) te u nju stavite magnet. očitajte ga i zabilježite. Napomena: poželjno je elektrodu pH-metra čim prije uroniti u otopinu. a uzorak koji ste titrirali bacite. 7 .6 Načelo postupka Dodatkom jake kiseline ili lužine u otopinu izoelektrične aminokiseline dolazi do protoniranja.2 M NaOH u dest.

Platoi na krivulji odgovarat će puferskom području (oko pKa) pojedine funkcionalne skupine. Ukoliko na krivulji odredimo volumen dodane kiseline potreban da se pojedina funkcionalna skupina prevede iz deprotoniranog oblika u oblik kada je 50% skupine još uvijek deprotonirano. Isto vrijedi i za dodatak lužine samo što tada u potpunosti protoniran oblik funkcionalne skupine prevodimo u oblik kada je 50% skupine deprotonirano.iona koja je ekvivalentna količini (molovima) te funkcionalne skupine. + COOH Cl H3 N + COO H3 N + - COO Na H H2 N C H H C H H C H glicin hidroklorid (AK+) izoelektrični glicin (AK0) natrijev glicinat (AK-) 8 . odnosno same aminokiseline (pH = točka ekvivalencije. taj volumen sadrži polovinu količine (molova) te funkcionalne skupine. Komercijalno ga možemo nabaviti u obliku glicin hidroklorida.). Glicin se često upotrebljava kao pufer. Unošenjem podataka o dodanom volumenu kiseline ili lužine (na os apscisu) i izmjerenom pH (na os ordinatu) moguće je skicirati titracijsku krivulju aminokiseline. 1. Na temelju određene količine (broja molova) i poznate mase nepoznate aminokiseline koja je otopljena u volumenu uzetom za titraciju moguće je izračunati njenu molekulsku masu. T. Volumen dodane kiseline ili lužine potreban da se pojedina funkcionalna skupina prevede iz deprotoniranog oblika u protonirani ili obrnuto sadrži količinu (molove) H+ ili OH. a 50% protonirano (pH = pKa). pa će se tako na titracijskoj krivulji aminokiseline s 2 funkcionalne skupine (koje u bočnom ogranku nemaju skupinu koja može disocirati) razaznati 2 platoa.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ • Skicirajte titracijsku krivulju te je interpretirajte na temelju uputstava koja slijede: Početni pH otopine (prije dodatka kiseline ili lužine) nepoznate aminokiseline u izoelektričnom obliku odgovara njenoj izoelektričnoj točki (pI). dok će se na titracijskoj krivulji aminokiseline s 3 funkcionalne skupine (koje u bočnom ogranku imaju skupinu koja može disocirati) razaznati 3 platoa. Postupnim dodatkom malih volumena kiseline ili lužine dolazi do promjene pH otopine što se mjeri pH-metrom. izoelektričnog glicina ili natrijevog glicinata.E. Pri kojem je pH puferski kapacitet dva puta veći u lužnatom nego u kiselom smjeru? 2. odnosno same aminokiseline. pa pH opet odgovara pKa). pKa vrijednosti i molekulske mase može se odrediti o kojoj se aminokiselini radi. a 50% još uvijek protonirano.8 Zadaci 1. Na temelju podataka o broju funkcionalnih skupina.

H. 5.05 M glicinskog pufera pri pH 9.M. Nažalost. Izračunajte konačni pH otopine ako ste u 500 mL 0. 6. C.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM 3.0 i drugu s pH = 9. ali ste uspjeli pronaći dvije 0.1).9 Literatura 1. and Grisham. 9 . Canada: Brooks/Cole Cengage Learning. R.5 M HCl (zanemarite promjenu volumena) (pKa = 4.5 M acetatnog pufera pH 5 dodali 1 mL 0. Izračunajte konačni pH otopine ako ste u 250 mL 0.2. Garrett. New York: John Wiley & Sons Inc. (1995) Biochemistry.1 mL 1 M HCl (zanemarite promjenu volumena) (pKa = 8.78. jednu s pH = 9.7). Izračunajte ionsku jakost 0. J. potreban vam je 0. (1999) Biochemistry.1 M puferske otopine glicina. 2. ponestalo vam je glicina u zalihama. Skicirajte titracijsku krivulju glutamilserilglutamilvalina. Pretpostavite a) da je pufer priređen titracijom izoelektričnog glicina otopinom NaOH b) da je pufer priređen titracijom glicin hidroklorida otopinom NaOH. U svrhu pročišćavanja određenog proteina. 4.02 M Tris/Cl pufera pH 8. Koji volumen svake od ovih dviju otopina morate pomiješati kako biste dobili 100 ml željenog pufera? 1. Voet.1 dodali 0. D. and Voet.5.1 M glicinski pufer pH = 9.

1). odnosno zrnca kromatografskog materijala. kolona za gel-filtraciju sazdana je od inertnih zrnaca koja ne stupaju u interakciju s analitom. a sadržaj i koncentracija pojedine tvari u sakupljenim se frakcijama određuje naknadno. Između zrnaca gela nalazi se intersticijska tekućina. ne reagiraju s uzorkom. a unutar njih prostor ispunjen gel-tekućinom. male molekule velike molekule porozna zrnca gela (stacionarna faza) Slika 2.1 Prikaz molekularnog prosijavanja tijekom gel-filtracije. Uzorak se nanosi na kolonu koja se potom ispire puferom. Tekućinska kromatografija u koloni podrazumijeva pokretnu fazu (otapalo) i stacionarnu fazu u staklenoj. Kod gel-filtracije velike molekule ne mogu prodrijeti kroz pore i ući u zrnca gela pa brzo putuju intersticijskom tekućinom. aparaturu za kromatografiju čini samo kolona punjena kromatografskim materijalom. odnosno ne vežu se. Kod kromatografije ionske izmjene. plastičnoj ili metalnoj koloni. kromatografije obrnute faze i afinitetne kromatografije pojedine komponente ostavaruju interakcije sa zrncima gela ovisno o svom naboju. Ovdje se razdvajanje temelji na različitoj brzini putovanja molekula ovisno o njihovoj veličini.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Vježba 2. Gel-filtracija hemoglobina 2. 10 . Punjenje kolone. U osnovnoj izvedbi. polarnosti ili afinitetu za ligand te se tako odjeljuju od ostalih komponenti iz uzorka.1 Gel-filtracija Jedna od osnovnih zadaća preparativne i analitičke biokemije je odjeljivanje i identifikacija bioloških molekula. niti nose električni naboj. dok male molekule prodiru u zrnca usporavajući svoje putovanje (Slika 2. mogu biti inertna ili mogu stupati u interakciju s analitom. Suprotno tome. Za odjeljivanje se često koriste kromatografske metode kod kojih se smjesa tvari otopljena u pokretnoj fazi (koja može biti tekućina ili plin) razdvaja na sastavnice propuštanjem kroz stacionarnu fazu (najčešće čvrsti polimer).

Agaroza je linearni polimer D-galaktoze i 3. najzastupljeniji hemoglobin u krvi odraslih osoba. Hem je izgrađen od organskog dijela.N-metilenbisakrilamid. U krvi odraslih osoba postoji i manje zastupljen hemoglobin A2 (2 α-lanca i 2 δ-lanca. sitna zrnca za većinu preparativnih postupaka. Po svojstvima pri odjeljivanju slični su dekstranu. a za njima kasnije izlaze manje molekule koje putuju i kroz pufer izvan zrnaca gela i kroz pufer unutar zrnaca. nastaje methemoglobin koji je 11 . a time je separacija uzorka slabija. Svaka podjedinica hemoglobina sadrži po jedan hem. no dostupni su u širem rasponu veličine pora. prisutan u venskoj krvi. Hemoglobin A. No pored veličine pora. Pore na zrncima su mnogo veće nego kod dekstrana. u čijem je središtu atom željeza koordinativnim vezama povezan sa četiri atoma dušika iz pirolovih prstena protoporfirina (Slika 2. Ukoliko se hemoglobinsko željezo oksidira iz Fe2+ oblika u trovalentni oblik. 2.2 Hem i hemoglobin Hemoglobin (Hb) je izgrađen od proteinskog i neproteinskog dijela.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Ukupni volumen tekućine u koloni jednak je zbroju volumena pufera izvan i pufera unutar zrnaca gela. kod kojeg je šesto koordinativno mjesto prazno. dok šesto mjesto može biti prazno ili popunjeno. Količina pufera potrebna da neka molekula izađe iz kolone naziva se volumen ispiranja. naziva se deoksihemoglobin.2). neproteinska komponenta neophodna za biološku aktivnost hemoglobina. α2γ2). Sama zrnca kao i pore u njima mogu biti različite veličine. agarozu i poliakrilamid. Kako je atom željeza heksakoordiniran u hemu. njegovo je važno svojstvo i veličina zrnaca gela (krupna. a četiri proteinska lanca tetraedarski su raspoređena. Stoga se krupna zrnca primjenjuju za velike preparacije kod kojih je brzina važnija od razlučivanja. Hemoglobin. Dekstran je polisaharid sastavljen od monomera glukoze. α2δ2). α2ε2) i fetalni oblici (2 αlanca i 2 γ-lanca. a na svaki globinski lanac vezana je po jedna molekula hema koji veže kisik. a vrlo sitna zrnca koriste se u analitičke svrhe kada je potrebno maksimalno razlučivanje. protoporfirina IX. Kada se putem šestog koordinativnog mjesta veže kisik (oksigenacija) nastaje svijetlo crveni oksihemoglobin (HbO) koji nalazimo u arterijskoj krvi. odnosno vrlo velike molekule putuju kroz pufer izvan zrnaca gela i prve izlaze iz kolone. Fe3+. To je specifična. Proteinski dio hemoglobina sastoji se od četiri polipeptidna lanca povezana nekovalentnim interakcijama (kvarterna struktura). Molekula hemoglobina gotovo je kuglasta. dok su tijekom intrauterinog života prisutni embrijski (2 α-lanca i 2 ε-lanca. što je korisno za odjeljivanje velikih proteina ili dugih linearnih molekula (DNA. što su zrnca krupnija pakiranje kromatografskog materijala je rjeđe pa je brzina protoka veća.6-anhidro-L-galaktoze umrežen vodikovim vezama. Zrnca za gel-filtraciju su umreženi polimeri. prostetičku skupinu smještenu u procjepu blizu površine molekule. srednja. sastoji se od dva α-lanca i dva β-lanca (α2β2). tamno crveni je oblik Hb. RNA). peto koordinativno mjesto uvijek popunjava elektronski par dušika iz histidinskog ogranka polipeptidnog lanca (His93). a razlikujemo tri osnovna tipa: dekstran. Volumen dostupan pojedinoj molekuli obrnuto je razmjeran njenoj veličini. Poliakrilamidne gelove čine umreženi akrilamid i N. sitna i vrlo sitna). Raspon masa molekula koje je moguće odijeliti određenim kromatografskim materijalom za gel-filtraciju određen je veličinom njegovih pora.

Gel-filtracijom razdvojite smjesu feri/ferocijanida i methemoglobina. ali i neutralnih molekula s izraženim dipolnim momentom. Nakon centrifugiranja 10 minuta pri 13000g i 4°C na dnu epruvete se nalazi debris stanica. Ispiranje se provodi tako da se eritrocitima doda jednaki volumen fiziološke otopine. krv se centrifugira 10 minuta pri 600g i 4°C kako bi se razdvojili eritrociti (donji crveni sloj) od plazme (gornji prozirno žuti sloj). odnosno destilirane vode. Prilikom vađenja krvi zbog razlike u tlakovima u epruvetu ulazi točno određeni volumen krvi tako da je konačna koncentracija EDTA 1. A) B) C) Slika 2.3 Zadaća Priredite otopinu methemoglobina dodatkom kalijevog fericijanida u otopinu hemoglobina. Eritrociti se potom tri puta isperu fiziološkom otopinom. Epruvete koje sadrže K2EDTA ili K3EDTA kao antikoagulans standardno su označene ljubičastim čepom. Ovaj oblik ima veliki afinitet vezanja negativnih iona. a supernatant koji predstavlja uzorak otopine deoksihemoglobina se otpipetira i pohrani na -20°C do daljnje uporabe. Plazma i leukociti s tromobocitima se otpipetiraju i bace. Supernatant se baci i postupak pranja se ponovi još dva puta.2. Graña hemoglobina. pa umjesto kisika veže vodu. A) Tetramerna struktura hemoglobina. Nakon vađenja. Preostale dvije koordinativne veze povezuju ogranak histidina i molekularni kisik. 2. Potom se eritrocitima doda 7 volumena hipotonične otopine.1 Priprema otopine deoksihemoglobina Krv se izvadi venepunkcijom u vacutainer-epruvetu koja sadrži antikoagulans.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ smeđe boje. 2. a zatim oksigenirati otopljenim 12 . epruveta se lagano promućka i ponovno centrifugira 10 minuta pri 600g i 4°C. C) Struktura Fe-protoporfirina IX. Vacutainer-epruvete mogu biti različitih volumena i namjena. poznat pod engleskim nazivom buffy coat). Između navedena dva sloja čiji su volumeni približno jednaki nalazi se vrlo tanak sloj leukocita i tromobocita (bijele boje.8 mg/mL krvi. Protein će daljnjim prolazom kroz gel reagirati s prethodno unijetim Fe(II) reagensom uslijed čega će se reducirati u deoksihemoglobin. Ubrzo nakon miješanja dolazi do hemolize. B) Aktivno mjesto hemoglobina: Fe-atom leži u ravnini u kojoj su uspostavljene četiri koordinativne veze s atomima porfirinskog dušika.2.

Postupna zbivanja tijekom prolaza proteinske frakcije kroz kolonu pratit će karakteristične promjene boje. φ=1 cm gumeni nastavak za kolonu sa stezaljkom parafilm stalak sa stezaljkom staklena čaša od 100 mL staklena boca Pasteurova pipeta plastične epruvete od 1. pH 7 uzorak (otopina deoksihemoglobina) u dest. pH 7 80 mM EDTA u 0.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM molekularnim kisikom. Unutar kolone u koju je prethodno unijet reducens u potpunosti se odvija redukcija methemoglobina u deoksihemoglobin.2 M natrijevom fosfatnom puferu. fericijanida i ferocijanida. Daljnjim prolaskom deoksihemoglobina kroz kolonu ispunjenu puferom deoksihemoglobin se oksigenira u oksihemoglobin.7 Postupak • Stezaljkom podesite protok pufera kroz staklenu kromatografsku kolonu u staklenu čašu na 30 kapi u minuti. 13 .2 M natrijevom fosfatnom puferu. • Uzorak (otopinu deoksihemoglobina) razrijedite u epruveti puferom u volumnom omjeru 1+4 (70 μL krvi + 280 μL pufera). pH 7 80 mM FeSO4 u 0. Dodajte sasvim mali kristal fericijanida i protresite epruvetu.4 Reagencije • • • • • • 0.2 mL svježe priređene smjese FeSO4/EDTA u fosfatnom puferu.5 mL plastične epruvete od 15 mL stalak za epruvete špatula automatske pipete nastavci za automatske pipete boce štrcalice 2.6 Načelo postupka Gel-filtracijom se smeđi methemoglobin razdvaja od puno manjih iona kalija. • Kako biste dobili oštre vrpce slojeva u koloni nužno je pažljivo raditi i prilikom nanošenja uzoraka na kolonu ne uzmutiti površinski sloj gela.1 mL otopine EDTA. vodi kalijev fericijanid Sephadex G-25 2. Prekinite istjecanje kada se razina pufera spusti do površine zrnaca gela.1 mL otopine FeSO4 i 0. • U drugoj epruveti pomiješajte 0.02 M natrijev fosfatni pufer. 10 cm. Na kolonu prvo nanesite 0. 2. 2.5 Pribor • • • • • • • • • • • • • • staklena kolona.

H. E. R. 2.H.J. Brooks Cole. Na kolonu nanesite oko 1 mL (25 kapi) pufera te otpuštajući stezaljku omogućite da sav pufer uđe u kolonu. http://www. and McIntosh. (1989) Practical Biochemistry for Colleges. (1967) Reduction of Methaemoglobin in Haemoglobin Samples using Gel Filtration for Continuous Removal of Reaction Products. Navedite prednosti i mane pojedine tehnike odjeljivanja molekula. Nastavite na kolonu dodavati pufer i ostvarite kontinuirani protok (oko 30 kapi u minuti) kroz kolonu tako da otpustite stezaljku. Potom na kolonu nanesite 350 μL razrijeđene krvi te otpuštanjem stezaljke omogućite da sav uzorak uđe u kolonu. (1995) Biochemistry. Ima li razlike između oksidacije i oksigenacije hemoglobina? Objasnite! 4. 4. C. 2.htm 14 . J. Pergamon Press. and Grisham.com/mathews/ch07/heme. Garrett. Pazite da kolona nikada ne ostane bez nadsloja pufera! Pratite promjene boje slojeva u koloni.5 mL sakupljajte frakcije svijetlo-crvene odnosno žute boje prilikom njihovog izlaska iz kolone. Voet.M.8 Zadaci 1.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ • • • • polagano otpuštajte stezaljku da sav dodani volumen uđe u kolonu te stezaljku ponovno pritegnite.F. and Voet.aw-bc. (1999) Biochemistry.g.B. D. Wood. John Wiley & Sonc Inc. 5. R. Zašto se kisik labilno veže za prostetičku skupinu hemoglobina? 2. Koji ćete kromatografski materijal upotrijebiti za razdvajanje molekula DNA od slobodnih nukleotida? 3.9 Literatura 1. 2. Dixon. Usporedite gel filtraciju i dijalizu. U epruvete od 1. 3. Nature 213: 399-400. Obilježili ste velik segment DNA radioaktivnim nukleotidima.

dok konstantni dio posreduje u aktivaciji stanica imunosnog teški sustava. Stvara ih imunosni sustav kralježnjaka kao odgovor na strane tvari (antigene) koje mogu prodrijeti u organizam. 3. Ig. Imunoglobulini su heterodimeri koji se sastoje od dva laka i dva teška lanca. Najčešće se radi o nizu postupaka. laki Varijabilni dio specifično prepoznaje i lanac veže antigen.2 Metode pročišćavanja proteina Proces pročišćavanja proteina rijetko se odvija u samo jednom koraku. molekula u organizmu. dio krvi bez čimbenika zgrušavanja. Serum je. Humani serum sadrži pet klasa imunoglobulina (IgA.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Vježba 3. među kojima je najzastupljeniji IgG. možemo ga smatrati puferiranom otopinom koja sadrži ione. IgD. DNA). Kombiniranjem različitih aminolanac kiselina u varijabilnom dijelu. ε – IgE. pa ih nazivamo i protutijela. imunosni sustav posredstvom protutijela može prepoznati milijune različitih stranih Slika 3. biološke makromolekule (proteini. vežu se na njega i posreduju u aktivaciji imunosnog sustava. Metoda se temelji na činjenici da u vodenoj otopini molekule vode koje okružuju proteinske 15 konstantni dio varijabilni dio . bilirubin). Na molekuli funkcionalno razlikujemo konstantni i varijabilni dio (Slika 3. a svakim od njih odjeljuju se pojedine vrste molekula određenom učinkovitošću. Proteini čine velik dio suhe tvari seruma (60-80 g/L).1 Shematski prikaz molekule.1 Taloženje (isoljavanje) amonijevim sulfatom Taloženje amonijevim sulfatom omogućava razdvajanje proteina na temelju njihove različite topljivosti pri određenoj koncentraciji amonijevog sulfata u otopini. μ – IgM). IgE. koji djeluju kao obrambeni proteini. Lanci su međusobno povezani disulfidnim mostovima između prostorno bliskih cisteinskih ostataka. fibrinogena i krvnih stanica. kreatinin. Pročišćavanje imunoglobulina G iz humanog seruma 3. dakle. Protutijela prepoznaju specifičan antigen. Teški su lanci specifični za pojedinu klasu protutijela (α – IgA. organske tvari (urea. γ – IgG. Pravilnim odabirom metoda pročišćavanja i njihovim primjerenim slijedom. 3. može se iz smjese proteina izdvojiti točno određeni protein. Centrifugiranjem se ugrušak odvaja od supernatanta koji nazivamo krvnim serumom.2.1). Značajan dio proteinske frakcije seruma čine imunoglobulini (7-16 g/L). δ – IgD.1 Humani serum i imunoglobulin G (IgG) Krv izvađena venepunkcijom bez dodatka antikoagulansa zgrušava se stajanjem na zraku posredstvom sustava za koagulaciju. lipoproteini. IgG i IgM).

pa elektrostatskim silama vežu katione otopljene u mobilnoj fazi (Slika 3.3 B). 3. Na slici 3. SDS se 16 . 3.3 Shematski prikaz zrnaca gela A) kationskog i B) anionskog izmjenjivača. prisutan je anionski detergent natrijev dodecil-sulfat (SDS. Možemo reći da amonijev sulfat oduzima vodu otopljenim proteinima te oni stoga stvaraju nakupine i talože se. anionski izmjenjivač s pozitivno nabijenim funkcionalnim skupinama veže anione iz mobilne faze (Slika 3. smatra se da povećanjem koncentracije amonijevog sulfata u otopini dolazi do kompeticije između amonijevih i sulfatnih iona i proteina za slobodne molekule vode što dovodi do agregacije i precipitacije proteina. sodium dodecyl sulphate). u gelu i u puferu za nanošenje uzoraka.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ molekule poprimaju uređenu strukturu. 0 0 A) B) Slika 3. Istaložene proteine moguće je centri. Suprotno tome. Jasno je da će se protein s lijeve strane slike taložiti pri manjoj koncentraciji amonijevog sulfata (jer ima manje vodi izloženih hidrofilnih skupina. U ovoj se vježbi koristi anionski izmjenjivač trimetilaminoetan koji je jaki kation (otporan na promjene pH od 2-14). odnosno okružen je s manje molekula vode).2 prikazana su dva proteina s različitim omjerom hidrofilnih i hidrofobnih skupina na površini molekule. U SDSpoliakrilamidnoj gel elektroforezi.2. od engl.Slika 3. Za odvajanje je ključna empirijski utvrđena činjenica da se određeni protein taloži u uskom rasponu koncentracija amonijevog sulfata.2 Dva proteina s različitim hidrofilnih (crno) i fugiranjem razdvojiti od proteina zaostalih u omjerom hidrofobnih (bijelo) skupina. Različiti proteini imaju različit ukupni naboj koji potječe od bočnih ogranaka aminokiselina na površini molekule proteina. Premda točan mehanizam nije poznat.3 A).2 Kromatografija ionske izmjene Kromatografija ionske izmjene provodi se na koloni ionskog izmjenjivača koja se sastoji od čestica gela s kovalentno vezanim nabijenim skupinama. otopini. Funkcionalne skupine kationskih izmjenjivača negativno su nabijene.3 SDS-poliakrilamidna gel-elektroforeza Elektroforeza je metoda razdvajanja molekula pod utjecajem električnog polja na temelju razlika u njihovoj masi i naboju.

Brzina putovanja u razdvajajućem gelu uvjetovana je učinkom molekulskog prosijavanja. pri čemu je ε molarni ekstinkcijski koeficijent. ali ne boja proteine. Višak boje s gela uklanjamo ispiranjem u otopini Slika 3.4 Odreñivanje prisutnosti i koncentracije proteina mjerenjem apsorbancije Proteini apsorbiraju svjetlost valne duljine 280 nm zbog prisutnosti aromatskih prstenova na bočnim ograncima aminokiselina fenilalanina. maskira njihov površinski naboj i oni postaju negativno nabijeni.4 Ureñaj za diskontinuiranu SDSPAGE.8. Nakon provedene elektroforeze. a veći sporije. linearan odnos vrijedi samo unutar određenog raspona koncentracija proteina. Osim toga. 17 .8 koncentriraju u usku vrpcu te svi zajedno ulaze u razdvajajući gel (10-15%) u kojem je pH 8. odnosno manji proteini putuju brže. 3. Slika preuzeta i modificirana iz (6). β-merkaptoetanol kida disulfidne mostove. a ne smjese proteina. Coomassie blue® R-250. a c koncentracija tvari koja apsorbira) može se zaključiti da je odnos vrijednosti apsorbancije i koncentracije proteina linearan. glicerol i boju bromfenol plavo u puferu pH 6. a boja bromfenol plavo služi za praćenje tijeka elektroforeze. octene kiseline. Uzorke pripremamo dodatkom pufera za nanošenje uzoraka koji sadrži SDS. valja uočiti da se mjerenjem apsorbancije može odrediti koncentracija otopine čistog proteina. jer se proteini razlikuju po molarnom ekstinkcijskom koeficijentu. Međutim.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM veže za proteine u uzorku. glicerol povećava gustoću uzorka te se oni tako lakše nanose u jažice. l duljina puta zrake svjetlosti kroz uzorak. proteine vizualiziramo bojanjem gela bojom koja specifično boja proteine. Količina negativno nabijenog detergenta koja će se vezati na protein razmjerna je njegovoj veličini (1.4 g SDS/g proteina) pa putovanje proteina u električnom polju u ovoj vrsti elektroforeze ovisi isključivo o njegovoj molekulskoj masi (s obzirom na to da je omjer naboja i mase konstantan). otopljenoj u metanolu i octenoj kiselini.8. Za određivanje koncentracije određenog proteina mjerenjem apsorbancije potrebno je stoga ili poznavati njegov molarni ekstinkcijski koeficijent ili konstruirati baždarni pravac koji odražava odnos poznatih koncentracija tog proteina i apsorbancija. Temeljem Beer-Lambertovog zakona (A = ε x l x c. Proteini se prolaskom kroz sabijajući gel (3-5%) pri pH 6. Proteine razdvajamo diskontinuiranom elektroforezom uz uporabu sabijajućeg i razdvajajućeg gela koji se međusobno razlikuju u pH i gustoći (Slika 3. βmerkaptoetanol.4). SDS denaturira proteine uz kuhanje pri 95°C. triptofana ili tirozina u svojoj strukturi.

6% SDS. vodi 1% agaroza u dest. pH 8. 10% ledena octena kiselina u dest.1% bromfenol plavo u dest. 45% metanol. Provjerite čistoću pročišćenog proteina SDS-poliakrilamidnom gel elektroforezom te odredite koncentraciju izoliranog proteina.8. vodi TEMED gel za razdvajanje: 30% akrilamid/0.6 Reagencije • • • • • • • • • • • • • 3. 1. 5% β-merkaptoetanol. 10% amonijev persulfat u dest.0 M Tris HCl. 3.8.5 Zadaća Iz uzorka humanog seruma izolirajte imunoglobulin G.7 Pribor • • • • • • • • • • • • • • • • • • 18 automatske pipete nastavci za automatske pipete plastične epruvete od 1. u dest.5 mM SDS. 10% SDS. 10 cm.3.8 2 M NaCl u dest.8% bisakrilamid.5 i 2 mL stalak za epruvete stalak sa stezaljkom staklene boce flomaster za označavanje stolna centrifuga plastične kolone. vodi gel za sabijanje: 30% akrilamid/0. 10% SDS.8. pH 6.8% bisakrilamid. 3. φ = 1 cm gel Sephadex G-25 Fractogel® TMAE-650 (anionski izmjenjivač trimetilaminoetan) plastične kapaljke peristaltička pumpa plastične cijevi s odgovarajućim priključcima čaše od 100 mL termostatirana tresilica mješač Vortex digestor . vodi) komercijalno pribavljena smjesa proteina poznatih molekulskih masa komercijalno pribavljen imunoglobulin G 3. vodi pufer za nanošenje uzoraka: 187. 20% glicerol. 10% amonijev persulfat u dest. vodi) otopina za odbojavanje gela: (10% octena kiselina u dest. 1. vodi otopina za bojanje gela (0.5 M Tris HCl. pH 8. 0. pH 6.5 mM Tris/HCl pH 6. 25 mM Tris HCl.5 M amonijev sulfat u dest. vodi 10 mM natrijev fosfatni pufer.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ 3.1% Coomassie blue® R-250. vodi pufer za elektroforezu: 192 mM glicin.

5 M otopine amonijevog sulfata.8) vežu se svi ostali proteini osim IgG.2 Odsoljavanje gel-filtracijom (princip metode objašnjen je u Vježbi 2. Kolona nikad ne smije ostati bez nadsloja tekućine. 3.) • Iz kolone za gel-filtraciju ispustite višak fosfatnog pufera u čašu za otpad. Nakon otapanja istaloženih proteina u fosfatnom puferu zaostali se amonijev sulfat odvaja od proteinske frakcije gel-filtracijom. • Uzorak centrifugirajte 5 minuta pri 5400g te potom supernatant pipetom odbacite u čašu za otpad.3 M. Koncentracija čistog IgG u pojedinim frakcijama određuje se na temelju apsorbancije tih frakcija i apsorbancija otopina poznatih koncentracija IgG (uz konstruiranje baždarnog pravca) pri valnoj duljini 280 nm. a isti se s kolone ispiru povećanjem ionske jakosti.5 mL počnite sakupljati tekućinu koja istječe. Začepite epruvetu i promiješajte uzorak.1 Isoljavanje amonijevim sulfatom • U 200 μL humanog seruma dodajte 400 μL 3. Prisutnost i čistoća IgG u pojedinim frakcijama provjerava se elektroforetskim razdvajanjem proteina sakupljenih frakcija u poliakrilamidnom gelu u denaturirajućim uvjetima.8. taloži se pri određenoj koncentraciji amonijevog sulfata (2. Na kolonu anionskog izmjenjivača pri određenim uvjetima (pH 6. power supply) kvarcna kiveta staničevina boce štrcalice UV/VIS spektrofotometar 3. Nadsloj pufera mora biti u razini površinskoj sloja gela. 19 .BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM • • • • • • • • • • češalj i razmaknice za elektroforezu stakla za elektroforezu štipaljke kadica za elektroforezu žice s priključcima izvor istosmjerne struje (ispravljač. među kojima i IgG. tako da njegova konačna koncentracija bude 2. pri čemu se polipeptidni lanci razdvajaju na temelju razlike u svojoj masi te vizualiziraju bojom koja se veže na proteine.9 Postupak 3. Prisutnost proteina u sakupljenim frakcijama utvrđuje se na temelju porasta apsorbancije mjerene pri valnoj duljini od 280 nm.37 M). • Uzorak (resuspendirani talog nakon taloženja amonijevim sulfatom) nanesite na kolonu za gel-filtraciju i istovremeno u epruvetu od 1.9. 3. eng.9. Kada uzorak uđe u kolonu na vrh kolone dodajte još pufera. • Preostali talog resuspendirajte u početnom volumenu (200 μL) 10 mM fosfatnog pufera pH 6.8 Načelo postupka Dio proteina humanog seruma. a talog se odvaja od topljivih proteina centrifugiranjem.

5 mL/min (oznaka 5 na pumpi Pharmacia P-3). • Pomiješajte 2 µL supernatanta nakon taloženja proteina seruma amonijevim sulfatom s 8 µL vode i 5 µL pufera za nanošenje uzoraka. • Uravnotežite kolonu ispiranjem s 30 mL 10 mM fosfatnog pufera koji nakon izlaska iz kolone sakupljajte u čaši za otpad.5 Elektroforeza proteina u diskontinuiranom denaturirajućem poliakrilamidnom gelu • Razrijedite uzorak seruma 50 puta te pomiješajte 10 µL seruma s 5 µL pufera za nanošenje uzoraka (187. • Pomiješajte 3 µL pročišćene frakcije IgG sa 7 µL vode i 5 µL pufera za nanošenje uzoraka. Sakupite 10 frakcija.) • Prikažite dobivene rezultate grafički na milimetarskom papiru nanoseći na apscisu broj sakupljene frakcije.9. s puferom za nanošenje uzoraka u omjeru 2:1. 20% glicerol.9. • Frakciju proteina sakupljenu nakon gel-filtracije seruma razrijedite 10 puta te pomiješajte 10 µL razrijeđene frakcije s puferom za nanošenje uzoraka u omjeru 2:1. 3.4 Odreñivanje prisutnosti proteina mjerenjem apsorbancije pri λ = 280 nm • Kvarcnu kivetu u koju ste ulili 10 mM fosfatni pufer stavite u spektrofotometar te apsorbanciju pri λ = 280 nm postavite na vrijednost 0. Ispustite pufer iznad zrnaca gela u čašu za otpad. isperite je destiliranom vodom i protresite kako biste iz nje uklonili svu tekućinu. • Ispraznite kivetu.8 mL/min (oznaka 8 na peristaltičkoj pumpi) te sakupite 10 frakcija volumena 1 mL. propustite kroz nju 30 mL pufera koji po izlasku s kolone sakupljajte u čašu za otpad i potom bacite. • Nanesite uzorak na kolonu anionskog izmjenjivača i odmah počnite sakupljati uzorke eluensa od po 1 mL. 3. (Postupak mjerenja ponovite na isti način za sve frakcije. tu frakciju bacite. a na ordinatu A280. a sljedeća 2 mL koja istječu iz kolone nastavite sakupljati u epruvetu od 2 mL. Taj uzorak sačuvajte za sljedeći korak pročišćavanja (anionsku izmjenu).BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ • Nakon što sakupite prvih 1 mL tekućine koja istječe iz kolone. 3.5 mL za sakupljanje uzoraka. • Kolonu zatim isperite s 10 mL 2 M NaCl uz protok od 0. a po potrebi dodajte još pufera u kolonu.9.8. 20 . 6% SDS. 5% βmerkaptoetanol. • Pomiješajte 10 µL pufera koji je s kolone izlazio nakon imunoglobulina G. Pokrenite peristaltičku pumpu i namjestite brzinu protoka pufera na 0. a prije proteina. • Kako bi kolonu za gel-filtraciju isprali od amonijevog sulfata.1% bromfenol plavo). • U kivetu ulijte pojedinu frakciju sakupljenu tijekom anionske izmjene te očitajte apsorbanciju te frakcije pri λ = 280 nm.3 Kromatografija ionske izmjene • Označite i priredite na stalku 20 epruveta volumena 1. 0.5 mM Tris/HCl pH 6.

• Kuhajte uzorke 5 minuta pri 95°C. pH 6. • Između stakala ulijte razdvajajući gel.4 mL 0. • Nakon polimerizacije sabijajućeg gela izvadite češalj. Temed je katalizator reakcije umrežavanja akrilamida i bisakrilamida u kojoj sudjeluju slobodni radikali koji potječu od amonijevog persulfata. sabijajući gel (5%. Tablica 3.003 mL * dodaje se neposredno prije izlijevanja gela.8 1.33 mL 1.33 mL ----0. a nakon njegove polimerizacije i sabijajući gel.5 M Tris HCl. pH 8.035 mL 0.0 M Tris HCl.003 mL razdvajajući gel (10%.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM • Pomiješajte 5 µL frakcije proteina koji s kolone za anionsku izmjenu izlaze s NaCl s 5 µL vode i 5 μL pufera za nanošenje uzoraka. voda 30% akrilamid/0. • Temeljito operite stakla za elektroforezu detergentom.1.91 mL ----0. isperite destiliranom vodom te pažljivo prebrišite 70% etanolom.8 10% SDS 10% amonijev persulfat Temed* 1. • Stakla s gelom postavite u kadicu za elektroforezu. • Spojeve između stakala na stranicama gdje su postavljene razmaknice ispunite 1% otopinom agaroze.02 mL 0.19 mL 0. • Pomiješajte 3 μg komercijalno nabavljenog imunoglobulina G (otopljenog u 10 μL) s puferom za nanošenje uzoraka u omjeru 2:1. spacer) i "češalj" te ih učvrstite metalnim štipaljkama. • Stakla za elektroforezu spojite na način da između njih postavite razmaknice (eng.5 mL) 1. • U jažice nanesite redom: o komercijalno pribavljenu smjesu proteina poznatih molekulskih masa (3 μL/jažici) o uzorak seruma (15 μL/jažici) o uzorak supernatanta nakon taloženja amonij sulfatom (15 μL/jažici) o uzorak nakon gel filtracije (15 μL/jažici) o uzorak frakcije pročišćenog IgG (15 μL/jažici) o uzorak nakon izlaska imunoglobulina G (15 μL/jažici) o uzorak eluata s NaCl (15 μL/jažici) o uzorak komercijalno pribavljenog IgG (15 μL/jažici) • Spojite elektrode na izvor istosmjerne struje te elektroforezu provodite uz konstantan napon od 80 V za sabijajući gel i 120 V za razdvajajući gel u puferu za elektroforezu.8% bisakrilamid 1. 21 . • Pripremite sabijajući (5%) i razdvajajući (10%) gel prema tablici 3.02 mL 0. 2 mL) dest.25 mL 0.1 Sastojci za pripremu sabijajućeg i razdvajajućeg gela za SDS-PAGE.035 mL 0. 3. a nastale jažice nekoliko puta isperite destiliranom vodom.

851 2.104 0.40. Koji dio proteinske strukture apsorbira svjetlost valne duljine 280 nm? 4.062 0.899 1.002 0.40 mL 0.20 mL 0.40 mL 0.01 mL 0. 0. 3. Otopine se priređuju u duplikatu razrjeđivanjem matične otopine IgG koncentracije 2 mg/mL u 10 mM fosfatnom puferu.60 mL 0.442 0.20 mL 0.296 A 0.03 mL 0.294 1.60 mL 0.10 mg/mL 0.355 1. • Utvrdite u kojim se frakcijama nalazi IgG i je li pročišćen od ostalih proteina seruma.00 mL V (10 mM fosfatnog pufera) 1 mL 0.06. • Nacrtajte na milimetarskom papiru baždarni pravac nanoseći na apscisu koncentracije IgG iz tablice 3.002 0. Potom u nju dodajte otopinu za odbojavanje koju zatim zagrijte tijekom 45 sekundi u mikrovalnoj pećnici pri najvećoj jakosti.351 1.97 mL 0. SDS-poliakrilamidnom elektroforezom analizirali ste smjesu proteina i nakon bojanja gela bojom Coomassie na gelu vidite tri vrpce.063 0. Nastavite odbojavanje gela tijekom sljedećih 15 minuta na zibaljci.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ • Kada boja iz uzorka (bromfenol plavo) dosegne donji rub razdvajajućeg gela prekinite tok električne struje.02.20 mg/mL 1. IgG 0 mg/mL 0.063 0. 0.849 2. 1.6 Odreñivanje koncentracije pročišćenog imunoglobulina G Očekivane vrijednosti koncentracije IgG u sakupljenim frakcijama kreću se od 0.20.60 mg/mL 2.117 0.80 mL 0. a koja konstantnog dijela imunoglobulina G? 3.894 1.441 0.60.1 mg/mL do 2 mg/mL pa se stoga priređuju standardne otopine IgG koncentracija: 0.00 mL A1 0.889 1.80.359 1.2 Eksperimentalno utvrñene vrijednosti apsorbancije različitih koncentracija IgG pri svjetlosti valne duljine 280 nm. Koja je razlika između krvnog seruma i krvne plazme? 2.80 mL 1. a na ordinatu pripadajuće prosječne vrijednosti A280. 0. Tablica 3.853 2. 0. • Razdvojite stakla.026 0. 1.129 0.95 mL 0.00 mg/mL.440 0. • Izlijte otopinu za bojanje iz kadice u kojoj se nalazi gel te kadicu s gelom kratko isperite destiliranom vodom.02 mg/mL 0. i 2.05 mL 0. Kao referentna vrijednost uzima se prosječna izmjerena vrijednost A280 za pojedinu koncentraciju IgG.10.8 Zadaci V (2 mg/mL otopine IgG) 0 mL 0.1.022 0.06 mg/mL 0.40 mg/mL 0. Potom ostavite gel u otopini za bojanje na zibaljci tijekom sljedećih 15 minuta. uronite gel u otopinu za bojanje te sve zajedno zagrijavajte 45 sekundi pri maksimalnoj jakosti u mikrovalnoj pećnici.99 mL 0.000 0. • Pomoću baždarnog pravca odredite koncentraciju IgG u nepoznatom uzorku (u frakciji koja sadrži najviše IgG).7. Koja je funkcija varijabilnog dijela.024 0. Možete li na osnovu toga sa 22 .291 A2 -0. konačna konc.00 mg/mL 3.80 mg/mL 1.

(September 1967). G..ucl. 1: 247-251. Nature..htm 4. Protein A je homodimer s molekulskom masom monomera 42 kDa. protein B je heterodimer koji se sastoji od polipeptida molekulske mase 20 kDa i 30 kDa. Lauc. 5. Nacrtajte shematski prikaz SDS-PAGE gela u kojem je svaki protein pušten kao zasebni uzorak. Alberts.. Deyl Z. M. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. http://www. D. Maravić. dok je protein C monomeran protein molekulske mase 14 000 Da. M. 32: 605-608. M. 28 (5): 815–820... U. Dumić. D.uk/~ucbcdab/enzpur/amso4. Garland Science 7. Dumić. Heffer-Lauc. Laemmli. (1995) Biochemistry. Flögel. I. Flögel. Shapiro AL. 23 . (2002) Molecular Biology of the Cell.ac.9 Literatura 1. 8. I. B. Amsterdam/New York. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. 2. and Labar.K..BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM sigurnošću reći je li uzorak sadržavao tri različita proteina? Objasnite svoj odgovor! 5. Aurer. G. et al. J. Voet. Rendić. and Voet. Electrophoresis: A survey of techniques and applications. (1999) Fucosylation of IgG Heavy Chains is Increased in Rheumatoid Arthritis. Clinical Biochemistry... 6. Elsevier Scientific. 3.. Viñuela E. Miloš. G. and Lauc. J. Coll Antropol. Maizel JV Jr. Biochem Biophys Res Commun. (2007) Aberrant Glycosylation of Igg Heavy Chain in Multiple Myeloma. B. 3. Gornik. J. 227: 680-685. (1983). New York: John Wiley & Sons Inc. M. Ne zaboravite obilježiti anodu i katodu te molekulske mase pojedinih proteinskih vrpci.. D. ed. Matišić.

IUBMB) enzimi se označavaju brojevima EC. čijom oksidacijom nastaju visokoreaktivni kinoni. tirozinazu odnosno 1.1.1). Prema IUBMB nomenklaturi (nomenklaturi Međunarodnog udruženja za biokemiju i molekularnu biologiju.1 Klasifikacija enzima. Enzimska kinetika (sekvenciranje 4.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Vježba 4.10.2-dihidroksibenzen: kisik oksidoreduktazu.1). Svaki je enzim opisan slijedom četiri broja. a proteaze su enzimi koji kataliziraju razgradnju proteina. Klasifikacija enzima Nazivlje enzima najčešće potječe od imena supstrata ili vrste kemijske reakcije koju kataliziraju. Tako je primjerice katekol supstrat enzima katekolaze.2). Oznaka EC 1 EC 2 EC 3 EC 4 EC 5 EC 6 Razred Oksidoreduktaze Transferaze Hidrolaze Liaze Izomeraze Ligaze Vrsta reakcije Oksido-redukcija Prijenos funkcionalne skupine Hidroliza Odstranjivanje skupine i tvorba dvostruke veze Izomerizacija Tvorba kovalentne veze u sprezi s hidrolizom ATP 4. Smeđa boja koja nastaje kada se. 24 . Benzokinon inhibira rast mikroorganizama te tako štiti oštećenu biljku od truljenja. koji potom u neenzimskoj reakciji daju pigment melanin (Slika 4.1 Reakcija katekola s kisikom katalizirana katekolazom. uz nastavak – aza. voće razreže i stoji na zraku potječe od nastalog benzokinona. engl.2. pri čemu prvi broj klasificira enzime u jednu od 6 osnovnih skupina koje su formirane ovisno o mehanizmu reakcije koju kataliziraju (Tablica 4. International Union of Biochemistry and Molecular Biology.1). primjerice. Supstrati za katekolazu mogu biti i drugi dihidroksibenzeni. U stanicama se nalazi u vezikulama i dolazi u doticaj s katekolom i kisikom nakon oštećenja stanice.3. Katekolaza U oksidoreduktaze ubrajamo i katekolazu (drugim imenom katekol-oksidazu. EC 1.2 – dihidroksibenzen) Slika 4. enzim široko rasprostranjen u biljkama. Katekolaza katalizira reakciju katekola i kisika u kojoj se katekol oksidira u benzokinon (Slika 4. Tablica 4. katekolaza 2 + O2 2 benzokinon (crven) + 2 H2O katekol (1.

a kada u post-ustaljenom stanju. pri čemu je ε molarni ekstinkcijski koeficijent.3. Izračunajte vrijednosti početne brzine enzimske reakcije pri različitim koncentracijama supstrata.4. 4. Tijek enzimske reakcije koju katalizira katekolaza može se pratiti spektrofotometrijski – tijekom enzimske reakcije bezbojni se supstrat katekol pretvara u smeđi produkt benzokinon. počinje u trenutku kada se u reakcijskoj smjesi istovremeno nađu enzim i supstrat. ta je apsorbancija konstantna tijekom enzimske reakcije. Ekstrakt krumpira također apsorbira svjetlost valne duljine 540 nm. kao slijepa proba koristi se smjesa ekstrakta krumpira i pufera koja ne sadrži supstrat i u kojoj je koncentracija ekstrakta krumpira jednaka onoj u uzorku. Zaključite kada je enzimska reakcija u ustaljenom. Prilikom izvođenja pokusa na umu valja imati da enzimska reakcija.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Slika 4. Prilikom praćenja enzimske kinetike u in vitro uvjetima uobičajeno je da se u reakcijskoj smjesi nalaze enzim i supstrat u puferiranom vodenom mediju. 25 . Zadaća Priredite reakcijske smjese s istim koncentracijama enzima i različitim koncentracijama supstrata i odredite apsorbancije tako priređenih smjesa u tridesetosekundnim intervalima tijekom prve tri minute enzimske reakcije. koji apsorbira svjetlost valne duljine 540 nm. no s obzirom na to da se njegova koncentracija u određenoj reakcijskoj smjesi tijekom vremena ne mijenja. a c koncentracija tvari koja apsorbira). u potpunosti priređenu reakcijsku smjesu potrebno odmah premjestiti u kivetu i započeti mjerenje. Kako bi izmjerena apsorbancija potjecala isključivo od nastalog produkta. Kinetika reakcije katekolaze Osnovni principi enzimske kinetike objašnjeni su u zasebnom odjeljku (Dodatak – enzimska kinetika). 4. Apsorbancija otopine proporcionalna je koncentraciji tvari koja apsorbira.2 Reakcija dopamina s kisikom katalizirana katekolazom. l duljina puta zrake svjetlosti kroz uzorak. već se kao izvor enzima koristi ekstrakt krumpira. Stoga je takvu. koju pratimo spektrofotometrijski. Početna brzina enzimske reakcije stoga se može izraziti pomoću vrijednosti asporbancije: vo= d[P]/dt = dA/dt Katekolaza koja se koristi za ovu vježbu nije čisti protein otopljen u puferu. što je poznato kao Beer-Lambertov zakon (A = ε x l x c.

26 . pH 7. Nacrtajte graf ovisnosti početne brzine enzimske reakcije o koncentraciji enzima i zaključite kako koncentracija enzima utječe na početnu brzinu enzimske reakcije. pH 7. Koncentracija nastalog produkta tijekom određenog vremena može se odrediti izravnim mjerenjem apsorbancije istog. Vm i Km kao i ispitati kako početna brzina enzimske reakcije ovisi o koncentraciji supstrata i koncentraciji enzima. vodi 50 mM natrijev fosfatni pufer.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Nacrtajte Michaelis-Menteničin graf ovisnosti početne brzine o koncentraciji supstrata. odredite maksimalnu početnu brzinu enzimske reakcije pri zadanoj koncentraciji enzima (Vm).6.0 4. Načelo postupka U enzimskoj reakciji katekolaze s katekolom nastaje smeđi produkt bezokinon. Pribor • • • • • • • • • • • • • staklene epruvete plastične epruvete od 15 mL stalak za epruvete staklene čaše aluminijska folija automatske pipete nastavci za automatske pipete staklena kiveta staničevina staklene boce boce štrcaljke štoperica VIS spektrofotometar 4. Na temelju rezultata mjerenja može se zaključiti tijekom kojeg vremenskog perioda traje ustaljeno stanje te izračunati vrijednosti početne brzine enzimske reakcije. Reagencije • • • 10% ekstrakt krumpira u fosfatnom puferu.5. Michaelisovu konstantu za katekolazu u navedenim reakcijskim uvjetima (Km) te zaključite kako koncentracija supstrata utječe na početnu brzinu enzimske reakcije. 4.0 (držati na ledu u tamnom) 20 mM katekol u dest. Izračunajte vrijednosti početne brzine enzimske reakcije pri različitim koncentracijama enzima.7. Priredite reakcijske smjese s različitim koncentracijama enzima i istim koncentracijama supstrata te odredite apsorbancije tako priređenih smjesa u tridesetosekundnim intervalima tijekom prvih devedeset sekundi enzimske reakcije.

Zaključite tijekom kojeg vremenskog raspona traje ustaljeno stanje. oznaka epruvete 1 2 3 4 5 6 ckatekol (mM) 0.2 Sastav reakcijskih smjesa. Stavite kivetu u spektrofotometar te apsorbanciju pri 540 nm namjestite na vrijednost 0. Začepite epruvetu i promućkajte je. pufer.8 2.0 2 2 2 2 2 2 2 katekol 0. vode i katekola (navedene u tablici 4. Rezultate upisujte u tablicu 4.5 Tablica 4.5 2.5 2.0 • • Prikažite rezultate grafički nanoseći na apscisu vrijeme (t) u minutama.5 1. Postupak 4. Tablica 4.1.5 mL ekstrakta krumpira.3 Vrijednosti apsorbancije tijekom enzimske reakcije uz konstantnu koncentraciju enzima katekolaze. oznaka epruvete S 1 2 3 4 5 6 volumen (izražen u mL) H20 2.5 mL katekola i istovremeno uključite štopericu. Dodajte u prvu epruvetu 0. Napomena: nije potrebno ponovno koristiti slijepu probu. potom njezin sadržaj prelijte u kivetu koju umetnite u spektrofotometar te očitavajte apsorbancije svakih 30 sekundi tijekom 3 minute.0 0.0 3. isperite je destiliranom vodom i protresite kako biste iz nje uklonili svu tekućinu.0 1.8.2). Kako je vrlo moguće da eksperimentalno dobivene 27 .0 2. a na ordinatu A540.7 1.0 8. Tijek enzimske reakcije i učinak koncentracije supstrata na početnu brzinu enzimske reakcije • Označite epruvete i u njih precizno ispipetirajte odgovorajuće volumene pufera. začepite epruvetu i promućkajte je te sadržaj epruvete prelijte u kivetu.0 vrijeme u minutama 1.5 3. Iz vrijednosti apsorbancija koje se odnose isključivo na ustaljeno stanje izračunajte početnu brzinu enzimske reakcije pri određenoj koncentraciji supstrata.2 4. Na isti gore opisani način izmjerite apsorbancije ostalih uzoraka.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM 4. pH 7.0 0.0 6.5 1. Dodajte u sljedeću epruvetu (1) 0.3 2.0 • • • • Prva epruveta (označena S) ne sadrži katekol te služi kao slijepa proba.3.2 0. Ispraznite kivetu.0 1.8.5 0.8 1. Početnu brzinu enzimske reakcije izrazite kao prosječnu promjenu apsorbancije u minuti.5 2.

Tablica 4. promućkajte i prelijte u kivetu.5 0. Učinak koncentracije enzima na početnu brzinu enzimske reakcije • Označite ukupno 8 epruveta i u njih precizno ispipetirajte odgovorajuće volumene pufera. U uzorak 1 dodajte 2 mL katekola i istovremeno uključite štopericu.5 0. oznaka slijepe probe oznaka uzorka volumen (izražen u mL) pufer. očitajte vrijednosti Vm i Km i zaključite kako koncentracija supstrata utječe na početnu brzinu enzimske reakcije. Uočite da je za svaki uzorak potrebna odgovarajuća slijepa proba koja sadrži isti volumen ekstrakta krumpira. Sastav reakcijskih smjesa. isperite je destiliranom vodom i protresite kako biste iz nje uklonili svu tekućinu.8. 4.0 mM.0 1.8 1.5. Začepite epruvetu i promućkajte je. Prvu slijepu probu začepite.2 0. S2. potom njezin sadržaj prelijte u kivetu koju umetnite u spektrofotometar te očitavajte apsorbancije svakih 30 sekundi tijekom 1. prosječnu promjenu apsorbancije u minuti izračunajte prema formuli: n _____ Ay-Ax ____ Σ ty-tx dA d[P] n=1 vo = ____ = ____ = _________ n-1 dt dt • Nacrtajte Michaelis-Menteničin graf i Lineweaver-Burkov graf. oznaka epruvete 1 2 3 4 28 Vekstrakt /(mL) 0.5 .4.2 0. odnosno istu koncentraciju katekolaze. Ispraznite kivetu. pH 7.8 0. Na isti gore opisani način izmjerite apsorbancije ostalih uzoraka.0 2 2 2 2 H20 0.8 1.2. vode i ekstrakta krumpira (navedene u tablici 4. Stavite kivetu u spektrofotometar te apsorbanciju pri λ = 540 nm namjestite na 0 (pritiskom na tipku „auto zero“).0 ekstrakt krumpira 0.5 vrijeme u minutama 1.2 0. S3 i S4) dodajte još 2 mL vode.5 Vrijednosti apsorbancije tijekom enzimske reakcije pri koncentraciji katekola 8. Rezultate upisujte u tablicu 4.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ vrijednosti apsorbancije u ustaljenom stanju malo odstupaju od pravca kojim se može opisati ovisnost apsorbancije o vremenu.5 minute.5 0.0 S1 S2 S3 S4 • • 1 2 3 4 • • • U sve slijepe probe (S1. Napomena: svaki je put potrebno koristiti odgovarajuću slijepu probu! Tablica 4.0 0.4).

and Voet. Wood. Dwex. 2. E.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM • • Iz vrijednosti apsorbancija izračunajte početnu brzinu enzimske reakcije pri određenoj koncentraciji katekolaze. Price. Kako biste podesili reakcijske uvjete ako ste u pokusu A izmjerili određenu maksimalnu brzinu studirane enzimske reakcije. and Wormald. New York: John Wiley & Sons Inc. Voet. R. (1995) Biochemistry. D. Oxford: Pergamon Press.9. Možete li metodom opisanom u ovoj vježbi pratiti što se događa s koncentracijom produkta tijekom predustaljenog stanja? Zašto? 2.G.10.J. Zašto ekstrakt krumpira tijekom ove vježbe držite na ledu? 3.C. M.A. Početnu brzinu enzimske reakcije izrazite kao prosječnu promjenu apsorbancije u minuti. Literatura 1. (1989) Practical Biochemistry for Colleges. Nacrtajte graf ovisnosti početne brzine enzimske reakcije o koncentraciji enzima i zaključite o kakvoj je ovisnosti riječ i zašto. Koje su osnovne osobine ustaljenog stanja enzimske reakcije koja prati MichaelisMenteničinu kinetiku? 4. Oxford: Oxford University Press. J. R. 29 . N. 3. Ratcliffe. a u pokusu B želite da izmjerena maksimalna brzina bude 2 puta veća od brzine u pokusu A? 4.. 4. Zadaci 1.. (2005) Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists.R.

Sustav ulazi u ravnotežu kad je razlika Gibbsovih energija jednaka nuli. U kemiji se potrebna energija aktivacije najčešće namakne povišenjem temperature. Katalitička moć enzima je vrlo različita. Početkom 20. U organizmu. vrlo specifičnih i moćnih bioloških katalizatora. spore se reakcije ubrzavaju pomoću enzima. Enzim ne mijenja položaj ravnoteže S P. ali teče brže. Zbog načina vezanja supstrata. tijek i brzina reakcije vrlo su osjetljivi na reakcijske 30 . koji može živjeti u vrlo ograničenom temperaturnom rasponu. Oslobađanje energije bitno je za spontanost reakcije. ne teku sve energetski povoljne reakcije spontano i brzo. uz smanjenu energiju aktivacije (Slika 1). Postoje vrlo spore reakcije usprkos velikom energetskom potencijalu. a najveća brzina enzimske reakcije ograničena je difuzijom (k = 10-9Ms-1). Njih koči energetska prepreka koju treba prijeći na putu do produkta reakcije: treba aktivirati reaktante. stoljeća Michaelis i Menten pretpostavili su da se enzimska reakcija može odviti samo ako enzim E i supstrat S stvore funkcionalni kompleks ES.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Dodatak: Enzimska kinetika (sekvenciranje Svaku kemijsku reakciju pokreće negativna razlika Gibbsove energije između produkata reakcije i reaktanata. on samo ubrzava reakciju pretvorbe supstrata u produkt do uspostavljanja ravnoteže. Pozitivna energetska razlika pokreće povratnu reakciju. Enzimska je reakcija složenijeg mehanizma od nekatalizirane reakcije. Međutim. Shematski prikaz promjene Gibbsove energije (∆G) nekatalizirane i enzimski ∆ katalizirane reakcije S P. # ΔG0#(S→S#) → S ΔG0#(ES→P#) → P Slika 1. E+S ES P+E Kompleks ES zatim može dati produkt i slobodni enzim ili može u povratnoj reakciji disocirati na reaktante. Tijekom reakcije ta se energetska razlika smanjuje. Brzina nastajanja produkta ovisi o katalitičkim svojstvima i koncentraciji enzima te koncentraciji supstrata. prirode katalitičke reakcije i dinamičnosti proteinske strukture.

aktivatori. Tijek enzimski katalizirane reakcije. Koncentracija produkta P raste sve do uspostavljanja ravnoteže. tijekom kojeg dolazi do postupnog smanjenja koncentracije ES. intenziviranja povratne reakcije. kao što su temperatura. Ustaljeno se stanje uspostavi vrlo brzo (ms < t < 1s). Praktički je najčešće moguće mjeriti samo nastajanje produkta. Nakon miješanja enzima i supstrata dolazi do stvaranja kompleksa ES.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM uvjete. pH i ionska jakost te drugi sastojci u reakcijskom mediju (proteini. odnosno dok reakcijski sustav ne uđe u ustaljeno stanje. U ustaljenom stanju produkt (P) nastaje stalnom brzinom. Tijek enzimske reakcije Tijek pretvorbe supstrata u produkt u prisutnosti enzima može se teorijski pratiti bilo kojom indikatorskom metodom koja prati smanjenje koncentracije supstrata ili povećanje koncentracije produkta. Koncentracija ES raste dok se ne ustali. Grafički prikaz tipičnog reakcijskog tijeka dan je na slici 2. inhibitori i dr. prestaje ustaljeno stanje i započinje postustaljeno stanje. I. stoga i do postupnog smanjenja brzine nastanka produkta. 31 . a kratki period koji mu prethodi nazivamo predustaljeno stanje. koju nazivamo početnom brzinom. dok je smanjenje velike koncentracije tvari za neku malu vrijednost analitički teško uočljivo. a označava se vo. u kojoj su brzina nastajanja produkta i brzina njegove razgradnje izjednačene. jer je povećanje koncentarcije tvari koja raste od 0 do neke vrijednosti analitički pristupačno. Kad se potrošio osjetni dio supstrata. Michaelis-Menteničina kinetika odnosi se na brzine enzimskih reakcija u ustaljenom stanju. PREDUSTALJENO USTALJENO STANJE STANJE d[P] /dt=v0=konst POSTUSTALJENO STANJE [P] [P] i [ES] d[ES]/dt > 0 d[ES] /dt = 0 d[ES] /dt < 0 [ES] vrijeme Slika 2.).

Vm. Slijedi da je početna brzina enzimske reakcije određena izrazom k2[ET] [S] v o= Km + [S] Mjerimo li početne brzine enzimske reakcije uz različite početne koncentracije supstrata. Tu brzinu nazivamo početnom brzinom enzimske reakcije i označavamo je kao vo. Konstantu Km nazivamo Michaelisovom konstantom. k2 k1 ES P+E k-1 Brzina reakcije u ustaljenom stanju ovisna je isključivo o koncentraciji kompleksa ES koja je konstantna. jer su brzine nastanka i razgradnje kompleksa jednake. a trajat će dokle god je koncentracija produkta zanemarljivo mala u odnosu na koncentraciju supstrata. Prema tome shema enzimske reakcije u ustaljenom stanju zanemaruje povratnu reakciju. vo = Vm [S] Km gdje je Vm Km =k 32 . tako da je koncentracija kompleksa ES jednaka početnoj koncentraciji enzima.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ II. vo = Vm = k2 [ET] Prema tome početnu brzinu možemo izraziti kao vo = Vm [S] ] Km + [S] ] Kad je [S] << Km (< 0.[ES] Na osnovi gornjih jednadžbi možemo izraziti koncentraciju ES kao [ES] = [ET] [S] Km + [S] gdje je Km = (k-1 + k2)/k1. E+S vo= k2 [ES] gdje je k2 prava katalitička konstanta (I reda. opazit ćemo da početna brzina raste s porastom supstrata sve dok ne dosegne neku maksimalnu brzinu. Maksimalna brzina se postigne kad je sav enzim zasićen supstratom.01 Km) početna brzina linearno ovisi o početnoj koncentraciji supstrata. Kinetika ustaljenog stanja Ustaljeno stanje uspostavit će se u uvjetima kada je koncentracija enzima znatno manja od koncentracije supstrata. kcat). pa je brzina nastajanja produkta iz kompleksa ES izravno proporcionalna koncentraciji kompleksa ES k1 [E][S] = (k-1 + k2) [ES] Budući da se početna (ukupna) koncentracija enzima ET raspodjeljuje na slobodni enzim E i kompleks ES [E ]= [ET] .

Ovisnost vo o početnoj koncentraciji supstrata uz stalnu koncentraciju enzima. uz odgovarajući baždarni dijagram (ili poznati molarni ekstinkcijski koeficijent) moguće je odrediti koncentraciju mjerene tvari. Najčešće se koncentracija nastalog produkta određuje spektrofotometrijskom metodom koja se temelji na mjerenju promjene apsorbancije. te parametre ćemo 33 . Kako je sposobnost apsorpcije svjetlosti razmjerna koncentraciji tvari koja apsorbira.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM v= gdje je k konstanta brzine I reda. [S]=Km Slika 3. Mjerenje katalitičke aktivnosti i brzine enzimski katalizirane reakcije Katalitička aktivnost enzima obično se određuje mjerenjem koncentracija nastalog produkta nakon inkubacije smjese poznatih koncentracija supstrata [S] i enzima [E] pri pogodnom pH u određenim vremenskim razdobljima. d[S] = k[S] dt Znajući konstantu brzine možemo izračunati količinu nastalog produkta u određenom vremenu iz integriranog oblika v. Količina nastalog produkta ne ovisi o S. Ako optička svojstva produkta enzimske reakcije ne dopuštaju izravno mjerenje odgovarajuće promjene apsorbancije. pa je količina produkta jednaka [P] = Vm × t Enzimska kinetika u dijagnostičke svrhe mjeri se upravo u takvim uvjetima. Kad je [S] >> Km (> 100 Km) reakcija je 0-tog reda. Znamo da je Vm = k2 [ET] pa količina nastalog produkta izravno ovisi o koncentraciji aktivnog enzima. neophodno je uvesti konsekutivnu "indikatorsku" reakciju koja će nastali produkt prevesti u obojeni produkt indikatorske reakcije. Premda grafički prikaz ovisnosti vo o koncentraciji supstrata omogućuje određivanje karakterističnih konstanti Km i Vm za određeni reakcijski sustav. Ovisnost početne brzine o koncentraciji supstrata prikazana je grafički na slici 3. [P] = k2 [ET] t III.

67 nkat. Katal je definiran kao enzimska aktivnost (količina enzima) koja u jednoj sekundi pretvara 1 mol supstrata u produkt pri optimalnim uvjetima (1 kat = mol L-1s-1).BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ lakše grafički odrediti na osnovi algebarskih transformacija osnovnog izraza za početnu brzinu.I Inhibicija enzimske reakcije Kinetička studija enzimske reakcije pomaže u otkrivanju inhibitora i u prepoznavanju mehanizma njihova djelovanja. Starija jedinica za enzimsku aktivnost je tzv. mikromoli supstrata koje 1 mg proteina prevede u produkt u jednoj minuti). molarna aktivnost enzima i obrtni broj. internacionalna jedinica enzimske aktivnosti. Katalitička koncentracija enzima određena je brojem katala (ili IU) u litri otopine. a kaže koliko molova produkta nastaje u prisutnosti jednog grama proteina u jedinici vremena (ili IU mg-1. primjerice dijalizom. U prvom slučaju aktivnost se može ponovno uspostaviti odgovarajućim uklanjanjem inhibitora. Najčešće se koristi Lineweaver-Burkov prikaz (Slika 4. Srodne mjere enzimske aktivnosti su specifična aktivnost enzima. a predstavlja broj molova nastalog produkta po molu enzima u minuti. Aktivnost enzima moguće je izraziti na više načina. bilo terapijsko.) 1 / vo nagib (tg α)=K m /V max 1 / V max -1/K m 1/[S] Slika 4. Čimbenici koji utječu na brzinu enzimske reakcije IV. Specifična aktivnost enzima izražava se kao kat g-1. odnosno 1kat = 6×107 IU. Enzimske aktivnosti izražavaju se obično u mikrokatalima (µkat) i nanokatalima (nkat) što odgovara jedinicama µmol L-1 s-1 i nmol L-1 s-1. U SI-sustavu jedinica enzimske aktivnosti je katal. IV. Budući da enzim može imati više aktivnih središta. Inhibitori imaju veliko kliničko značenje. Definirana je kao količina enzima koja katalizira pretvorbu jednog mikromola supstrata u produkt u jednoj minuti (µmol L-1 min-1) pri standardnim (optimalnim) uvjetima. bilo toksično. Odreñivanje Km i Vm po Lineweaver-Burku. Molarna aktivnost enzima (kat mol-1) odgovara broju molova supstrata koje jedan mol enzima prevede u produkt u jedinici vremena. Prometni (obrtni) broj određenog enzima ima jedinicu min-1. Inhibitore možemo podijeliti u dvije skupine: reverzibilne i ireverzibilne. 1IU = 1/60 µkat = 16. Inhibitorno djelovanje reverzibilnog inhibitora ovisi o konstanti 34 . IU. prometni broj često se iskazuje kao broj molova produkta koji nastaju po molu aktivnih središta u minuti.

jer je time jedan dio enzima uklonjen iz katalitičkog tijeka. E+S ES + I ES E+P ESI 35 . Razlikujemo tri osnovna tipa reverzibilne inhibicije: kompetitivna (konkurentna). Svaki od njih se na karakterističan način odražava u prividnim vrijednostima Km i Vm. Stupanj inhibicije ovisi o relativnom odnosu koncentracija supstrata i inhibitora tako da odgovarajućim povećanjem koncentracije supstrata možemo potpuno potisnuti djelovanje kompetitivnog inhibitora.katekola) na katekolazu. Km se u nekompetitivnoj inhibiciji ne mijenja. Smanjuje se maksimalna brzina. na primjer na kompleks ES. tj. E+S E+I Ks = [E] [S] [ES] ES EI Ki = [E] [I] [EI] E+P Ukupna koncentracija enzima jednaka je [E t ] = vo = Vm [S] K mI + [S] vo K [I] =1+ m × vI K I K m + [S] K s [ES] K [ES] [I] + [ES] + s × [S] [S] Ki  [I]  K mI = K m 1 +   K   i  VmI = Vm Primjer je kompetitivne inhibicije djelovanje benzojeve kiseline (homologa pravog supstrata . nekompetitivna (nekonkurentna) i akompetitivna inhibicija. Kompetitivni inhibitor je spoj koji je po svojoj strukturi veoma sličan pravom supstratu i veže se u aktivno središte i tako konkurira supstratu pri vezanju na enzim. Nekompetitivni inhibitor ne veže se u samom aktivnom središtu. Akompetitivna inhibicija nastaje kad se inhibitor ne veže na slobodni enzim nego na neki enzimski oblik koji sam više ne može vezati supstrat. On zbog toga povećava prividnu Km vrijednost. što smanjuje ukupnu koncentraciju aktivnog enzima. a ne možemo na nju utjecati promjenom koncentracije supstrata. već njegovo vezanje na enzim izaziva konformacijsku promjenu koja enzim učini neaktivnim. Ireverzibilna inhibicija je neuklonjiva i progresivna.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM inhibicije odnosno disocijacijskoj konstanti kompleksa enzim-inhibitor (Ki). a aktivni udio enzima zadržava početni afinitet za supstrat. Do nekompetitivne inhibicije dolazi kad reverzibilna inhibicija ovisi isključivo o koncentraciji inhibitora.

Zbog toga mnogi enzimi postižu maksimalnu katalitičku učinkovitost samo u ograničenom području pH.kompetitivna inhibicija. B .neinhibirana reakcija. C . jer ukupna prostorna konformacija ovisi i o slabim nekovalentnim vezama od kojih su mnoge elektrostatske prirode.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ vi = Vm [I] 1+ Ki Km [I] 1+ Ki K mi = Mjerenje ovisnosti vo i [S] prikazano u Lineweaver-Burkovom dijagramu jasno predočuje kinetičke razlike različitih tipova inhibicije (Slika 5. Primjeri učinka pH na enzimsku aktivnost prikazani su na slici 6. 1 / Vo B D C A 1 / Vmax 1/[S] -1/Km Slika 5.nekompetitivna inhibicija.II Utjecaj pH na brzinu enzimske reakcije Katalitičko središte enzima sastoji se od katalitičkih i veznih mjesta koja moraju biti u odgovarajućem prostornom razmještaju i ionizacijskom obliku kako bi moglo doći do uspješne katalize. Grafičko odreñivanje tipa inhibicije po Lineweaver-Burku (A . 36 . IV. Razumljivo je da će kiselost i ionska jakost medija značajno i specifično utjecati na katalitička svojstva enzima.akompetitivna inhibicija). Proteinska struktura enzima vrlo je osjetljiva na kiselost medija.). D .

pa i vrijeme izlaganja određenoj nefiziološkoj temperaturi utječe na katalitička svojstva enzima. enzimi koji kataliziraju istu kemijsku reakciju. Povišenjem temperature iznad fiziološke temperature može doći do promjene konformacije ili denaturacije proteinske molekule. 37 . Utjecaj pH na brzinu enzimske reakcije. jer se proteinske molekule razlikuju u termičkoj stabilnosti. Kvarterne strukture su osjetljive na nisku temperaturu.III Utjecaj temperature na brzinu enzimske reakcije Temperatura ima dvojaki utjecaj na brzinu enzimske reakcije. Primjer oligomernih enzima su izoenzimi. A) B) 50°C % maksimalne brzine 100 – apsorbancija produkta 60°C 40°C 70°C 80°C 50 – 20 40 t (°C) 60 80 vrijeme (minute) Slika 7. Povišenje temperature povećava kinetičku energiju sustava i reakcija nužno teče brže. što će djelomice ili posve onesposobiti katalitičko djelovanje. Izoenzimi se često prepoznaju upravo po svojstvenoj termičkoj stabilnosti. Stoga se za mjerenje kinetike u dijagnostičke svrhe mora osigurati standardna temperatura od 30o ili 37oC. Brzina enzimske reakcije povećat će se u prosjeku za 10% uz povišenje temperature od 1 stupnja. ako se ti uzorci namjeravaju koristili za kinetička mjerenja. pa uzorke oligomernih enzima nije poželjno čuvati u zamrzivaču. Primjeri utjecaja temperature na brzinu enzimskih reakcija prikazani su na slici 7. Utjecaj temperature na brzinu enzimske rekcije (A i B).BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Slika 6. Konformacijski prijelazi su ponekad spori. IV. ali se razlikuju po svojim fizikalno-kemijskim osobinama. Temperaturni učinak bit će različit za različite enzime.

Price. Ratcliffe. A. New York: John Wiley & Sons Inc. N. 2. J. (2001) Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists. Voet. Oxford: Oxford University Press 38 .. Literatura 1. C. Dwek. D.. R. Wormald. and Voet.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ V. M. R. (1995) Biochemistry. R.. G.

1 prikazana je aldoheksoza glukoza. 2 (kod disaharida). pri čemu se rastvoreni oblik ugljikohidrata (koji nacrtan u linearnom obliku nazivamo Fischerovim prikazom) zatvara u ciklički oblik (koji prikazujemo Haworthovom projekcijom). a aldotetroze. a ovisno o položaju novonastale hidroksilne skupine na anomernom Catomu razlikujemo α i β anomere.2 prikazana ketoheksoza fruktoza. Monosaharidi mogu biti različiti metabolički intermedijari. jedini monosaharid koji se u stanicama nalazi samostalno. A) Linearan oblik – Fischerov prikaz B) Ciklički oblik – Haworthov prikaz. 3-10 (kod oligosaharida) te >10 (kod polisaharida).i polisaharida kao i nukleinskih kiselina i glikokonjugata. A) B) otvoreni oblik (<1%) stvaranje poluacetala D-glukofuranoza (<1%) D-glukopiranoza (99%) Slika 5. Na slici 5. Ugljikohidrati (sekvenciranje 5. oligo. a nalazimo je i u krvi i ostalim tjelesnim tekućinama.1 D-glukoza. koja se naziva i voćni šećer. pentoze.) dočim x može biti 1 (kod monosaharida). koja se još naziva i grožđani šećer. 39 . dok je na slici 5. Na taj se način stvaraju peteročlani prsteni (furanoze) ili šesteročlani prsteni (piranoze) koji osim ugljika sadrže i jedan atom kisika.1 Ugljikohidrati Jedna od četiri osnovne skupine bioloških makromolekula su ugljikohidrati polihidroksialdehidi ili polihidroksiketoni opće formule (CnH2n0n)x. Reakcijom karbonilne skupine monosaharida i jedne od njegovih hidroksilnih skupina nastaju poluacetali ili poluketali. heksoze itd. tetroze. a gradivne su jedinice već spomenutih di-. pri čemu je n≥3 (te ovisno o tome razlikujemo trioze. Pri tome karbonilni C-atom postaje asimetričan (anomeran). Aldoheksoze većinom stvaraju piranoze (reakcijom aldehidne skupine i hidroksilne skupine na petom C-atomu). aldopentoze i ketoheksoze stvaraju furanoze.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Vježba 5.

koja se sastoji od glukoze i fruktoze međusobno povezanih α1 →β2 vezom (tj. ciklički oblik monosaharida ne može se više rastvoriti u linearan oblik.3 prikazana je struktura saharoze. laktoza Aldehidna skupina ugljikohidrata lako se oksidira. saharoza Slika 5. vezom između dvije hidroksilne skupine na anomernim C-atomima koji nastaju nakon ciklizacije linearnih oblika monosaharida) i struktura laktoze. Te se reakcije temelje na redukciji metalnih iona. U krutom stanju monosaharidi su u cikličkom obliku. mliječnog šećera.3 Saharoza i laktoza. Tromerova. koji se sastoji od galaktoze i glukoze povezanih β(1. Linearan oblik – Fischerov prikaz i ciklički oblik – Haworthov prikaz. uobičajenog stolnog šećera.4) zasnivaju se na redukciji bakrovog (II) sulfata u bakrov (I) oksid koji se taloži u obliku svijetlo crvenog taloga. Na slici 5. ako nisu preko anomernog kisika povezane u glikozidnu vezu. Fehlingova i Benedictova reakcija (Slika 5. koji se taloži u obliku crnog mulja.4) vezom. Ukoliko hidroksilna skupina koja nastaje tijekom stvaranja poluacetala ili poluketala sudjeluje u stvaranju veze između monosaharida i druge molekule koja može. a Nylanderova reakcija na redukciji bizmutovog nitrata do elementarnog bizmuta. djeluju kao reduktivna sredstva. 40 . To zapravo znači da se ne može ponovno spontano stvoriti slobodna karbonilna skupina.2 D-fruktoza. pa aldoze.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ D-fruktoza (linearni oblik) D-fruktofuranoza (Haworthov prikaz) Slika 5. Različitim vrstama obojenih reakcija može se utvrditi je li određeni ugljikohidrat reduktivan. ali ne mora biti ugljikohidrat (takvu vezu nazivamo glikozidnom vezom). a u vodenim otopinama postoji ravnoteža između otvorenih i cikličkih oblika. pri čemu nastaju aldonske kiseline.

U prisutnosti reduktivnog šećera taloži se svijetlo crveni bakrov (I) oksid i nastaje aldonska kiselina. Ketoze nije moguće razlikovati od aldoza u reakcijama na reduktivne šećere jer se te reakcije provode u blago lužnatom mediju u kojem se uspostavlja ravnoteža između aldoznih i ketoznih oblika preko enolnih oblika (keto-enolna tautomerija. ketoza enol aldoza Slika 5.5). Slika 5. ali se razgranatost postiže i α(1.6) vezom). U spiralnu strukturu amiloze može se u reakciji s Lugolovom otopinom (otopinom elementarnog joda u kalijevom jodidu) interkalirati jod čime nastaje plavo-ljubičasto obojenje. pa ne pokazuju pozitivne reakcije reduktivnih šećera. polimeri više od 10 jedinica monosaharida. polisaharid koji sadrži glukoze povezane β(1. Polisaharidi.6).+ Cu2O + 3H2O || || C C Slika 5. Prema nijansama obojenja moguće je razlikovati pentoze od heksoza. 41 .→ R−C −O. koji se sastoji većinom od amilopektina (glukoznih jedinica povezanih α(1.4) vezom.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM R−C −H + 2Cu2+ + 5OH.4) vezom.5 Keto-enolna tautomerija ketoza i aldoza. sadrže premalo slobodnih reduktivnih krajeva u usporedbi s velikom količinom vezanih šećera. ne boja se jodom. Prisutnost ugljikohidrata u vodenim otopinama moguće je dokazati Molischovom reakcijom.4 Benedictova reakcija. U skupinu polisaharida ubraja se u biljnom svijetu široko rasprostranjeni škrob. a heksoza 5-hidroksimetil-furfural). U kiseloj sredini u kojoj se odvija Molischova reakcija polisaharidi hidroliziraju na monosaharide.4) vezom) i u manjoj mjeri od amiloze (kod koje su molekule glukoze povezane također α(1. Celuloza. U daljnjim reakcijama s α-naftolom furfurali stvaraju ljubičasto obojene kondenzacijske produkte (Slika 5. U prisutnosti koncentrirane sulfatne kiseline monosaharidi se dehidratiraju stvarajući derivate furfurala (pentoza daje furfural. Benedictov reagens sadrži bakrov (II) sulfat u alkalnoj vodenoj otopini natrijevog citrata i natrijevog karbonata.

ali i koncentracije proteina u smjesi. U različitim uzorcima provjerite prisutnost: škroba (Lugolovom reakcijom). Bradfordova je reakcija jedna od nekoliko metoda određivanja prisutnosti. 1 mg/mL) u dest.0 . za razliku od proteina. vodi humani serum 10% ekstrakt krumpira u 40 mM fosfatnom puferu pH 7. vodi otopina goveđeg serumskog albumina (BSA. što je temelj za Bradfordovu reakciju. vodi zasićena otopina saharoze u dest. 5. Ugljikohidrati. Prikazana je A) dehidratacija glukoze u 5-hidroksimetil-furfural i B) konačan produkt reakcije s αnaftolom. ne vežu boju Coomassie Blue G250.3 Reagencije • • • • • • • • • 42 laktaza (β-galaktozidaza. ugljikohidrata (Molischovom reakcijom) i reduktivnih ugljikohidrata (Benedictovom reakcijom).BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ A) 5-hidroksimetil-furfural B) obojani furfuril-difenilmetan Slika 5. proteina (Bradfordovom reakcijom).1 U/μL) u fiziološkoj otopini kravlje mlijeko (koje sadrži laktozu) nerazrijeđeno i razrijeđeno 1:10 destiliranom vodom 1% otopina škroba u dest. Spektrofotometrijskim mjerenje apsorbancije (λ = 595 nm) otopine proteina uz Bradfordov reagens može se odrediti koncentracija ukupnih proteina u uzorku (uz konstruiranje baždarnog pravca na temelju apsorbancija otopina proteina poznatih koncentracija). vodi zasićena otopina glukoze u dest.6 Molischova reakcija. 5. U kiseloj se otopini boja Coomassie Blue 250 uglavnom veže na bočne ogranke bazičnih aminokiselina pri čemu se boja otopine mijenja iz zelenkaste u plavu.2 Zadaća Razgradite laktozu u mlijeku djelovanjem enzima laktaze te odredite prisutnost i koncentraciju na taj način nastale glukoze u mlijeku. vodi zasićena otopina fruktoze u dest. 0.

0.1) približne koncentracije 15 μg/mL suncokretovo ulje Lugolova otopina (2% I2/ 10% KI u dest.67 M natrijev citrat i 70 mM bakrov (II) sulfat pentahidrat u dest.5 mL stalak za epruvete od 1.95 M natrijev karbonat. Slobodna aldehidna skupina ugljikohidrata oksidira dvovalente ione bakra pri čemu nastaju aldonske kiseline i narančasti talog bakrovog (I) oksida. Jod iz Lugolove otopine interkalira se u spiralnu strukturu amiloze koja je sastavni dio škroba pri čemu se boja mijenja iz smeđe u plavo-ljubičastu.7.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM • • • • • • • otopina DNA iz kravljeg timusa u puferu SSC/10 (15 mM NaCl. 1. odnosno povećava se apsorbancija pri valnoj duljini od 595 nm.5 mM natrijev citrat. vodi) Bradfordov reagens (0.5% H3PO4 u dest. Koncentrirana sulfatna kiselina uzrokuje hidrolizu složenih ugljikohidrata na monosaharide koji potom stvaraju derivate furfurala.0 . vodi) 5% α-naftol u 96% etanolu koncentrirana H2SO4 5. pH 7.5 mL automatske pipete nastavci za automatske pipete testne trake za semikvantitativno određivanje glukoze (primjerice Keto-Diastix®.5 Načelo postupka Laktoza iz mlijeka razgrađuje se djelovanjem enzima laktaze na glukozu i galaktozu.05 g/L Coomassie Blue G250 u 5% metanol/8. Koncentracija glukoze određuje se pomoću komercijalno dostupnih test-traka na kojima se odvijaju dvije enzimske reakcije u slijedu: glukoza-oksidaza katalizira oksidaciju glukoze iz uzorka u glukonsku kiselinu pri čemu se stvara i vodikov peroksid. Bayer) staničevina staklene epruvete stalak za staklene epruvete kapaljke vodena kupelj ili čaša i grijač staklene boce drvene hvataljke za epruvete 5. peroksidaza potom katalizira reakciju vodikovog peroksida s kalij-jodidnim kromogenom pri čemu nastaje smeđe obojani produkt (intenzitet boje ovisi o koncentraciji glukoze u uzorku). 43 . Derivati furfurala s α-naftolom u konačnici stvaraju ljubičasto obojene produkte. Bočni ogranci bazičnih aminokiselina u proteinima vežu boju Coomassie Blue G250 pri čemu se mijenja boja otopine u plavu. vodi) Benedictov reagens (0.4 Pribor • • • • • • • • • • • • plastične epruvete od 1.

9) otopine DNA.5 mL koncentrirane sulfatne kiseline. 5) otopine proteina BSA. 5. 7) ekstrakta krumpira. 3) otopine glukoze. 7) ekstrakta krumpira.5 mL. 10) vode u koju dodajte komadić staničevine. 11) suncokretovog ulja.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ 5.6 Postupak 5. U pojedinu epruvetu uronite po jednu testnu traku za određivanje razine glukoze. 2) otopine saharoze. 9) otopine DNA. 8) razrijeđenog mlijeka. 4) otopine fruktoze. U svaku pojedinu epruvetu dodajte 1 mL Bradfordovog reagensa i protresite epruvete.6. 2) otopine saharoze.3 Dokazivanje prisutnosti proteina Bradfordovom metodom • • • 11 plastičnih epruveta obilježite brojevima.6.1 Priprema uzorka mlijeka koje ne sadrži laktozu • • • • • Po 1 mL nerazrijeđenog kravljeg mlijeka otpipetirajte u 2 plastične obilježene epruvete od 1. 10) vode u koju dodajte komadić staničevine. Zabilježite promjenu boje iz smeđe u plavo-ljubičasto koja označava pozitivnu reakciju. Nakon 30 sekundi usporedite testno polje za glukozu sa skalom boja na pakiranju testnih traka te zaključite kolika je koncentracija glukoze u uzorcima. 6) seruma. 8) razrijeđenog mlijeka. Pazite da ne uzmutite smjesu tijekom 44 . 4) otopine fruktoze. 8) razrijeđenog mlijeka. 10) vode u koju dodajte komadić staničevine. U svaku pojedinu epruvetu dodajte pažljivo kapaljkom uz stijenku epruvete oko 0. Obje epruvete inkubirajte 15 minuta pri sobnoj temperaturi. 5. odmah je izvadite van i s trake uklonite višak mlijeka pomoću staničevine. Zabilježite promjenu boje iz zelenkaste u plavu koja označava pozitivnu reakciju. 11) suncokretovog ulja. 6) seruma. 3) otopine glukoze. stavite na stalak i u njih kapnite 6 kapi (~200 μL) sljedećih uzoraka: 1) otopine škroba. 6) seruma. 9) otopine DNA. 2) otopine saharoze.6.6. U svaku pojedinu epruvetu dodajte 6 kapi (~200 μL) otopine α-naftola i protresite epruvete. 7) ekstrakta krumpira. U jednu epruvetu dodajte 50 μL otopine laktaze. 5) otopine proteina BSA. 11) suncokretovog ulja.2 Dokazivanje prisutnosti škroba Lugolovom reakcijom • • • 11 plastičnih epruveta obilježite brojevima. 5) otopine proteina BSA. 5. stavite na stalak i u njih otpipetirajte redom po 1 mL sljedećih uzoraka: 1) otopine škroba.4 Dokazivanje prisutnosti ugljikohidrata Molischovom reakcijom • • • 11 plastičnih epruveta obilježite brojevima. stavite na stalak i u njih kapnite 3 kapi (~100 μL) sljedećih uzoraka: 1) otopine škroba. U svaku pojedinu epruvetu kapnite po 3 kapi Lugolove otopine (~100 μL) i protresite epruvete. 3) otopine glukoze. 4) otopine fruktoze.

b) celulozu i c) glikogen izlažete djelovanju α-amilaze iz sline uz prisutnost Lugolove otopine. Koji će od navedenih uzoraka pokazivati pozitivnu reakciju s I) Lugolovom otopinom. Epruvete pomoću drvene hvataljke stavite u čašu s vrućom vodom i zagrijavajte do pojave narančastog obojenja (što predstavlja pozitivnu reakciju) ili do razbistravanja otopina (što predstavlja negativnu reakciju). 9) otopine DNA. (1995) Biochemistry. J. D-glukarna kiselina c. (2005) Color Atlas of Biochemistry. 6) seruma. 8) razrijeđenog mlijeka. N-acetil-D-galaktozamin d. Voet. D. 3.biochemweb. stavite na stalak i u njih kapnite 10 kapi (~300 μL) sljedećih uzoraka: 1) otopine škroba. 5. 5. albumin e. Pretpostavite i objasnite rezultate pokusa u kojem a) škrob. Je li u reakcijama na reduktivne ugljikohidrate moguće razlikovati Dgliceraldehid od dihidroksiacetona? Obrazložite! 5. K. II) Bradfordovim reagensom. and Voet.7 Zadaci 1. 7) ekstrakta krumpira. 3) otopine glukoze. 10) vode u koju dodajte komadić staničevine. New York: John Wiley & Sons Inc. and Roehm.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM • dodavanja koncentrirane sulfatne kiseline.5 Dokazivanje prisutnosti reduktivnih ugljikohidrata Benedictovom reakcijom • • • 11 staklenih epruveta obilježite brojevima. 2. 4) otopine fruktoze. Nakon dodatka sulfatne kiseline nemojte protresati epruvete! Nakon 5 minuta utvrdite je li u sredini pojedine epruvete nastao ljubičasti prsten koji upućuje na pozitivnu reakciju. imunoglobulin G f. 3. III) Molischovim reagensom i IV) Benedictovim reagensom i zašto: a. 5) otopine proteina BSA. J. 11) suncokretovog ulja. U svaku pojedinu epruvetu dodajte 1 mL Benedictovog reagensa i protresite epruvete.H. maltoza 2. Stuttgart: Thieme Verlag.org/carbohydrates. http://www.6.8 Literatura 1. Koolman.shtml 45 . D-glukozamin b. 2) otopine saharoze.

dvovalentni dugolančani aminoalkohol sfingozin (sfingolipidi). većinom su esterificirane te su kao takve sastavnica membrana stanica i organela. 46 . kao što je oksidacija pomoću KMnO4. dok se nezasićene masne kiseline najčešće nalaze u biljnim namirnicama i ribi. za razliku od proteina.1 α-linolenska kiselina.1. Neki su lipidi izoprenoidnog porijekla: alkani karakterizirani dugim lancima s višestruko konjugiranim dvostrukim vezama (β-karoten) ili izoprenoidi višestruko ciklizirani u steroidne strukture (kolesterol i steroidni hormoni). Stupanj nezasićenosti masnih kiselina u mastima i uljima može se odrediti reakcijama dvostruke veze .). Slika 6.1 Lipidi Lipidi su biološke makromolekule raznolikih struktura koje. Jedna od njihovih najvažnijih osobina je netopljivost ili vrlo slaba topljivost u vodi. a u velikim se količinama nalaze u tkivima koja služe za pohranu energije. jednovalentni dugolančani alkohol (voskovi) ili jednovalentni sterolni alkohol (esteri kolesterola).BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Vježba 6. nukleinskih kiselina i polisaharida nisu polimeri. Velika većina lipida su esteri u kojima je kiselinska komponenta dugolančana masna kiselina (jedna ili više). Zasićene masne kiseline uglavnom se nalaze u proizvodima poput mesa i mlijeka. Neki lipidi sadrže fosfatnu kiselinu (fosfolipidi) ili šećerne strukture (glikolipidi). Naziva se još i ω-3 masnom kiselinom jer se prva dvostruka veza nalazi na trećem ugljikovom atomu od kraja (hidrofobni rep). U organizmima se rijetko nalaze u slobodnom obliku. a alkoholni dio može biti trovalentni alkohol glicerol (masti i ulja). Masne su kiseline nerazgranate karboksilne kiseline koje sadrže 4-24 (najčešće 16 do 18) ugljikova atoma. dočim se one kod kojih postoje takve veze nazivaju nezasićenima (Slika 6. Slika preuzeta s (2).adicijom halogena ili oksidacijskim reakcijama. nezasićene masne kiseline – „dobre“). Lipidi 6. Nezasićena masna kiselina koju nalazimo u lanenim sjemenkama. One koje ne sadrže dvostruke veze među ugljikovim atomima nazivaju se zasićenim masnim kiselinama. Unos masnih kiselina povezuje se s razinom kolesterola u krvi i povećanim rizikom od razvoja srčanih bolesti (zasićene masne kiseline – „loše“.

Smanjujući površinsku napetost vode i emulgirajući lipide omogućavaju njihovo otapanje u vodi. A) sapun (natrijev stearat) i B) detergent (natrijev-pdodecilbenzensulfonat). Na slici A) i B) sivo su osjenčani hidrofobni dijelovi.2 Sapuni i detergenti stvaraju micele. palmino ili drugo biljno ulje. Hidrofilni dio detergenta čine anionske.3 Saponifikacija. Nastaju reakcijom saponifikacije koja uključuje hidrolizu triacilglicerola i neutralizaciju masnih kiselina jakom lužinom (Slika 6. a hidrofilni vanjsku stranu micele koja je okrenuta prema vodi.3-distearil-2-palmitil-glicerata nastaju glicerol. odnosno tri molekule sapuna. Sapuni su. A) triacilglicerol lužina sapun + diacilglicerol lužina sapun + monoacilglicerol lužina sapun + glicerol B) O CH2O CHO C O C O CH2O C C17H33 CH2OH C17H33 C15H31 + 3 NaOH CH2OH CHOH + 2 C17H33COO-Na+ + C15H31COO-Na+ Slika 6. a hidrofilni dio sapuna karboksilna skupina.2). B) Kemijski prikaz ukupne reakcije saponifikacije kojom iz 1. natrijev palmitat i dvije molekule natrijevog stearata. A) C) B) Slika 6. soli (većinom natrijeve i kalijeve) masnih kiselina.3). C) micela – hidrofobni dijelovi čine unutrašnjost. 47 . U pripremi sapuna najčešće se koriste trigliceridi životinjskog porijekla. a hidrofobni jedan prema drugome stvarajući unutrašnjost micele.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM 6. iako se mogu koristiti i biljne masti.2 Saponifikacija Sapuni i detergenti su amfifilne molekule koje u vodenom okružju stvaraju micele – hidrofilni dijelovi molekula okreću se prema vodi. a kod sapuna je hidrofobni dio zapravo lanac masne kiseline (Slika 6. Hidrofobni dio detergenta može biti raznolike strukture (primjerice linearan ili razgranati ugljikovodični lanac ili sterolni prsten deoksikolata). dakle. kationske ili neionske polarne skupine. A) Slijed reakcija kojima iz triacilglicerola (estera glicerola i tri masne kiseline) uz dodatak lužine nastaje sapun (sol masnih kiselina) i u konačnici alkohol (glicerol). kao što su kokosovo. a plavo zaokruženi i osjenčani hidrofilni dijelovi molekula.

vodi biljno ulje 5 M NaCl u dest. Reakcijom jake lužine i ulja nastaje sapun. koji oksidira dvostruku vezu između ugljikovih atoma masne kiseline.3 Zadaća Ekstrahirajte lipide iz uzorka čokolade i lanenih sjemenki acetonom te odredite stupanj nezasićenosti ekstrahiranih lipida oksidacijom pomoću KMnO4. 6. .7 Postupak 6. Stupanj nezasićenosti masne kiseline može se odrediti pomoću KMnO4. vodi mliječna čokolada lanene sjemenke 6.5 g tako usitnjene čokolade prebacite u označenu staklenu čašicu. Sapuni i detergenti omogućavaju otapanje lipida u vodi. Napravite sapun miješanjem jake lužine i jestivog ulja te ispitajte učinkovitost otapanja ulja tako priređenog sapuna i komercijalno pribavljenog detergenta.7. voda ohlađena na 4°C detergent aceton 2% otopina KMnO4 u dest.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ 6.6 Načelo postupka Lipidi su topljivi u nepolarnim otapalima pomoću kojih se mogu ekstrahirati iz smjese. U tarioniku usitnite lanene sjemenke te 0.5 Pribor • • • • • • • • • • staklene čaše (10 mL i 400 mL) magnetska miješalica s grijačem magnet za miješanje stakleni štapić stakleni lijevak filter papir Erlenmayerova tikvica staklene epruvete vaga kapaljka 6.4 Reagencije • • • • • • • • • 20% otopina NaOH u dest. 6.1 Ekstrakcija lipida i odreñivanje stupnja nezasićenosti masnih kiselina • • 48 U tarioniku usitnite čokoladu te 0.5 g tako usitnjenih sjemenki prebacite u drugu označenu staklenu čašicu. vodi dest.

Filtriranjem kroz filter papir postavljen na stakleni lijevak sakupite topljive frakcije tih dvaju smjesa u dvije suhe epruvete. nalazi i β-karoten. Filtrirajte kroz obični filter papir u Erlenmayerovu tikvicu uz dva dodatna ispiranja s po 100 mL vode koju ste prethodno ohladili u frižideru. Miješajte staklenim štapićem nekoliko minuta dok se sapun ne odvoji od stijenki čaše. U mrkvi se. Ukoliko naribanu mrkvu stavite u navedena otapala. Dodajte magnet za miješanje i zagrijavajte na magnetskoj miješalici uz konstantno miješanje. Promatrajte što se događa te zapišite svoja zapažanja.2 Saponifikacija • • Pomiješajte 15 mL 20% otopine NaOH i 10 mL suncokretovog ulja u staklenoj čaši od 400 mL. destilirana voda b. Zagrijavajte svih šest epruveta. 96% etanol e. Zagrijavajte dok ne nastane gusta smjesa (približno 30 minuta).7. Taj aceton služi kao slijepa proba. 2. U treću i šestu epruvetu dodajte 100 μL detergenta. petroleter 49 . U drugu i petu epruvetu dodajte malo (vrh špatule) pripremljenog sapuna. 6. a u slučaju prejakog kipljenja. U sve tri epruvete dodajte 1 kap 2% KMnO4. Smjesu maknite s grijača i u nju odmah ulijte 150 mL 5 M otopine NaCl.3 Osobine sapuna i detergenta • • • • • • U tri epruvete ulijte po 5 mL destilirane vode. • • • 6. Poželjno je da smjesa lagano kipi. smanjite zagrijavanje. 6.8 Zadaci 1. fiziološka otopina c. pratite promjene boje tijekom 10 minuta i objasnite ih. U svih šest epruveta dodajte po tri kapi ulja. u kojima će β-karoten biti topljiv i po čemu to možete zaključiti: a. Drugu i petu epruvetu povremeno promiješajte staklenim štapićem. a u druge tri epruvete po 5 mL tvrde vode (u tu svrhu koristite vodovodnu vodu). 3.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM • • • • U svaku pojedinu čašu dodajte 5 mL acetona i smjese miješajte staklenim štapićem oko 1 minutu. Usporedite temperaturu taljenja zasićenih i nezasićenih masnih kiselina. za koji je karakteristična izoprenska struktura. U treću suhu epruvetu dodajte volumen acetona jednak onima koji imate u drugim epruvetama. 50% etanol u destiliranoj vodi d.7. između ostalog. Usporedite maslinovo ulje i maslac obzirom na udio zasićenih i nezasićenih masnih kiselina.

gif http://www.9 Literatura 1.cem.msu. odnosno princip na kojem se temelji primjena sapuna i detergenata kao sredstava za čišćenje. 4. (1995) Biochemistry. D.com/od/cleanerchemistry/a/how-soap-cleans.htm 50 . 6.nicerweb. 3. and Voet J.htm http://chemistry.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ f.com/med/Alpha-linolenic_acid. http://biology. Voet.about. Podrobno objasnite mehanizam djelovanja sapuna i detergenta. New York: John Wiley & Sons Inc.edu/~reusch/VirtualText/lipids. 2. suncokretovo ulje 4.

Purinske ili pirimidinske baze u DNA nositelji su genske informacije.1 Deoksiribonukleinska kiselina Deoksiribonukleinska kiselina (DNA) je vrlo dugačka. Slika 7.2 Denaturacija DNA Ukoliko se vodikove veze među bazama razore uslijed izlaganja povišenoj temperaturi. U sastavu molekule DNA nalazimo četiri različite dušične baze: purinske baze adenin (A) i gvanin (G) te pirimidinske baze timin (T) i citozin (C). promjeni pH ili promjeni ionske jakosti. sastoji se od deoksiriboza povezanih fosfodiesterskim vezama. dva se lanca DNA odvajaju te DNA prelazi iz konformacije dvostruke uzvojnice u konformaciju nasumičnog klupka (Slika 7. Lanci uvijaju oko zajedničke osi i međusobno su antiparalelni. Baze su smještene u unutrašnjosti uzvojnice. dočim deoksiriboze i fosfatne skupine imaju strukturnu ulogu. nitasta molekula sastavljena od velikog broja deoksiribonukleotida. Taj se proces naziva denaturacija. DNA se sastoji od dva polinukleotidna lanca čije smjerove označavamo 5'-3'. Preuzeto i prilagođeno iz (1). Planarne bazne parove čine adenin i timin povezani dvjema vodikovim vezama te gvanin i citozin povezani trima vodikovim vezama. Fosfodiesterska veza povezuje 3'-hidroksilnu skupinu jedne deoksiriboze s 5'hidroksilnom skupinom susjedne. Termička denaturacija DNA (sekvenciranje 7. 51 . Oni su izgrađeni od dušičnih baza te šećera i fosfata. a fosfatne i šećerne jedinice u vanjskom dijelu. 7. Lanci su povezani vodikovim vezama koje stvaraju baze u unutrašnjosti uzvojnice te van der Waalsovim interakcijama među bazama usporedno s osi uzvojnice.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM Vježba 7.1). konstantna duž cijele molekule. Tu pojavu nazivamo komplementarnošću baznih parova. Okosnica DNA.1 Shematski prikaz denaturacije DNA.

Svaki poremećaj dvostruke uzvojnice ogleda se kao povećavanje optičke gustoće prema vrijednostima karakterističnim za slobodne baze (Slika 7. Tm se povećava za oko 0. Tri vodikove veze koje povezuju gvanin i citozin stabilnije su od dviju vodikovih veza između adenina i timina. Iz nje se može očitati temperatura pri kojoj je postignuto 50% denaturacije i koju nazivamo temperaturom mekšanja. a time i njezin Tm. A) B) Slika 7. Ta se pojava naziva hiperkromizam i rezultat je gubitka interakcija među elektronskim sustavima gusto složenih baza u DNA. Preuzeto i prilagođeno iz (1). Veličina Tm linearno je razmjerna molarnom udjelu baznih parova GC. Prilikom denaturacije događaju se i promjene optičke gustoće. što je karakteristično za pojedine baze). Hiperkromni pomak se pri određenoj valnoj duljini (najčešće 260 nm) odvija unutar uskog temperaturnog područja.2 A) Apsorpcijski spektar u UV području nativne i termički denaturirane DNA iz bakterije Escherichia coli. Krivulja mekšanja je prikaz ovisnosti apsorbancije otopine DNA o temperaturi (Slika 7. To znači da je denaturacija DNA kooperativni proces pri čemu razaranje dijela strukture destabilizira ostatak i potiče daljnju denaturaciju. 52 . Denaturacija ne mijenja značajno oblik apsorpcijske krivulje. ovisi o nekoliko čimbenika kao što su sastav baza DNA. ionska jakost i pH otopine te prisutnost drugih molekula koje se vežu na DNA. koja je posljedica krute strukture dvostruke uzvojnice. Međutim. Tm.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ Denaturacija je praćena kvalitativnim promjenama fizikalnih svojstava DNA.2 B).2 A)). izrazito se smanjuje kada DNA prelazi u oblik razmjerno slabo međusobno povezanih jednostrukih lanaca. apsorpcija odgovarajuće smjese slobodnih nukleotida je oko 40% viša od apsorpcije molekule DNA. već samo povećava njezinu vrijednost. karakteristična velika viskoznost otopine nativne DNA. Stabilnost dvostruke uzvojnice DNA. Primjerice. Kada se DNA nalazi u otopini pri približno fiziološkim uvjetima. B) Krivulja mekšanja DNA.4°C ako se udio GC baznih parova poveća 1%. Heterociklički prstenovi nukleotida jako apsorbiraju svjetlost ultraljubičastog područja (s maksimumom blizu 260 nm.

Promjena pH koja uzrokuje protoniranje ili deprotoniranje baza narušava vodikove veze među njima te dovodi do denaturacije DNA. destabilizira uzvojnicu DNA. heterogene DNA sadrže mnoštvo različitih fragmenata nastalih nasumičnim kidanjem kromosoma. Takve su molekule. Ako se otopina denaturirane DNA naglo ohladi na temperaturu znatno nižu od Tm. Oni se na toj temperaturi više ne mogu razdvojiti te se DNA postupno u cijelosti renaturira. Denaturacija i renaturacija DNA bitne su za biološku ulogu ove molekule pri procesima replikacije i transkripcije. 53 . Tm kao mjera denaturacije DNA važan je čimbenik za mnoge eksperimentalne metode koje uključuju hibridizacije nukleinskih kiselina (primjerice. Slično tome. bit će dovoljno toplinske energije da se kratkim.) Stoga je bez intervencije staničnog sustava dvolančana DNA stabilna unutar stanice. odnosno zauzima nativnu konformaciju. ali i proteini koji se vežu na jednolančanu DNA. pod istim uvjetima ima Tm oko 95°C. Ukoliko se promijenjeni parametri sustava koji su uzrokovali denaturaciju DNA (primjerice temperatura) vrate na početne vrijednosti. Na temperaturu mekšanja utječu i ionska jakost i vrijednost pH.PCR). Uzvojnica DNA se stabilizira. 7. otopina denaturirane DNA polagano hladi do temperature 20-25°C manje od Tm. što je vrijednost svojstvena genomu sisavaca. Denaturacija DNA je reverzibilan proces. Zapravo. pri fiziološkim uvjetima ima Tm oko 87°C. eng. krivulja denaturacije se sužava i Tm raste. DNA se renaturira. Kako je elektrostatsko odbijanje istoimenih naboja ovisno o dielektričnoj konstanti otopine. koje pri fiziološkim uvjetima imaju fosfatne skupine. Homogene DNA (primjerice virusne ili plazmidne) koje se sastoje od identičnih kratkih dijelova. polymerase chain reaction . primjerice. Međusobno odbijanje negativnih naboja. Za razliku od homogenih. Dvostruka uzvojnica odgovarajuće DNA samo je neznatno stabilnija od tako nastalih hibrida. bilo koja molekula koja može stvoriti vodikove veze s funkcionalnim skupinama baza u DNA ili omesti slaganje baza jedne iznad druge može pridonijeti denaturaciji uzvojnice. urea i formamid. pak. pogrešno sparenim dijelovima DNA omogući razdvajanje i ispravno sparivanje te na taj način stvaranje duljih komplementarnih sljedova. denaturiraju se u uskom rasponu promjene temperature. temperaturni raspon pri kojem se takva DNA denaturira je širi.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM vrijednost Tm je obično unutar područja 85-95°C (DNA koja sadrži 40% GC parova. povećanjem ionske jakosti povećava se dielektrična konstanta te se smanjuje međusobno odbijanje fosfatnih skupina. nastala DNA bit će samo djelomično dvolančana poradi toga što komplementarni lanci neće imati dovoljno vremena da se u u otopini susretnu i pravilno spare prije nego što se tako djelomično dvolančana struktura "smrzne" u otopini. lančana reakcija polimeraze. Kako se Tm tih fragmenata razlikuju. Ako se. dok DNA koja sadrži 60% GC parova. Odredite Tm iz krivulje mekšanja. komplementarni lanci RNA i DNA u procesu hibridizacije tvore dvolančane RNA-DNA hibride.3 Zadaća Postupno zagrijavajte uzorak DNA do temperature 92°C i pratite denaturaciju mjerenjem apsorbancije pri valnoj duljini 260 nm.

1. u dest. Pri tome dolazi do renaturacije dijela lanca. 7. Krivulja koja se konstruira iz dobivenih podataka u korelaciji je s krivuljom koja bi se dobila kao rezultat pokusa s termostatiranom kivetom.1) – standardni pufer za eksperimente denaturacije otopina DNA izolirana iz kravljeg timusa u puferu SSC/10 – uzorak 7. 54 . pH 7. po jednu epruvetu izvadite i odmah ohladite u smjesi leda i vode. uzorci DNA se zagrijavaju do određene temperature. Nakon što je prikupljen i dobro ohlađen i posljednji uzorak.5 Pribor • • • • • • • • plastične epruvetice od 1. uzorcima redom izmjerite A260. Budući da dostupan spektrofotometar nema termostatiranu kivetu koja bi se mogla postupno zagrijavati. Predlažu se sljedeće temperature (°C): 25 • • 40 55 65 70 75 80 84 88 92 U prikladnu tablicu upisujte stvarnu temperaturu pri kojoj je uzorak izvađen.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___ 7. Kada se dostigne željena temperatura. vodi . Kupelj postupno zagrijavajte do 92°C. označite je kao Tm0).5 mL stalak za epruvete automatske pipete nastavci za automatske pipete vodena kupelj posuda sa smjesom leda i vode UV spektrofotometar kvarcna kiveta 7. Termičku denaturaciju DNA moguće je pratiti spektrofotometrijski.5 mM natrijev citrat.6 Načelo postupka Izlaganjem povišenoj temperaturi DNA se denaturira.4 Reagencije • • pufer SSC/10 (15 mM natrijev klorid. mjereći A260 u temperaturnom rasponu od sobne temperature do temperature potpune denaturacije. Epruvete stavite u stalak i uronite u vodenu kupelj. na milimetarskom papiru nacrtajte graf ovisnosti apsorbancije o temperaturi te odredite temperaturu mekšanja (budući da se ona razlikuje od vrijednosti koju biste dobili mjerenjem kod stvarnih temperatura. a zatim naglo hlade u smjesi leda i vode.7 Postupak • • • Po 1 mL otopine DNA otpipetirajte u 10 plastičnih obilježenih epruveta.0 7.

2 M otopini natrijevog klorida Tm DNA je 75°C.8 Zadaci 1. U 0. Voet.9 Literatura 1. Koje sile združuju dva lanca molekule DNA? 2. U drugoj otopini ista DNA ima Tm od 100°C. 55 . and Voet. Kakva svojstva ima nepoznata otopina u odnosu na 0. New York: John Wiley & Sons Inc. J. (1995) Biochemistry.2 M otopinu natrijevog klorida? 7. D.BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM 7.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful