1.

INTRODUÇÃO

Atualmente é muito importante o conhecimento de Espectrofotometria em

análises químicas, devido o fato expõem-se os conteúdos básicos para compreensão de tal
assunto.
Primeiro o conceito, Espectro que é o registro das características espectrais de
uma substância, mostrando a quantidade de energia absorvida ou emitida a cada comprimento
de onda ou de freqüência do espectro eletromagnético.
Espectro eletromagnético é um arranjo da radiação conhecida de acordo com o
comprimento de onda ou energia de fóton; já o instrumento espectrofotômetro que permite o
desmembramento da radiação policromática, por meios dispersivos (rede ou prisma) ou não
dispersivos (interferômetros), permitindo determinar a intensidade da radiação nos diferentes
comprimentos de onda, através da obtenção do espectro, isto é, fornecendo a razão, ou uma
função da razão, do poder da radiação de dois feixes em função do comprimento de onda
espectral.
A radiação infravermelha corresponde aproximadamente a parte do espectro
eletromagnético situada entre regiões do visível e das microondas, sua maior utilização são
para compostos orgânicos, que está situada entre 4.000 e 400 cm-1.
Banda de absorção é o registro, num espectro, da absorção da radiação
incidente numa amostra, num intervalo de freqüências.

2. FUNCIONAMENTO DO APARELHO

O funcionamento consiste em passar um feixe de energia radiante através da

solução e medir sua absorção, assim, utiliza-se um colimador que localiza o feixe especifico
de luz sobre um prisma de quartzo, que decompõe a luz nas cores do espectro. O feixe de luz
monocromática especifico a ser usado é localizado por uma fenda seletora e enviado para uma
cubeta contendo a solução a ser analisada. A luz transmitida é medida por uma fotocélula

1
acoplada a um galvanômetro, portanto, a diferença é a luz absorvida. Um feixe de energia
radiante (luz) atravessa a solução e a quantidade desta luz que for absorvida pela substancia
informa obre a quantidade e a qualidade dos componentes desta solução.
Nota-se que há duas fontes de radiação, as lâmpadas de deutério e tungstênio,
cujas emissões são focalizadas através de uma lente sobre a amostra. Portanto, todo o espectro
de emissão da lâmpada incide sobre a mesma, sendo que a radiação incidente será, em parte,
absorvida. Esta radiação que atravessa a amostra (transmitida ou emergente) ira incidir sobre
uma lente que focaliza o feixe sobre uma fenda, e desta sobre uma grade de difração. Esta
grade irá difratar a radiação, separando seus diferentes comprimentos de onda, sendo que cada
um deles irá incidir sobre um diodo do arranjo. Este diodo, ao ser irradiado, produz uma
corrente elétrica cuja magnitude depende da intensidade da emissão (se aplica o efeito
fotoelétrico).
Na faixa correspondente aos raios IV, nenhuma sensação de cor pode ser
observada, enquanto que no espectro visível, existe correspondência entre o comprimento de
onda e a cor. O comprimento de onda é simbolizado pela letra grega lambda (λ) e é medida
em nanômetros (nm). As faixas visíveis, que podem ser vistas pelo olho humano e sem ajuda
de aparelhos, vai de 400 a 750 nm. As lâmpadas usadas no espectro visível são de tungstênio
e na espectroscopia na região ultravioleta utiliza normalmente uma lâmpada de deutério.

3. APARELHAGEM E INSTRUMENTOS

Para as medidas na região do infravermelho médio (2.5 a 50µm), são muitas as

diferenças entre os instrumentos da espectrofotometria no UV e no visível, e os instrumentos
destinados ás determinações no infravermelho.
Estas modificações são ditadas, principalmente, pelo fato de o vidro e o quartzo
absorverem fortemente na região infravermelha e de as células fotomultiplicadoras serem
insensíveis a radiação infravermelha.
Empregam-se bastantes superfícies espelhadas na face frontal a fim de evitar-se
a passagem da radiação através de camadas de vidro ou de quartzo, a reflexão das superfícies
metálicas é em geral muito eficiente na região infravermelha.
As células de absorção e as janelas dos instrumentos, no entanto, devem ser
fabricadas com materiais transparentes ao infravermelho. A seguir na tabela estão as

2
substâncias que se usam mais comumente com a radiação infravermelho, com as respectivas
bandas de transmissão utilizáveis.

As principais fontes de radiação infravermelho que se usam nos

espectrofotômetros são: um fio de níquel-cromo (nichrome) montado sobre um suporte de
cerâmica; uma lâmpada de Nernst, que é constituída por um filamento de óxidos de zircônio,
de tório e cério aglutinados por um cimento apropriado; uma lâmpada Globar, que tem um
bastão de carbeto de silício aglutinado. Estas fontes são aquecidas eletricamente a
temperaturas na faixa de 1.200 – 2.000°C, na qual ficam incandescentes e emitem radiação
infravermelha com um espectro parecido com o do corpo negro.
Os espectrofotômetros de infravermelho tradicionais eram construídos com
monocromadores de prismas de cloreto de sódio ou d brometo de potássio. Estes prismas
tinham a desvantagem de serem higroscópicos e também de exigirem duas unidades
diferentes para se operar na região do infravermelho médio, a fim de se conseguir dispersão
conveniente sobre toda a região.
Por estas razões, as redes de difração substituíram os prismas como os
dispositivos principais de monocromatização na região infravermelha.
As redes têm poder de resolução mais elevado que os prismas e podem ser
projetadas para operar eficientemente sobre uma região espectral mais ampla que os prismas.
Mesmo assim, a maioria dos instrumentos de rede opera com duas redes,
havendo uma substituição automática da rede nas vizinhanças de 2.000 cm-1. O esquema de
um espectrofotômetro de infravermelho de rede esta na Figura 3.2.

3
 A detecção do sinal de infravermelho tem, como é claro, importância
primordial. Dispõe-se de vários detectores para este fim, e o tipo usado num instrumento
dependerá do tipo e da qualidade do espectrofotômetro.

4. MANUSEIO DAS AMOSTRAS

O manuseio das amostras é a parte mais difícil e demorada de uma análise

espectrométrica no infravermelho, essas amostras podem ser gasosas, líquidas ou sólidas.

4.1 GASES

O espectro de um líquido de ponto de ebulição baixo ou gás pode ser obtido

expandindo-se a amostra em uma célula cilíndrica evacuada dotada de janelas apropriadas.
Para esse propósito, uma variedade de células cilíndricas está disponível, com ópticos que vão
de alguns centímetros a 10 m ou mais.
Os caminhos ópticos mais longos são obtidos em células compactas com
superfícies internas refletoras, de modo que o feixe faz numerosas passagens pela amostra
antes de sair da célula.

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4.2 LÍQUIDOS

Quando a quantidade de uma amostra líquida é pequena ou quando um

solvente um solvente apropriado não está disponível, é pratica comum obter-se o espectro do
líquido puro. Em geral uma gota do líquido puro é espremida entre duas placas de sal de rocha
para produzir uma camada com espessura de 0,01 mm ou menos. Tal técnica não fornece
dados de transmitância reprodutíveis, mas os espectros resultantes são normalmente
satisfatórios para investigações qualitativas.
Amostras de líquidos puros podem conter água suficiente para embaçar as
placas de sal e tornar necessário um polimento periódico das mesmas.

4.3 SÓLIDOS

A maior parte dos compostos orgânicos apresenta numerosos picos de absorção

na região do infravermelho médio, e encontrar um solvente que não tenha picos que se
superpõem é quase impossível.
Por isso, os espectros são freqüentemente obtidos com dispersões do sólido em
uma matriz sólida ou líquida. Geralmente, nessas técnicas, a amostra precisa ser moída até
que o tamanho das partículas seja menor que o comprimento de onda da radiação, para evitar
os efeitos de espelhamento de radiação. Uma das técnicas mais populares para manuseio de
amostras sólidas é o pastilhamento com KBr; já o espectro no infravermelho de sólidos que
não são solúveis em um solvente transparente no infravermelho ou que não podem ser
convenientemente transformadas em pastilhas com KBr são obtidos dispersando-se o analito
em um óleo mineral ou hidrocarboneto fluorado dispersantes. As dispersões são feitas
moendo-se 2 a 5 mg da amostra finamente pulverizada na presença de uma ou duas gotas de
um óleo de hidrocarboneto pesado (Nujol); a dispersão resultante é examinada como um filme
entre placas salinas planas; o comportamento de sólidos no infravermelho pode também ser
obtido por técnicas de reflectância e pelo método fotoacústico.

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5. TIPOS DE LASER

A chamada radiação infravermelha (IR) corresponde aproximadamente à parte

do espectro eletromagnético situada entre as regiões do visível e das microondas. A porção de
maior utilidade para a área da química está situada entre 4000 e 400 cm -1, que é chamada de
região do infravermelho médio (MIR). As outras regiões, do infravermelho próximo (14290-
4000 cm-1) e do infravermelho distante (700-200 cm-1) tem também atraído atenção.
Embora o espectro de infravermelho seja característico da molécula como um
todo, certos grupos de átomos dão origem a bandas que ocorrem mais ou menos na mesma
freqüência, independente da estrutura da molécula. È justamente a presença destas bandas
características de grupos que permitem ao químico a obtenção, através do exame do espectro
e consulta a tabelas, de informações estruturais úteis, e é neste fato que baseamos para fazer a
identificação das estruturas.
Uma lâmpada de tungstênio é uma excelente fonte de radiação contínua na
região do visível e do infravermelho próximo. Um filamento de tungstênio opera,
normalmente, em uma temperatura próxima de 300K e produz radiação útil na faixa de 320 a
2500 nm. Essa faixa cobre toda a região visível e parte das regiões infravermelha e
ultravioleta. A espectroscopia na região ultravioleta utiliza normalmente uma lâmpada de
deutério, na qual uma descarga elétrica (um arco, uma espécie de centelha elétrica) provoca a
dissociação do D2 e a emissão da radiação ultravioleta de 200 a 400 nm (mostrada na figura
abaixo). Em um espectrofotômetro ultravioleta-visível típico, a troca entre as lâmpadas de
deutério e tungstênio é feita entorno de 360 nm, de forma que esteja sempre sendo usada a
fonte mais intensa. Para as regiões visíveis e ultravioleta também são muito utilizadas
lâmpadas de descarga elétrica cheias com vapor de mercúrio ou gás xenônio. Existem
lâmpadas diferentes para quase todos os metais. Altamente sensível, é o método de escolha
para dosar mercúrio.

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6. LEITURA DE RESULTADOS

Pequenas diferenças na estrutura e na constituição de uma molécula resultam

em mudanças significativas na distribuição dos picos de absorção nesta região do espectro,
que se estende cerca de 1200 a 700 cm-1 (8 a 14 µ m). Em conseqüência, uma semelhança
estreita entre dois espectros nessa região de impressões digitais constitui-se em forte
evidência da identidade dos compostos que produziram os espectros.
Os espectros no infravermelho possuem uma característica única,
principalmente na região de impressão digital. As duas moléculas diferem apenas por um
grupo metila e, no entanto, os espectros diferem significativamente em suas aparências na
região de impressão digital.
O estabelecimento indubitável da identidade ou da estrutura de um composto
dificilmente é possível apenas à partir das tabelas de correlação. Aparecem incertezas
principalmente devido a freqüência de grupos superpostos, variações espectrais devido ao
estado físico da amostra e limitações instrumentais.
Ao se usar as freqüências de grupos, é essencial que todo o espectro, em vez de
uma pequena parte isolada, seja considerado e inter-relacionado. Uma interpretação baseada
em uma parte do espectro deveria ser confirmada ou rejeitada pelo estudo de outras regiões.
As tabelas de correlação servem apenas como guias para um estudo posterior mais cuidadoso.
Um estudo das características de absorção de grupos funcionais, bem como de
outras propriedades físicas da amostra, podem permitir a identificação inequívoca. A
espectroscopia no infravermelho, quando usado em conjunto com outros métodos,
normalmente torna possível a identificação positiva de uma espécie.
As tabelas de correlação dificilmente bastam para a identificação positiva de
um composto orgânico a partir de seu espectro de infravermelho. Há, no entanto, vários
catálogos de espectros no infravermelho disponíveis que ajudam uma identificação qualitativa
fornecendo espectros de um grande número de compostos puros para a comparação. A busca
manual de catálogos de espectros grandes é lenta e tediosa. Por esta razão, sistemas de busca
por computador têm sido amplamente usado nos últimos anos.
Atualmente, os fabricantes de instrumentos oferecem sistemas de busca para
auxiliar o químico a identificar compostos a partir de dados armazenados de espectros no
infravermelho. Os bancos de memória desses instrumentos são capazes de armazenar perfis de
cerca de 100 mil compostos puros.

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7. TIPOS DE APARELHOS

A Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIV) é uma

técnica de análise para colher o espectro infravermelho mais rapidamente. Em vez de se
coletar os dados variando-se a freqüência da luz infravermelha monocromática, a luz IV (com
todos os comprimentos de onda da faixa usada) é guiada através de um interferômetro. Depois
de passar pele amostra o sinal medido é o interferograma. Realizando-se uma transformada de
Fourier no sinal resulta-se em um espectro idêntico ao da espectroscopia IV convencional
(dispersiva).
Os espectrofotômetros FTIV são mais baratos do que os convencionais porque
é mais simples construir um interferômetro do que um monocromador. Em adição, a medida
de um único espectro é bem mais rápida nessa técnica porque as informações de todas as
freqüências são colhidas simultaneamente. Isso permite que se façam múltiplas leituras de
uma mesma amostra e se tire a média delas, aumentando assim a sensibilidade da análise.
Devido às suas várias vantagens, virtualmente todos os espectrofotômetros de infravermelho
modernos são de FTIR.
Dentre os tipos de reflexão mais usados estão os de espectrometria de reflexão
difusa e de reflectância total atenuada. A espectrometria de reflexão difusa no infravermelho
com transformada de Fourier (em inglês, DRIFTS) pode ser um método efetivo de se obter
espectros de infravermelho diretamente de amostras pulverizadas com um mínimo de
preparação da amostra. Além de poupar tempo na preparação da amostra, permite a aquisição
de dados convencionais de infravermelho em amostras que não foram alteradas
significativamente em relação a sua forma original.
A reflexão difusa é um processo complexo que ocorre quando um feixe de
radiação atinge a superfície de um pó finalmente dividido. Com esse tipo de amostra, ocorre
reflexão especular em cada superfície plana. No entanto, como há muitas destas superfícies e
elas estão orientadas aleatoriamente, a radiação é refletida em todas as direções.
Na espectrofotometria de reflectância total atenuada, utiliza-se um sensor
especial baseado na radiação que passa por um guia de onda recoberta, ou seja, o sinal é
reduzido pela presença de analito.

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 Quando a radiação passa pela guia de onda, ela é totalmente refletida por
ambas as superfícies. Na superfície superior existe uma fina camada de vidro poroso, de baixo
índice de refração, impregnado com um indicador específico para a amostra.
A cada vez que os raios de radiação se deslocam a partir da superfície
superior, parte da onda evanescente é absorvida pelo complexo metálico e menos a radiação é
refletida. A intensidade da radiação que emerge do sensor diminui quando o que se procura na
amostra está presente.
Essa é uma técnica geralmente utilizada para se obter espectros de
infravermelho de amostras que são de difícil manuseio, como sólidos de solubilidade limitada,
filmes, pastas, fios, adesivos e pós.
Outro método conhecido é a espectroscopia fotoacústica no infravermelho,
assim como estudos espectrais no ultravioleta e visível, a técnica é aplicada proveitosamente
em amostras sólidas e líquidas que são de difícil manuseio por técnicas comuns, devido sua
tendência de espalhar radiação. Além disso, o método tem sido usado para detectar
componentes de misturas separadas por cromatografia em camada delgada ou cromatografia
líquida de alta eficiência. A maior parte desse trabalho tem sido realizada com instrumentos
com transformada de Fourier, devido a sua melhor característica de sinal-ruído. A maioria dos
fabricantes oferece células fotoacústicas como acessórios para instrumentos FTIR.
A espectroscopia fotoacústica no infravermelho também tem sido usada para
monitorar concentrações de poluentes na atmosfera.

9
8. FERRAMENTAS MATEMÁTICAS

As transformadas contínuas e discretas de Fourier têm muitas aplicações em

disciplinas científicas em Física, Física e Química Quântica, Teoria dos números, Estatística,
Óptica, entre outras. Nos campos relacionados com o processamento de sinal, a trans formada
de Fourier é tipicamente utilizada para decompor um sinal nas suas componentes em
freqüência e suas amplitudes. As transformadas são operadores lineares e, com a devida
formalização, são também unários uma propriedade conhecida como o teorema de Pontryagin.
As transformadas são invertíveis, e a transformada inversa tem quase a mesma forma que a
transformada. As funções de base sinusoidal são funções de diferenciação, o que implica que
esta representação transforma equação diferencial linear com coeficientes constantes em
equações algébricas ordinárias. (por exemplo, um sistema linear invariante no tempo, a
freqüência n é uma quantidade conservada, logo o comportamento em cada freqüência pode
ser resolvido independentemente).
Por meio do teorema de convolução, as transformadas tornam a complicada
operação de convolução em multiplicações simples, o que as torna um método eficiente de
calcular operações baseadas em convolução, como a multiplicação polinomial, a
multiplicação de números grandes e o calculo da função densidade de probabilidade de uma
soma de variáveis aleatórias. A versão discreta da transformada de Fourier pode ser calcula
rapidamente por computadores, utilizando algarismos baseados na transformada rápida de
Fourier.
Geralmente, a denominação “Transformada de Fourier” refere-se a
transformada de Fourier para funções continuas, que representa qualquer função integrável,
como a soma de exponenciais e amplitude complexa.

10
 Transformada de Fourier para funções contínuas

Para uso em computadores, tanto para aplicações científicas ou em

processamento digital de sinal, é preciso ter valores xk discretos. Para isto existe a versão da
função transformada para funções discretas.
Um método largamente utilizado para o cálculo computacional desta versão é o
transformada rápida de Fourier algoritmo FFT ( Fast Fourier Transform) cuja complexidade é
O(“n” log “n”) contra O(n2) necessários para o mesmo cálculo, porém pela definição.

9. FUNCIONAMENTO INTERNO

A figura abaixo mostra as características essenciais de um espectrofotômetro

de feixe simples. A radiação proveniente de uma fonte é separada em pequenos intervalos de
comprimentos de onda por um monocromador, passa através de uma amostra e é medida por
um detector. Medimos, inicialmente, a intensidade de energia radiante (P0, watts/m2) que
atinge o detector usando uma célula com a referência (um branco, ou um solvente ou um
reagente), que é colocado no compartimento da amostra. Quando a referencia é substituída
pela amostra de interesse, normalmente alguma radiação é absorvida, e a energia radiante que
atinge o detector (P) é menor que P0. a razão P/ P0, que é um número entre 0 e 1, é a
transmitância (T). A absorvância, que é proporcional à concentração, é A = log P0/P = - log T.

Figura 9.1 - Espectrofotômetro de feixe simples

11
 Um espectrofotômetro de feixe simples não é cômodo, pois a amostra e a
referência têm que ser colocadas alternadamente no caminho do único feixe de radiação. Para
medidas em diferentes comprimentos de onda, devemos medir a referencia a cada
comprimento de onda. Um instrumento de feixe simples não é adequado para medidas de
absorvância em função do tempo, como por exemplo, em experimentos de cinética química,
pois tanto a fonte de radiação como o detector apresentam pequenas variações.
A figura a seguir mostra esquematicamente um espectrofotômetro de feixe
duplo, em que a radiação direcionada por um espelho rotatório (o alternador de feixe), passa
alternadamente através da amostra e da referência. Quando a radiação passa pela amostra, o
detector mede a energia radiante P. quando o alternador faz a radiação passar através da
referência, o detector mede P0. O feixe passa alternadamente através da amostra e da
referência várias vezes a cada segundo, e o instrumento compara automaticamente P e P 0 de
modo a obter a transmitância e a absorvância. Esse procedimento, em que as intensidades da
radiação que emergem das duas cubetas são comparadas freqüentemente, permite a correção
automática para as variações na intensidade da fonte e na resposta do detector com o tempo e
com o valor de comprimento de onda. A maioria dos espectrofotômetros de qualidade permite
uma varredura automática do espectro em termos de comprimento de onda e o registro
contínuo da absorvância contra comprimento de onda.

Figura 9.2 - Espectrofotômetro de feixe duplo

12
 Um procedimento de rotina em espectrofotômetros de duplo feixe é obter
inicialmente uma linha de base usando-se a solução de referencia em ambas as cubetas. O
valor da absorvância da linha de base, em cada comprimento de onda, é então subtraído do
valor da absorvância medido para a amostra, de modo a se obter o valor real da absorvância
da amostra em cada comprimento de onda.
Um espectrofotômetro ultravioleta-visível de duplo feixe, mostrado a seguir, a
radiação correspondente a região do visível é proveniente de uma lâmpada incandescente com
filamento de tungstênio e bulbo de quartzo, contendo uma atmosfera rarefeita de halogênio.
Na região do ultravioleta a fonte é uma lâmpada de descarga elétrica em deutério, que emite
na faixa espectral de 200 a 400 nm. Apenas uma das lâmpadas é usada de cada vez. A rede de
difração 1 seleciona uma faixa estreita de comprimentos de onda pra incidir no
monocromador. Este, por sua vez, estreita ainda mais a faixa de comprimento de onda que
passara através da amostra. Após ser alternado e transmitido através da à ostra e da
referência, o sinal é detectado por uma fotomultiplicadora (um tubo fotomultiplicador), que
produz uma corrente elétrica proporcional à intensidade de energia radiante.

13
 Figura 9.3 - Diagrama esquemático do banco óptico do instrumento

10. LIMITAÇÕES DO APARELHO

10.1 LINEARIDADE/SENSIBILIDADE

Quando executado de acordo com o recomendado, o teste é linear até 15

mg/dL, amostras com valores superiores a 15 mg/dL devem ser diluídas com solução salina a
ponto de ficar entre 0-15 mg/dL e então os resultados devem ser multiplicados pelo fator de
diluição. (Sensibilidade: 0,389 mg/dL).

10.2 INTERFERÊNCIAS

14
 Deve-se ter cuidado para evitar a contaminação de fósforo. O uso de tubos
descartáveis ou cubetas de plástico é recomendado.
Amostras hemolisadas, lipêmicas e ictéricas podem causar resultados
falsamente elevados. Neste caso, sugere-se branco de amostra. Para 1,0 mL de solução salina
0,9%, adiciona-se 2 mL de amostra e ler absorbância contra o branco de solução salina em
340 nm. Subtrai-se a absorbância do branco da amostra da absorbância do desconhecido.
Quando executado de acordo com o recomendado, o teste é linear até
1000mg/dL. Amostras com valores superiores a este valor devem ser diluídas com solução
salina a ponto de ficarem entre 0,64 e 1000 mg/dL, e os resultados devem ser multiplicados
pelo fator de diluição. A sensibilidade do ensaio é de 0,640 mg/dL.
Ou seja, o aparelho não tem limites consideráveis, a sua limitação esta em manusear
corretamente as amostras e não deixar que haja interferência do ambiente onde ele está.

11. EXEMPLOS DE BANDAS DE ALGUNS COMPOSTOS

Devido à importância do compreendimento e estudo das bandas dos compostos

em espectrometria, a seguir tem a exemplificação de bandas de alguns compostos.

15
Figura 11.1 - Banda de alcano

Figura 11.2 - Banda de alceno

16
Figura 11.3 - Banda de álcool

Figura 11.4 - Banda de alcino

17
Figura 11.5 - Banda de composto aromático

Figura 11.6 - Banda de aldeído

18
 Figura 11.7 - Banda de cetona

Figura 11.8 - Banda de ácido carboxílico

19
 Figura 11.9 - Banda de éster

Figura 11.10 - Banda de haleto

20
12. INDICAÇAO DE USO NA INDÚSTRIA E NA SAÚDE

A importância da espectrometria no infravermelho para o trabalho do químico

pode ser medida pelo numero de livros publicados que se dedicam inteiramente, ou em parte,
à discussão da aplicação deste. Existem muitas compilações de espectros, bem como índices
para coleções de espectros e para a literatura. Dentre estas, as mais comumente utilizadas são
as publicações por Sadtler (1972) e pela Aldrich (1985).
Um dos exemplos que a espectrofotometria pode fazer, é a medida contínua de
O2 e CO2 nas vias respiratórias de uma pessoa saudável. O O2 é detectado pela absorção da
radiação ultravioleta no comprimento de onda de 147 nm. O CO2 é detectado pela absorção da
radiação infravermelha no numero de onda de 2,3 X 103 cm-1. [P. B Amoudse, H. L. Pardue, J. D.
Bourland, R. Miller, and L. A. Geddes, “Breath-by-Breath Determination of O2 and CO2 Based on
Nondispersive Absorption Measurements” , Anal. Chem. 1992, 64, 20.].
É possível também observarmos uma única molécula de DNA com um
sinalizador molecular. A cadeia de único elo, proveniente do ácido desoxirribonucléico
(DNA) ou do acido ribonucléico (RNA), mostrada na figura abaixo, pode funcionar como um
“sinalizador molecular”. As duas terminações da molécula encontram-se interligadas por meio
de ligações de hidrogênio, criando uma estrutura em forma de “grampo de cabelo”. Por meio
de um processo químico, uma molécula de um corante fluorescente, F, adicionada a uma das
pontas da cadeia e uma molécula supressora de fluorescência, Q, é adicionada à outra ponta.
Quando a molécula de corante absorve um fóton, a energia de excitação é transferida de
maneira eficiente para a molécula supressora vizinha, que dissipa essa energia sob a forma de
calor, em vez de luz. Como conseqüência, há pouca fluorescência a partir do sinalizador
molecular. Quando DNA ou RNA complementar é adicionado, ele se liga ao “grampo de
cabelo”, forçando a abertura das pontas da cadeia do sinalizador, o que afasta a terminação
fluorescente da terminação supressora. Agora, o corante torna-se fluorescente, pois o
supressor está muito distante para que ocorra uma transferência eficiente de energia entre eles.
A seqüência molecular do sinalizador é projetada para se associar a um determinado tipo de
DNA. Quando este DNA complementar é encontrado, ocorre um grande aumento na

21
fluorescência. O sinalizador “acende”! Os sinalizadores moleculares estão sendo
desenvolvidos para detectar mutações genéticas e vírus, bem como para analisar sangue e
tecidos transplantáveis. A figura abaixo nos da uma idéia de como funciona o processo.

Figura 12.1 - Esquematização do processo

As aplicações analíticas da espectrofotometria se fundamentam na

proporcionalidade entre a absorvância e a concentração, expressa analiticamente por meio da
Lei de Beer. A absorvância de uma mistura é a soma das absorbâncias dos componentes
individuais presentes na mistura. De uma maneira simples, podemos determinar a
concentração de duas espécies em uma mistura por cálculos feitos a mão. Para isso,
resolvemos um sistema de duas equações lineares para absorvância em dois comprimentos de
onda diferentes. Este procedimento torna-se mais exato se os dois espectros de absorção não
têm muita superposição.
Dentre outros processos que a espectrofotometria é utilizada estão,
controle de hemodiálise, titulação espectrofotométrica, o uso em usinas de açúcar e álcool e
até determinação de acido tricloroacético em urina.

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13. REFERÊNCIAS

HARRIS, D. C. Análise química quantitativa. Tradução de José Alberto Portela Bonapace

e Oswaldo Esteves Barcia. Rio de Janeiro: LTC, 2005.

SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, F. X. Identificação espectrométrica de compostos

orgânicos. Tradução de Paula Fernandes de Aguiar e Ricardo Bicca de Alencastro. Rio de
Janeiro: LTC, 2000.

VOGEL, A.I. Análise química quantitativa. 5ª edição. Rio de Janeiro: Editora LTC, 2002.

WILLIE, A. B. Manual de espectroscopia vibracional. Editora McGraw-Hill, Ltda. São

Paulo.

Espectrofotometria de infravermelho médio. Disponível em <http://www.scielo.br>.

23