Teknik molekuler

Sekarang ini penggunaan metode molekuler telah sangat luas untuk analisis sel dan penentuan urutan nukleotida dari keseluruhan genom. Pengetahuan mengenai aktivitas DNA polymerase, enzim restriksi dan DNA ligase melahirkan teknik-teknik kloning DNA dan PCR (polymerase chain reaction) yang memungkinkan diisolasinya segmen DNA. Para ilmuwan juga telah mengembangkan alat dan metode untuk memurnikan protein dan meneliti fungsinya. DNA Isolasi DNA DNA adalah molekul yang terdapat pada semua mahluk hidup. Molekul ini sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata. Tetapi DNA dapat diekstrak dari ribuan sel sehingga DNA dapat terlihat karena jumlahnya yang sangat banyak. Tahapan dalam ekstraksi DNA adalah pemecahan sel, keluarnya DNA dari nukleus dan pengendapan/presipitasi DNA. Ekstraksi DNA memiliki banyak aplikasi praktis, diantaranya adalah untuk tujuan pemuliaan, evolusi, sitematik, konservasi, dll. Dalam ekstraksi DNA tumbuhan, metode ekstraksi yang sering digunakan adalah berdasarkan Doyle dan Doyle 91989). Metode ini menggunakan buffer ekstraksi yang terdiri dari Elektroforesis DNA Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel. Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listrik. DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif (Gambar 1). Molekul yang berukuran besar, memiliki kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis selesai, molekul DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti ethidium yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA.

Gambar 1. Elektroforesis DNA dengan gel agarosa Dua alternatif macam gel adalah poliakrilamida dan agarosa. Poliakrilamida memiliki kapasitas resolusi yang lebih tinggi, tetapi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit. Jadi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA satu sama lainnya yang berbeda ukurannya hanya beberapa atau bahkan satu pasang basa saja tetapi pada molekul yang berukuran beberapa ratus pasang basa saja (dibawah 1000 pasang basa). Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah tetapi dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa. DNA yang berukuran sangat panjang tidak dapat melewati pori gel bahkan pori gel agarosa. DNA yang sangat besar melewati matriks dengan satu ujung bergerak lebih dulu sedang ujung lainnya mengikuti. Akibatnya DNA diatas ukuran tertentu (30 -50 kb) bermigrasi dengan jarak yang sama sehingga tidak dapat diamati pemisahannya. DNA yang sangat panjang ini dapat dipisahkan satu sama lainnya dengan jika daerah listrik diaplikasikan dalam ‘pulses’ yang berasal secara orthogonal satu sama lainnya. Teknik ini disebut pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (Gambar 2).

Pulsed field gel electrophoresis Gambar 2. Pulsed field gel electrophoresis Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan RNA. Seperti juga DNA, RNA memiliki muatan negative, tetapi molekul RNA merupakan molekul utas tunggal dan memiliki struktur sekunder atau tersier. Untuk mengatasinya, RNA diberi perlakuan dengan glyoxal yang bereaksi dengan RNA sehingga menghalangi pembentukan pasangan basa. RNA yang ter-glyoxylasi tidak dapat membentuk struktur sekunder atau tersier sehingga dapat bermigrasi dengan mobilitas yang proporsional terhadap ukurannya. Elektroforesis juga digunakan untuk memisahkan protein dengan prinsip yang sama. Pemotongan DNA dengan enzim restriksi Kebanyakan molekul DNA dalam sel berukuran lebih besar dari yang diperlukan untuk analisa DNA di laboratorium. Jika akan mempelajari gen secara individual atau mempelajari situs individual pada DNA, molekul DNA berukuran besar di dalam sel harus dipotong ke dalam fragmen-fragmen yang lebih kecil. Pemotongan DNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi. Nuklease ini adalah enzim yang memotong DNA pada tempat tertentu dengan cara mengenali urutan basa yang spesifik (Gambar 3). Enzim restriksi yang digunakan dalam biologi molekuler umumnya mengenali urutan basa yang pendek (4-8 bp) dan memotong pada posisi tertentu yang telah ditentukan dalam urutan sekuens DNA tersebut. Contohnya adalah enzim EcoRI yang ditemukan pada strainEscherichia coli dan merupakan enzim restriksi yang pertama (I) ditemukan pada spesies ini. Enzim ini mengenali urutan DNA 5′-GAATTC-3′.

Gambar 3. Situs pengenalan enzim restriksi Jika molekul DNA yang sama dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda, misalnya oleh HindIII yang mengenali urutan 6pb (5′-AAGCTT-3′), atau dipotong dengan EcoRI, maka molekul DNA dipotong pada posisi yang berbeda dan menghasilkan fragmen dengan ukuran yang berbeda (Gambar 4). Jadi sebuah molekul akan menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat dipotong dengan satu set enzim restriksi yang berbeda.

maka akan menghasilkan autoradiogram dengan pola terekspos sama dengan lokasi hybrid (Gambar 6). DNA yang terdenaturasi dari dua sumber yang berbeda bercampur satu sama lain dalam kondisi yang sesuai kekuatan ion dan temperaturnya. Ujung lengket dan ujung tumpul yang merupakan hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik DNA yang telah terdenaturasi memiliki kapasitas untuk bergabung kembali (untuk membentuk kembali pasngan basa di antara utas komplementer). Mereka tampak ‘smear’. ribuan fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan genom yeast dengan enzim restriksi berjumlah terlalu banyak sehingga tidak dapat dipisahkan menjadi ‘band’ DNA yang terpisah. Media film atau media yang sensitif terhadap cahaya atau elektron yang dikeluarkan oleh DNA yang dilabel dapat mendeteksi lokasi probe berhibridisasi. Saat X-ray film diekspos ke filter dan di-develop. membran diinkubasi dengan probe yang mengandung sekuens DNA komplementer dengan sekuens yang diinginkan. Di sisi lain terdapat enzim retriksi yang mengenali sekuens oktamerik (8 bp) yaitu enzim NotI yang mengenali uruta 5′-GCGGCCGC-3′ dan rata-rata memotong hanya sekali dalam 65 kb. Dalam hal ini. HindIII dan PstI menghasilkan ujung lengket (Gambar 5). hibridisasi merupakan dasar untuk mendeteksi sekuens spesifik dalam campuran asam nukleat yang kompleks. ‘Probing’ dilakukan dalam kondisi konsentrasi garam dan temperature dekat dengan kondisi denaturasi dan reanturasi asam nukleat. Fragmen ini kemudian ditransfer dari gel ke membrane yang bermuatan positif tempat DNA akan terikat. . Hal ini menyebabkan terjadinya pembentukan molekul hybrid saat homolog. Beberapa enzim seperti HpaI menghasilkan produk dengan ujung tumpul. Campuran yang telah ter=probe dipisahkan berdasarkan ukuran pada gel atau didistribusikan sebagai perpustakaan klon (library of clones) Gambar 6. Probe digunakan untuk mencari molekul yang memiliki sekuens komplementer dalam campuran DNA. Enzim restriksi tidk hanya berbeda dalam urutan basa yang dikenali. sehingga dapat dengan mudah diketahui lokasinya saat telah menemukan sekuens targetnya.Gambar 4. Dalam kondisi ini DNA probe akan berhibridisasi dengan kuat hanya dengan komplementer yang tepat. kira-kira satu kali dalam 250bp. Saat diwarnai dengan etidium bromida. Misalnya genom yeast dipotong dengan enzim EcoRI dan peneliti ingin mengetahui ukuran fragmen DNA yang mengandung gen yang diinginkan. enzim lain seperti EcoRI. Proses perpasangan basa antara polinukleotida utas tunggal yang komplementer disebut hibridisasi. DNA probe harus dilabel. Pemotongan DNA dengan EcoRI menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran yang bervariasi Enzim restriksi jenis lain seperti Sau3A1 yang ditemukan pada bakteri Staphylococcus aureusmengenali sekuens teramerik (4bp) dengan urutan 5′-GATC-3′ sehingga enzim ini memiliki frekuensi yang lebih tinggi dalam memotong DNA. Setelah DNA tertransfer pada membran. Banyak teknik yang tergantung pada ke-khas-an hibridisasi antara dua molekul DNA dari sekuens yang komplementer. Gel edirendam dalam larutan alkamli untuk mendenaturasikan double heliks. Teknik yang dianamakan Southern blot hybridization akan mengidentifikasi ukuran dari fragmen tertentu di antara smear DNA. tetapi juga pada pada struktur hasil produk pemotongannya. satu molekul adalah ‘probe’ dari sekuens tertentu (dapat berupa sekuens yang dimurnikan atau molekul DNA yang disintesis secara kimia. Sebagai contoh. Gambar 5.

Gambar 6. . DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika. Hal ini menghasilkan koleksi vector dengan insert DNA yang berbeda (Gambar 8). Mengandung asal replikasi (origin of replication) yang memungkinkan DNA bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang. Kunci untuk menghasilkan molekul DNa rekombinan adalah enzim restriksi yang memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong dengan DNA lain. tetapi bukan E. fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar. Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu: 1. kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak. Misalnya plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI.sell ini disebut transforman. 2. Pada banyak kasus. sedang yang tidak membawa plasmid. Inang (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak DNA adalah bakteriE. Gambar 7. Kloning DNA dalam plasmid vektor Vektor dapat dimasukkan ke organism inang melalui transformasi Transformasi merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari lingkungan. coli dapat bersifat kompeten mengambil DNA melalui perlakuan dengan ion kalsium. Potongan DNA yang akan diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar 7). Untuk membuat perpustakaan DNA. Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya. Antibiotika kemudian ditambahkan dalam medium untuk menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid . Ukuran insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih dari satu megabase. maka vector disiapkan dengan memotongnya dengan Eco RI. Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah. E. Dengan menghasilkan molekul DNA rekombinan yang dapat diperbanyak pada organisme inang. Beberapa bakteri. Mengandung marker selektif yang menyebabkab sel yang membawa vector (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi 3. DNA target dipotong dengan enzim restriksi yang memberikan ukuran rata-rata insert yang diinginkan. Memiliki situs yang unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi. Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid. Kloning DNA dalam plasmid vektor DNa dipotong dengan enzim restriksi. Proses ini melibatkan vektor yang menjadi sarana DNA untuk memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada medium. Perpustakaan molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning Perpustakaan DNA merupakan populasi vector identik yang masing-masing berisi insert yang berbeda. tidak dapat tumbuh (Gambar 7). coli. Hasil probing DNA Kloning DNA Kemampuan molekul DNA membentuk rekombinan dan menjaganya dalam sel disebut kloning DNA. coli dapat mengambil DNA secara alami dan dikatakan memiliki kompetensi genetik. DNA yang telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang dipotong dengan enzim restriksi yang sama) dan ditambah ligase. Molekul ini biasanya ditemukan pada banyak bakteri.

Utas ganda DNA yang baru disintesis. membrane filter dengan positive charge digunakan untuk probing. Gambar 10 menunjukkan proses PCR. teknik ini telah melahirkan teknik PCR-based marker teknik lainnya yang sangat bervariasi. Filter yang mengandung sel diberi perlakuan yang memecah sel dan mengeluarkan DNA yang kemudian terikat pada filter pada lokasi yang sama dengan sel. PCR digunakan untuk mengamplifikasi bagian DNA yang pendek (sampai 10 kb). Membran ditekan di atas koloni dan cetakan koloni aakan berada pada membrane. cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi yang sama dan fragmen-fragmen hasilnya disambungkan ke dalam vector. Sejak ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983. Saat diberi perlakuan dengan reverse transcriptase. Proses ini disebut reverse transcription yang dilakukan oleh enzim reverse transcriptase (Gambar 9). Protokol dasar PCR adalah: I. Selanjutnya. proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada DNA genomic. didenaturasi pada suhu tinggi dan siklus berulang.Gambar 8. Ikatan preimer terjadi pada utas yang komplementer dengan cetakan pada daerah ujung batas sekuen DNA target. II. mRNA dikonversi menjadi kopi DNA utas ganda yang disebut cDNA (copy DNA). DNA utas tunggal yang pendek (disebut primer) berikatan dengan DNA cetakan pada temperature rendah. cDNA library akan memiliki ribuan insert yang berbeda dan masing-masing terdapat dalam vektot umum. DNA utas ganda didenaturasi pada suhu 95C sehingga membentuj DNA utas tunggal yang berfungsi sebagai cetakan. Gambar 9. sel ditumbuhkan dalam cawan petri dalam media agar. ‘cDNA library’ dikembangkan untuk memperkaya ‘coding sequences’ dalam library. IV. III. Perpustakaan DNA yang paling sederhana dihasilkan dari DNA genomik total yang disebut dengan ‘genomic libraries’. Produk PCR diamati dengan gel elektroforesis dengan menggunakan gel agarose ataupun gel poliakrilamida dan diamati dengan uv-transiluminator. Proses penggunaan probe dengan DNA yang dilabel digunakan untuk melakukan screening terhadap library disebut colony hybridization. Selanjutnya dilakukan probing terhadap filter. cDNA library dibuat dengan menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA. Setelah transformasi ke dalam bakteri khusus yang cocok sebagai inang. Tiap sel akan tumbuh menjadi koloni dan tiap sel dalam koloni mengandung vector yang sama dan insert dari library. Filter selajutnya diinkubasi dengan probe. Pembentukan DNA library Berbagai perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari berbagai sumber. . PCR (polymerase chain reaction) PCR adalah sebuah teknik biologi molekuler untuk mereplikasikan DNA dengan menggunakan enzim Taq polimerase. Suhu ditingkatkan menjadi 72C sehingga enzim DNA polymerase dapat melakukan sintesis DNA membentuk utas ganda DNA baru. Pembentukan cDNA Hibridisasi digunakan untuk mengidentifikasi klon spesifik dari sebuah library Identifikasi fragmen dari sebuah gen di antara klon-kon dapat dilakukan dengan menggunakan DNA probe yang urutan DNAnya sesuai dengan sebagian dari urutan DNA gen yang diinginkan.

hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel. DNA plasmid. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel. dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol. RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA). Pertama. Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air. Untuk memisahkan DNA plasmid. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. RNA. Sumber DNA bisa dari tanaman. protein dan komponen lain. Proses ini membebaskan DNA kromosom. Supernatan yang mengandung DNA plasmid. DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Pada organisme tingkat rendah. sehingga yang tinggal adalah DNA. Isolasi DNA plasmid DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen. sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. atau sel manusia. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). . Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. kultur mikroorganise. Proses PCR Dasar Teori DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia. Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Isolasi DNA kromosom. DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein.Gambar 10.

Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002). Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Supaya hasil isolasi berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam . terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein. hanya sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung DNA. sel darah merah dan sel darah putih (dilapisan buffy coat) dengan teknik sentrifugasi. Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi memekatkan. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol. Lapisan kedua yang merupakan sel darah putih diambil dengan klinipette. Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. sampel darah total akan terbagi menjadi tiga lapisan. Setelah disentrifugasi. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi. Oleh sebab itu sampel darah total (whole blood) yang masih segar langsung dipisahkan menjadi serum. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193). Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA (ethyllenediamine tetraacetic). penghilangan protein dan RNA (cell digestion) dan pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. hewan dan tumbuhan) dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls). lapisan tengah berwarna putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat) dan lapisan bawah adalah sel darah merah. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. memisahkan DNA dari larutan. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). Pada manusia.Isolasi RNA RNA. isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. sehingga saat ini muncul berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. Atau RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia. Enzim RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung ependorf. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. mRNA eukariot dapat dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT. yaitu lapisan paling atas merupakan serum. dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). Agar lebih efisien. dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Berbagai teknik ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut.

RNA. Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan DNA bermuatan negatif. DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Pemilihan buffer tersebut dilihat dari kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik. selain itu pewarna ini digunakan untuk memudahkan meletakan contoh DNA ke dalam sumur dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Agar proses lisisnya bakteri sempurna maka larutan dibolak-balik secara halus.8. Elektroforesis memisahkan DNA. Akan tetapi pada beberapa kelompok pergerakan DNA tiadak dapat diamati. coli. Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan munculnya lendir. Sehingga pergerakan yang tinggi ini menunjukan ukuran DNA yang tidak terlalu besar. Hasil elektroforesis DNA total menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli yang kemungkinan adalah DNA plasmid (Gambar 1). kerapatan media gel yang dilalui DNA. Ciran DNA yang dihasilkan kemudina dipisahkan dari endapannya. DNA hasil elektroforesis yang terlihat di atas lampu UV dapat dilihat pergerakannya. Cairan ini ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA supaya hasil yang diisolasi berupa DNA murni. Nilai ini belim termasuk nilai DNA murni karena isolasi DNA murni nilainya lebih besar atau sama dengan 1.proses isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH berfungsi sebagai larutan pelisis. Hal ini dapat dilihat dari pergerakannya yang tinggi. Tingkat kemurnian DNA plasmid yang diisolasi dilihat dari nilai absorban pada panjang gelombang 260 nm dibadi nilai absorban pada panjang gelombang 280 nm. dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah.115. Sedangkan larutan C befrungsi untuk merenarutasikan kembali. Bakteri yang telah diendapkan tersebut kana lisis dengan penambahan larutan buffer. serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul DNA. . Kejadian ini dapat terjadi karena kesalahan teknis saat memasukan DNA ke dalam sumur gel agarose. Kuantifikasi DNA total dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm menunjukkan bahwa rendemen isolasi DNA konsentrasinya berkisar antara 19610 ng/ µL dan 19800 ng/ µL tiap 1500 µL bahan biakan E. Larutan A berfungsi sebagai resuspensi yaitu penggabunagn kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan. Bisa jadi DNA yang dimasukan tidak masuk benar-benar ke dalam sumur gel sehingga saat elektroforesis DNA tidak bergerak. Sehingga sumur tidak berisi DNA. Sebelum proses elektroforesis suspensi DNA dicampur dengan peyangga muatan berwarna loading dye. Larutan di vortex untuk memudahkan bakteri tersuspensi. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Penambahan warna ini berfungsi untuk menambah densitas sehingga DNA bearada di bagian bawah sumur. Plasmid merupakan DNA sirkuler yang ukurannya relatif kecil. Pergerakan DNA di agarose berhubungan dengan besar molekul. Selain itu kesalahan juga dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke dalam sumur tersedot kembali masuk ke dalam pipet mikro. Larutan ddH2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA yang dihasilkan didapat dengan konsentrasi yang cukup tinggi. Kemurnian DNA plasmid kelompok 8 menunjukan hasil sebesar 1. Selain itu larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein. Hal ini menunjukkan bahwa DNA total yang diisolasi mempunyai keutuhan yang tinggi.

Oleh karena itu. beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl . Teknik Isoalsi DNA Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase.Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel. khususnya plasmid. zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC). aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom. Langkah berikutnya adalah lisis sel. tekanan tinggi. . DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Dengan demikian. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Setelah sel mengalami lisis. sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan. sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi. Pertama. perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan. Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. remukan-remukan sel harus dibuang.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful