INTRODUCCIÓN Resumen La fecundación es un proceso que involucra varias etapas.

Para que ocurra la fecundación debe haber una unión entre los espermatozoides (ESP) y los oocitos (FIGURA 1). Para que el ESP pueda fecundar al oocito es necesario que haya sufrido una serie de cambios dentro del tracto reproductor de la hembra que le otorguen capacidad fecundante. El oviducto de los mamíferos actúa como un reservorio funcional de ESP proveyendo un ambiente que permite su mantenimiento y competencia para la fecundación del oocito (Harper, 1994). En diferentes especies los ESP son almacenados en la región inferior del oviducto, el istmo, donde se unen a las células epiteliales (Smith y Yanagimachi, 1990). Esta interacción prolonga la vida del ESP hasta que señales asociadas a la ovulación inducen su liberación permitiendo que transite hacia la región superior del oviducto (ampolla) para la fecundación (Harper, 1994). La liberación de los ESP en el período periovulatorio in vivo es inducida por el remodelamiento de la membrana plasmática que ocurre durante la capacitación y/o hiperactivación del ESP (Smith y Yanagimachi, 1990). Una vez que llegan los ESP al oviducto toman contacto con las células epiteliales y con sus secreciones. Trabajos previos han puesto la atención en el estudio de los componentes del fluido oviductal uterino que afectan los eventos relacionados con la fecundación y el desarrollo embrionario pre-implantatorio. Por ejemplo, algunas proteínas en el fluido oviductal están involucradas en la interacción ESP-oviducto. Los endocannabinoides comprenden una nueva clase de mediadores lipídicos que han sido aislados de cerebro y tejidos periféricos que mimetizan los efectos de los cannabinoides. Estos compuestos pueden tener efectos adversos en algunas funciones reproductivas como ser el retraso del desarrollo embrionario y abortos espontáneos (Das y col., 1995). La N-araquidoniletanolamina o anandamida (AEA) es un agonista endógeno de los receptores de cannabinoides, que fue aislado originariamente de cerebro y tejidos periféricos (Devane y col., 1992). La AEA se sintetiza en oviducto y útero de mamíferos (Paria y col., 1996; Schuel y col., 2002; Wang y col., 2006). Se ha encontrado niveles elevados de este compuesto en el útero comparado con otros órganos, incluido el cerebro (Schmid y col., 1997). De esta manera los ESP estarían expuestos a la AEA durante su tránsito en el tracto reproductor de la hembra, lo cual afectaría la capacidad fecundante de los mismos. La AEA podría estar regulando la capacitación espermática en momento de la liberación del ESP de su reservorio en el cervix y cauda oviductal y, de este modo, contribuir a la selección del ESP para llevar a cabo la fecundación in vivo.

Figura 1: Espermatozoides unidos a la zona pelúcida del oocito obtenidos de un estudio in vitro (microfotografía de Nomarsky, fuente: Wassarman y col., 2005)

I. El espermatozoide de mamíferos I. 1. Estructura y función espermática. Un ESP de mamífero está formado por una cabeza y una cola o flagelo (FIGURA 2). La cabeza está constituida por un núcleo haploide, el acrosoma, una pequeña cantidad de citoesqueleto y citosol. El acrosoma es una vesícula derivada del Aparato de Golgi que cubre aproximadamente la mitad de la cabeza y que contiene enzimas que hidrolizan proteínas y azúcares complejos. Cuando el ESP entra en contacto con la zona pelúcida del oocito sufre un proceso llamado reacción acrosomal (FIGURA 3), que es un evento exocitótico que involucra la fusión de la membrana plasmática del ESP con la membrana externa del acrosoma, liberando el contenido enzimático del mismo (Yanagimachi, 1994). La cola puede subdividirse en cuatro regiones: pieza conectora o cuello, pieza media, pieza principal y pieza Terminal. La cola es la porción responsable de la motilidad del ESP. En el cuello, están localizados los centríolos, que dan origen a los microtúbulos del axonema. Este, recorre toda la cola, y es la principal porción motora del flagelo. En la pieza media se encuentra localizados los anillos de mitocondrias que aportan la energía (ATP) necesario para el movimiento del flagelo (Gilbert, 2003). La membrana plasmática se extiende recubriendo toda la cabeza y la cola cumpliendo un papel fundamental en la supervivencia del ESP.

Figura 2. Representación esquemática de un espermatozoide de mamífero

Figura 3: Cambios en la morfología del espermatozoide de mamífero durante la reacción acrosomal. (A) Acrosoma intacto antes de la reacción. (B) Fusión de la membrana acrosomal externa con la membrana plasmática; inicio de vesiculización del acrosoma. (C) Pérdida progresiva de las membranas y contenido acrosomal. (D) Finalización de la reacción acrosomal y exposición de la membrana acrosomal interna. (Modifications de YANAGIMACHI R., Mechanism of fertilization in mammals, in MASTROIANNI I., BIGGERS J.D. (eds.), In vitro fertilization and embryo transfer, New York: Plenum Press, 1981: 81-182; TALANSKY, Fertilization and early embryo).

I.2. Adquisición de la capacidad fecundante En mamíferos, los ESP testiculares no son capaces de fecundar a un oocito. Para adquirir capacidad fecundante, estos deben atravesar un proceso de maduración en el epidídimo del macho y un proceso de capacitación en el tracto reproductor de la hembra. La maduración espermática implica una serie de cambios estructurales de la membrana plasmática del ESP. En este proceso ocurre una reorganización lipídica y proteica que le confiere al ESP nuevas propiedades antigénicas, además de adquirir la motilidad necesaria para la fecundación (Yanagimachi, 1994). El proceso de capacitación implica una serie de cambios estructurales y bioquímicos que le permiten al ESP llevar a cabo la reacción acrosomal para la posterior fecundación (Yanagimachi, 1989). Algunas de las alteraciones descriptas durante este proceso son: -Cambios en la composición y fluidez de la membrana plasmática por remoción de moléculas de colesterol de la misma (Harrison, 1996; Cross, 1998). -Remoción, redistribución y/o aparición de proteínas en la superficie espermática (Jaiswall y Eisenbach, 2002). -Incremento del Ca2+ intracelular (Visconti y col., 1995) -Incremento del pH citoplasmático (Parrish y col., 1989) -Activación de canales iónicos (Florman, 1998)

-Generación de especies reactivas de oxígeno (Leclerc y col., 1997) -Aumento de proteínas fosforiladas en residuos tirosina (Visconti, 1995; Galantino-Homer y col., 1997). Durante la capacitación se observa también un cambio en el patrón de motilidad de los ESP. Este proceso se denomina hiperactivación y se caracteriza por ser un movimiento de alta amplitud del flagelo asociado a un batido asimétrico del mismo (FIGURA 4) (Yanagimachi, 1994).

Figura 4: Hiperactivación del espermatozoide en bovinos

Método de estudio de la capacitación espermática in vitro La capacitación in vitro se realiza incubando a los ESP en un medio capacitante definido, en ausencia de fluido seminal (proveniente de la vesícula seminal), ya que la presencia del mismo inhibe la capacitación por contener factores decapacitantes que se adhieren a la membrana del ESP (Yanagimachi, 1994). La composición del medio para realizar una capacitación in vitro varía según la especie, pero, comúnmente, estos contienen iones (Ca2+ y HCO3-), sustratos de energía (ácido pirúvico y ácido láctico) y albúmina (Yanagimachi, 1994). Además, para algunas especies es necesario incluir un agente capacitante en el medio, por ejemplo, taurina o hipotaurina para ESP de hámster (Lui y col. 1979) y heparina para ESP bovinos (Parrish y col., 1988). Previamente se ha mencionado que durante la capacitación se producen cambios en el ESP. Cada uno de estos es un potencial parámetro a medir con diferentes técnicas. La mayoría de los métodos parta medir capacitación se basan en la definición fisiológica de la misma, determinando la habilidad de los ESP para llevar a cabo la reacción acrosomal en presencia de

algún inductor fisiológico (zona pellúcida, fluido folicular, LPC) o farmacológico (ionóforo de Ca2+). La evaluación de la reacción acrosomal se realiza utilizando la técnica de PSA-FITC. La técnica de clorotetraciclina (CTC) es una de las más empleadas para evaluar capacitación que no mide este parámetro. El CTC es un antibiótico que fluoresce cuando se une al Ca 2+ acoplado a fosfolípidos de membrana. El patrón de fluorescencia cambia cuando la membrana del ESP sufre cambios durante la capacitación y/o reacción acrosomal. Con esta técnica pueden distinguirse tres patrones: ESP intactos (no capacitados), ESP capacitados, y ESP reaccionados (FIGURA 5) (Jaiswall y Eisenbach, 2002).

Figura 5: Distintos patrones de CTC observados en espermatozoides bovinos. a) ESP intacto; b) ESP capacitado; c) ESP reaccionado (indicado con la flecha). Imagen modificada de Fraser y col., 1995.

Otro método para estudiar la capacitación es la evaluación de la expresión de fosforilación proteica dado que, durante el proceso de capacitación incrementa la fosforilación en residuos tirosina de varias proteínas (Visconti y col., 1998; Galantito-Homer y col., 1998). Tránsito de los espermatozoides a través del tracto reproductor de la hembra El sitio donde se ubican los ESP al llegar al tracto reproductor de la hembra varía entre los mamíferos. En primates y rumiantes el semen es eyaculado y depositado en la región de la vagina más cercana al cervix. En minutos los ESP atraviesan el mucus cervical que actúa como barrera y solamente aquellos que poseen morfología normal y son mótiles pueden nadar a través del mismo (FIGURA 6A). Mullins y Saacke (1989) demostraron la presencia de pliegues de la mucosa en el cervix de bovinos, que forman canales orientados hacia la cavidad uterina. Los ESP viajan por esos canales hasta el útero, evadiendo al sistema inmune de la hembra. Una vez que los ESP llegaron al útero, las contracciones musculares del mismo fomentan su transporte hacia el oviducto. Para llegar al mismo los ESP deben atravesar la unión útero-tubaria. Esta región les representa una barrera física debido a la estrechez dada por la gruesa capa muscular de la pared que puede estar acompañada de ligamentos musculares. En ratas, se ha

demostrado que esta región permite el pasaje de los ESP aunque impide el de los componentes del plasma seminal hacia el oviducto (Carballada y Esponda, 1997). Una vez que llegan al oviducto, los ESP se unen a las células epiteliales del mismo y se forma el reservorio oviductal (Figura 6B). El oviducto de mamíferos Anatomía del órgano En el oviducto de mamíferos pueden diferenciarse 3 regiones: infundíbulo, ampolla e istmo. La zona de unión entre el oviducto y el útero se denomina unión utero-tubaria y el extremo del infundíbulo ostio. La pared oviductal está compuesta por tres capas: una serosa externa, una capa muscular doble intermedia y una capa epitelial interna llamada mucosa. Estas capas varían en complejidad entre las distintas regiones. El epitelio o mucosa está compuesto por células ciliadas y células secretoras. Además, la mucosa está organizada formando pliegues hacia la luz del oviducto los cuales van incrementando su complejidad desde la unión útero-tubaria hacia el infundíbulo (FIGURA 7).

Figura 6. Esquema del tránsito de los espermatozoides (ESP) por el tracto reproductor de la hembra en mamíferos. A) Pasaje de los ESP por el cervix. B) ESP adheridos al istmo oviductal formando el reservorio. C) ESP hiperactivados en el oviducto. D) Oocito en la sección transversal de la ampolla oviductal.

Secreciones oviductales El fluido oviductal está compuesto por secreciones provenientes de las células secretoras del epitelio oviductal, junto con nutrientes provenientes del plasma sanguíneo. Se ha demostrado que a mitad del ciclo estral estas células tienen mayor actividad secretoria (Harper, 1994). Función oviductal Cada una de las regiones del oviducto cumple una función fisiológica particular. El infundíbulo capta con sus fimbrias a los oocitos que son ovulados hacia la cavidad peritoneal, la ampolla es el sitio en el que se encuentran las gametas y ocurre la fecundación y, el istmo está involucrado en el transporte de gametas y embriones además de ser considerado como reservorio de ESP (Figura 6B) (Hunter y Wilmut, 1984; Suarez, 1987).

A

B

Figura 7: A) Diagrama esquemático del oviducto de mamíferos B) Cortes transversales de diferentes porciones del oviducto, dibujos modificados de el-Banna and Hafez, Anat. Rec, (1970).

El reservorio oviductal Una vez que los ESP llegan al oviducto se adhieren a las células epiteliales de la mucosa presentes en la porción inferior del mismo (istmo) y forman un reservorio (FIGURA 8). La formación de este reservorio fue descubierta en hamsters por los investigadores Yanagimachi y Chang en el año 1963 y más tarde se lo encontró en una gran variedad de mamíferos, entre ellos: conejos (Harper, 1973), porcinos (Hunter, 1981), ovinos (Hunter y Nichol, 1983) y bovinos (Hunter y Wilmut, 1984). Una vez que los ESP llegan al reservorio, se mantienen allí hasta el momento de la ovulación, en el que por señales aún desconocidas, un pequeño número de ellos es liberado para permitir el encuentro con el oocito (Suarez, 2002). Además de coordinar temporalmente el encuentro de las gametas, la formación del reservorio es necesaria para evitar la polispermia. Esto se debe a que permite que un número apropiado de ESP se liberen y lleguen a la ampolla oviductal en las condiciones bioquímicas adecuadas para que ocurra la fecundación en forma exitosa (Demott y col., 1995).

Figura 8. Microscopía electrónica de de barrido de ESP bovinos unidos a la mucosa del epitelio oviductal del istmo. A) Vista del istmo oviductal (barra=75μm). B) ESP unidos a la mucosa del epitelio oviductal (barra=5μm). C) ESP asociados a las cilias del epitelio oviductal (barra=1μm). Tomado de Lefebvre y col., 1995 a.

Por otro lado, es sabido que la unión entre los ESP y el epitelio oviductal mantiene la fertilidad del mismo hasta el momento de la ovulación (Suarez, 2002). La adhesión al oviducto juega un papel clave en la selección de subpoblaciones, ya que únicamente pueden unirse al mismo ESP caracterizados por poseer acrosoma intacto (bovino: Gualtieri y Talevi, 2000), estado no capacitado (bovino: Lefebvre y Suarez, 1996; cerdo: Fazeli y col., 1999), bajo contenido de Ca2+ intracelular libre y bajos niveles de proteínas fosforiladas en residuos tirosina (cerdo: Petrunkina y col., 2001), morfología normal (equinos: Thomas y col., 1994) y estructura normal de la cromatina (humanos: Ellington y col., 1998). Todos estos antecedentes indican que in vivo el reservorio estaría seleccionando a los ESP con mejor calidad y los mantendría vivos y no capacitados hasta el momento en el que, señales asociadas a la ovulación desencadenan la liberación de los mismos para lograr una fecundación exitosa (Suarez, 2002). Durante la formación del reservorio, los ESP se unen a las células epiteliales del oviducto a través de un proceso reversible que involucra reconocimiento de oligosacáridos de la membrana apical de las células epiteliales del oviducto (Demott y col., 1995) con lectinas dependientes de Ca2+ de la membrana del ESP (Suarez y col., 1998). En todas las especies estudiadas hasta el momento, se ha demostrado la participación de diferentes azúcares en dicho proceso, por ejemplo en bovinos el residuo involucrado es la fucosa (Suarez y col., 1998). Además, en la unión ESP-oviducto bovina está involucrada una proteína secretada por la vesícula seminal denominada PDC-109 (que se asocia al ESP) y residuos de fucosa presentes en el epitelio oviductal. Esta interacción permite la adherencia del ESP al epitelio contribuyendo de este modo a la formación del reservorio. La pérdida o modificaciones de la proteína PDC-109 como consecuencia de la capacitación espermática facilitaría la liberación de los ESP del epitelio oviductal (Suarez 2002) (FIGURA 9). Liberación de los espermatozoides del reservorio oviductal Los mecanismos que controlan la liberación de los ESP del epitelio oviductal aún no han sido establecidos. Sin embargo, se ha demostrado en equinos, que los cambios que se producen durante la ovulación en el entorno hormonal del epitelio, no afectan la densidad de los sitios de unión presentes en las células epiteliales (Lefebvre y col., 1995; Suarez y col., 1991).

Varios autores han propuesto que tanto los cambios que se producen en la membrana plasmática de la cabeza del ESP durante la capacitación, como los que ocurren en la cola durante la hiperactivación, son los principales procesos que promueven su liberación del reservorio (Gualtieri y col., 2005; Suarez, 2002). Fazeli y col. (1999) encontraron que solamente los ESP no capacitados pueden unirse a las células epiteliales del oviducto. Esta interacción induciría la capacitación espermática con la consecuente liberación de los ESP.

Figura 9 Modelo que explica la unión y liberación de ESP bovinos del epitelio oviductal (adaptado de Suarez, 2002). (a) La proteína PDC-109 es secretada por la vesícula seminal y se asocia a la membrana plasmática de los ESP. (b) Al llegar al istmo los ESP se unen a las células epiteliales porque PDC-109 reconoce residuos fucosilados presentes en dicho epitelio. (c) Durante la capacitación se pierde o modifica PDC-109 facilitando la liberación de los ESP del reservorio.

Otras evidencias indican que el número de ESP unidos a explantos oviductales disminuye si los mismos son previamente capacitados in vitro (Lefebvre y Suarez, 1996). Correspondiéndose con estos resultados, Revah y col. (2000) demostraron que durante la capacitación espermática en bovinos se modifica la membrana de los ESP disminuyendo su afinidad por los residuos fucosilados. Por otro lado, en bovinos, moléculas tales como los glicosaminoglicanos sulfatados (entre ellos la heparina y el fucoidan) secretadas por el oviducto durante el estro, han sido propuestas como inductoras de la liberación ya que modulan progresivamente la capacitación espermática favoreciendo el despegue de los ESP del oviducto (Talevi y Gualtieri, 2001). Además, existen evidencias en porcinos que indican que tanto el complejo cúmulo-oocito (Brussow y col., 2006) como las hormonas ováricas (estradiol y progesterona) (Bureau y col., 2002) influyen en la liberación de los ESP. En resumen, los procesos de capacitación e hiperactivación espermática modulan la interacción ESP-oviducto. Sin embargo hasta el momento, hay escasa información acerca de las

señales moleculares que estarían regulando la liberación de los mismos del epitelio oviductal en el período periovulatorio. Endocannabinoides El sistema endocannabinoide El sistema endocannabinoide es un sistema de señales recientemente descubierto que participa en una gran variedad de procesos fisiológicos. Sus principales componentes son los receptores cannabionoides, los endocannabionoides, y las enzimas de síntesis y degradación de los mismos (Pagotto y col., 2006). Los cannabinoides Los cannabinoides constituyen un conjunto de compuestos que están presentes en preparados obtenidos a partir de la planta Cannabis sativa como el hachís y la marihuana, que se encuentran entre las drogas ilegales más consumidas en el mundo. En 1964 los investigadores Mechoulam y Gaoni purificaron e identificaron el principal componente psicoactivo de la marihuana: Δ9tetrahidrocannabinol (Δ9-THC). Además se clonaron y caracterizaron dos subtipos de receptores cannabinoides: CB1 originalmente encontrado en cerebro (Matsuda y col., 1990; Gerard y col., 1991), y CB2 originalmente clonado en células de bazo (Munro y col., 1993). Recientemente fue demostrado que los cannabinoides pueden actuar a través del receptor vanilloide TRPV1 (Zygmunt y col., 2000). N-araquidoniletanolamida o anandamida Los endocannabinoides son compuestos que derivan de ácidos grasos insaturados que actúan como ligandos endógenos de los receptores cannabinoides. Devane y col. en 1992 aislaron la Naraquidoniletanolamida a partir de un extracto lipídico obtenido de cerebro de cerdo. Esta molécula fue llamada anandamida (AEA), derivado de la palabra ananda que en sánscrito significa “el que trae bendición y tranquilidad interna” o “felicidad” (Figura 10).

Figura 10. Estructura química de la N-araquidoniletanolamida

Posteriormente se describieron varios compuestos que actúan como mediadores lipídicos a través de los receptores CB1 y/o CB2, entre ellos, el 2-araquidonilglicerol y el oleoiletanolamida. (Pagotto y col., 2005). Receptores de cannabinoides Previamente se mencionó que los principales receptores cannabinoides descriptos son los receptores CB1 y CB2. El receptor CB1 se encuentra distribuido principalmente en el sistema nervioso central (Matsuda y col., 1990) Aunque también se demostró que está presente en los tejidos periféricos incluyendo los reproductivos tales como testículo de vertebrados (Cobelis y col., 2006), ESP, oocitos, embriones preimplantatorios (Schuel 2006), oviducto (Wang y col., 2004), placenta, membrana fetales y miometrio (Taylor y col., 2007). Por otro lado CB2 se encuentra principalmente en células del sistema inmune (Munro y col., 1993). Sin embargo, se ha encontrado dicho receptor en una gran cantidad de tejidos reproductivos (Macarrone y col., 2008). Receptores vanilloides La AEA también puede actuar como agonista de los receptores vanilloides TRPV1. Este es un canal de cationes no selectivo que se encuentra relacionado con los canales iónicos TRP. La unión de la AEA al TRPV1 produce un aumento de Ca2+ intracelular con activación de mecanismos de acción que involucran este mensajero (Ross, 2003). Hasta este momento este receptor ha sido descrito principalmente en sistema nervioso central (Ross, 2003). Recientemente Maccarrone y col., 2005 encontraron que TRPV1 se expresa en ESP porcino y la activación del mismo está involucrada en la estabilización de la membrana plasmática durante la capacitación espermática. Metabolismo de la anandamida La AEA es una molécula que no se almacena en la célula sino que se sintetiza a demanda a partir de precursores de ácidos grasos de cadena larga poli-insaturados que derivan del ácido araquidónico (Habayeb y col., 2002).

Función de la anandamida como molécula moduladora de procesos reproductivos La AEA está involucrada en diferentes funciones reproductivas como ser la secreción de hormonas sexuales, gametogénesis, ovulación, desarrollo embrionario, implantación del blastocito en el endometrio uterino, crecimiento fetal, etc. (Schuel, 2006). El sistema endocannabinoide fue caracterizado en ESP de cerdo y humanos (Maccarron y col., 2005; Rossato y col., 2005). Además en otro trabajo se observó la presencia del receptor CB1 en ESP de sapo, rata y ratón (Cobelis y col., 2006). En estos trabajos se evaluaron posibles efectos de la AEA sobre la funcionalidad espermática. Maccarrone y col. 2005 demostraron que una concentración de 1 micromolar de meta-AEA (un análogo estable de la AEA) inhibe de manera tiempo-dependiente la capacitación espermática en cerdo. A su vez, estudios realizados con gametas de erizo de mar indicaron que concentraciones micromolares THC disminuyen el proceso de fecundación dado que se inhibe la reacción acrosomal (Schuel y col., 1994). Más tarde Schuel y col. 2002 demostraron el mismo efecto con meta-AEA sobre la reacción acrosomal en ESP humanos. La AEA es sintetizada en oviducto y útero de roedores (Schmid y col., 1997; Paria y Dey 2000). Schuel y col., 2002 detectaron niveles nanomolares de AEA en fluido oviductal en la mitad del ciclo estral en humanos. Varios estudios realizados en humanos y porcinos sugieren la posible existencia de un gradiente de AEA en el oviducto que regula la capacitación espermática (Schuel y col., 2002; Schuel y Burkman, 2005; Maccarrone y col., 2005). Hipótesis La fecundación in vivo requiere que un número apropiado de ESP alcance la ampolla oviductal y coincida con un oocito viable en un ambiente fisiológico adecuado. Los ESP de mamífero penetran el mucus cervical, entran al tracto superior de la hembra y pueden ser almacenados en reservorios localizados en el istmo oviductal hasta que señales relacionadas con la ovulación inducen su liberación.

El mecanismo de acción que involucra la AEA podría estar regulando la capacitación, el momento del escape del ESP de su reservorio dentro del oviducto y seleccionar al ESP para la fecundación in vivo. La anandamida modula la capacitación espermática en espermatozoides bovinos favoreciendo la liberación de los mismos desde el reservorio oviductal. Objetivos - evaluar la posible participación de la anandamida en la capacitación espermática en bovinos - Estudiar la liberación de los espermatozoides del epitelio oviductal en presencia de anandamida y/o antagonistas de los receptores CB1 y TRPV1. REFERENCIAS: • Brüssow KP, Torner H, Rátky J, Manabe N, Tuchscherer A. Experimental evidence for the influence of • • • • • • • • • • • •
cumulus-oocyte-complexes on sperm release from the porcine oviductal sperm reservoir. J Reprod Dev. 2006; 52(2):249-57. Bureau M, Bailey JL, Sirard MA. Binding regulation of porcine spermatozoa to oviductal vesicles in vitro. J Androl. 2002; 23(2):188-93. Carballada R, Esponda P. Fate and distribution of seminal plasma proteins in the genital tract of the female rat after natural mating. J Reprod Fertil. 1997;109(2):325-35. Cobellis G, Cacciola G, Scarpa D, Meccariello R, Chianese R, Franzoni MF, Mackie K, Pierantoni R, Fasano S. Endocannabinoid system in frog and rodent testis: type-1 cannabinoid receptor and fatty acid amide hydrolase activity in male germ cells. Biol Reprod. 2006; 75(1):82-9. Cross, N. L. Role of cholesterol in sperm capacitation. Biol. Reprod. 1998; 59: 7-11. Das SK, Paria BC, Chakraborty I, Dey SK. Cannabinoid ligand-receptor signaling in the mouse uterus. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92:4332-4336. Demott, R. P., Lefebvre, R., and Suarez, S. S. Carbohydrates mediate the adherence of hamster sperm to oviductal epithelium. Biol. Reprod. 1995; 52:1395-1403. Devane WA, Hanus L, Breuer A, Pertwee RG, Stevenson LA, Griffin G, Gibson D, Mandelbaum A, Etinger A, Mechoulam R Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science 1992; 258:1946-1949. Ellington JE, Jones AE, Davitt CM, Schneider CS, Brisbois RS, Hiss GA, Wright RW Jr. Human sperm function in co-culture with human, macaque or bovine oviduct epithelial cell monolayers. Hum Reprod. 1998; 13(10):2797-804. Fazeli A, Duncan AE, Watson PF, and Holt WV. Sperm-oviduct interaction: induction of capacitation and preferential binding of uncapacitated spermatozoa to oviductal epithelial cells in porcine species. Biol Reprod. 1999; 60(4):879-86. Florman HM, Arnoult C, Kazam IG, Li C, O'Toole CM. A perspective on the control of mammalian fertilization by egg-activated ion channels in sperm: a tale of two channels. Biol Reprod. 1998; 59(1):12-6. Galantino-Homer, H. L., Visconti, P. E., and Kopf, G. S. Regulation of protein tyrosine phosphorylation during bovine sperm capacitation by a cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-dependent pathway. Biol. Reprod. 1997; 56: 707-719. Gerard CM, Mollereau C, Vassart G, Parmentier M. Molecular cloning of a human cannabinoid receptor which is also expressed in testis. Biochem J. 1991; 279 (Pt 1):129-134.

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Gilbert SF. Fecundación: el comienzo de un nuevo organismo, en “Biología del Desarrollo” Medica panamericana. 2003. 7º Ed. Gualtieri R, Boni R, Tosti E, Zagami M, Talevi R. Intracellular calcium and protein tyrosine phosphorylation during the release of bovine sperm adhering to the fallopian tube epithelium in vitro. Reproduction. 2005; 129(1):51-60. Gualtieri R, Talevi R. In vitro-cultured bovine oviductal cells bind acrosome-intact sperm and retain this ability upon sperm release. Biol Reprod. 2000; 62(6):1754-62. Habayeb OM, Bell SC, Konje JC. Endogenous cannabinoids: metabolism and their role in reproduction. Life Sci. 2002; 70(17):1963-77. Review. Harper, MJK. Gamete and zygote transport, en “The physiology of Reproduction”. Ed: Knobil E y Neill J. Raven Press. 1994; 1: p123 Harper, MJK. Relationship between sperm transport and penetration of eggs in the rabbit oviduct. Biol. Reprod. 1973; 8:441-450 Harrison, R. A. P. Capacitation mechanisms, and the role of capacitation as seen in eutherian mammals. Reprod. Fertil. Dev. 1996; 8: 581-594. Hunter, R. H. F, and Nichol, R. Transport of spermatozoa in the sheep oviduct: Preovulatory sequestering of cells in the caudal isthmus. J. Exp. Zool. 1983; 228: 121-128. Hunter, R. H. F, and Wilmut, I. Sperm transport in the cow: Periovulatory redistribution of viable cells within the oviduct. Reprod. Nutn Dev. 1984; 24: 597-608. Hunter, R. H. F. Sperm transport and reservoirs in the pig oviduct in relation to the time of ovulation. J. Reprod. Fertil. 1981; 63: 109-117. Jaiswall B y Eisenbach M. Capacitation, en “Fertilization”. (Hardy D y Garbers D.) 2002, pp. 57-117. Elsevier. Leclerc, P., de Lamirande, E., and Gagnon, C. Regulation of protein-tyrosine phosphorylation and human sperm capacitation by reactive oxygen derivatives. Free Radic. Biol. Med. 1997; 22: 643-656. Lefebvre R, Chenoweth PJ, Drost M, LeClear CT, MacCubbin M, Dutton JT, Suarez SS. Characterization of the oviductal sperm reservoir in cattle. Biol Reprod. 1995; 53(5):1066-74. Lefebvre R, Suarez SS. Effect of capacitation on bull sperm binding to homologous oviductal epithelium. Biol Reprod. 1996; 54(3):575-82. Lui, C. W., Mrsny, R. J., and Meizel, S. Procedures for obtaining high percentages of viable in vitro capacitated hamster sperm. Gamete Res. 1979; 2: 207-211. Maccarrone M, Barboni B, Paradisi A, Bernabò N, Gasperi V, Pistilli MG, Fezza F, Lucidi P, Mattioli M. Characterization of the endocannabinoid system in boar spermatozoa and implications for sperm capacitation and acrosome reaction. J Cell Sci. 2005; 118(Pt 19):4393-404. Macarrone M. CB2 receptors in reproduction. Br. J Pharmacol. 2008; 153(2):189-198 Matsuda LA, Lolait SJ, Brownstein MJ, Young AC, Bonner TI. Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA. Nature 1990; 346:561-564 Mullins, K. J., and Saacke, R. G. Study of the functional anatomy of bovine cervical mucosa with special reference to mucus secretion and sperm transport. Anat. Rec. 1989; 226: 106-117. Munro S, Thomas KL, Abu-Shaar M. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids. Nature. 1993; 365:61-65 Pagotto U, Marsicano G, Cota D, Lutz B, Pasquali R. The emerging role of the endocannabinoid system in endocrine regulation and energy balance. Endocr Rev. 2006; 27(1):73-100. Review. Paria BC, Deutsch DD, Dey SK. The uterus is a potential site for anandamide synthesis and hydrolysis: differential profiles of anandamide synthase and hydrolase activities in the mouse uterus during the periimplantation period. Mol Reprod Dev. 1996; 45(2):183-92 Paria BC, Dey SK. Ligand-receptor signaling with endocannabinoids in preimplantation embryo development and implantation. Chem Phys Lipids. 2000; 108(1-2):211-20. Review. Parrish, J. J., Susko-Parrish, J. L., Handrow, R. R., Ax, R. L., and First, N. L. Effect of sulphated glycoconjugates on capacitation and the acrosome reaction of bovine and hamster spermatozoa. Garnet. Res. 1989; 24: 403-413 Parrish, J. J., Suako-Parrish, J., Winer, M. A., and First, N. L. Capacitation of bovine sperm by heparin. Biol Reprod. 1988; 38: 1171-1180.

• • • • •

• • • • • • • •


Petrunkina AM, Friedrich J, Drommer W, Bicker G, Waberski D, Topfer-Petersen E. Kinetic characterization of the changes in protein tyrosine phosphorylation of membranes, cytosolic Ca2+ concentration and viability in boar sperm populations selected by binding to oviductal epithelial cells. Reproduction 2001; 122(3):469-80. Revah I, Suarez SS, Flesch FM, Colenbrander B, and Gadella BM. Changes in capacity of buU sperm to bind fucose. Biol. Reprod. 2000; 62: 1010-1015 Roberts, S. J. "Veterinary Obstetrics and Genital Diseases," 3rd Ed. Stephen Roberts, Woodstock,VT.(1986). Ross RA. Anandamide and vanilloid TRPV1 receptors. Br J Pharmacol. 2003; 140(5):790-801. Review. Rossato M, Ion Popa F, Ferigo M, Clari G, Foresta C. Human sperm express cannabinoid receptor CB1, the activation of which inhibits motility, acrosome reaction, and mitochondrial function. J Clin Endocrinol Metab 2005; 90:984-99 Schmid PC, Paria BC, Krebsbach RJ, Schmid HH, Dey SK. Changes in anandamide levels in mouse uterus are associated with uterine receptivity for embryon implantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94:41884192 Schuel H, Burkman LJ. A tale of two cells: endocannabinoid-signaling regulates functions of neurons and sperm. Biol Reprod. 2005; 73(6):1078-86. Review. Schuel H, Burkman LJ, Lippes J, Crickard K, Forester E, Piomelli D, Giuffrida A. N-Acylethanolamines in human reproductive fluids. Chem Phys Lipids. 2002; 121(1-2):211-27. Review. Schuel H, Goldstein E, Mechoulam R, Zimmerman AM, Zimmerman S. Anandamide (arachidonylethanolamide), a brain cannabinoid receptor agonist, reduces sperm fertilizing capacity in sea urchins by inhibiting the acrosome reaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91(16):7678-82. Schuel H. Tuning the oviduct to the anandamide tone. J Clin Invest. 2006; 116(8):2087-90. Smith TT, Yanagimachi R. The viability of hamster spermatozoa stored in the isthmus of the oviduct: the importance of sperm-epithelium contact for sperm survival. Biol Reprod. 1990; 42(3):450-7. Suarez SS. Formation of a reservoir of sperm in the oviduct. Reprod Domest Anim. 2002; 37(3):140-3. Review.anagimachi, R. Sperm capacitation and gamete interaction. Reprod. Fertil. 1989; 38,27-33. Suarez SS. Gamete transport, en “Fertilization”. (Hardy D y Garbers D.) 2002, pp. 3-28. Elsevier. Suarez, S. S., Redfem, K., Raynor, P., Martin, R, and Phillips, D. M. Attachment of boar sperm to mucosal explants of oviduct in vitro: Possible role in formation of a sperm reservoir. Biol Reprod. 1991; 44: 99S1004. Suarez, S. S., Revah, I., Lo, M., and KoUe, S. Bull sperm binding to oviductal epithelium is mediated by a Ca2+-dependent lectin on sperm which recognizes Lewis-A trisaccharide. Biol Reprod. 1998; 59: 39-44. Suarez, S. S. Sperm transport and motility in the mouse oviduct: Observations in situ. Biol Reprod. 1987; 36: 203-210. Talevi R, Gualtieri R. Sulfated glycoconjugates are powerful modulators of bovine sperm adhesion and release from the oviductal epithelium in vitro. Biol Reprod. 2001; 64(2):491-8 Taylor AH, Ang C, Bell SC, Konje JC. The role of the endocannabinoid system in gametogenesis, implantation and early pregnancy. Hum Reprod Update. 2007; 13(5):501-13. Review. Thomas PG, Ball BA, Miller PG, Brinsko SP, Southwood L. A subpopulation of morphologically normal, motile spermatozoa attach to equine oviductal epithelial cell monolayers. Biol Reprod. 1994; 51(2):303-9. Visconti PE., Bailey JL, Moore GD, Pan D, Olds-Clarke R, and Kopf GS. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development 1995; 121: 1129-1137. . Visconti PE y Kopf GS. Regulation of protein phosphorylation during sperm capacitation. Biol Reprod. 1998; 59: 1-6. Wang H, Guo Y, Wang D, Kingsley PJ, Marnett LJ, Das SK, DuBois RN, Dey SK. Aberrant cannabinoid signaling impairs oviductal transport of embryos. Nat Med. 2004; 10(10):1074-80. Wang H, Xie H, Guo Y, Zhang H, Takahashi T, Kingsley PJ, Marnett LJ, Das SK, Cravatt BF, Dey SK. Fatty acid amide hydrolase deficiency limits early pregnancy events. J Clin Invest. 2006; 116(8):2122-31. Wassarman, P. M., Huayu Qi L. J., Williams Z., Darie, C. and Litscher E. S., Recent aspects of mammalian fertilization research. Molecular and Cellular Endocrinology 234 (2005) 95–103.

• • • • • •

• • •

• • • • • • • • • • •

• • •

Yanagimachi, R., and Chang, M. C. Sperm ascent through the oviduct of the hamster and rabbit in relation to the time of ovulation. J. Reprod. Fertil. 1963; 6: 413-420. Yanagimachi, R. Mammalian fertilization. In "The Physiology of Reproduction" (E. Knobil and J. Neill, eds.), 1994; pp. 189-317. Raven Press, New York. Zygmunt PM, Chuang H, Movahed P, Julius D, Högestätt ED. The anandamide transport inhibitor AM404 activates vanilloid receptors. Eur J Pharmacol. 2000; 396(1):39-42.