García-Vázquez, F. A.; Matás, C.

Bovino

Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (II)
Francisco A. García-Vázquez y Carmen Matás Departamento de Fisiología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia E-mail: fagarcia@um.es, cmatas@um.es. www.um.es/grupo-fisiovet.

Introducción
En esta segunda parte completamos la visión sobre el estado actual del cultivo embrionario in vitro en la especie porcina, centrándonos en la Dinámica de los Cultivos embrionarios.

Dinámica del CE
En la dinámica del CE debemos tener en cuenta diferentes aspectos que pueden influir en el desarrollo embrionario. En este apartado vamos a ver algunos de estos factores. • Medio secuencial: El embrión in vivo pasa por diferentes estados de desarrollo con diferentes necesidades metabólicas.

Por tanto, el cultivo in vitro requiere medios con los nutrientes adecuados en cada fase del desarrollo. En la especie humana, Gardner et al., (1996) analizaron la composición metabólica de los fluidos del oviducto y el útero a lo largo del ciclo menstrual y observaron que las concentraciones de metabolitos a los que son expuestos in vivo los ovocitos y los embriones en sus primeros estadios varían a lo largo del tracto reproductor femenino. Para imitar esta situación se han desarrollado lo medios secuenciales los cuales aportan los nutrientes, oligoelementos y hormonas según el estadio de desarrollo embrionario aunque con un coste elevado. Además, un medio de cultivo bajo las condiciones en la que se desarrolla un embrión (por ejemplo temperatura y humedad) durante un largo periodo fácilmente

puede deteriorarse y no soportar el desarrollo embrionario adecuadamente (StewartSavage y Bavister, 1988). Generalmente el cultivo secuencial se ha llevado a cabo en dos medios distintos en los que variará tanto la composición como la concentración de sus componentes. Ejemplos de medios comerciales secuenciales en la especie humana son el medio G1 y G2 (Gardner’s Growth Médium) (Gardner et al. 1998). El medio G1 está basado en el nivel de carbohidratos presente en las trompas y aminoácidos esenciales para la división. También posee EDTA para secuestrar los cationes divalentes tóxicos y contrarrestar la actividad glicolítica del embrión. El medio G2 está basado en el nivel de carbohidratos en el útero, contie-

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ne aminoácidos esenciales y no esenciales, pero no contiene EDTA. En bovino Lane et al., (2003) utilizaron estos medios secuenciales comerciales (G1.2/G2.2) frente a otros no secuenciales. Los resultados fueron similares en cuanto a la calidad embrionaria, sin embargo, tras la transferencia de embriones obtuvieron mayor éxito con embriones que habían sido cultivados bajo un sistema secuencial. En la especie porcina también se ha estudiado este medio frente a un medio simple de una única etapa como es el NCSU23, sin embargo, en esta especie no se han mejorado los resultados con medio secuencial (Swain et al. 2001). Este hecho podría atribuirse a la diferente composición del medio más que al sistema secuencial ya que el NSCU23 contiene glucosa, glutamina y taurina pero no piruvato ni lactato como es el caso de G1 y G2. No obstante, el uso de diferentes medios según los requerimientos del embrión (medio secuencial) parece ser una metodología prometedora para la mejora del desarrollo embrionario aunque la composición del medio variará no solo en función del estadio embrionario sino también en función de la especie. • Sistema de cultivo dinámico: como ya se ha mencionado anteriormente, el uso de un medio estático (sin renovación) (Figura 4a) puede conllevar al acumulo de toxinas procedentes del metabolismo del embrión, como por ejemplo el amonio, y por otro lado no se renuevan los nutrientes esenciales. Por lo que se propone un nuevo sistema donde el medio se renueve constantemente, es el denominado sistema de cultivo dinámico (Figura 4b). Además, según Gardner (1999) este sistema provoca un

menor estrés en el embrión, dando lugar a una mayor viabilidad. El problema de estos sistemas según algunos autores es no solo la eliminación de las productos tóxicos sino también de los factores beneficiosos (factores autocrinos y paracrinos) procedentes del propio embrión.

Figura 4. a) Esquema del sistema estático de cultivo de embriones donde el medio no es renovado. b) Sistema dinámico en el cual el medio de cultivo es renovado constantemente.

• Tranquilidad o estrés: En 2002, Leese propuso la siguiente hipótesis “…la supervivencia de los embriones pre-implantaciones mejora con un bajo metabolismo; una situación que se lleva a cabo reduciendo la concentración de nutrientes en el medio de cultivo…”, por tanto según el autor la consecuencia del cultivo embrionario in vitro es el aumento de la actividad metabólica y compromete la capacidad de desarrollo. Por otro lado, la reducción del metabolismo mediante agentes específicos incluyendo bajos niveles de oxígeno y bloqueantes químicos del metabolismo oxidativo mejora el desarrollo. Otra observación que apoya dicha hipótesis, sería que en los ovarios y en oviducto la temperatura es menor que en los tejidos adyacentes, lo que conlleva un descenso del metabolismo. Sin embargo, esta teoría ha sido cuestionada y otros autores plantean justamente la teoría opuesta ¿estresamos o no al embrión? La respuesta correcta a esta pregunta debe ser que en general, el estrés especialmente de forma incontrolada y continua causa serios daños y por tanto se debe evitar. Pero, se ha demostrado que en determinadas situaciones donde un apropiado y bien aplicado estrés ayuda a los gametos y embriones a aumentar su tolerancia a otras

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situaciones estresantes incluidas aquellos procedimientos que ocurren en el laboratorio (revisado por Vajta et al. 2010). Prybenszky et al. (2008) describieron un método donde usaban una determinada presión hidrostática como pre-tratamiento de ovocitos madurados in vitro, aumentando las tasas de división embrionarias y el desarrollo a estadio de blastocisto. El fenómeno de que un estrés subletal induce una respuesta de mejora hacia otros tipos de estrés ha sido observado en todos los niveles de la vida desde bacterias a organismos multicelulares incluidos los humanos, es el denominado síndrome general de adaptación o también conocido como Ley de Selye (1963).

Sin embargo, las investigaciones que se han realizado parecen confirmar que el estrés crea una especie de protección, que bien podría tratarse del desarrollo de un estado de resistencia. Pero, todavía no hay datos suficientes para explicar con detalle que factores están involucrados en la respuesta al estrés de los gametos y embriones.

diferentes técnicas y procesos de evaluación embrionaria, pudiéndose clasificar en método invasivos (Figura 5) y no invasivos. Los métodos invasivos son aquellos en los cuales el embrión muere al aplicar la técnica de evaluación, y los no invasivos aquellos en los que todavía el embrión es viable. A continuación destacamos algunos de estos métodos.

Evaluación de la calidad embrionaria
Una vez que ya tenemos los embriones, la siguiente pregunta seria ¿Cómo sabemos que los embriones obtenidos son de buena o mala calidad? Para ello existen

Transferencia de embriones
Finalmente, tras la obtención de los embriones, se requieren del desarrollo de sistemas biotecnológicos adecuados que

Figura 5. Blastocisto porcino de 6 días cultivado in vitro y teñido con Hoescht para la identificación de los núcleos celulares.

• Métodos NO INVASIVOS
Cronología desarrollo Evaluación morfológica Pruebas metabólicas (Respirometría) Formación blastocistos y eclosión Descendencia tras transferencia

• Métodos INVASIVOS
Recuento número células Análisis cromosónico y expresión génica Tinción diferencial Microscopía electrónica Estudio componentes celulares

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nos proporcionen una alta eficiencia en la transferencia embrionaria en estadios avanzados del desarrollo. En la especie porcina, la transferencia embrionaria ha sido realizada con éxito mediante procedimientos quirúrgicos durante décadas (Figura 6) (Hazeleger y Kemp, 1999, Garcia-Vazquez et al. 2010), por lo que las aplicaciones comerciales han sido en parte limitadas por este hecho. En los últimos años se han desarrollado diferentes técnicas para la transferencia embrionaria mediante endoscopia o por métodos no quirúrgicos (transcervical) (revisado por Hazeleger y Kemp, 1999). Este último método permite la transferencia de embriones sin necesidad de anestesia, ni material quirúrgico ni personal altamente especializado, aumentando la aplicación de esta técnica a nivel de campo con una considerable reducción de los costes. Por tanto, con un desarrollo adecuado de la producción in vitro de embriones, incluyendo el cultivo embrionario, y la transferencia embrionaria podemos aplicar estas biotecnologías en otras áreas de la biomedicina como la producción de animales transgénicos por diversas metodologías como microinyección pronuclear, vectores virales, transgénesis mediada por espermatozoides… (Gadea y

García-Vázquez, 2010), clonación animal o la recuperación de animales en peligro de extinción. Además, en un futuro no muy lejano y cuando los sistemas de criopreservación embrionaria se encuentren más avanzados, estos embriones se podrían conservar de manera indefinida, pudiendo realizar intercambios genéticos de una manera más sencilla y efectiva.

Agradecimientos
A todos los miembros de Departamento de Fisiología de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Murcia.

Financiación
Ministerio de Ciencia e Innovación (AGL-2009-12512-C02-01) y Fundación Séneca de la Región de Murcia (08752/PI/08).

Problemática CE porcino y conclusiones
El limitado desarrollo de los embriones obtenidos in vitro hasta estadío de blastocisto y su menor calidad en comparación a los obtenidos in vivo, no se debe a un fallo puntual en el sistema de producción in vitro de embriones, sino a una combinación de determinados factores como una inadecuada o incompleta maduración citoplasmática, una inadecuada formulación de los medios de cultivo y unas condiciones de cultivo subóptimas (revisado por García-Roselló, 2005). Por tanto, se debe seguir investigando en las diferentes líneas que conlleva la producción in vitro embrionaria, con el fin de mejorar los rendimientos finales.

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