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UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS


DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES TRANSMISIBLES
CATEDRA DE INMUNOLOGIA

PRACTICA Nº 3
INMUNO-DIFUSION EN AGAR. GEL

OBJETIVOS:
1) Definir lo que es la reacción de precipitación.
2) Comprender cuál es el fundamento teórico de esta reacción.
3) Explicar la Curva de Precipitación.
4) Describir y clasificar las pruebas basadas en el fenómeno de precipitación.
5) Conocer el uso clínico y/o laboratorio que se da a cada una de ellas.

INTRODUCCIÓN

Los antígenos y los anticuerpos interactúan entre sí a través de fuerzas reversibles no


covalentes para formar complejos antígeno-anticuerpo. Cuando un antígeno soluble se une a su
anticuerpo específico se forma un precipitado que consiste en complejos Ag-Ac. La interacción
de antígeno soluble con un anticuerpo soluble se denomina entonces reacción de precipitación.
Este principio se puede aplicar a la determinación cualitativa y/o cuantitativa de Ag y Ac. En esta
interacción influyen principalmente la fuerza iónica, el pH del medio y la concentración de los
reactores.

M. Heidelberger y col., emplearon la reacción de precipitación como método cuantitativo para


determinar la cantidad de anticuerpo presente en un antisuero. Para ello, se mezclaron en una
serie de tubos, cantidades crecientes de antígeno con una cantidad constante de antisuero
específico. Después de la incubación, se analizaron el sobrenadante y el precipitado. La
cantidad de precipitado estaba determinada por las proporciones relativas de los reactivos: a
concentraciones bajas de antígeno, no se forma nada de precipitado. A medida que aumenta la
cantidad de antígeno, aumenta la cantidad de precipitado formado hasta alcanzar un punto
máximo; si continúa agregándose antígeno, la cantidad de precipitado disminuye en forma
gradual hasta no observarse nada en los tubos en los que existe gran cantidad de antígeno. Si se
grafica la cantidad de precipitado formado vs la cantidad de antígeno agregada, se construye una
curva, llamada Curva de Precipitación (Fig.1), en la cual pueden observarse tres zonas:

Zona de exceso de Ac: en la cual se produce una cantidad discreta de complejos y por
consiguiente, de precipitado, y existen Ac libres en la solución.
Zona de Equivalencia: aquí se produce la máxima cantidad de complejos y precipitado, y no
hay Ac ni Ag libres en la solución. Es decir, aquí la mezcla de antigeno y antisuero es apropiada
para la precipitación completa del anticuerpo y el antigeno.
Zona de exceso de Ag: en donde se forman cantidades pequeñas de complejos, pero queda Ag
libre en la solución.

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Estos resultados se deben al hecho de que los anticuerpos son bivalentes, y por eso sólo son
capaces de unir dos epítopes a la vez, mientras, los antígenos suelen ser multivalentes (tienen
muchos epítopes). Así, en la zona de exceso de Ac, cada Ag tendrá la posibilidad de unirse a
tantos Ac como determinantes antigénicos expuestos posea, de manera que cada molécula de Ag
está cubierta de Ac, estos complejos son pequeños y se forma escasa cantidad de precipitado. En
la zona de exceso de Ag, los sitios de unión del Ac son rápidamente ocupados por los Ag (cada
molécula de Ac se une a un par de moléculas de Ag), por tanto, aquí también el precipitado es
poco. En cambio, en la zona de equivalencia, existen proporciones equilibradas de Ac y Ag, por
lo cual se establecen una gran cantidad de enlaces cruzados (cada molécula de Ac está unida a
mas de una molécula de Ag, y cada molécula de Ag está unida a mas de una molécula de Ac).
Esto origina la formación de enrejados estables o mallas, las cuales, al alcanzar cierto tamaño, se
hacen insolubles y precipitan (Fig.2).

Originalmente la reacción de precipitación se observó en medios líquidos contenidos en tubos,


posteriormente Oudin introdujo un método para observar la precipitación en medios semisólidos
(geles); este sistema permite observar la difusión simple del Ac y del Ag ya que la reacción se
expresa en forma de una banda de precipitado, aumentando la sensibilidad y el poder de
resolución que se observa en los medios líquidos.

La inmuno-difusión en agar gel es una prueba de precipitación en medio semi-sólido,


ampliamente utilizada en la actualidad en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y
parasitarias, que ofrecen algunas dificultades para ser detectadas.

METODOS DE INMUNO-DIFUSION:
Se han diseñado muchas variantes de la precipitación en gel. Además, aprovechando las
propiedades que tienen las proteínas de migrar en campos eléctricos, se ha facilitado el desarrollo
de variantes llamadas de difusión activa, con la ventaja de que poseen mayor sensibilidad y se
efectúan en menor tiempo que los métodos de difusión pasiva, sin la acción de los campos
eléctricos.

1.- Métodos de difusión pasiva:

Son aquellos que aprovechan la propiedad que tienen los geles de permitir la difusión
espontánea del Ag y del Ac, reaccionando y precipitando en forma de bandas visibles.

• Doble difusión:
En este método se dejan difundir los dos reactantes, uno hacia el otro en una capa plana
de agar, produciéndose el precipitado cuando se encuentran. La técnica de doble difusión
permite identificar la existencia de antígenos o anticuerpos en los líquidos corporales (Fig. 3).

Método de Ouchterlony:
Es una de las técnicas de doble difusión mas usadas para determinar en forma cualitativa
la presencia de Ag o Ac en una solución o líquido biológico. Para la realización de esta prueba se
abren orificios (5mm) en un gel aplicado sobre una placa de Petri o sobre un portaobjetos. Uno de
los orificios se llena con la solución de antígeno soluble y la otra con antisuero. Durante la
incubación, ambos reactivos difunden en forma radial dentro del agar. En el punto en que ambos
reactivos se encuentren en proporciones equivalentes aparecerá una línea blanca opaca de
precipitado. La Prueba de Coggin es un método de difusión en gel que se usa para detectar
anticuerpos contra el virus de la anemia infecciosa equina en el suero de estos animales. Aquí, el
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antígeno (obtenido de caballos infectados), se hace reaccionar con el suero del caballo problema
en un gel de agar; la aparición de una línea de precipitado constituye una reacción positiva. Puede
emplearse una prueba similar para identificar reses infectadas con el virus de la leucemia bovina.

• Método de Difusión radial (Inmunodifusión radial o Técnica de Mancini):


Es la técnica más segura y más ampliamente utilizada. Es una prueba cuantitativa ya que
permite la determinación exacta de la concentración del antígeno o del anticuerpo mediante un
método relativamente simple. En ella, el anticuerpo (un antisuero monoespecífico) se mezcla con
el agar, mientras éste está todavía fundido y se vierte seguidamente en una placa o en un porta-
objeto. Una vez endurecido, se corta una serie de orificios en él y se llena con un volumen
cuidadosamente medido de la muestra (o la solución que contenga el antigeno). Durante la
incubación, el antígeno difunde en el agar formando un precipitado con los anticuerpos
contenidos en éste, originándose un círculo opaco alrededor del orificio antigénico. La reacción
se observa entonces en forma de un anillo de precipitado alrededor del pozo, cuyo diámetro es
directamente proporcional a la concentración de antigeno utilizada. Terminado el tiempo de
incubación, se procede a medir el diámetro de los anillos y se calcula la cantidad de antigeno
realmente presente mediante la comparación con los resultados dados por soluciones estándar,
que se colocan en otros pocillos en la misma placa. (Fig. 4). Este método resulta común por la
facilidad de ejecución, la versatilidad y el bajo costo. No requiere de equipo especial y puede
utilizarse prácticamente con cualquier combinación de antígeno soluble y anticuerpo precipitante.
Su aplicación en el laboratorio clínico incluye su uso en la medición de la concentración de
diversas clases de Inmunoglobulinas o de componentes del Complemento presentes en el suero
de las personas y los animales domésticos.

2.- Métodos de difusión activa


Combinan los principios de la difusión y precipitación en gel con el uso de campos eléctricos
que aceleran el proceso de reacción Ag-Ac y se basan en la propiedad que tienen las proteínas de
separarse cuando se someten a una fuente eléctrica. Las mas usadas son:

• Inmonoelectroforesis:
Esta técnica mejora la resolución cuando se tienen mezclas complejas de antígenos ya que
consiste en separar la mezcla de antígenos por electroforesis antes de realizar la inmunodifusión.
Se emplea para identificar proteínas en los líquidos corporales. El principio de esta técnica
consiste en colocar la mezcla de antígenos (generalmente proteínas séricas) en un orificio
excavado en una placa de agar y aplicar un campo eléctrico durante una o dos horas con el
propósito de separar las moléculas de antígeno de acuerdo a su tamaño y movilidad
electroforética (Fig. 5). Luego se corta un canal o surco en el agar paralelo a la zona de
migración, en el cual se coloca un antisuero contra uno o varios de los antígenos (mono-
específico o poli-específico). Ambos, Ag y Ac difunden en forma pasiva y cuando se encuentran
se forman líneas curvas de precipitado (reacción positiva). Se origina un arco de precipitado para
cada uno de los pares Ag-Ac constituyentes de las mezclas usadas (pueden obtenerse de 25 a 40
bandas diferentes cuando se separan las proteínas de un suero normal). Por esto, esta técnica se
emplea para identificar la ausencia de una proteína sérica normal, como sucede en los animales
que tienen deficiencia congénita de alguno de los componentes del complemento. También, es
útil para detectar cantidades excesivas de algún componente, como por ejemplo en los casos de
discracias de linfocitos B como mielomas, macroglobulinemias, etc.

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• Electroinmunoensayo o electroforesis en cohete.
Es una técnica similar a la IDR en el sentido de que el antisuero se mezcla con el agar y
en él se cortan orificios donde se coloca la muestra (antígeno) en estudio. Pero, en vez de permitir
la difusión pasiva, se hace pasar una corriente eléctrica que provoca la migración del Ag que va
formando complejos con el anticuerpo hasta agotarse. En este trayecto se produce una banda de
precipitado en forma alargada que adquiere la forma de un cohete (Fig. 6). La longitud de la
banda es proporcional a la concentración de Ag que se coloca en cada orificio.

TRABAJO PRACTICO No. 3:

Materiales y Equipos
- Agar noble al 2 % - Solución de antígeno proteico
- Solución salina fisiológica o tamponada - Suero Inmune de conejo antiproteina
- Azida sódica o merthiolate - Pipetas serológicas
- Juego de sacabocados - Placas de Petri
- Erlenmeyer - Vaso de precipitado
- Incubadora

Procedimiento:
- En una placa Petri, vierta agar noble al 2 % hecho con solución salina fisiológica o
tamponada, que lleva añadido un conservador como la azida sódica o merthiolate para
impedir el crecimiento de bacterias y hongos, formando una delgada capa de unos 3 mm
de grosor que le servirá de base a la prueba.
- Una vez solidificado esta capa de agar, proceda a perforarla con el sacabocado formando
pocillos o cavidades, como se ve en la Fig. 2
- Coloque en el hoyo central el antígeno y en los periféricos la solución del anticuerpo o el
suero problema. Incubar a 37ºC sobre una superficie horizontal, en cámara húmeda,
durante 48 horas aprox.

Resultados:
Al difundir uno hacia el otro, la zona de equivalencia corresponderá aproximadamente a la
dilución que forme una línea o banda de precipitación que estará en el punto en que se encuentran
el antisuero y el antigeno en concentraciones equivalentes. La ubicación de la banda dependerá
de la concentración de antígeno y de anticuerpo colocada inicialmente en los orificios. La
aparición de la banda indicará una reacción positiva. Mientras, al estar ausente uno de los dos
reactantes (en este caso, el anticuerpo) no se formará la banda de precipitado (reacción negativa).

BIBLIOGRAFIA
1.- Benacerraf B. y Unanue E. Inmunología. Segunda Edición. 1986. Ed. Panamericana.
2.- Muñoz J., Rangel A., Espinoza G., Cristancho M. y Hernández M. Inmunología Básica.
Segunda Edición. 1991. ULA.
3.- Tizard I. Inmunología Veterinaria. Sexta Edición. 2002. Ed. Interamericana.
4.- Arce A, Rosas A, Rodríguez L. Practicas de Inmunología General Aplicada y Veterinaria.
2007. El Manual Moderno.

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Figura 1. Curva de Precipitación Figura 2. Inmunocomplejos

Figura 3. Doble difusion

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Figura 4. Inmunodifusión radial Figura 6. Electroforesis en Cohete

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Figura 5. Inmunoelectroforesis

Fig. 1