UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS PROGRAMA DE PESQUISA EM NEUROCIÊNCIA BÁSICA E CLÍNICA

Efeito da terapia com células mesenquimais em tubo de policaprolactona na regeneração de nervo mediano de camundongos.

Ana Maria Blanco Martinez I Simpósio de Reabilitação Locomotora: da bancada ao leito
25-26 de Novembro, UFRJ

OS NERVOS PERIFÉRICOS SÃO RESPONSÁVEIS PELA CONEXÃO ENTRE O CORPO, ENCÉFALO E MEDULA ESPINAL

SEM OS NERVOS PERIFÉRICOS NÃO HÁ MOVIMENTO, NÃO HÁ SENSIBILIDADE...

OS NERVOS PERIFÉRICOS SÃO FREQUENTEMENTE ACOMETIDOS POR DIVERSAS PATOLOGIAS. APESAR DISSO, ESSAS PATOLOGIAS NÃO SÃO AMPLAMENTE CONHECIDAS OU ENTENDIDAS POR PACIENTES, PROFISSIONAIS DA ÁREA DE SAÚDE OU NEUROCIENTISTAS !!

NERVO PERIFÉRICO- estrutura e função

Adaptado a partir de Krstić, 1988.

• Lesão
• Degeneração Walleriana
Injúria – influxo de cálcio - proteases – desintegração do citoesqueleto. Células de Schwann detectam e fagocitam restos axonais e mielínicos, desdiferenciam, formam agregados tubulares e, uma vez que contactam o axônio, começam o processo de remielinização.

Lesões do plexo braquial são muito comuns, correspondendo a mais de 73,5% das lesões nervosas, acarretando transtornos diversos.

Retirado de Gordon et al., 2003.

Será que a recuperação funcional sempre acontece???

Adaptado a partir de NETTER, Frank H. Atlas de anatomia humana, segunda edição, Porto Alegre, Artmed, 2000.

• ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS
Neurorrafia

-

-

Aloenxerto

-

Autoenxerto

-

Tubulização

-

Terapia Celular

• ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS

-

Neurorrafia

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Aloenxerto

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Autoenxerto

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Tubulização

-

Terapia Celular

• ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS

-

Neurorrafia

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Aloenxerto

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Autoenxerto

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Tubulização

-

Terapia Celular

INTRODUÇÃO

• ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS

-

Neurorrafia

-

Aloenxerto

-

Autoenxerto

-

Tubulização

-

Terapia Celular

Tubo de Policaprolactona (PCL)
- Sintético

-Biodegradável

-Bom substrato para adesão, sobrevivência, diferenciação e migração de células de Schwann

Células - Tronco mesenquimais
- Multipotentes

- Extraídas do estroma da medula óssea

Tubo de Policaprolactona (PCL)
- Sintético

-Biodegradável

-Bom substrato para adesão, sobrevivência, diferenciação e migração de células de Schwann

Células - Tronco mesenquimais
- Multipotentes

- Extraídas do estroma da medula óssea

Células Mesenquimais
- Se diferenciam em: Osso Cartilagem Músculo Tecido adiposo Linhagem neural

• Células Mesenquimais - Se diferenciam em:
Osso Cartilagem Músculo Tecido adiposo Linhagem neural

- Secretam diversos fatores tróficos;

- Podem ser facilmente obtidas, isoladas e expandidas em cultura;

- Possuem efeitos parácrinos e comportamento migratório;

- Questões éticas mais favoráveis e não apresentam risco de tumorigênese;

- Transplante autólogo

• Células Mesenquimais - Se diferenciam em:
Osso Cartilagem Músculo Tecido adiposo Linhagem neural

- Secretam diversos fatores tróficos;

- Podem ser facilmente obtidas, isoladas e expandidas em cultura;

- Possuem efeitos parácrinos e comportamento migratório;

- Questões éticas mais favoráveis e não apresentam risco de tumorigênese;

- Transplante autólogo

• Células Mesenquimais - Se diferenciam em:
Osso Cartilagem Músculo Tecido adiposo Linhagem neural

- Secretam diversos fatores tróficos;

- Podem ser facilmente obtidas, isoladas e expandidas em cultura;

- Possuem efeitos parácrinos e comportamento migratório;

- Questões éticas mais favoráveis e não apresentam risco de tumorigênese;

- Transplante autólogo

• Células Mesenquimais - Se diferenciam em:
Osso Cartilagem Músculo Tecido adiposo Linhagem neural

- Secretam diversos fatores tróficos;

- Podem ser facilmente obtidas, isoladas e expandidas em cultura;

- Possuem efeitos parácrinos e comportamento migratório;

- Questões éticas mais favoráveis e não apresentam risco de tumorigênese;

- Transplante autólogo

• Células Mesenquimais - Se diferenciam em:
Osso Cartilagem Músculo Tecido adiposo Linhagem neural

- Secretam diversos fatores tróficos;

- Podem ser facilmente obtidas, isoladas e expandidas em cultura;

- Possuem efeitos parácrinos e comportamento migratório;

- Questões éticas mais favoráveis e não apresentam risco de tumorigênese

- Transplante autólogo

• Células Mesenquimais - Se diferenciam em:
Osso Cartilagem Músculo Tecido adiposo Linhagem neural

- Secretam diversos fatores tróficos;

- Podem ser facilmente obtidas, isoladas e expandidas em cultura;

- Possuem efeitos parácrinos e comportamento migratório;

- Questões éticas mais favoráveis e não apresentam risco de tumorigênese;

- Transplante autólogo.

Objetivo - Analisar a regeneração do nervo mediano de camundongo após secção e tubulização com o biopolímero PCL contendo ou não células-tronco mesenquimais.

Cultura de células-tronco mesenquimais
Black6/c57 GFP+ Cultura Primária Extração das células (5 x 107 células) (fêmur e tíbia)

Remoção das células não aderidas Confluência Terceira passagem
Tripsinização

Enxerto das MSCs (1 x 105 cél/2µL)

Caracterização morfológica das células mesenquimais

Procedimento cirúrgico
30 camundongos black6/c57. Os animais foram anestesiados, tiveram o nervo mediano exposto e transeccionado ao nível da porção média do bíceps braquial.

Retirado de Ronchi et al., 2008. Barra de escala= 300 µm.

Tubulização
Imagem do tubo de PCL, após tubulização no nervo mediano (A). Ilustração da tubulização e dos segmentos proximal (1), médio (2) e distal (3) analisados após oito semanas de procedimento (B). • Barra de escala 1mm.

Grupos
-Tratado lesão e tubulização mesenquimais em DMEM (n=10) com células-tronco

-Controle

lesão e tubulização com DMEM (n=10)

-Normal

sem lesão nem tratamento (n=10)

Após 8 semanas

perfundidos segmentos 1, 2 e 3 coletados

Análise funcional
Aparato do teste funcional (grasping test), o qual consiste de uma grade com quatro pontos de apoio sobre uma balança digital. Um peso é deixado sobre a grade e a função tara da balança o anula, permitindo a leitura da força de tração que o animal desempenha ao agarrá-la.

Análise funcional – Grasping test
Análise funcional semanal dos grupos controle e tratado, através do grasping test. • N=9, **P<0,01.

Análise do peso do músculo flexor dos dedos
Análise do peso do músculo flexor dos dedos dos grupos normal, controle e tratado, após oito semanas de pós-operatório. • N=10, P=0,08.

Medida do conteúdo de creatina fosfocinase total do músculo flexor dos dedos
Análise dos níveis de creatina fosfocinase no músculo flexor dos dedos nos grupos normal, controle e tratado após oito semanas de pós-operatório. • N=9, P<0,05.

Microscopia eletrônica de varredura
Eletromicrografias de varredura evidenciando o tubo de PCL intacto, numa perspectiva transversal (A, A’ e A’’), mostrando as características da parede do tubo, e suas superfícies externa (B, B’ e B’’) e interna (C, C’ e C’’) em três aumentos diferentes.
Parede do tubo Superfície externa Superfície interna

Análise temporal do grau de degradação do tubo de PCL
Eletromicrografias de varredura evidenciando cortes transversais do segmentos1 (A-E’) e 2 (F).

Microscopia de luz
Micrografias de luz evidenciando cortes transversais semi-finos corados com azul de toluidina de nervo do grupo normal (A e B) correspondentes aos segmentos 2 e 3 do tubo dos grupos controle (C e D) e tratado (E e F). • Barra de escala 20 μm.

Microscopia de luz
Micrografias de luz de cortes tranversais semi-finos corados com azul de toluidina dos nervos dos grupos controle e tratado, nos segmentos 2 (A e C) e 3 (B e D) do tubo.

Barra de escala 10 μm.

Quantificação dos vasos sanguíneos
Quantificação de vasos sanguíneos no nervo dos grupos controle e tratado no segmento 2 do tubo. • N=10, P<0,05.

Microscopia eletrônica de transmissão

Micrografias eletrônicas de transmissão de cortes tranversais ultra-finos (70nm) dos nervos dos grupos controle (A) e tratado (B), no segmento 2 do tubo.

Visualização de células GFP+ e imuno-marcação para células de Schwann
Micrografias de fluorescência de corte transversal de nervo mediano

Conclusões O tubo de policaprolactona mostrou-se um bom substrato para crescimento linear e organizado do nervo em regeneração. As células-tronco mesenquimais implantadas no tubo de policaprolactona foram capazes de melhorar a função preênsil, prevenir uma diminuição da atividade do músculo flexor dos dedos e aumentar o número de vasos sanguíneos e de fibras mielínicas em camundongos após lesão traumática de nervo mediano. Em alguns casos, essas células se transdiferenciaram em células de Schwann.

Obrigada!

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