Relatório

Análise da ação do magnésio por controle da permeabilidade membranar
Docente:
Profº Dr. Joaquim A. F. Vicente

Discentes:
Delcides A. Moraes 2010156971 Isabella K. R. Dias 2010157022 Licenciatura em Biologia

Coimbra Dezembro de 2010

.................................................................................................................................................................................................................................3 Resultados e Registros ............................4 Discussão ..........9 Referências Bibliográficas ............................................6 Conclusão .....................2 Materiais e Métodos ........................................................Sumário Sumário Introdução ...................................10 1 ..................................

entre outras coisas. A cadeia respiratória é uma das etapas da respiração celular. através de indução da permeabilidade membranar por ação de um ionóforo. e está relacionado à produção de energia. É nessa organela que ocorre o processo conhecido como Cadeia Respiratória. É justamente nesta etapa da respiração que vamos realizar nossos estudos. Seus componentes estão localizados na crista mitocondrial e apresentam um complexo enzimático com três citocromos. a fim de perceber a importância de determinados cátions na fisiologia celular. De modo geral. 2 . seja. Entre essas organelas merecem destaque as mitocôndrias. Mais especificamente. e contribuindo assim para a obtenção de energia. Esse complexo é responsável pela oxidação da substância. poderemos avaliar a importância do Mg+2 para a fosforilação oxidativa. Para ser mais específico. Inúmeras organelas desempenham diversas funções que favorecem o desenvolvimento e manutenção dos organismos. a importância do magnésio na atividade de diferentes substratos da respiração mitocondrial e respectiva fosforilação oxidativa ou . pela oxidação de substâncias. Energia essa utilizada em inúmeros processos vitais. sua importância como agente que auxilia o desenvolvimento do potencial. através da permeabilidade membranar induzida. temos como objetivo para este ensaio a avaliação da importância fisiológica de um cátion.Introdução Sabemos que a estrutura celular é um tanto complexa em sua fisiologia. que são responsáveis.

Adiciona-se agora 1 M de Ionóforo A23187. Para cada ensaio é necessário a adição de 1.5 de tiamina pirofosfato). E por final. . .5 mM de Tiamina pirofosfato.1 M de succinato de K.100 mM de ATP.1 M de -cetoglutarato. . 2 mM de KH 2PO4. teríamos algumas complicações com a diminuição do potencial.5 mM de NAD+ + 0. 20 mM KCl.1 mM de A23187. . . Também se faz necessário a utilização de um sistema de medição de potencial elétrico ( ) mitocondrial com eletrodo de TPP +. Tudo isso em um pH neutro (em torno de 7).2).100 mM e 250 mM de MnCl2.05% BSA. 3 . 10 mM HEPES. Adicione 100 M de ADP. 2 mM KH2 PO4.5 mM de meio de reação com 250 mM de sacarose. 10 mM HEPES. 0. o meio de reação.3 a 0. (Observe o movimento de TPP+). ou 4 mM de -cetoglutarato + 50 M de ADP + 0. . 20 mM de KCl. Também foram utilizadas as seguintes soluções: .1 M de Citrato de K. com TPPCl (3 M) e a concentração de MgCl2 indicada para cada ensaio. -100 mM e250 mM CaCl2. uma vez que se fossem utilizadas mitocôndrias de fígado de ratos.2 mM ATP (MV) Adicionar 0.1 mM de TPP+.05% BSA. de tubérculo de batata ( Solanum tuberosum). no presente caso. e selecione uma sensibilidade de escala total correspondente a 20 ou 50 mV. 0. é necessário a utilização de mitocôndrias vegetais. (pH 7. Adiciona-se 10 mM de succinato (ou 4 mM de citrato +0. Adicione 0. (Verifique a sáda de TPP+ da mitocôndria devido a despolarização induzida pela fosforilação do ADP).200 mM de TPP. Deve-se verificar a acumulação eletroforética de TPP+ na mitocondria por energização mitocondrial.5 mg de suspensão mitocondrial Inicia-se então o movimento do papel do registrador (1 a 2 cm/m).100 mM de ADP. .100 mM e 250 mM de MgCl2.5 mM de NAD+ + 0. .200 mM de NAD+. devido ao transporte de cálcio.Materiais e Métodos Para a realização dos ensaios. (Verifique novamente a saída de TPP+ da mitocondria devido a despolarização induzida pela fosforilação do ADP). Nesse caso utiliza-se 250 mM sacarose. . Adiciona-se então 100 M de ADP. .

5 mM de MgCl2. e novamente a agulha desloca -se para a esquerda e depois de poucos segundos retorna à mesma linha. e iniciamos o registro. que se mant m constante at ent o. succinato. E com isso faz com a que a agul a rapidamente se desloque para a esquerda. Ao adicionar as mitocôndrias. a agul a do registrador se desloca rapidamente para a direita. Logo em seguida.R Registro com Magnésio (Mg+2) lt e Regi t Fig. 1 ± Registro obtido por utilização de eletrodo de TPP+ e representativo da atividade da ATP-sintetase em um meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de 0. Isso não provoca qualquer alteração no registro da agulha. adiciona solução de 50 mM de ADP. Novamente adiciona-se solução de 50 mM de ADP. ATP. adicionando mitocôndrias de batata. voltando logo em seguida à mesma linha de onde partiu. evidenciando a exist ncia de um -se potencial. 4 . Foram adi ionados TPP+ (4 mM de Mg . Adiciona agora o -se ionóforo A23187 (1 l).

que se deslocava no mesmo sentido. Entretanto. Adiciona-se ADP novamente. sem apresentar duas fases. e demorando um pouco mais para voltar à posição original. e a agulha novamente se desloca para a direita. TPP+. adicionamos ao final uma quantia Mg e verificou-se que a agulha. Agora foram adicionados um meio sem Mg+2. deslocou se drasticamente para a esquerda. Adicionam-se mitocôndrias. nada ocorre. entretanto de forma menos acentuada. ATP e succinato. 2 .Registro sem Magnésio (Mg+2) Fig.Registro obtido por utilização de um eletrodo de TPP+ e representativo da actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na ausência de MgCl2. porém. Adiciona-se ADP. e mais uma vez a agulha desloca-se para a esquerda. e inicia-se o registro. 5 . mesmo sendo um ensaio sem Mg+2. a agulha permanece no mesmo sentido. a agulha se desloca um pouco mais para a direita. Com a adição do ionóforo A23187.

Com a análise dos resultados obtidos podemos supor que ao ser adicionado o ADP ocorre uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial de forma rápida. aqui o desenvolvimento do potencial ocorre em uma única fase. que assim como a primeira. evidenciando a existência de um potencial. O eletrodo em questão mede a saída de TPP+ das mitocôndrias. Aqui. sendo portanto um pouco melhor. Nesse momento é possível verificar uma nova fosforilação oxidativa. Entretanto. acaba por inibir a atuação da ATP-sintetase. Isso traduz-se em uma fosforilação mais lenta. a agulha se desloca rapidamente para a direita. verifica-se. Ao adicionar ADP. assim como no caso anterior. mesmo após nova adição de ADP. porém menos que no caso anterior. e transferido ao meio. parte desse potencial é dissipado. Com a adição do ADP. e nehum vestigio inicial de Magnésio. ao contrário do que aconteceu no meio com Magnésio. após a adição das mitocôndrias. Em seguida. 6 . A partir disso. volta a ser o mesmo que antes da despolarização. e em poucos segundo. não notamos qualquer alteração evidente Para . A curva desloca-se rapidamente para a esquerda. ao adicionarmos as mitocôndrias. é possivel verificar que na ausencia de Mg2+ a taxa de fosforilação (TF) é menor que nos caso anterior. podemos supor que a atividade do ionóforo A23187. pois como a solução não possuia Mg+2. Por isso não causava movimentação de íons. indicando uma despolarização. uma vez que na ausência de Mg+2 o potencial não é afetado. A adição de A23187 provoca uma alteração no movimento da agulha que se desloca um pouco mais para a direita. ao adicionar 1µM de A23187 cuja função é retirar o magnésio que existe no interior da mitocôndria para o meio.Discussão Regi gnési g+2) Como já mencionado anteriormente. embora tenha sido exercida. Com isso. porém. o potencial obtido através do eletrodo de TPP+ não é um potencial elétrico. Dessa forma. Registro sem Magnésio (Mg+2) No caso do registro em meio contendo EDTA. não seja registrada uma nova fosforilação oxidativa. foi retirado grande quantidade de tal cátion do interior da mitocôndria. que a agulha se desloca para a esquerda. Possivelmente isso ocorre porque as quantias de Magnésio existente tanto internamente quanto externamente apresentavam certa equivalencia. e com base nos cálculos posteriores. a agulha indica o desenvolvimento de um potencial. mas o deslocamento da agulha para a direita deixa claro que o potencial perdido está sendo recuperado. comprovar que a atividade foi realizada com sucesso adicionou-se novamente o ADP. Há a queda do potencial por alguns instantes. não apresentou resultados evidentes. ocorre de forma rápida. conseguimos ver a atuação do ionóforo representada no papel. fazendo com que.

indicando uma fosforilação. era responsável pela ausência de fosforilação. como por exemplo. podemos pressupor algumas informações. (50 X 3 = 150 nMoles). Neste caso temoso seguinte quadro: 50 mM 50 M 50 nM 1L 1 ml 1 l Logo.Tomaremos por base de nossos cáculos a seguinte equação: Taxa de Fosforilação = Concentração de ADP Unidade de Tempo . uma concentração de 150 nMoles. são 50 nM em 1 l. nesse caso a falta dele. Cal lando as Taxas de Fosforilação Como já mencionado anteriormente. Essa adição imediatamente foi traduzida como um rápido deslocamento da agulha. a fosforilação é menos favorecida.Então. de que na ausencia de magnésio. uma vez que a unidade padrão para l é nM. adicionamos tal íon ao meio. temos de transformar mM em nM. A partir dessa informaçõa podemos calcular o tempo de cada fosforilação. resultando para o ADP. e aplicando regra de três: 7 . através de análises dos registros. Em 3 l serão tres vezes mais. . Entretanto. com o intuito de mostrar que o magnésio. medindo no registro a distancia entre o seu começo e o seu fim.Foram adicionados 3 l de ADP a 50mM. Agora vamos demosntrar os cálculos que nos confirmam tais suposições: Algumas considerações para o cálculo da TF do ADP.O papel correu com velocidade de 2cm/minuto. .

6 minutos TF2 = 150 nMoles. na segunda adição de ADP.6 minutos TF2 = 250 nMoles. Logo. uma vez que há uma menor taxa de fosforilação se comparada à um meio com o mesmo íon. TF 3: 2.4 minutos TF3 = 150 nMoles.mg-1 de proteína / minuto TF2 = 250 nMoles.mg-1 de proteína / 0. a fosforilação oxidativa é reduzida. +2 8 . refernte ao ensaio em meio com Magnésio. mg-1 de proteína / minuto TF 2: 1. mg-1 de proteína / minuto TF 4: TF4 = 0.5 cm (15mm) 20mm ² 1 minuto 15mm ² x x= 0. podemos confirmar que na ausência de Mg . com bases nos cálculos acima.75 minutos TF1 = 150 nMoles. pois não houve fosforilação no segundo registro.mg-1 de proteína / 0.75 minutos TF1 = 200 nMoles.4 minutos TF3 = 107 nMoles. mg-1 de proteína / minuto TF1 = 200 nMoles.mg-1 de proteína / 1. mg-1 de proteína / minuto Nota: TF1 e TF2 estão contidas no registro apresentado na figura 1.8 cm (28mm) 20mm ² 1 minuto 28mm ² x x= 1.TF 1 : 1.2 cm (12mm) 20mm ² 1 minuto 12mm ² x x= 0.mg-1 de proteína / minuto TF3 = 107 nMoles.

Conclusão A partir dos ensaios realizados. Quando está em baixa quantidade dentro da célula. Sua presença esyá associada à taxas mais altas. altera o funcionamento da ATP-sintetase. podemos concluir que de fato o magnésio tem um papel importante no processo de respiração celular. 9 . uma queda no processo de fosforilação oxidativa das substâncias. especificamente na taxa de fosforilação. ocasionando por isso. enquanto que sua ausência se relaciona a taxas menores. mais especificamente na mitocôndria.

vol 34. Anibal Eugênio. 16-23. Vercesi. Joaquim A. Protocolo Prático: Análise da acção do magnésio por controlo da permeabilidade membranar (eletrodo de TPP+). Mitocôndrias: ATP.Referências Bibliográficas Vicente. nº 199.. Nota: Foram utilizados ainda para elaboração do presente relatório. Novembro de 2003. pág. Calor e Morte Celular in Ciência Hoje. os apontamentos de aulas ministradas e de aulas em laboratórios. F. 10 .

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