Diagnostica microbiologica delle infezioni delle basse vie respiratorie

Lucia Martelli

Infezioni basse vie respiratorie

LA DIAGNOSI MICROBIOLOGICA
‡ influenza la terapia che è in funzione di
Presenza di patogeni piu frequentemente isolati oppure di patogeni non comuni

Presenza di patogeni che mostrano antibiotico resistenza

Presenza di patogeni per i quali le linee guida non prevedono un trattamento ottimale

‡ permette di individuare cluster epidemici ‡ permette di individuare patologie causate da patogeni non endemici in quell'area

Infezioni basse vie respiratorie

Perchè una corretta diagnosi eziologica è importante? ‡ per studiare l·andamento dell·antibiotico resistenza ‡ Per aumentare l·accuratezza delle raccomandazioni delle linee guida ‡ Per guidare i comportamenti in caso di patologie particolari come SARS, Influenza,Legionellosi patologie da bioterrorismo

La diagnosi microbiologica rende possibile una:
‡ Diagnosi probabile
quadro clinico compatibile + rilevazione di un patogeno polmonare in quantità medio alta (in modo semiquantitativo)

Infezioni basse vie respiratorie

‡ Diagnosi definita
quadro clinico tipico + agente eziologico probabile un campione non contaminato

+

probabile patogeno che non colonizza le vie respiratorie superiori

Infezioni basse vie respiratorie

La diagnosi microbiologica della malattia E·importante ma non sempre efficace
nelle cap che necessitano di ricovero per pazienti ospedalizzati per pazienti immunocompromessi con infezioni delle basse vie

gravità È limitato

nelle bronchiti nelle cap non complicate e in assenza di fattori di rischio (sono sufficienti le linee guida)

Uso di test diagnostici rapidi e sensibili importanti sono: esame microscopico la ricerca di antigeni tests di biologia molecolare .Infezioni basse vie respiratorie Fattori interferenti con la diagnosi microbiologica .Adeguatezza del campione( assenza di contaminazione da parte della flora del tratto respiratorio superiore) .

RSV RSV. Influenza Virus Tipo A Mycoplasma pneumoniae. Haemophilus influenzae adulti . Streptococcus agalactiae Chlamydia trachomatis .Infezioni basse vie respiratorie Correlazione tra agenti patogeni ed età età Neonati(0-1 mo) lattanti (1-6 mo) bambini (6 mo-5 yr) ragazzi (5-15 yr) giovani adulti(16-30) microrganismi più probabili Escherichia coli. Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae. Parainfluenza Viruses Mycoplasma pneumoniae .

tuberculosis. meningitidis Adenovirus. pneumoniae Primaria atipica tosse non produttiva Polmonite nosocomiale bacilli Gram neg(Enterobacter. Klebsiella. Clamydia spp.catarrhalis N. batteri anaerobi . H. pneumoniae.Infezioni basse vie respiratorie Correlazione tra agenti patogeni e patologia Tipo di polmonite Acquisita in comunità patogeni comuni S.. Acinetobacter . patogeni rari Staphylococcus M. Legionella spp. influenzae. pneumoniae Mycoplasma pneumoniae RSV. aureus. S. Pseudomonas). K. polmoniti fungine acute legionella S. Influenza.

Nocardia sp. immunodepressi batteri come nella CAP* Pneumocystis carinii.Infezioni basse vie respiratorie Tipo di polmonite polmonite ematogena patogeni comuni Staphylococcus spp. patogeni rari bacilli Gram negativi polmonite in paz. Streptococcus spp. HSV. Funghi opportunisti * Candida * Mucor * Aspergillus Legionella. Coccidioides Polmonite da aspirazione anaerobi Staphylococcus.. Cytomegalovirus.Listeria Histoplasma. Bacilli Gram negativi aerobi .

Diagnosi Microbiologica Materiale Idoneo Escreato Escreato indotto Germi comuni.virologiche fungine parassitologiche Germi comuni.Nacardia .Legionella.Miceti.carinii Bronco Aspirato Lavaggio Bronchiale Lavaggio Broncoalveolare Liquido pleurico Idem Solo per Micobatteri.carinii e miceti filamentosi Idoneo per tutte le ricerche batteriologiche. P. Legionella Micobatteri Nocardia . miceti + P.Anaerobi Micobatteri. Legionella.

GramMiceti Urina Rilevazione antigeni di Legionella. Pneumococco Siero Per ricerche di anticorpi ricerca di antigene di Aspergillus .Diagnosi Microbiologica Materiale Idoneo Sangue Batteri Gram+.

Infezioni basse vie respiratorie La diagnosi Microbiologica Metodi diretti es batteroscopico es colturale emocoltura rilevazione di antigeni Metodi di amplificazione genica tecnologie microarray su materiali respiratori Metodi indiretti tests sierologici .

Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie Esame microscopico Permette di Stabilire l'idoneità del materiale Valutare la quantità di PMN e microrganismi (processo infiammatorio e infezione batterica) Fare una diagnosi presuntiva mediante il rilevamento di potenziali patogeni può indurre ad attuare iter diagnostici diversi da quelli routinari .

Infezioni basse vie respiratorie Inoltre di avviare una terapia empirica verso patogeni meno comuni e di abbandonare terapie inappropriate Di validare i risultati dell'esame colturale Di valutare l'azione inibente della terapia antibiotica su microrganismi presenti che non si sviluppano in coltura .

Infezioni basse vie respiratorie Esame colturale Esame microscopico Materiale Biologico Idoneo Esame Colturale Isolamento batteri e miceti non esigenti .

Esame colturale dei materiali ottenuti con procedimenti non invasivi ‡ l'eventuale precedente terapia antibiotica Infezioni basse vie respiratorie spesso non è specifico nè sensibile P e ‡ difficoltà di interpretazione la presenza di flora delle r alte vie che può includere eventuali patogeni (falsi positivi) ‡ l'eventuale scarsa idoneità del campione o coprire il vero patogeno (falsi negativi) .

Metodi diretti Esame colturale di materiali ottenuti con procedimenti invasivi permette Infezioni basse vie respiratorie di attribuire un significato eziologico ai vari isolati se accompagnati da una valutazione numerica .

Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie Esame colturale Semina su terreni idonei Incubazione a 37° per 24-48h In atmosfera normale o in Co2 LETTURA ANTIBIOGRAMMA (se previsto) IDENTIFICAZIONE .

Metodi diretti Emocoltura Infezioni basse vie respiratorie E' raccomandata per tutti i pazienti con grave polmonite e se positiva permette di fare diagnosi Si ha positività nel 5-14% Il più comune isolato è S.pneumoniae .

Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie Rilevazione antigeni su materiali respiratori si basano su Agglutinazione al lattice Immunofluorescenza diretta EIA .

Pneumococco .2.HSV2 Legionella.Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie Ricerca antigeni su materiali respiratori Vantaggi ‡ Sono rapidi ‡ Idonei per Virus influenzali A e B RSV Adenovirus Virus parainfluenza 1.3 HCMV HSV1.

pneumoniae sier 1 e Rivelazione antigeni su urine Infezioni basse vie respiratorie legionella pneumophila Vantaggi ‡ Rapidi ‡ semplici ‡ Positivi anche dopo l'inizio della terapia .Metodi diretti ‡ Tests immunocromatografici S.

pneumoniae Antigene (polisaccaride parete) Vantaggi Specificità >90% Sensibilità 50-80% < nei bambini portatori sani Svantaggi Cross-reattività con S.Infezioni basse vie respiratorie S.mitis Non distingue infezione in atto da infezione pregressa Il valore diagnostico è maggiore se associato a emocultura .oralis e S.

Infezioni basse vie respiratorie Antigene urinario di legionella Il test non rileva tutti i sierotipi Vantaggi Positività prolungata nel tempo y y Svantaggi Sensibilità 70-100% Specificità 100% y .

Infezioni basse vie respiratorie Diagnostica molecolare Si basa ‡ Ricerca del DNA mediante amplificazione con metodica PCR ‡ Tecnologia microarray .

identifica un organismo in base a sequenze geniche specifiche ‡ ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO ‡AMPLIFICAZIONE CON PRIMER IDONEI A LIMITARE LA SEQUENZA GENICO SPECIFICA ‡IDENTIFICAZIONE DNA AMPLIFICATO IMMUNO CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA SU GEL DI AGAROSIO FLUORESCENZA (REALTIME) Diagnostica molecolare Infezioni basse vie respiratorie .

Diagnostica molecolare Vantaggi Elevata sensibilità Elevata specificità Non necessita di isolamento batterico Non necessit di microrganismi vitali Può essere eseguita su materiale preventivamente congelato ‡ Determinazione qualitativa in Pcr tipo nested ‡ Determinazione quantitativa (virus erpetici latenti) ‡ ‡ ‡ ‡ ‡ .

Diagnostica Molecolare Svantaggi ‡ Costo elevato ‡ Se qualitativa non indica se infezione in atto o pregressa ‡ Non consente di procedere alla determinazione della sensibilità ai chemioterapici ‡ Richiede esperienza di metodiche molecolari .

Diagnostica Molecolare ‡ Nel nostro laboratorio vengono rilevati con PCR ‡ Virus respiratori Adenovirus VRS Influenza A-B HSV1-2 HCMV ‡ Batteri atipici Mycoplasma Legionella Chlamydia Aspergillo ‡ Miceti .

Microarray Rappresenta un potenziale interessante per il laboratorio di microbiologia ‡ Un DNA microarray (o DNA chip) è costituito da una collezione di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida. Permette di ‡ Esaminare il profilo di espressione di un gene ‡ Di identificare un gene in una miscela di migliaia ‡ Sfrutta la tecnica di ibridazione inversa .

Identificare funghi patogeni coinvolti nelle micosi invasive Identificazioni batteriche Per una rapida identificazione da bottiglie di emocolture positive Microarray . 2. 3.Vantaggi ‡ Rapido (non necessita di reazioni di amplificazione) ‡ E' un sistema miniaturizzato ‡ Dotato di alta processività ‡ Permette analisi parallele su larga scala ‡ Nei laboratori di ricerca è stato utilizzato per 1.

Metodi indiretti Metodi sierologici ‡ ‡ ‡ ‡ ‡ ‡ Infezioni basse vie respiratorie Tests di immunofluorescenza Tests di FC Non sono utili per una diagnosi precoce Sono importanti a scopi epidemilogici Utili per la diagnosi di infezione dei patogeni atipici Necessitano di due campioni uno in fase acuta ed uno in fase di convalescenza (sieroconversione) ‡ Permette di valutare se infezione in atto o infezione pregressa .

Diagnostica di alcune patologie .

Polmonite da C.pneumoniae è responsabile del5%15% delle polmoniti ‡ Raramente è necessario il ricovero (anziani con comorbidità. associata ad altri patogeni) ‡ La reinfezione è comune .pneumoniae ‡ La C.

Diagnosi microbiologica difficile ‡ La chlamydia è difficilmente coltivabile ‡ La sierologia è problematica e non specifica Polmonite da C.pneumoniae Nelle infezioni primarie le IgM possono impiegare anche 3 settimane a manifestarsi Le IgG 8 settimane: la negatività non esclude la malattia Nelle reinfezione leIgM rimangono costanti Le IgG salgono rapidamente ‡ PCR con marchio CE e IVD Recentemente è uscita Real time PCR solo qualitativa Viene eseguita su materiale respiratorio É specifica per la specie .

64 supportano la diagnosi ma sono poco specifiche La reazione di FC rileva le IgM se il prelievo è precoce ‡ PCR con marchio CE e IVD .pneumoniae Il Mycoplasma è responsabile del10%-20% delle polmoniti nei giovani adulti Diagnosi ‡ Esame colturale (troppo lento) ‡ Tests sierologici Le agglut a freddo >1.Polmonite da M.

rilevazione di anticorpi -ibridizzazione degli acidi nucleici * *E· IMPOTANTE L·IDONEITA· DEL MATERIALE .rilevazione dell·antigene urinario .Legionellosi Diagnosi di laboratorio metodiche utilizzate: .esame colturale * .test di immunofluorescenza diretta * .

Esame colturale Rappresenta il gold standard per la diagnosi (per un risultato positivo occorrono da 3 a 5 giorni ) Materiali idonei sputo * campioni broncoscopici .Terreni idonei BCYE (buffered charcoal yeast extract) BCYE con antibiotico .

Esame colturale Fattori che influnzano la sensibilità ‡ Scarsa sopravvivenza nelle secrezioni ‡ Produzione scarsa di secrezioni .

Esame colturale ‡ E· importante per Confermare i risultati positivi dell·antigenemia Individuare infezioni sostenute da specie e sierogruppi diversi da sier 1 .

Identificazione Vengono valutate le seguenti caratteristiche Capacità di crescita su BCYE Morfologia tipica delle colonie Capacità di reagire con antisieri specifici fluorescenti e non Test di ibridizzazione del DNA .

può permanere per mesi ) L·atg è un componente della frazione polisaccaridicadella parete Metodiche RIA EIA ( per più sierogruppi ) Immunocromatografiche (solo per legionella p.Ricerca dell·antigene urinario un metodo rapido che produce una diagnosi precoce (1 giorno dopo l·insorgenza dei sintomi . sier 1 ) E· un esame ritenuto sufficiente a fornire un criterio microbiologico di certezza nelle definizione di caso .

Antigene urinario Data la sua possibile permanenza protratta nelle urine può risultare difficile la distinzione tra ‡ ‡ ‡ infezione acuta fase di convalescenza infezione pregressa .

Antigene urinario ‡ Test immunocromatografico ( BIOTEST ) Sensibilità 70-100 % ( dopo centrifugazione aumenta ) Specificità 100 % Vantaggi semplicità rapidità rileva solo la presenza di Lp 1 Svantaggi .

Immunofluorescenza diretta Questa tecnica che utilizza anticorpi fluorescenti specifici messi a contatto con frammenti di tessuto polmonare o secrezioni respiratorie pemette di ‡ di rilevare le presenza di legionelle nei materiali respiratori ‡ di identificare eventuali colonie sviluppatesi su terreni selettivi per legionella .

non pneumophila (specificità e sensibilità di questi reagenti non è stata ancora ben valutata) .Immunofluorescenza diretta ‡ Permette di evidenziare le legionelle anche dopo alcuni giorni dall·inizio della terapia antibiotica ‡ ‡ E· possibile identificare L.pneumophila (sensibilità da 25 a 75% specificità sup a 95%) L.

Diagnosi sierologica La rilevazione di anticorpi specifici (IgG. IgM IgA ) può essere fatta con varie metodiche ‡ Immunofluorescenza indiretta ‡ Metodi immunoenzimatici ‡ Metodi di microagglutinazione E· utile per una diagnosi retrospettiva ( E· significativo un aumento del titolo di almeno 4 volte) .

PCR Produce : ‡ Diagnosi rapida ‡ Rileva la presenza di varie specie e sierogruppi di legionella ‡ E· applicabile a campioni ambientali ‡ Ha una sensibilità simile all·esame colturale .

‡ Malattia sistemica frequentemente letale Diagnosi ‡ Sierologica Rilevazione IgM specifiche IgG specifiche in aumento Sindrome polmonare da hantavirus ‡ PCR Rilevazione RNA specifico nei capioni cinici .

carinii In pazienti con deficit dell'immunità cellulo-mediata diagnosi immunofluorescenza diretta sul BAL PCR .Polmonite da P.

In terapia con echinocandine Sensibilita 80% Specificità 89.Aspergillosi polmonare ‡ Diagnosi ‡ es. microscopico diretto non specifico ‡ Rilevazione del galattomannano su siero -La positività può precedere di 5-8 gg i sintomi clinici -Il test dovrebbe essere usato come screening -La rilevazione di risultati positivi in due campioni successivi supporta la diagnosi -Può essere usato come follow up della risposta clinica alla terapia -Il titolo diminuisce in caso di risposta clinica eccetto che per i paz.2% ‡ PGR .