Modelos experimentales de enfermedades metabólicas: Porfiria y Síndrome Metabólico. Proteómica y Metabolómica de estos disturbios.

Alumnos: Duperron y Mauro Elencwagj ORT 1, 6º Química Investigadores: Marta Mazzetti y Laura Matkovic’ Laboratorio de Disturbios Metabólicos por Xenobióticos, Salud Humana y Medio Ambiente (DIMXSA) Departamento de Química Biológica Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires Ciudad Universitaria

Introducción al proyecto final
El organismo está sujeto a continuas situaciones de estrés, tanto por su defensa contra la acidosis proveniente del metabolismo como debido a causas exógenas como son los tóxicos. El presente plan abordará el estudio de estos tipos de estrés en varios modelos experimentales: ratas tratadas con hexaclorobenceno y alil-isopropilacetamida (AIA)/3,5dietoxi-carbonil-1,4-dihidrocolidina (DDC), que mimetizan cuadros de porfiria crónica y aguda respectivamente y ratas con acidosis como modelo experimental de estrés metabólico. En ellos estudiaremos diferentes metabolismos como el de los hidratos de carbono, tratando de explicar el conocido “efecto glucosa” sobre la enzima 5-aminolevulínico-sintetasa (ALA-S), y de indoles a partir de triptofano, investigando a nivel molecular las modulaciones ejercidas sobre enzimas claves regulatorias y las alteraciones producidas por el estrés toxico sobre el nivel de varias hormonas (glucagón insulina, corticosterona, adrenalina y noradrenalina). Investigaremos el rol de los glucocorticoides y la regulación de su actividad, precisamente esta última está involucrada en el desarrollo de enfermedades como el Síndrome Metabólico y afectarían también la condición y sintomatología de los pacientes con porfiria. Asimismo, se evaluará la importancia que el estrés oxidativo tiene en estas patologías, analizando la actividad de enzimas antioxidantes y diferentes biomarcadores de daño a macromoléculas (lípidos, proteínas y DNA). Modelos experimentales de porfiria Se trabajará con varios modelos experimentales de porfiria mediante la administración de drogas porfirinogérnicas: las inducidas por AIA + DDC ó modelos agudos y la producida por la administración de HCB (modelo de PCT ó modelo crónico) a distintos tiempos y dosis de las drogas porfirinogénicas. Modelos experimentales de estrés Se trabajará en dos modelos experimentales de estrés producido en ratas machos, Sprague-Dawley, por cánula y por acidosis clorhídrica (Igarreta y col. 1999, Zallocchi y col. 2004, Altuna y col. 2006). Se respetarán las normas internacionales del uso y cuidado de animales de laboratorio (Guide for Care and Use of Laboratory Animals, National Research Council, USA, 1996, and the Council of the European Communities Directive, 86/609/ECC) y se usarán guantes y barbijos para el preparado y administración de las drogas. Objetivos generales del proyecto subsidiado por UBACyT : -Ahondar en los estudios bioquímicos, metabólicos, hormonales y moleculares en modelos experimentales de toxicidad, investigando las alteraciones producidas por drogas porfirinogénicas (estrés toxico-oxidativo) o por acidosis (estrés acídico y por cánula) sobre caminos metabólicos tales como los de hidratos de carbono y el de triptofano a indoles, investigando su relevancia en la terapéutica y la sintomatología clínica de las porfirias y del Síndrome Metabólico. Evaluar especialmente la contribución y

mediación de los glucocorticoides activos, a través de su impacto en los caminos metabólicos del hemo y de los hidratos de carbono. Nuestros objetivos como estudiantes de ORT serán: -Abordar una de las líneas de investigación en la que se analiza el daño producido por estrés en modelos de porfiria en relación a la actividad de enzimas claves de la gluconeogenesis como la fosfoenolpiruvatocarboxiquinasa (PEPCK), de la glucógenolisis como la glucógeno fosforilasa (GP) y los niveles de hormonas regulatorias de estos metabolismos. Así, mediremos sus actividades y la concentración de metabolitos biomarcadores de porfiria tales como ácido 5-aminolevulínico (ALA), porfobilinógeno (PBG) y porfirinas hepáticas, es decir que estableceremos un perfil metabólico de la enfermedad. En otras palabras, nos acercaremos a determinar un a descripción metabólica de la patología. -Analizar estructuralmente a la porfobilinógeno deaminasa (PBG-D), enzima clave en las porfirias agudas. Se la caracterizará determinando sus parámetros moleculares (peso molecular, presencia de subunidades, forma de la molécula nativa, radio de Stokes) y se analizará su composición aminoacídica. También se analizarán las proteínas hepáticas de hígado normal y porfírico haciendo electroforesis bidimensional y con ello nos acercaremos al campo de la Proteómica. -Con respecto a la PEPCK, se la estudia genéticamente, para lo cual se requiere su amplificación por PCR. Esto último es una aproximación al campo de la Genómica. Las distintas actividades se completarán con prácticas virtuales y mostraciones de técnicas. -Se realizará con los alumnos una visita al Centro de Estudios Químicos y Biológicos por Espectrometría de Masa MALDI-TOF (CEQUIBIEM) depende de dos universidades nacionales (UBA-UNLP), con sede propia en la FCEyN de la UBA En la Fig. 1 y 2 se representan los caminos metabólicos a los que pertenecen las enzimas en estudio

Fig. 1: Biosíntesis del hemo

Fig. 2: Gluconeogenesis y glucólisis

Estado actual del conocimiento sobre el tema El estrés es uno de los desencadenantes principales de enfermedades de diversos tipos como hipertensión, depresión, alteración del metabolismo, diabetes, dislipemias, alteraciones vasculares, porfirias agudas etc. Las porfirias denominadas agudas o inducibles son enfermedades genéticas y pueden presentar ataques agudos desencadenados por factores diversos que generan la de-represión de la enzima ALA-S (Kappas y col. 1995). El ALA por semejanza con el ácido 5-aminobutirico (GABA), es un compuesto neurotóxico que produce en estos pacientes serios problemas neuropsiquiátricos y abdominales, llegando en muchos casos al coma y a la muerte (Emmanuelli y col. 2001). En la literatura se ha reportado que la acumulación de ALA es tóxica ya que produce especies reactivas de oxígeno (ROS) (Bechara, 1996, Karbownik y col. 2000). Se ha informado que las ROS son capaces de oxidar ácidos nucleicos, proteínas, lípidos y carbohidratos, afectando e inactivando funciones claves para la célula (Costa y col. 2002). El daño oxidativo a nivel de proteínas involucra la oxidación de las cadenas laterales aminoacídicas, la fragmentación y el entrecruzamiento (Costa y col. 2002). Para la transcripción de PEPCK se ha reportado un factor NF-1 sensible al estrés oxidativo (Morel y Barouki, 1998). El ALA también es productor de radicales libres y genera estrés oxidativo. AIA y DDC, son compuestos que utilizados solos o en forma combinada generan modelos experimentales de porfiria aguda que se asemejan a la porfiria, de allí su importancia. Recientemente hemos demostrado, en el modelo experimental AIA/DDC, un bloqueo gluconeogénico a nivel de PEPCK y glucogenolítico a nivel de la glucógeno fosforilasa (GP). Si bien se han involucrado parcialmente a las ROS en estos disturbios (Lelli y col. 2005), es importante evaluar la contribución de los glucocorticoides, del glucagon y de la insulina, teniendo en cuenta que estas hormonas regulan el metabolismo hidrocarbonado. Por otra parte el modelo experimental más usado de la porfiria cutánea tarda (PCT), la porfiria crónica con mayor incidencia en la población mundial, es el inducido en ratas por acción del hidrocarburo policlorado hexaclorobenceno (HCB). Este funguicida produce una porfiria experimental semejante a la PCT humana en distintos tipos de animales (San Martín de Viale, 1970). El HCB es un disruptor endócrino, metabólico y hormonal. Altera: el metabolismo del hemo generando una porfiria, el metabolismo de los hidratos de carbono (Mazzetti y col., 2004; Taira y col. 2004), el de lípidos (Billi de Catabbi y col. 2005), de ciertos aminoácidos (Llambías y col. 2003), el estado de óxido reducción celular y el metabolismo hormonal (Lelli y col. 2004, 2007). La glucosa reprime la inducción del ALA-S, es decir, modula la porfiria (Tschudy y col. 1964) y nuestro grupo ha reportado que el HCB produce un bloqueo gluconeogénico y glucogenolítico, altera la captación de glucosa y los niveles plasmáticos de insulina (Mazzetti y col 2004; Taira y col. 2004). y que dietas ricas en hidratos de carbono suprimen la producción de porfiria por HCB, efecto que es mas marcado en dietas con glucosa (Ivanov,y col. 1976). Se sugirió un rol de las ROS producidos por HCB en el descenso de la actividad de la enzima PEPCK y por lo tanto en el bloqueo gluconeogénico que este pesticida produce. Así se han postulado varios puntos de acción

para estos radicales: a nivel de la proteína enzimática, a nivel de DNA y a nivel de factores de trascripción (Mazzetti y col. 2004). Datos recientes obtenidos en nuestro laboratorio demuestran una disrupción hormonal de glucocorticoides (GC) en este modelo experimental de porfiria a nivel circulatorio, hepático y adrenal. Con una disminución de niveles plasmáticos de corticosterona, en sus receptores hepáticos y en sus niveles en adrenales. Se ha postulado que las alteraciones provocadas por el HCB en el metabolismo de los glucocorticoides jugaría un rol en el bloqueo de la PEPCK en esta PCT experimental. (Lelli y col. 2007). Los corticosteroides están involucrados, entre otros, en la respuesta del organismo al estrés, principalmente debido a un aumento de su secreción y al efecto de las 11β-Hidroxiesteroide deshidrogenasas (HSDs) localizadas en órganos efectores La activación de la isoforma HSD1 “in vivo” aumenta la oferta de glucocorticoides activos, mientras que la de la isoforma 2 (HSD2) la disminuye. Considerando que los glucocorticoides: 1) regulan la actividad de la tirosina aminotransferasa (TAT) (Kido y col. 1987 ) de la PEPCK (Petrescu y col.1979) y de la triptofano pirrolasa (Knox ,1951; Badawy y Evans, 1977) enzima involucrada en la degradación de triptofano a quinurenina; 2) que el triptofano y sus metabolitos inhiben la gluconeogénesis; 3) que la HSD1 aumenta la oferta de glucocorticoides activos, es interesante estudiar en el modelo de PCT crónico, inducido por HCB, y en los modelos de porfirio aguda, cómo están afectadas la triptofano pirrolasa, la TAT, la HSD1 y la PEPCK y si estas alteraciones están correlacionadas. Debido a que la HSD1 está ampliamente distribuidas en el organismo: SNC, hígado, tejido adiposo, pulmón y tejido vascular. (Stewart y Krozowski, 1999), su activación potencia la función de los corticoides en esos tejidos. El efecto del estrés sobre la regulación de las actividades de las HSDs y los mecanismos involucrados en esta regulación han sido investigados entre otros, por nuestro grupo de trabajo. En los mismos observamos que el estrés actúa inhibiendo la HSD2 renal permitiendo la unión de la corticosterona al receptor a aldosterona y produciendo hipertensión arterial (Igarreta y col. 1999). La isoforma HSD1 fue la primera encontrada, la importancia de la actividad de la misma y su función en la regulación del metabolismo del organismo está siendo estudiada y discutida actualmente (Tomlinson y col. 2004). Probablemente debido a la variedad de especies y tejidos en los cuales se desarrollan las investigaciones y a la gran cantidad de sustancias encontradas en la regulación de la HSD1, los resultados no son aun concluyentes (Seckl y Walker 2001). Sin embargo, todos coinciden en una premisa y es que la actividad de la HSD1 está involucrada en el desarrollo del Sindrome Metabólico, que produce cada vez con más frecuencia y en personas más jóvenes disminución de la calidad de vida y aumento de la mortalidad (Sapolsky y col. 2000, Paterson y col. 2004, Rask y col. 2002). En esta última década se han replanteado los mecanismos por los cuales los glucocorticoides influencian la respuesta al estrés, una interesante revisión ha sido realizada por Sapolsky et al. (Sapolsky y col. 2000). Además de lo detallado nuestro grupo observó que el estrés, producido por acidosis, producía un aumento de la actividad de la HSD1 hepática

acompañada alteraciones metabólicas, aumento de la PEPCK, de la glucemia y disminución del glucógeno hepático (Altuna y col. 2006). ¿Qué son los “omas”? El conocimiento de la secuencia génica y la composición nucleotídica de los genes está abriendo caminos insospechados poco tiempo atrás, acerca de numerosos procesos patológicos, así como andariveles casi increíbles en el camino de la prevención y curación de las enfermedades, el conocimiento de la genómica funcional abre el camino para la investigación sobre un grupo particular de los así denominados "omas", ellos son el genoma, transcriptoma, proteoma y metaboloma. ( ver tabla abajo) Nivel de análisis GENOMA Definición Conjunto completo de genes de un organismo o sus organelas Método de análisis Secuenciación sistemática del ADN Hibridización. SAGE (serial analysis of gene expresion)

Conjunto completo de moléculas de ARN TRANSCRIPTOMA mensajero presentes en una célula, tejido u órgano. PROTEOMA Total de moléculas proteicas presentes en una célula, tejido u órgano. Conjunto completo de metabolitos (intermediarios de bajo peso molecular) en una célula, tejido u órgano.

Electroforesis bidimensional. Espectroscopía con luz infrarroja. Espetrometría de masa. Espectrometría con resonancia nuclear magnética.

METABOLOMA

Proteoma El proteoma se define como la totalidad de las proteínas específicas complementarias al genoma tanto temporalmente como por el tipo de célula. Esto incluye todas las proteínas que se expresan en una célula en un determinado momento, ya sean las isoformas como las proteínas modificadas. Su complejidad es extraordinaria si se supone que en la especie humana hay 45.000 genes, y que cada RNA transcrito puede sufrir uniones alternativas, y cada proteína codificada puede sufrir modificaciones post-traduccionales. Es posible, por tanto, que el proteoma de cada individuo independiente, retratado en un momento particular de su vida, tenga una complejidad de dos a tres órdenes de magnitud superior a la del genoma. De hecho se estima que el proteoma completo de la especie humana podría estar constituido por 108 cadenas polipeptídicas.

El conocimiento del proteoma constituye uno de los desafíos más importantes de la era post-genómica. A diferencia del genoma, el proteoma presenta una gran variabilidad -estructural y funcional-, que depende del individuo considerado, de su estado de desarrollo, del tejido estudiado, e incluso de las condiciones ambientales. El análisis de dicha variabilidad está cobrando cada vez mayor interés, debido a que está asociada tanto al funcionamiento normal del organismo, como a muchas de sus patologías. Los principales mecanismos generadores de dicha variabilidad son tres:  el splicing alternativo del mRNA  las modificaciones postraduccionales  los SNPs ("single nucleotide polymorphisms") Aunque la aproximación experimental al estudio de la variabilidad del proteoma facilita una información de gran calidad, de momento se ha ceñido al estudio de sistemas específicos. Frente a esta situación, la bioinformática puede proporcionar una aproximación original a este problema, al permitir realizar un análisis sistemático del amplio volumen de datos disponible. Así la bioinformática permitirá racionalizar y sintetizar los resultados de los estudios experimentales, la información sobre el genoma humano y de otros genomas, la enorme colección de datos sobre SNPs, la información estructural sobre proteínas, los datos sobre patrones de splicing alternativo, y las bases de datos de patologías asociadas a mutaciones. Considerando esta gran complejidad, está claro que el científico, hoy en día, necesita tener a disposición un amplio abanico de instrumentación para separar e identificar cada proteína del proteoma de cualquier organismo. Entre los más antiguos y populares, también en nuestros días, está la clásica electroforesis bidimensional que consta de un isoelectroenfoque como primera dimensión, que discrimina en base a la carga superficial, y un SDSPAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida saturados de docecilsulfato sódico) como segunda dimensión, que separa en base a la masa. A esta metodología se le han sumado, en los últimos años, métodos cromatográficos bidimensionales, que en general combinan cromatografía de intercambio iónico y de interacción hidrofóbica (con diversas variantes, dado que se pueden utilizar múltiples procesos cromatográficos, como quelación de metales, exclusión molecular, chromatofocusing, resinas de fosfato cálcico, etc., sin considerar las resinas basadas en la bioafinidad). Estas últimas metodologías pueden incluso hibridarse, p.ej. el eluído de una columna de RP-HPLC acoplada con la electroforesis capilar. Por último, no podemos olvidar los chips de proteínas que pueden constituir interesantes superficies de captura de marcadores en líquidos biológicos para un rápido diagnóstico en bioquímica clínica. Estos chips de proteínas no llegan a alcanzar los sistemas variados y complejos de los chips de ADN, donde es posible mostrar simultáneamente miles y miles de genes diferentes, cosa que es impensable para los chips de proteínas de hoy en día. Sin embargo, el análisis proteómico actual, no avanzaría mucho si sólo dependiera de los instrumentos anteriormente mencionados. De hecho, ya en 1975 O’Farrel perfeccionó bastante los geles 2-D, pero se avanzó muy poco

debido a la falta de medios tanto para el análisis cuantitativo como cualitativo. La identificación de la proteína o proteínas contenidas en un punto electroforético o en un pico cromatográfico necesita de ulteriores técnicas que son independientes de la separación. La proteómica moderna es en realidad un conjunto de al menos tres disciplinas diferentes, que contribuyen por igual a la solución de problemas complejos, siendo estas:  Metodologías de separación: tanto las enumeradas anteriormente como las futuras.  Espectrometría de masas: técnica indispensable para el reconocimiento de las cadenas polipeptídicas eluídas de los geles 2-D, cromatografía bidimensional, chips de proteínas, etc.  Bioinformática: instrumento en continua evolución, con creación de buscadores, bancos de datos y métodos de screening cada vez más avanzados en la identificación de proteínas de cualquier origen. La bioinformática, es un instrumento fundamental para conectar las bases de datos de proteínas y genes Estas tres disciplinas contribuyen por igual al análisis proteómico y por tanto, tienen que estar a disposición en los laboratorios ligados al proteoma. La Proteómica de expresión involucra el análisis global de cambios en la expresión de proteínas durante un proceso biológico o una enfermedad. La interactómica permite estudiar las interacciones proteína-proteína e identificar miembros de complejos funcionales, caminos de señalización, análisis de redes de proteínas e Interacciones proteínas-pequeñas moléculas y unión proteína-droga

Introducción a la Metabolómica La Metabolómica es el estudio de todos los metabolitos, encontrados en muestras biológicas tales como células, fluidos biológicos o tejidos. Estas pequeñas moléculas son el producto del metabolismo e incluyen, por ejemplo, azúcares (o carbohidratos), grasas (o lípidos) y aminoácidos. La colección de todos los metabolitos dentro de una célula se llama el metaboloma. Los científicos han comenzado a caracterizar al metaboloma con el fin de comprender mejor y diagnosticar a las enfermedades.

La metabolómica incorpora el uso de la bioinformática, es decir, la aplicación de las computadoras u ordenadores y de las técnicas estadísticas en la comprensión y el manejo de información biológica, con el fin de buscar patrones únicos de metabolitos que pueden ser indicadores de una enfermedad en particular.

 La metabolómica es un acercamiento multidisciplinario que involucra a biólogos, computadores científicos y químicos analíticos. Las herramientas usadas para medir a los metabolitos se asocian comúnmente con los laboratorios químicos, e incluye a la espectroscopia por medio de la resonancia magnética nuclear (RMN) y la espectrometría de masa.

La ventaja de la metabolómica para el diagnóstico de las enfermedades, radica en el hecho de que este acercamiento mide el fenotipo de un organismo, es decir, las características biológicas de un organismo, que resultan de la interacción de su paquete genético con el medio ambiente. Cuando un organismo se enferma o se estresa, disparando así cambios moleculares específicos, el fenotipo se ve alterado. Este cambio puede entonces, en principio, ser medido usando la metabolómica. Aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades humanas Por muchos años los médicos han estado midiendo metabolitos específicos en la sangre o en la orina de sus pacientes con el fin de diagnosticar enfermedades particulares. Quizás el procedimiento más familiar es la medición de la glucosa para el diagnóstico de la diabetes. La metabolómica está abriendo nuevos horizontes, dado que se pueden medir rápida y simultáneamente a cientos de metabolitos, proveyendo una medida mucho más completa del estado de salud de un paciente. Recientemente, varias aplicaciones notables de la metabolómica en el estudio de las enfermedades humanas han comenzado a emerger:  La detección de la presencia y la severidad de la enfermedad coronaria usando metabolómica basada en la Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Este técnica no invasiva identifica a la enfermedad a partir de una muestra de suero de la sangre, y en el futuro puede reducir el uso de los angiogramas, los cuales son altamente invasivos.

La predicción del resultado clínico de una hemorragia repentina en un vaso sanguíneo sobre la superficie del cerebro (llamado hemorragia subarachnoidea), por medio del análisis metabolómico del fluido cerebroespinal.

¿Qué es la porfiria? El término porfiria se refiere a un grupo de al menos ocho desórdenes que difieren clínicamente uno de otro, pero todos comparten el mismo problema de acumulación de Protoporfirina III o de sus precursores (Kappas y col. 1995). La Protoporfirina III es un metabolito de la síntesis del hemo, que es un constituyente esencial de la hemoglobina, mioglobina, catalasa, peroxidasa, y citocromos P450 y del sistema respiratorio. Se han descripto porfirias tanto hereditarias como adquiridas, siendo éstas: porfiria aguda intermitente (PAI), nueva porfiria aguda (NPA), porfiria variegata o mixta (PV), coproporfiria hereditaria (CPH), porfiria congénita eritropoyética (PCE), protoporfiria eritropoyética (PPE), coproporfiria eritropoyética (CPE) porfiria hepatoeritropoyética (PHE) y porfiria cutánea tardía (PCT), esta última puede ser congénita o adquirida. Existen tres clasificaciones distintas para agruparlas: en la primera, las porfirias se clasifican según el sitio principal de expresión de la falla metabólica. Si bien en las enfermedades genéticas, la falla reside en el genoma de todas las células, en las porfirias hepáticas se acumulan precursores en hígado, mientras que en las eritropoyéticas se acumulan precursores en células sanguíneas.

También se clasifican según las principales manifestaciones clínicas en agudas y no agudas así como cutáneas y no cutáneas. La diferencia entre estas dos últimas clasificaciones es que en el caso de las enfermedades agudas se acumulan precursores neurotóxicos correspondientes al inicio del camino metabólico, mientras que en las cutáneas se acumulan intermediarios correspondientes al final del camino biosintético, que son fotosensibles, causando quemaduras, ampollas y desgarre en las áreas expuestas al sol.

Fig.3. Quemaduras y ampollas observadas en una porfiria cutánea El tipo de porfiria con más incidencia mundial es la Porfiria cutánea tarda y luego la porfiria aguda intermitente Las porfirias agudas tienen como característica distintiva que las personas que la poseen son susceptibles de desencadenar un ataque agudo por simple exposición a una gran variedad de fármacos comunes. Es por ello que se las conoce como enfermedades fármaco-genéticas. En el caso de la PAI, la enfermedad se produce como consecuencia de una disminución en la actividad de la enzima PBG-D. Una actividad enzimática por debajo de los niveles normales, produce una acumulación del sustrato de la PBG-D, el PBG, y por ende, también del anterior en la ruta metabólica: el ALA. Es sumamente importante destacar el papel que desarrolla una acumulación de ALA y PBG, ya que estos dos compuestos son neurotóxicos y contribuyen particularmente a uno de los síntomas más trascendentes de este tipo de porfiria. La neurotoxicidad de estos productos intermedios puede provocar convulsiones, ataques de pánico y ansiedad. Asimismo, también son frecuentes los síntomas de excitación, manía y alucinaciones visuales, entre otras. De ser este estado muy avanzado, el desarrollo de una neuropatía puede llevar a una parálisis respiratoria y así a la muerte. De hecho, el mayor porcentaje de los descenlaces fatales se debe a paros respitratorios y cardíacos. Cabe aclarar que una persona con una deficiencia genética en esta enzima puede no desencadenar nunca un ataque agudo (aproximadamente un 75-80% de los afectados) y llevar una vida normal en términos generales, siempre y cuando no se consuman los compuestos porfirinogénicos que pueden inducir a estas manisfestaciones clínicas. Entre los agentes precipitantes de dichos ataques podemos mencionar la ingesta de alcohol, el ayuno, y desde ya, las hormonas esteroideas. Un cambio en los niveles hormonales usuales puede provocar variaciones que afecten a la

síntesis del hemo y puedan desencadenar una crisis. Es por ello que el embarazo y los anticonceptivos orales son probables inductores. Cuando un paciente llega a la sala de un hospital y se detecta la enfermedad, se pueden aplicar distintos tratamientos. Uno de los más importantes, es el suministro de ácido fólico. Éste actúa estimulando la actividad de la PBG-D Debido a su acción, los niveles de PBG y ALA disminuyen. También es conocido como un posible y efectivo tratamiento de los ataques porfíricos el grupo hemo, en forma de hematina, directamente por vía intravenosa, el producto final del camino metabólico con el cual se puede conseguir reprimir la actividad de la ALA-S, limitando así su propia síntesis. Los hidratos de carbono también son conocidos como un posible y efectivo tratamiento de los ataques porfíricos. Estos compuestos actúan a través de un mecanismo llamado “efecto glucosa”, inhibiendo el metabolismo de las porfirinas, es decir impidiendo la inducción de la primera enzima de la vía, la ALA-S. El mecanismo de este efecto no se conoce todavía. De ahí el interés de nuestro grupo por relacionar el metabolismo de hidratos de carbono con la biosíntesis de hemo. La porfiria afecta el camino metabólico del hemo en diferentes puntos según el tipo. Se explica a continuación el mismo: La enzima regulatoria más importante de la síntesis del hemo es la ALAsintetasa (ALA-S). Esta enzima se regula principalmente por el producto final de la vía metabólica, es decir por el hemo. A su vez la baja proporción fisiológica de Protoporfirina III con hierro en estado férrico (hematina), también puede regular a la ALA-S. Estos dos compuestos regulan a la enzima por diversos mecanismos que se pueden agrupar en: inducción-represión de la síntesis de la ALA-S y por retroalimentación negativa. El punto de partida para esta regulación es la existencia de uno o más pools de hemo libre, probablemente ubicados en citosol, mitocondria o retículo endoplasmático; las variaciones que ocurren en los mismos son las que dirigen ambos mecanismos. Cabe destacar que la regulación de la ALA-S por parte del hemo difiere en hígado y en tejido eritropoyético. Se hará referencia principalmente a la regulación en hígado y se mencionarán algunos puntos sobre la regulación en tejido eritropoyético: La ALA-S es una enzima mitocondrial que utiliza como cofactor al fosfato de piridoxal. La deficiencia de piridoxal y la presencia de drogas que compiten con el cofactor disminuyen la actividad de esta enzima. Debido a la baja actividad y a la corta vida media de la ALA-S y su ARNm, la regulación primaria de esta enzima a nivel de su síntesis constituye un control muy sensible y por esto mismo es el principal de la vía. A continuación se detallarán las diversas formas en las cuales el hemo regula la síntesis y la actividad de esta enzima en hígado. • La transcripción del gen de ALA-S es reprimida por la unión de un holorepresor formado por un apo-represor proteico y un grupo hemo. A su vez el hemo induce la transcripción del apo-represor. La sensibilidad de la regulación por inhibición de la ALA-S es tal que, incluso a bajas concentraciones de hemo, éste inhibe la síntesis de la misma a nivel de la traducción, ya que el ARNm contiene una secuencia que se une a una proteína reguladora sensible al hemo. De esta forma, disminuye la vida media del mensajero.

• •

El hemo en concentraciones elevadas puede afectar la translocación de la enzima a la mitocondria. El hemo y la hematina actúan como inhibidores alostéricos de la ALA-S.

Si bien la ALA-S es la enzima regulatoria más importante de la vía, existen otras enzimas que pueden ser puntos de control en ciertas condiciones, en particular cuando la ALA-S está desreprimida (Fig. 4). En estos casos, la desrepresión de la ALA-S convierte a la PBG-D en la enzima de velocidad limitante, por lo cual la reacción catalizada por esta última pasa a ser el punto de control más importante de la vía biosintética. También es importante por lo tanto su regulación.

Fig 4. Regulación de la ALA-S por grupo Hemo

Gen regulador

promotor

Gen estructural para la ALA-S

Represor activo (holorrepresor) Apo-represor + Hemo (+) Mecanismo lento: represión de la síntesis de la enzima

ARN-m ALA-S (-) Hemo Mecanismo rápido: inhibición de la actividad de la ALA-S

La PBG-D es una enzima alostérica sulfhídrica que presenta cooperatividad homotrópica positiva para su sustrato (PBG). Un cambio en la concentración de PBG afectará considerablemente la actividad de la enzima. En células eritroides, la actividad de la PBG-D es inducible por hormona eritropoyetina, una proteína que disocia la combinación apo-represor-hemo. Por último, la Ferroquelatasa es también una enzima regulable aunque, en general, su regulación es mucho menos importante que la de la ALA-S y la PBG-D. Sin embargo, la regulación de la Ferroquelatasa, y sobre todo su inhibición, puede cobrar importancia en situaciones de intoxicación por plomo y en algunas porfirias. La actividad de la Ferroquelatasa es inhibida por oxígeno, plomo y diversos cationes bivalentes. Al ser ésta una enzima sulfhídrica, la oxidación de un solo grupo -SH puede inactivarla completamente. Por otra parte, se cree que en el tejido eritropoyético el hemo regula la adquisición de Fe2+ de la transferrina (proteína transportadora de hierro en estado ferroso), modificando así la actividad de la Ferroquelatasa.

En cuanto a la acción de sustancias exógenas sobre las enzimas antes descritas, existe una gran cantidad de drogas (compuestos porfirinogénicos) que modifican la biosíntesis del hemo, disminuyendo su concentración y, en consecuencia, aumentando marcadamente la actividad de la ALA-S. (Kappas y col. 1995) Habitualmente para el estudio de estas patologías se suelen utilizar modelos experimentales generados en roedores (rata, ratón) por la administración de drogas que inhiben enzimas del camino metabólico del hemo. Bibliografía: Altuna,M.E., Lelly, S.M., San Martín de Viale, L.C. y Damasco, M.C .2006. Effect of stress on hepatic 11-beta-hydroxysteroid dehydrogenase activity and its influence on carbohydrate metabolism. Can. J. Physiol. and Pharmacol. 84 977-984. Badawy A.A.B, Evans M, (1977) The regulation of rat liver tryptophan pyrrolase by its cofactor haem. Experiments with haematin and 5-aminolaevulinate and comparison with the substrate and hormonal mechanisms. Biochem J 150: 511-520 Bechara, E.J.H. 1996. Oxidative stress in acute intermittent porphyria and lead poisoning may be triggered by 5-aminolevulinic acid.Braz J Med Biol Res 29 841-851. Billi de Catabbi SC, Faletti A, Fuentes F, San Martín de Viale LC, Cochon AC, 2005. Hepatic arachidonic acid metabolism is disrupted after hexachlorobenzene treatment. Toxicol. Appl. Pharmacol. 204 187-195. Costa, V. M. V., Amorin, M.A., Quintanilha, A., Moradas-Ferreira, P. 2002. Hydrogen peroxide-induced carbonylatyon of key metabolic enzymes in Sacharomices cereviciae: The involvement of the oxidative stress response regulators Yap1 and Skn1. Free Radicals Biology and Medicine 33 15071515. Emanuelli T, Pagel FW, Alves LB, Regner A, Souza DO. 2001. 5-Aminolevulinic acid inhibits [3H]muscimol binding to human and rat brain synaptic membranes Neurochem Res. 26 101-105. Igarreta Mdel P, Calvo J.C and Damasco M.C 1999. Activity of renal 11betahydroxysteroid dehydrogenase 2 (11betaHSD2) in stressed animals. Life Sciences 64 2285-2290.Ivanov DE, Chernev K, Adjarov D, Krustev L, Georgiev G, 1976. Proceedings of the First International Porphyrin Meeting on Porphyrins in Humans Diseases, 1975, Karger, Basel 438–444 Kappas, A., Sassa., S., Galbraith, R.A., Nordmann, Y. 1995 The Porphyrias. In: Karbownik M., Reiter R.J., Garcia, J.J., Tan,D.X.; Qi,W.; Dun, X.T.,Qi, W., Mancester, L.C. 2000. Melatonin reduces rat hepatic macromolecular damage due to oxidative stress caused by delta-aminolevulinic acid.Biochim Biophys Acta 1523 140-146. Kido H, Fukusen, N, Katunuma N. 1987. Epidermal growth factor as a new regulador of induction of tyrosine aminotrasferase and tryptophan oxygenase by glucocorticoids. FEBS Lett. 223, 223-226.

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