UNIVERSIDAD DE CHILE ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA MECESUP UCH0003 ASIGNATURA BIOQUIMICA APLICADA CINETICA ENZIMATICA EN HOJA DE CALCULO Autor

: Teresita Castillo 1 INTRODUCCIÓN

La cinética enzimática es uno de los tópicos Fisicoquímico que tiene muchas aplicaciones en las ciencias médicas. Las enzimas son agentes químicos que ayudan a que los procesos bioquímicos del organismos se lleven a cabo a un velocidad compatible con la vida. Estos niveles enzimáticos en plasma se analizan para detectar la enfermedad y llegar al diagnóstico diferencial y pronóstico de la misma. Para lograr determinar la actividad de las enzimas presente en el plasma se debe conocer los parámetros físicos y químicos de las enzimas. El estudio de la cinética requiere la aplicación de conocimientos matemáticos, los cuáles se pueden expresar en modelos gráficos interactivos, para lo cuál se usará el programa de hoja de cálculo Excel. lo que permitirá observar directamente los efecto de la manipulación de los valores de sustrato, velocidades y constante cinéticas como Km y Vm. 2 OBJETIVOS DE APRENDIZAJES

1.- Adquirir una mayor comprensión del efecto del sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática. 2.- Visualizador los cambios de la Km y Vm al manipular las concentraciones de sustrato. 3.- Analizar en los gráficos de Linewaever -Burk los efectos de los inhibidores competitivos y no competitivos. 3 ACTIVIDADES DE APRENDIZAJES

1.- Cada grupo de estudiantes deberá construir en el programa excel una hoja para automatizar el cálculo de los parámetros Vm y Km mediante el gráfico Linewaever- Burk 2.- Graficar la curva de Mickaelis Menten y Curva de Progreso

264 0.5 0 0 0.5 1 0.2 Actidadad Enzimática Lectura Ensayo en Do: se multiplica x factor obtenido curva de fenol DO x Factor = mM /min Lect Do 0.495 0.371 0.5 .056 0. con lo cual. conociendo la ecuación que los une.9985 1 1. Do 1. Sustrato 4.1 DESARROLLO Curva de Fenol La lectura Do y la concentración de Fenol presenta un comportamiento lineal entre ambos.043 0.4 4.5 mM Fenol.119 0. Lecturas Fenol Curva de Fenol Densidad Optica.608 y = 1. es posible calcular la concentración de fenol a partir de la lectura Do conocida.1921x 2 R = 0. Tabla #1.

00009 0. La curva resultante es una hipérbola rectangular donde es difícil determinar las constantes cinéticas Vm y Km.00005 0.4. mM Sustrato Curva de Michaelis 0.00008 0.00007 0.00004 0. Tabla #2:Velocidad en función del Sustrato S.00006 0.0001 0.078 0.00003 0.195 0.117 0.3 Curva de Michaelis-Menten Ecuación de M-M V = Vm ⋅ S Km + S La ecuación de M.00002 0.39 3 4 .M explica la curva que se obtiene cuando los datos de velocidad se representan frente a la concentración de sustrato.00001 0 0 1 Velocidad mmoles/min/ml 2 Sustrato mM 0.

. graficando 1/V v/s 1/S y determinando la ecuación de la recta (m y b) se encuentran los valores para las constantes cinéticas Vm y Km..8205128 8.56410256 5 1/S 10 15 y = 2936. la cual se realiza linealizando la expresión de M-M de la siguiente forma: Vm ⋅ S Km + S 1 Km + S = V Vm ⋅ S 1 Km 1 1 = ⋅ + V Vm S Vm V = ⇒ ⇒ De esta forma. Valores linealización de ecuación M-M 1/S Linewaever-Burk 60000 40000 1/V 20000 0 -5 -20000 0 Igualando términos.12820513 2. Tabla #3.2x + 8779.54700855 5. la ultima expresión representa una línea de tipo Y =mx+C.4 Gráfico de Lineweaver – Burk Para determinar las constantes Vm y Km se representa la curva de Michaelis en forma lineal.5 R2 = 0.9337 . 12.4. donde: Y = 1/V : Variable en eje y m = Km/Vm : Pendiente de la recta x = 1/S : Variable en eje x b = 1/Vm : Punto intersección eje y Así.

5 1 0.5 0 0 Tiempo (min) 5curva Do v/s Pendiente 10 Tiempo (min) 15 5 10 20 15 30 20 30 ⇓ 20 40 60 Tiempo (min) .2 ⇒ Vm = 0.Cálculo de Fenol Producido b.5 Curva de Progreso Utilizando las expresiones ya determinadas.1/Vm = 8779..2*Vm 0.0001139 mmoles/min ⇒ Km = 2936.5 Km/Vm = 2936.Determinar el fenol producido( mmoles) Curva de progreso Fenol Producido m m oles 1. Tabla #4: Lecturas Do para distintos tiempos Realizar: a. es posible estimar la hidrólisis del sustrato y/o las velocidades de inicio para cada tiempo..334mM 4.