CORPORACIÓN TECNOLÓGICA DE BOGOTÁ TQI/TRF PRÁCTICA DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA N° 5.

Práctica N° 5
CARACTERIZACIÓN DE MACROMOLÉCULAS OBTENIDAS DE TEJIDOS

Fecha:

DOCENTE. EDWIN ALFREDO REYES GUZMÁN

Título. CARACTERIZACIÓN DE MACROMOLÉCULAS OBTENIDAS DE TEJIDOS. Objetivos Generales. - Comprobar la presencia de Macromoléculas en los tejidos empleados en la práctica 4, utilizando para ello reacciones características de cada uno de los componentes obtenidos. Marco teórico. El marco teórico lo deben tener en cuenta en relación a los siguientes aspectos. Recuerden que siempre antes de la práctica habrá Quiz. Fundamentos A. Carbohidratos: Los organismos vivos contienen carbohidratos que pueden estar formando polisacáridos de reserva, pueden ser componentes estructurales o pueden estar participando en el metabolismo en forma monomérica. Las propiedades químicas de tales compuestos permiten diferenciarlos así: 1. Reacción de Lugol Los polisacáridos son solubles en soluciones acuosas ácidas, pero insolubles en etanol. Los polisacáridos como el almidón- amilosa y amilopectina-, el glicógeno y los dextranos, forman compuestos coloreados característicos cuando se combinan con yodo molecular. A pesar de que la naturaleza de estos complejos no esta bien definida, evidencias indican la formación de complejos de absorción entre las cadenas helicoidales del polisacárido y el yodo. Para que haya estructura helicoidal se necesita por lo menos una cadena de 8 monosacáridos. Los polisacáridos que a todo lo largo de su molécula muestran estructura helicoidal, dan coloración azul intensa (amilosa). Aquellos que son ramificados con hélices ininterrumpidas producen coloraciones menos intensas (amilopectina). Los altamente ramificados con segmentos cortos de ramificación, producen color pardo o rojizo (glicógeno). 2. Reacción de Molish. Un carbohidrato tratado con alfa-naftol y ácido sulfúrico concentrado produce una coloración violeta. Se presume que el ácido sulfúrico actúa como deshidratante formando derivados furfurales que reaccionan con el alfa-naftol para dar productos coloreados. 3. Reacción de Benedict. Azucares reductores tratados con soluciones cúpricas en medio alcalino suave (citrato-carbonato de sodio) reducen el ión cúprico a ión cuproso de color ladrillo.

Lípidos: En cuanto a solubilidad. que finalmente dan los monofosfonucleótidos 2’ ó 3’. los jabones sedimentan y en el sobrenadante queda el glicerol. Otros carbohidratos pueden producir colores amarillo. reaccionan con el anhídrido acético para dar ésteres. el amoniaco desprendido reacciona con una molécula de ninhidrina en estado oxidado y con otra en estado reducido. 3. Las proteínas a temperaturas mayores de 50°C precipitan. Prueba de Millon: Las proteínas que contiene tirosina reaccionan con mercurio disuelto en ácido nítrico.B. La acidificación de la solución después del tratamiento alcalino precipita las moléculas de DNA intactas. producen complejos de óxidos de molibdeno de color azul. 3. para dar complejos rojos.0 N). produciendo fosfatos inorgánicos. Saponificación La hidrólisis alcalina de los acilgliceroles produce jabones y glicerol. 2. Si el hidrolizado se somete a la acción del éter. los lípidos son insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos. Hidrólisis alcalina Los álcalis diluidos (0. La facilidad de hidrólisis en el RNA parece estar asociada a la presencia de OH en los carbonos 2’ y 3’. dando complejos de color violeta. lo mismo que los enlaces Nglicosídicos de ambos ácidos. mientras que los enlaces éster del ácido desoxirribonucleico son relativamente estables.2. hidrolizan los enlaces éster del ácido ribonucleico. Desnaturalización: Por acción de pHs extremos se destruyen los puentes de hidrógeno que mantienen la estructura secundaria de las proteínas. Reacción de Lieberman Burchard Los hidroxiesteroides con instauración en la posición 5. Como la desoxirribosa del DNA no forma tales intermediarios. 1. En ellos. Prueba de la Ninhidrina: Los grupos aminoterminales y laterales de las proteínas reaccionan con la ninhidrina caliente. que con el ácido molibdico dan fosfomolibdatos.3 a 1. Proteínas: 1. 2. es relativamente estable en presencia de álcali diluida. Reacción de Fiske-Subbarow (prueba de fosfatos) Los fosfolípidos por acción del NaOH se hidrolizan. produciendo nitroderivados mercuriales de color rojo. Prueba de Tollens para pentosas Se basa este ensayo en la producción de furfural por medio del ácido clorhídrico y su posterior identificación con un fenol. D.4aminonaftolsulfonico o el ácido ascórbico. Acidos nucleicos: 1. 2. en este caso floroglucinol. . y éstos por acción de reductores como el ácido 1. lo cual permite la formación de intermediarios cíclicos 2’ y 3’ fosfonucleótidos. por formación de agregados que resultan de la destrucción de la estructura secundaria. que en medio sulfúrico se deshidratan produciendo una coloración verde. C. naranja o carmelito.

5 y 10 ml.5 g 0. Hidroxido de amonio conc. pinzas para tubo de ensayo. 1 gradilla. Reacción Xantoproteica: Esta reacción se basa en la nitración del anillo bencénico por el HNO3 concentrado. Acido clorhídrico 2N Acido sulfurico conc. fenilalanina Orcinol Cloruro Ferrico sln 50 ml 50 ml 100 ml 100 ml 100 ml 50 ml 50 ml 500 ml 50 ml 50 ml 100 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml c/u 0. 5 Tubos de centrífuga. 1 beaker 400 ml. 1 pipeta Pasteur plástica (gotero). Beaker 600 ml.4. Equipos. Para nitrar la fenilalanina se requiere H2SO4 como catalizador. pero el color amarillo resultante se transforma en naranja si se le adiciona NH 4OH. Hidroxido de sodio 15% Acido clorhidrico 6N Hidroxido de potasio 2N Acido nitrico conc. 1 beaker de 100 ml. Embudo y papel filtro. dando derivados amarillos de nitrobenceno. Pipetas de 1.2% Reactivo de Biuret Almidon Glucosa Albumina. Prueba de Biuret: Los nitrógenos del enlace peptídico forman complejos coloreados con los iones cúpricos en medio alcalino.5 g .2. 5. Papel aluminio. mechero bunsen o placa de calentamiento. Agua destilada Reactivo de Millon Sln de lugol Etanol 96% Reactivo de Molish Reactivo de Benedict Eter etilico Cloroformo Anhidrido acetico Ninhidrina 0. termómetro. 15 tubos de ensayo. Las proteínas que contienen tirosina y triptófano dan esta reacción. 1 frasco lavador. Balanza. Materiales. Reactivos. glicina. Centrifuga 2500 rpm.

Explique el resultado obtenido. agregar 1 ml de cloroformo. M2 y patrones de glucosa y almidón. En seguida adicionar 10 gotas de solución de ácido ascórbico. Observe los resultados y explíquelos en el informe.5 ml de cada una) agregar 4 ml de agua y 1 gota de solución de Lugol. Molish.5 ml de cada una). Agregar 1 ml de anhídrido acético. A otras porciones iguales de estos compuestos adicionar 1 ml de HCl 2 N y colocarlos en baño maría durante 15 min.5 ml de la muestra indicada. Observe la coloración en la interfase al minuto y a los 15 minutos. Observe los resultados y continúe calentando por 15 min. agitar y adicionar con cuidado por las paredes del tubo 3 gotas de H2SO4 concentrado. Si la solución es muy oscura diluir con más agua y observar nuevamente. Tomar una fracción de 0. C. Lugol. Saponificación (M3). M3. A una nueva fracción (0. A una fracción de cada una de las muestras y de los patrones (0. Mezclar cuidadosamente y con los tubos inclinados agregar 1 ml de H2SO4 concentrado de manera que se forme una capa de ácido debajo de la fase acuosa. agregar 3 ml de NaOH al 15 %. se harán las siguientes pruebas de caracterización (Ver los diagramas adjuntos) 1. fracciones de las muestras y patrones (0. Con las muestras M1. Carbohidratos: Muestras M1. M2. mezclar y dejar en reposo 5 min. 3. C. A. Lípidos: Muestras M3. Observe la coloración. con 1 ml de solución de Benedict. mezclar. No agitar los tubos. Añadir 2 ml de éter y filtrar los jabones resultantes. Si no se desarrolla color colocar el tubo en el baño maría por 5 min. B. A una cantidad análoga a la anterior de las fracciones indicadas.5 ml de cada uno) de los compuestos anteriores agregar 2 gotas de reactivo de Molish. (M3). Colocar al baño maría durante 2 minutos. De nuevo observe los tubos. Dejar enfriar y agregar nuevamente Lugol. Acidos nucleicos: Muestras M5 . Fosfatos (filtrados obtenidos en B) A 1 ml del filtrado agregar 10 gotas de ácido molíbdico. 2. Observe el color del anillo formado en la interfase. M4 y M5 obtenidas en la práctica anterior. Benedict. Prueba de Lieberman-Burchard. Colocar en la boca del tubo una esfera de vidrio o papel de aluminio y reflujar al baño maría durante 20 min.Metodología. Observar las coloraciones. B. A.

(M4. C. Calentar la mezcla a baño maría durante 1 minuto. B. D. B.5 ml de cada muestra. Acidificar la solución con HCl y observar si se forma precipitado correspondiente al DNA.5 ml de cada una de las muestras con 1 ml de ácido nítrico concentrado. Fosfatos. La aparición de un color o precipitado verde.. observar el color. Ninhidrina. albúmina y fenilalanina) Calentar una fracción de 0. Limusa Noriega editores.5 ml de HCl 2N. de aminoácidos en las proteínas. (hidrolizado obtenido en A) Repita la prueba de fosfatos (numeral 2C) con 1 ml del hidrolizado. C. 1996. Colocar la solución al baño maría durante 20 min. y glicina) A una fracción de las muestras (0. D. Separar éste por centrifugación. albúmina y fenilalanina) A una fracción de las muestras agregar 1 ml de la solución de ninhidrina al 0. (M4. 4. Prueba de Pentosas (hidrolizado obtenido en A) A 0. realice el análisis correspondiente. Esperar 10 minutos y observar el color. Que se requiere para que un carbohidrato tenga poder reductor y por qué la sacarosa es negativa para la prueba de Benedict? 3. albúmina) Tomar una fracción de 0.2%. 2. . Observar la interfase.A. (M4. Shriner R. Escriba las reacciones de las diferentes pruebas realizadas en esta práctica. En la prueba de fosfatos. indica que existen pentosas en la muestra. deduzca qué tipo de polisacáridos. tirosina y glicina. calentar durante unos minutos al baño maría . Calentar al baño maría durante 10 minutos . albúmina. de lípidos y de ácidos nucleicos están en el tejido. observar el precipitado. Xantoproteica. Proteínas: Muestras M4 y patrones de albúmina. Universidad Nacional de Colombia. Guías de Análisis Orgánico. Por qué las proteínas no dan la reacción con Ninhidrina? 4.L. por qué es necesario adicionar el ácido molibdico antes del agente reductor? BIBLIOGRAFIA. 1995.5 ml del hidrolizado adicionar 2 ml de HCl 6N y agregar 10 mg de orcinol y 10 mg de Cloruro ferrico. agregar 1 ml de reactivo de Biuret.C. A. Martínez J. enfriar y observar el color.5 ml de cada una) agregar 5 gotas de reactivo de Millon. Acidificar con 0. Biuret. 1. 1. Fuson R. RESULTADOS. Hidrólisis básica (M5) En un tubo de ensayo colocar la fracción de la muestra M5 correspondiente a los ácidos nucleicos. Agregar cuidadosamente 10 gotas de NH4OH. Mezclar. Millon. 2. Identificación sistemática de compuestos orgánicos. adicionar 3 ml de KOH 2 N y colocar en la boca del tubo una esfera de vidrio o papel de aluminio. De acuerdo con los resultados. (M4.

Gokel G.W. 2009. Departamento de Química. Durst H. 5.D. Laboratorio de Principios de Bioquímica.. Facultad de Ciencias. Universidad nacional de Colombia. 1985. Vogel’s A. Textbook of practical Organic Chemistry. Fourth Ed. Química Orgánica experimental. 1978. . Reverté. 4.3. Ed.