Dijagnostika

Dijagnostičke tehnike
1. Identifikacija uzročnika

• • •

Kultura
Pre-enrichment media Enrichment media Selektivne podloge

– – – – –

Identifikacija kolonija: biohem. osobine i serotipizacija Imunološke metode i prepoznavanje nukleinske kis. RSAT (rapid SLIDE agglutination test) – brza Agg SAT (serum agglutination test) – spora Agg ELISA za S. Enteritidis

2. Serološke metode

Uzorci
• Uzorci:
– idealno: sakupljeni aseptično, pre Ab tretmana, u akutnoj fazi ili ubrzo nakon uginuća – bakterije adaptirane prema domaćinu teže je izolovati, pa ako postoji sumnja, treba, ako je moguće, uraditi kulturu inficiranih organa – životinje sa subkliničkom infekcijom izlučuju bakteriju intermitentno i u malom broju. Zato se preporučuje uzimanje većeg uzorka, većeg broja uzoraka, ponavljanje uzorkovanja. U ovoj situaciji identifikovaće se inficirano stado (ili jato), ali ne i pojedinačna grla.

Uzorci
1. 2. 3. 4.

Parenhimatozni organi (srce, pluća, jetra, slezina) Feces ili oguljena intestinalna mukoza Krv, serum Fetus, placenta
Živina: 1., 2., 3., plus: 4. uginuli embrioni sa ljuskom 5. oboleli pilići 6. ceo leš

Kultura
Pre-enrichment media
Buffered peptone water Universal pre-enrichment broth

Podloge za obogaćivanje
selenit F, selenit cistein bujon brilijant zeleno bujon Rappaport-Vassiliadis bujon

Selektivne podloge
xylose lysine desoxycholate (XLD) agar desoxycholate citrate agar bismuth sulphite agar briliant green agar Rambach agar Endo agar SS agar

Pre-enrichment media
• broj bakterija u uzorcima kod subkliničkih slučajeva, u uzorcima iz okoline i u hrani životinja je obično nizak pa je neophodno koristiti pre-enrichment media kao što su:
– Buffered peptone water – Universal pre-enrichment broth

* nije najbolji metod za izolaciju salmonela koje slabije rastu, kao što su sojevi adaptirani prema domaćinu zbog prerastanja konkurentnih μo

Enrnichment media
• je tečna/polutečna podloga koja sadrži aditive koji selektivno dozvoljavaju rast salmonela, a delom inhibišu rast dr. bakterija • toksične su prema nekim sojevima Salmonella (npr. selenit prema S. Choleraesuis i brilijant zeleno prema nekim sojevima S. Dublin)

• Primeri: – selenit F/cistein – brilijant zeleno – Rappaport-Vassiliadis bujon

Enrnichment media

Salmonella in Selenite Broth (right - control)

Brilliant Green Bile Broth

Selektivne podloge
• radi se o čvrstom agaru koji sadrži inhibitorne aditive za rast drugih bakterija osim salmonela, kao i aditive koji će pružiti informacije o osnovnim diferencijalnim biohemijskim karakteristikama (izostanak fermentacije laktoze, produkcija H2S) • Inkubacija na 37°C tokom 24-48h • Formiraju se karakteristične kolonije salmonela, koje se teže razlikuju samo od Pseudomonas i Proteus kolonija

Selektivne podloge
• • • • briliant green agar xylose lysine desoxycholate (XLD) agar desoxycholate citrate agar bismuth sulphite agar

• Hromogeni agar: • Rambach agar
”...contains chromogenic substrates... Certain enzymes, produced by some bacteria, cleave these substrates, resulting in the different coloration of certain bacteria colonies.”

• SMID • ASAP

Selektivne podloge

Briliant green agar (BGA)

XLD

Selektivne podloge

desoxycholate citrate agar (DCA)

Bismuth sulphite Agar (Wilson Blair Medium)

Briliant green agar (BGA)

BGA: Salmonella Citrobacter Shigella

XLD Agar

Citrobacter

Salmonella

Shigella

(Low pH usually inhibits formation of the black compound, FeS.)

Xylose-lysindesoxycholat-agar (XLD)

Selektivne podloge
• Hromogeni agar: Rambach agar

Salmonella - red other bacterial colonies - blue, violet or colourless

Salmonella – čista kultura

Endo agar
(ne spominje se u OIE priručniku)

• Engo agar je diferencijalna i selektivna podloga
– diferencijalna – diferencijacija lactoza + i laktoza – μo – selektivna – inhibiše rast G+ μo jer sadrži Na-sulfit i fuksin

S. Typhimurium: Bezbojne kolonije

μo E. coli Salmonella Shigella Citrobacter

Laktoza + -

E. coli: Crvene do crveno-crne kolonije sa metalnim odsjajem

SS (Salmonella-Shigella) agar
(ne spominje se u OIE priručniku)

ID sumnjivih kolonija
• sumnjive kolonije se inokulišu na selektivne i neselektivne podloge. Ako postoji čist, obilan rast vrši se aglutinacija sa polivalentnim Salmonella-tipizirajućim serumom • nekad ne dolazi do aglutinacije ili postoji auto aglutinacija pa je potrebno uraditi biohemijske testove radi potvrde identiteta

Biohemijski testovi
Fermetišu U.H. do kiseline i gasa, ali ne i laktozu laktozu. Laktoza – Ureaza – KCN – Indol –
Kligler’s Iron Agar (TSI – Triple Sugar Iron Agar):
Fenol crveno Glukoza 0.1% Laktoza 1% Saharoza 1% FeSO4 Indikator. Ako je stvorena kiselina, boji se u žuto. Ako je fermentisana samo glukoza, stvara se malo kiseline, dovoljno da se oboji samo dno (butt) epruvete Ako kultura fermentiše bilo laktozu ili saharozu, stvara se mnogo kiseline, pa se fenol crveno boji u žuto u celoj epruveti, od dna do vrha. Izvor SUMPORA

Lactose – H2 S + Salmonella Proteus

Ureaza -

Ureaza +

Butt --------------- Slant

TSI ( Kligler)

Slant: R – RED – ne fermentiše ni laktozu ni saharozu Y – YELLOW – fermentiše laktozu ili saharozu

Butt: R – RED –bez fermentacije, μo je obligatni aerob Y – Yellow – došlo di fermentacije, stvoreno je nešto gasa, μo je fakultativni aerob YG – GAS – balončići ili pukotina u agaru + – Black – stvoren je H2S

Serotipizacija
• Aglutinacijom na pločici, upotrebom specifičnog antiseruma, određuje se prisustvo O, H i u posebnim prilikama Vi antigena
(Vi Ag prisutan samo kod: S. Typhi, S. Paratyphi C i S. Dublin)

Serotipizacija
• U slučaju bifazičnih μo potrebno je odrediti obe faze H Ag (polučvrsti agar sa antiserumom)

Imunološke metode i prepoznavanje nukleinske kisiseline
• Imunomagnetska separacija • ELISA • PCR
• Gene probe PCR metode • Real time PCR • Kvantitativna PCR itd.
* Ni jedna od navedenih metoda nije odgovarajuća za direktnu detekciju salmonela, i upotreba selektivnih faza obogaćivanja je neophodna

Serološke metode
• Rapid Slide Agglutination Test • Serum Agglutination Test • ELISA za S. Enteritidis

ELISA za S. Enteritidis
• Postoje 2 osnovna sistema za otkrivanje IgG: 1. Indirektna ELISA 2. Kompetitivna sendvič ELISA