· NA~OES UNIDAS

r;wMrlo 00"1111 0rV(Jil1 , CrIme

programa Nadonal Secretaria de Minlsterio

de OST-AI05 Vigillinda em Salida cia Saud e

Ministerlo da Saude Secretaria de Vigilancia em Sande Programa Nacional de DST e Aids

Cultura, Isolamentoe ldentiflcacao da Neisseria gonorrhoeae

BTa~11ia 2ob7

"lvUN1STEHIO DA SAtJDE

Jose Gomes Temporao Ministro de Estado da Sande

Gerson Oliveira Penna Serretario de Pollticas de Saiide

Mariiingeia Batista Galvio Sirnao Diretora do Pregrarna Nacional de DST/AIDS-MS

Lilian Amaral Inocencio

Assessors Tecnica da Urndade de Laboratorlo do PN DST/AIDS-MS

Mirlan Pranchini

Coordenadora de Producao do Projeto TELELAB

Simone Monzani Vivaldini' Claudia Beatriz Oliveira Coordenadoras do TELELAB - Revisao

Antares:

Claudia Renata Fernandes Martins Jose Antonio Pinto de S~ Ferreira Luis Fernando de Got's Siqueira l.uls Alberto Peregrina Ferreira Maria Luiza Bazzo

Miriam Franchini

Oscar Jorge Berro

Silvio Valle

Assessoria Pedag6gica:

Mafia Lucia Riccioui Ribinik M a rtistela Ara n res M artele to

Cultura, isolarnento e iden tificacao cia Neisseria gOllorrIJoellc, - Brasl lia: Ministerio da Saude, Programa Nacional de Doencas Scxualmeute Tmnsmisslveise AIDS, 1997.

68 p.: iI. (serie TELELAB)

I.Neisseria gonorttweae J. Prograrna Nacional tie Doencas Sexualrnente Transmisslveis c AIDS (Brasil). 11. S(!ric TILE] Ali

Os responsaveis pela implantacao do TELELAB ernpenhararn loda sua capacidade profissional para tornar este projeto digno da quahdade tecnica e cientifica e da eficiencia que nossa coordenadora geral scmpre irnpnmiu as realizacoes do Prograrna Nacional de DST e AIDS du 1\ linisterio da Saude.

A Ora. Lair Guerra de Macedo Rodrigues, exernplo de coragcm e llderanca, dedicamos este trabalho.

MarlAngela Batista Ga.lvao Sirnao

umario

APRESENTAc;:AO ~ 0'1

JNTRODU<;AO E CARAcTERlSTICAS DA

NEISSERIA GONOAAHOEAE 9

lntroducac , w , 11

Caractertsticas da Neisseria Gonorrhoea.e __ .. _ .. _ 1.2

A mcs tras Indi cadas ~.--- '" 13

Cultura _ 13

ConiJi~oes para 0 Cresci mento da Neisseria Gonon·hoeae _~_ 14

I ENTIFICA<;AO, CULTURA E ISOLAMENTO IS

Meios de Transporte " 17

Meios de Cultura 18

Melo de JdenLiflcatao __ 18

F luxograma, , , _ ,., 19

Obtencao da Atmosfera de CO 20

R ccnhecrmento da Nefsseria 90norrhoeae no Meio de

Tha er Martin _ , 2.0

Caractensticas Morfotmtoriais da Neissena gonoIThoeae .. , 22

Pro a de Cat lase, -2)

Prova de Oll.idase , , _ _ _ 2j

Prova de D egr a da\do de carbni dr atos ,., .., 25

Outros Metodos de ldenttflcacao de Neisseria _gonvn-hoeae _ 26

Lactamase ou Penicilinase __ 26

Pr ova da Cef alas pori na CTom ogen 1 Ca. , , Z9

M, nutencao de Cepas de Neisseria gonolyhueae .29

,

CONTROLE DE QUALIDADE 31

P.REP ARO DOS ME.I:OS, II' •• , •••••• ._ •••••••• "" 'A;I t 35

Melo de Armes ,., , , ,. . , 37

Meio de Trayer Mal'tin Modiflcado _ ; 38

SupJemento DeAnido de Kellogg·s ; 39

Meio para De9'rada~ao de A\uc.ares ,,, 39

Meio de ritas para Prova de Oxidasa., 41

Meio de.Btll. Glicero _ 42

BIOSSEGUltANG:A 43

CONSIDERA<;OES FINAIS 58

REF"E:R£NCIAS BIBUOGRAFICAS .•.. ,II I., ,.~ •• "', n II'~-li."5..~,~65

GRADEClM.ENTOS 67

Agora voce faz parte do Sistema de Educaca a Distan ia para prorJ:'bionais da saude, envolvidos com 0 diagnosrico laboratorial do Doencas Scxualrncnte Transmissiveis e Aids- DSTtAfDS - TELELAB.

o TELE.LAB foi criado para Ievar ate voce curse com infortnacees iudi 'pen a eis para que eu trabalho seja realizado dentro dos padroes do qualidade estnbelecidos pelo Programa Nacional de Doencas Sexualmente I ransrnis Iveis e Aids. do Ministerio da Saude - PN-DST1AIDS-MS.

Assistindo an pr grama de video e esrudando este manual, voce tera a iporrunidade de verificar 0 que pode ser mudado no seu dia-a-dia e 0 que pode ser rua n tido.

ASSlUl, voce tera rnais confiancs nos resultados do sen trabalho e mais tranquilidade uo que sc refere.a sua seguranca pessoal,

GlJARDE ESTE MANUAL PARA CONSULTAR SEMPRE QUE NECESsARIO. ELE E SEU. USE-O!

Para esclarecimentes de duvidas esempre que predssr, comuniq ue-se diretamente:

TELELAB - PN-DST/AIDS-MS

Telefax gratnito: 0800 - 61- 2436 e-mail: telelab@aids.gov.br

Funcionamento do seu CUTSO n:.U:'LAB

Agora que voce fez a inscnc;ao e 0 pre-teste, esla
tnscricao Pre,.teste na hora de se orqanizar para fazer seu curso!
Voc~ tern1 rnes para condul-Io.
Assista ao video quantas vezes voce precisar;
Video e Manual No manual estao todos os conteudos para 0 seu
estudo,
P6s-teste Fac;a 0 pbs-teste e responda ao
Questlonario questionario de avalia~ao. Suas informa'joes- sao
de Avalia'jao fundamentais para a melhoria do TELElAB.
Para obter 0 certiflcado, voce deIJera acertar no
Certificado rninlrno 80% do pas-teste.
Depois de correcao do seu teste via internet pete
PN-DST/AIDS, voce recebera 0 certificado. Ao final deste curse voce sera capaz de: identificar os procedimentos, os testes e as tecnicas recomendados pelo PN·DST/AIDS para a cultufa, 0 Isolarnento e a identificacao da Nisseria Gouorrhoeae;

• executar II cultura, 0 isolamento, a identificacao de Neisseria gOllorrhoeac e as provas cspeciais, obedec ndo 'lOS criterios tecnicos, criterio: de controlc de qualidade !! ~'UiddUOS de biosseguranca recom ·ndados.

lntroducao

A gonorreia e uma Doeuca Sexualrnente Transmisslvel (DST) delinida como um processo Infeccioso cau ado pela Neisseria gOllorrlioeac. A \h:scrj~a do agente eliol6gico da gonorreia foi feita par Albert Neisser em 187Y e ua trnnsrnlssao da-se por rneio do contato sexual. A transmissao vet tical causa a oflalrniagonococia do recem-nascido.

o risco de contagia para 0 sexo masculine, apes contato sexual com parceira infectada, e de 2091.1 C, no easo de reexposicao, este mdice podeni elevar-se a 90%. Nos horneus, e em cerca de 20% das rnulheres, 0$ sintornas surgern cerca de 2 a 8 dias apos a contagia. Para 0 sexo feminine, 0 risco de infeccao e em torno de 80%. Quando as mulheres sao reexpostas, esse numero aurnenta para rnais de 90%. Deutrc as mulheres infectadas, ccrca de ()O% a 80% nao apre en tam sintomas.

Bpidemiologicamente;o tato de fiO% a 80% das rnulheres nao apresentarern sintcmas ressalta a importancia do conrrole da populacao infecIndo para interrupcao da cadeia de transrnissao. A gonorreia, no hornem, quando nao tratada, evolui pam compllcacoes do tipo epididimire, prosratite e outras, cuminando com 0 quadro de esterilidade, 13 na rnulhcr, as complicacoes sao mats severas, evoluindo para OCIl,.a lnflarnatoria Pelvica (1)[1') e esterilidade, chegando, em alguns casus, il obito.

Os principals metodos de diagnostico dol gonorreia sao a bact erios-

opia e a cultura. A Organizacao Mundie! da Saude ( MS) indica a bacterioscopia como metoda de escolha para e diag.n6sticu cia gonorreia no hornern, em funcao de sua sensibilidade e especialldade. hi para as mulheres, ern fUllyao do numero de casas assintomaticos e da presen~a de U111 ecossisI ana vaginal, e indicada a cultura de amostras do canal endocervical.

Neste manual, estao apresentadas as recornendacees do Programa Nnciunal de DQ(:n~a5 Sexualrnente Transmissfveis e Aids do Ministerio da ::',IIIt!\ - PN-DST/AIDS, para transporte, cultivo, isolamento e identifies~. 0 d Neisseria g{l1"lorr'/loeae, alern da provas especiais para deteccao de

"1 .1:; de Neisseria g(Jllon·lloeae resistentes i penicilina,

CUhUr.l'illOt.menID" id.n11fiC4~.fi"" dn N~meringv" .. rl"/l\IIla~

Quais as caractensticas da Neisseria $onorrheae?

A Nt'I~5cria gOIlDrrllOPHe e uma bacteria Gram-negative, aerobia, 11a forma de diplococos "riuiformes" au "graos de cafe", caracteristicas do gen ro de Nei ser. Esse. diplo OCO& rnedem 0,6nm por ) .Onm e apre entamse ans pare, com faces coucavas adjacentes, au seja, voltadas entre si, Esra especie adere nas su perflcies de celulas epiteliais do hospedeiro, por meio de U0111 estrutura chamada pili (DU peln) que {j urn apendice filamentoso de origem proteica, Ja . uperficic bacteriana.

Figura 1: Diplococcs Gram-negativos lntracelulares sugestlvcs de Neisseria gonorr/roea!!

QU<11S as arnostras cltnicas indicadas para cultivar, isclar e identlflcar 0 agente eticilOgi(.0 dil gonorr€ia?

A ultura da Neisseria ganolT/wcnl' pode ser realizada nas seguimes amostrae • ecrecoes colhida nos seguintes sitics:

• canal endocervical,

• uretra rnasculina e ferninina;

o rota ringe,

• canal anal;

• coniuntiva;

• articulacoes, Icsoes; I?

angue,

o que I! uma cultura e quando deve ser utilizada?

Culrura eo metoda de crescimento e isolarnemo 1.10 agente euologico em meios especlficos. Deve er realizada no eguintes caso :

a) em pacientes do sexo rnascullno, e recornendado cultivo da secrecao uretral sempre que, apes exame bacterioscopi 0 negative, persistir a suspeita cliruca, au em casos de suspeita de resistencia ao tratamerito. Pode <linda ser realizada em amostras da orofaringe e do canal <mal, quando houver indicacao;

h) em pacientes do sexo Ieminlno, c recomeudado culrlvo da secrecao endocervical como retina diagnostica. Ap6s a correla anarrme e ou ainda quando houver sinais cllnicos, recornenda- eo cultivo de arnostra da orofaringe e do canal anal;

C) 113 efialmia gonocodca, em recem-nasddos au em adultos;

d) Il.l infec.ya di erninada, pOI' meio da cultura de sangue; e ,) Ul) seguimeruo de tratarnento,

I.

Quais. sao as condi~5es tndispensaveis para 0 crescimento da Neisseria gOl'lorrnoeae ern rneio de cultura?

o snccsso da cultura do gOlllJCOCO depende de cinco requi itos ambiernais bdsicos:

• erneadura imediata no meio de transporte OLL meio d TMm;

Atmosfera de -Oz em torno de 3% a 7%; Tear de umidade ern cerca de 90%; Incubacao a temperatura de 35,5<1 a .36,SDC; e Meio de cultura adequado.

o PN-UST/AID'i recemenda 0 meio de Arnies para 0 transporte de lliIlWill'aS de ccrec es suspeitas. Este rueio prcscrva 0 gonococo em boas condlcoes para 0 cultivo por ott 8 horas,

{l meio de Arnies cornem um Iampao de sal inorganico balanceado C (JIJVJO mineral para ahsorver as roxinas inlbidoras preseutes 110 mate- 1 ial. Na evolucso dos meios de trail porte de especlmes biologicos, val ios I Ul101I sistemas foram desenvolvidns para Neineru: gmlOrr/lol.?lIc e colo

ados a disposicao nos rnercados nacional c intcrnacional, Estes sistemas buseinm se nn utilizacao do mcio indicado para (l cultivo de dlplococos llJ11m-llegativos patogenicos, que e () meio de Thayer Marlin rnodlhcado ('I'M rn). Algun Sal) a presentados na forma de garrafas 011 tubes de ensaio,

ontendo aproximadamcntc 30 ml de meio disposto em agar lncllnaelo "hico de llauta", proporcicnando lima superfkle maier para a semeadura. C'oT1lel11, ainda, atmosfera de 3 a 101.1/0 de CO" requisite obrigatcnu para 0 ~ rescirnento das Neisscrias. Para a semeadura ncste rneio, deve-se lamar 0 cuulado de manter 0 Frasco em posi~ao vertlcal, garantindo a permauencta d . C )~ que, POI' ser rnais pes ad que 0 ar, terule a ocupar 0 Iundo do fra 'CO, I\I'<lS.l serneadura, deve ser incubado em estufa a 35.5" a - 36.5I1C. pm urn P 'rlodo de 24 horas. Este sistema pcrrnite 0 primo-isolarnento no proprio I.u'in de transporte e tarnbem se presta a identificacao presuntiva,

lim outre tipo de sistema de rra nsporte para .1 Neisseria gonorrhoeae rill .lesenvolvrdo em uma placa plas! ica, retangular I COlli endo 0 rneio de

Mill E,slol placa apresenra urn oriflcio lateral onde e colocado lim cornpri- 1(lIdo t;l.'radnr de CO!' sendo depots hermetieamente lacrudo em urn saco I II I ico l.stc sisrema aprcscnta grandes vantagens quando comparado aos d '111:11.s, por apresentar 1I rna superflcie rna lor, lacilitando a serneadura c a Ilh 'IV' " ) das colenias isoladas, alem de gerar 0 proprio CO~, Este sistema

Ll IIIrd!l npropriudo uo transite postal. enrretanto e muito caro.

;j in' I flllli , •• ,d

Quais os metes que podem ser utilizados para a cultura cia Neissena gonorr:ho(!ac e qual Q rernrnendado pelo PN·DST I AIDS-MS?

Para a cultura da Ntds$e-ria gOllorrflOeae sao necessarios meio cnri quecidos e seletivns. A seletividnde assegura 0 crescrmenrc i!:' dcsenvoivimenta da Neisseria gOllol'I'IltJerJe. Ern rneios nao seletivos, ocorre 0 f-en6meno da competitividade com outras bacterias, constituintes de microbiota normal ou nan, presentes nos rnateriais coletados. A Neisseria gOflorrhoetfL e uma bacteria fastidiosa que exigc suplernentos csperiais para 0 seu cres irneuto, per ISS0 os meios sao enriquecidos com 0 suplemento VX .

Dentre as rneios de cultura seletivos para 0 cultivo da Neisseria go-

II a rr}mca.e, os mais tradicionais sao 0 Thayer Martin rnodificado, Martin Lewis e 0 NY (New York City), que diferem entre si pelas substancias inibidoras utilizadas, 0 rneio recorneudado pelo PN-DST/AIDS, por sua camprovada eficiencia e implicidade de pr ducao, e 0 Thayer Martin modificado (TMm). 0 PN-DST/AIDS recomenda rigoroso centrale Ja qualidade em todos os Iores do meios utilizados,

Quais os metes uttlizados "para ide'l1bfica,ao dol Neisseria 5QrtOrrhoeae?

A lderuificacao da Neiss ria g01JlJrrhot'ae e feita em meios que revelam a utilizacao de carboidratos (iH;:ucarl?S), alern de outras prevas, Para a realizacao da prove d .. l degradaca do carboidratos entre as especies do genero Neisseria, C: necessaria um rneio cam base enriquecida onde foram adkicnedo diferentes carboidratos, Alern disso, rcalizarn- e prays c pe cfficas como coloracaode Gram, prova de catalase, prova da oxidase.

Veja, no fluxograrna na pagina eguinte, a sequencia em que essa prova devem ser real izadas.

IUl(ugrama para cultura, isolarnento e id(lTItrfic.d.~ao cia NU5StRIA GONORRHotA.E

AB-

c-

D-

E-

Se voce possuir urna estufa de CO2, em seu laboratono, (: s6 calihrar a injc~ao de CO. e garantir que esle equiparnenro esteia proporcionandn urna atmosfera entre 3% e 70/0 de CO~. No processo tie caiibragern, aeonselhamos a reguiagern pam 5% de C01• Se VOc~ nao possuir este equipsmente em seu laberatorio, utilize 0 metoda da vela ou do cornprinudo efervescente,

Para executar I.) primeiro rnerodo, voce deve fixar urna vela na parede da lata sobre a tampa de urna place de petri, Acemla a vela, tampe bcm a lata c vede com fita adesiva uu esparadrapo. Certifique- Sf' de que a vela usada nao e toxiea, 11$_1I1do cepas-controle,

o mecaursmo de furtcionamento deste sistema consiste no quei rna do oxigeuio COl) pela chama, transforrnandn em dioxide de carbone (CO.). Le m bre-se de que a vela devera ser colccada na parte rna 15 su perior da lata, puis 0 CO, e mais pesado do que 0°2, que subirs e entra~:i em cornbustao. Este sistema proporcions uma atmosfe-ra em torno de 3% de COz.

o ouLro metoda consiste na colocacao de urn coniprirnido efervescenle sabre lim chumaco de algodao emhebido em agua na tampa de uma placa de Petri. Tampe bem a lata como no metoda da vela,

o mecanisme de funcronamento desse metoda It sernelhante ao do. vela. A diferenca e que 0 COl e gerado a partir do cornprirmdo efervescentc, A atmosfera de COl obtida com este rnetodo fica em torno de 7%.

iCl:l1mo 'l"iflQ0liI"beGer rum a Cil)lfm~a de Nell,~t'.I'Ml ~~rl(i.frnhoaru! iTlIlll m:e.i.ilI a1'l D\:J l:tn.lTuilld-e T'htll¥er Mar't:rrm? .(/EJ~lDaAtdID fihjilr.Qg;rm;m~

As colonies de Neisseri'l gOrlorrhaae sao norrnnlmente pequenas, brilhantcs.viscosas e extrernarnente aderidas ao meio, difkeis de serem retiradas do me-in cia cultura com IJ auxllio do alca bacieriolcgica. Essa aderertcia dcve-se u presenca dos pili (pelos), Quan to rnais pili possui uma cepa, mais adcrida rica JO melo,

As Vl'ZC5. na culture, aparecern colon las grandes.xorn aspecto e 1iJ- 11.d ulade acastauhada. ESsa5 ccpas nao possuern pili e sao fdCiJ mente rL'1l10- \ ld.u .. do rneio com alca baeteriologica.

Figura I: colenias caraderistiO'l. de Nei£si!TitJ gmlOrrhtJeatJ.

Como Fazer a confimla~ao das caracterfsticas rnorfctintortats da Neisseria grmarrhoeat> pelo metoda de Gram" (E.tapa B do fluxograma)

Ap6s 24 a 48 horns de incubacao, verifique (1 cres ... imenro nas placas de Thayer Martin rn dificado. Selecione uma colenla uspeita. Peguc esse colonia com alca bacteriologica e transfira-a para a superfide de urna larni na de vidro, contendo lima gota de solueao salina esleril.

Deixe secar e ra~tI a oloracao de Gram conforme demostrado no curso TELELAB -Temica de coloracao Gram. Observe, sob microscopic, em objetiva de irnersao (1 OOX). a achado de estruturss morfo!6gicas compativeis com I,) genera de Neisser (diplococos Graru-negativos riniformesj confirma que a bacteria c rescida e urna Neisseria (flglt.M ~).


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• Figura 2: V.isualizapo uricroscopica em aumcnto de lOOx em lamina corada por colorafjao de gram

( 111110 I azer a prova de catalase? (£tapa ( do fluxograma)

Com 0 au: Ilio de uma alca bactericlogica, pegue urna colonia susI eitn do meio de Thlm e hornogeneize sobre uma lamina limps, sec a e descugordurada. Em seguida, adicione uma gota de peroxide de hidrogenio (. gU.l oxigenada) a 10 volumes, que corresponds a uma solucao a 3%. A re "ao de catalase detecta uma enzima hemoproteica que cataliza a quebra do peroxide de hidrogenio em oxigenio e agua. Na reacao positiva, ocorrer.l desprendimento de pequenas bolhas e.na reatt~o uegntiva, 0 liquido permanecera i nalterado. A Neisseria gouorrhoeae caracteriza-se por apresentar reacao de catalase positiva, indican do a producao dessa enzirna.

o peroxide de bidrogeuio a 30% tarnbern pode ser utilizado para esS,I prova. Pingue urna gota da solucao sobre urna colonia suspeita e observe .1 reacao. Quando ocorre bolhas, a rcacao e positiva

( ClITIO Iazer a prova de Q)oda.-.e? (ctapa D do fluxograma)

fu istem doi rea gentes que podern ser utilizados para essa reacao . prirneiro pode ser preparado segundo Kovacs e con siste na formulacao de 111Ili.1 solucao aquosa a I % de tetrametil-p-fenilenodiarnina, 0 segundo de .1 ordo com Cordon e Mcleod, consrste no prepare de uma solucao aquosa .1 I, ';tv.., de dlmetil-p-fenilenodiarnina.

Voce podera fazer a re.;.l~ao de oxidase cclocando 0 reanvo dirctamente sobrc a colonia. na placa de cultivo, Oll preparado previarnente W1'3 IIt.1 de oxidnse .. e voce utilizar 0 reativo em ollt~ao obre a colonia, este lc Yi r a ser preparado no memento do use, Ilao podendo ser estocado. Se

'\'Ill rcferir user a fitas reativas de oxidai e, veja C 1110 prepare-las em pll'pillO rios meios, Para realizar a reacao de. oxidase, pegtle Un1R colonia.

II p~i t.1 (' cstregue-a sabre a fila urna cor rose, chegando ate purpura, apaI 'I CI I rupidamente, entre lOa 20 segundos, nils reacoes de oxidase posi ti~ l, .phlildo 0 reagente utilizado for 0 dirnetil-p-fenilenodiamina. Urna cor , Ii II t.l ~urgj 1'.1 quando for utilizado 0 tetrametil-p-fenilenediamlna.

~ I rcacdo for negativa, a coloracao do reagente no papel de nitro I" IIII,II! 'll'l inalterada, Para maier praiicidade, existern fitas de oxidase, I' 111,1 JlIInI us I d, ponrvcis no mercado. A Neisseria gonorrhoeae caracI 111 I I; pill apre entar reacao de oxidade positiva-Pigura 3.7

Oxidase neg.

Pigura .~: Mostrando a prove de oxidase

Oxidase pos,

Quah,,@s, f'a:to~ l:jue im rmrrfon!1n L1(,Nreswtad.ll d.i. pl'G~il! daQKldlis.e?

A 1I1di"1l;;:ao de alcas ou fins rnetalicos, tars 0..: irno ruquel-cromo e plat ina, podern pro\,onu reacoes false positivas, E importante reforcar que a prova de oxidase dew ser feita sempre ap6fo a coloracso de ram. puis algun: badlos Gram-negatlvos sao posinvos OQ reacno de oxidase e podem produzir colonia sernelhantes as cia Neisseria gO/lorrllOefll::. princlpalmentc quando 0 rncio de 1 haver Martin rnodihcado tern rnai de lO dial; de prcparu. Nesta fa!; do procedimento tit.' ideniificacao, lie as proves forem positives, voce tent tcrminudo a identificurao presun tiva,

Se a reacao de oxida e [or posuivn, voce de vera repicar a (epa rn meio rill I selelivo (!lgM cho .olate enriquecido) - etapu E do Iluxogmma, A partir dn suhcultivo, vuce val 1:1ZCI' J reacao de degradacao dos carboidratos (;l~ tk,m':b).

Prepare limn suspensao dcnsa da bacteria em sol ucao sail na O,R'l'-Yf}, utihzando 0 cresciment de uma subculture pura, obtula a partir do meio de isolamcn to nao seletivo (agar chocolate ennquccido) com crescimeni de J 8 horas. Pingue de duas a Ires gOt.1S em cada urn dos tubos de eTA. contendo 1""1 de (ada um dos acucares (gl icose, mal tese e saca rose, respertivarncnte). \ r IS ure ,1 sol u<;Ju no terce superior do rneio com alca bacteriologica. ] ncube entre 35,S<} e 36,50C pur 24. 48 c 72 horus. sern atmosfera de CO .

Examine os tubes de fermcntacao de acucarcs a cada 24 horas de m~ Ub"l,-,lU. Casu ha]a nciditic a,iio do rncio, () indicadur (vermelho de Ienol ) mndani a cor do mcio de vermelho alaruniado para amarelo, A pruva "era posurva pclfil NClSSt''';(I g(1I10rr/raelll, apenas quando a glicosc lor 0 unico carbmdrato mctabohzado, C01110 rode ser viSln, na tahcla,

upe-crme

Ghcose

MahClSI'

lactose

aCoJrose

ONPG

N. gonr;(mo~"e +

N T11MUTgllidls

+

N lacramica

N POIY5d!challNl N sub/lava

+

+

1/

N SICU

+

+

+

1.Jj1i\l bul;u"":IIIU illJ,nflH

Que OUrrO!; mstodcs exi.:.lem para a identifka¢o confirmat6Tia da Neisseria gonorrl1 oeae?

Existern vario metodos disponlveis no mercado, Dentre eles, as mais utilizados sao 0 sistema Quad Ferrn + TM, 1\ Iinitek e Bactek. Metodos imunologicos baseados na reacao com a protelna ] do Gonococo tarnbem estan dispontveis no rnercado internacional e sao apresentados e111 varies formatos.O mati; conhecidos sao 0 Gonogen, Gonogen II, PHADRBACf MONOCLONAL GC e 0 MINrrEK-TM.

Embora praticos, os testes acima mencionados sao, via de regra, irnporrados e custam care,

Como Sol ber se uma cepa de 90no(OCO e Predutora defl-Lactamrue Voce deve fazer ,I pesquisa de fi-lactl1m;)se.

o que ej3-lac.tamase ow penid/inase?

fi-lactJmase ou penicilinasc ~ uma enzima produzida por algumas cepas de N. gOllorrot'ae e outras bacterias e esta as rociada a resistenoa de algumas drogas antiruicrobianas, Esta cnzima, na Nt~ls>erui gOl/orr/wel1e. e sintetizada no espao:;o perlplasmatico da parede celular, Sua produ\ao e mediada por LIm plasrnidio (material gene-tieo cxtracrornossomico) - figure 4.

A fl-lactamase destroi a ligacao amnia deutro do and fi-lactamico da penicilina, produzindo acido penicilinoico. Como 0 anel j3-lacttlmico da pen icili na e responsavel pela atividude deste aotlbiotico, a hidrolise deste .1I1el causa a perda de sua atividade - figura 5.

No espaco peripla 'matJco. entre a protelna-alvo, na membrana intcrna, e a membrana extern a da parede celular, ajl-laclactamase.pcr mecanismo de competicao, liga-se a penicilina, inatlvaudo-a-s- fi:gura 6,

Alguns dos antfbacterianos jl-lacramicoss silo as pinicilinas, cefalos porinas, carbapenernicos, rnonobactamico: inibidores de fi-laClJma 'e.

J 'N JJST/AidJl/Mil1j.I~'R .... '.1I1"~

Parede celular b ac.teri an a

Mcnlhr<lI1<.1 extern a

( amada tripla: protepina Iosolipideo lipoproteina

Espa~o perisplasmatlco

Carnada peptidoglican

Espa~o extracelular

Citoplas",a celular

Iljguru 4: Representacao esquemerica do envelope celular de bacterias Gam-neK. tlvns

IIMIlI : A~ltI) bioqu mica da penicilinase sobre II penlcilina,

Peniciti.l1a

.t

Membrana extern a

IJ - Lacramase

Espaco

peri plasmatico

Membrana interna

'Protelna receptora de penicili110

Pigura 6: mecanisme de a(,:80 da /3-lactamase. hidrolise c ugll.Siio da 1~-I:l.Clamase an and p-lactamico deantlhierico.

Q1,jaiii,os met~cl~s dispmf1fvei&p(u;a! cfuteG.rra0 cia e-m~mdJ~-ladirmase 01.J pe:1Il1 ti: iltnas:e?

I-xJstem algun rnetodos dispontveis, dentre cotes:

1. metodo acidometrico: e cornpnsto PClT urna penicilina como substrate e UIl1 corante indicador de pH. Quando a penicilinase esld presente, cla hidroliza 0 and 13-lactamico da penicihua, for m<ldo acido penicilinoico, que acidifica 0 rneio, rnudando a cor do coranle indicador .. le cor,

2. metoda iodometrice: e composto por urna mistura de arnido pcnicilina e reveladu par urna sniulfao de iado. 0 iodo, quando em cuntato com 0 aruido, ti.uma urna coloracao negr -azulada,

"hm I ,1'111"'1"

Quando a penicillnase esia presente, ela hidroliza 0 ariel ~-la.::lamku da penicilina, Iorrnando acido penicilinoico, que acidifica 0 IllCIU, desnaturando 0 amide I! evidenciandu urn halo esbranqui.ado ('111 volta do material testado (colonia suspeita): e

3. metodo da cefalosporlna cromogenica: a cefalo ipcrina cromogenica e urn antibiotico ~ lactamico, assim como a pcniciliua, Quando a penicilinase esta presente, ela hidrollza D anel f3-laclamico do cefalospina croruogenica, formando tarnbem urn <1 cido, que vai induzir 0 aparccirnento de urna coloracao avermelhada. Bsta prova pode er realizada em solucao llquida, em Ata Oll dis- 1..0 previamente preparado, Esle teste- eo metodo indicado como padrao de trabalho pelo Prcgrama Nacioual de Docncas Sexualmente Trunsmis: lveis e Aids do Minislerio da adele.

A cefalosporina cromogenica rnais usada e a nitro efim,

t:omlil fazer a pmCllv<tdiJ.{r~efa;ll!lS'pooima'Cir;Q1mug:enica?

A cefalo penna cromogemca pode ser adquirlda cornercialmente

ull ",irids apresentacoes: solucoes ltqukla ,discos e fitas.Independentc da npresentacao, a realizacao do teste consiste basicamente na rnistura da cepa h I~ teriana com a celalosporina, A reacao positiva, indicada pelo deseuvolvlrncnto de coloracao rosa 1\0 material, ocorre gcmlrnente dentro de 5 rru- 1l1l11lS, porem, as vezes, pode levar ale I hera para se desenvolver.

( ~JlTIO e~hll.Caf rC8pas & NRi5~miagDJ1l!llnrllcyeae llIiLTa. J;lIltUH1S esl:l:H!ies ride Sem51 a.~11- J i aos ii11'lti,b16ti OIPs?

I' isrem varies rnetodos para a manutencao de cepas por longos pe-

I orlos 1i\1!Jliza~au, 0 congelarnento a -701lC em pi! pel de fihro, f.)1I tubus

,"111 ",

J J1N~LJ~T/AIDS recornenda a esloragern em tubes, por congelaIll, III , .1 -7{)1le. iJara assegurar a viabllldade de sua cepa, proceda como It .l trln.!, I: tuir:

I. I \'UIIC lim tubo para congelamento (cnotubo l esreril de 1,8 ml;

2. Prepare uma sclucao densa de suspensao bacteriana, pela adl~aq de varias colonies em. 1,0 mJ de BEl com glicerol (vide prepare des meios). Utilize urn subcultivo recente, com 18 horas de incuba\ao e tome ceres Je ] /3 das colcrrias crescidas; e

3. Congele imcdiatamente .1 -70QC. Essa suspensao pede SCI des congelada para a remocao de urna pequena aliquota e recongela da a seguir, desde que a uspensao inicial eja basrante densa.

I H, I n II Wln'lllI: IfIn~.Ijj,l:ll '

(orno Iazer (!) controle de qualidade dos meios de transporte., cultura e identiflca(.~o da Neisseria. gonorrhoeae?

Voce vai fazer 0 controlc de qualidade, loie a lote, de todos os meios reagente usando cepa -padrao, 0 controle de qualidade deve ser reiro 3 cnda novo Iote de meio preparado ou adquirido e sempre antes de iniciar a testagern das amostras da rotina diana. eja na tabela quai as cepa -pa. drno que voce devera utilizer e que os resultados voce deverd nbtcr.

Resultado "'SJlltraaO

Maios de Transnorte Neisseria gonoffnoeae WHO A. a,

de ArniE'S C, D ~ E ATCC 4'9".126 e 19.113

Re~pera,.aCl cia ba<;. lerla quando semeado em meio de TMm

Mdio de Thayer N'!lJrtJn mod!lica<lo

NE!Isserta gonorrhoe<lt! WHO A. B. c. 0 e E ATeC 49.226 e 29.213

CrE'scimento po.smvo

Escnerl-chia coU A Tee 25.922

Cresdmehto NEGAllVO

CY'I/na TryptYlcase

Agdt· eTA

Neiss:etld gon.offnQeo.e WHO A, B, C, DeE ATCC 49.226 e 29.231

,

ACldl(tca apenasa glicose

Ne~eria meningitrdis ATee 13,102

Addifica a gllt.ost' e iI mallo~e

St~phyl{)(OCClJfj IfIJreus ATCC 25923 Strepwli,QI;;ws pyogenes ATCC 19.615 Escllf:!rlcll/il/;.o/i ATCC 25.922

POsttlVA N~GATIVA NECiAllVA

/VeTssena gonorrhoeae W~ID A e E

Cllf'" WHO A Nl!Ballvd (j.Pll WHo E PosltlV,)

Como f azer 0 centro leda qual, dade dos meios e reagen tes?

Com 0 auxilio de urn swab. pegue uma au duas colenlas de urna das ceras descrita no quadro e inocule no meia de transporte de Amies, Apes 4 horas, serneie em meio de Thayer Martin rnodificado (veja le nicas de: semeadura no curse TELELAB - Tecnlcas para coleta de secrecoes). Ap6 4B horas de incubacao em condicoes apropriadas, confira 0 crescirnento da Neisseria gonorrhoeae, Caso esse seja positive. signifies que 01011' do rncio de Amies possui a qualidade desejada,

Para 0 rneio de Thayer Martin modificado utilize as cepas descritas 0 quadro e, ap6 48 hora de incubacao em condicoes apropriadas, confira a condicao de crescirnerrto, tumbern descrita no quadro,

Para 0 teste de degradacao de acucares utilize as cepas descrita no quadro e, ap6s H. 48 e 72 horas de incubacao em condicees aprepriadas, confira a condicdo de acidificacao des acucares.

Para os dernais testes utilize as cepa!\ indicadas no quadro, realizando os testes con forme- ,15 tecnicas descritas nesse manual.

Sempre que os resultados forern os descritos no'quadre, seus meios e reagentes es arao adaquados para uso,

--a;lf------.

Meio de Amies

Esse rneio rode ser adquirido cornercialmente na forma desidratadn Ol1 preparado em seu laboratorio.

Caso voce adquira o produto cornercialmenle, siga as instrucoes do labricante. Caso voce opte pelo prepare, pese separadamente as seguintes ((1111 pon en tcs.

Ti ogl i co I ,1 to de sodio .. , '" '" 1 ,OOg

carvao tannaceutico neutro l0,Og

cloreto de sodio (N llCl)., , " 3,OOg

fosfato de sodio dibasicc (N,J, HPO ) l,lSg·

.. I

fosfato de potassic monobasicr; (KH2 PO~) O,20g

cloreto de potassic (KCIl (J,IOg

clorcto de calcic (CaCl~ lH10) lOg

clore to de magnesia (Mg:CI16H~O) O,lOg

agar 3;60g

<igua destilada IOOOlnJ

Dissolve os componentes na igu.a destilada, Esse meio pode ser ,lIlliC,ido ate 0 ponte de fervura, Oimportanle e que todos os componcnlet; estejarn completamen:te dissolvidos, Ajuste 0 pH em 7,4 ± 0,2. AutoII ~w 110f 15 minutes a 121°C. Distribua 2 mI em tubos de vidro eslkru

11111 uunpa rosqueavel. Estes tubes podem ser guardados em gel a deira, no nuiximo, par urn meso

Lembre-se de que 0 meio de. Arnies proporciona urn percentual alte .11' ( ulturas posi1.iv3S de Neisseria gOtlorr/lOt!lU! eru relaQio 11 outros sistemas II I r,1I1sl urte, Bnlretanlo,e recomendado para lrinsito de' curio perfodo, 11 H hu .... 's,

1 1 J 'ItA,,1 1~II"M6rl,,!U S~"'k

Meio de Thayer Martin modificado

Esse mew e preparado em quatros clapas. Para" seu prepare, confi-

ra e voce dispoc dos eguintes componentes:

rneio base CC 36.UOg

h rnoglobina bovina 10 OOg

suplernenio VX (ou de KdJogg'5 ) , " , 1 O)OOml

VeNT (vanccmicina 3,OOml. colistina 1,5mt, nistatina 12,Sml

e trimetroprirna 5,Oml) •

agui.l destilada 1 litro

ctapa I

Fm urn balao de Iundo chato, coloque 500 In L de agua destilada. Adicione 36 grarnas de rncio base lie. Aqueo soh Jgil,l\iW consrante ern chama de bico de RU5Cr1 II de fogiiu ;1 ga5, ate a cornplcta di!tsolu~-a() do rneio, Evitc que a mistura atinja o ponte de fervura. Autoclave por l'i minutes a 121 C.

E.tapa L

Em outre balao de tundo chato, di OIV,l IO.OOg de hemoglobina em 500 ml de. gua dcstilada. Aqueca sob agitacao constunte em chama de bico d Busen uu de rogao a gas, ate a complera dissolulfdO. Autoclave por 15 mmutos a 121 C.

E.tapa :3

Em hanho-maria ajustado em 45 ± 5 C, aqueca as rnisturas produzidas nas etapas 1 e 2 at~ que 0 agar esteja cnmpletamente fundido. Assept! I,; mente, misturc u corncudo dos dois baloes e horuogeneize.

Ern capela de lluxo laminar, pegue a mistura da etapa .~. Assegure- e d Jue e~L.1 esteia em temperatura de- 5 _ soc.

JlN·US·I·/AI,J MlIll,1 rIO, d" 'ilI1'''"

Adicione os 10 rnl de suplemcnto VX e os antibioticos que compoem o VeNT, nas concentracoes definidas, Homogeneize bern. Distribua, ass .piicarnente, erca de 2S 1111 do nreio em placas de petri. Deixe solidificar (J.5 a 20 mlnutos).

Acondicione em sacos plasticos, Esteque ern geladeira a 40C por 10 lias, Ap6s esse perfodo, os meios comecam a sofrer desidratacao C as ant'hioucos apresenrarn declinio de 1I<1 <l¢.io lnibidora, diminulndo a seletividade do rneio,

nplemento deflnido de Kellogg's

Glicose 40,OOg

Glutamina 1.OOg

Solucao de nitrate de ferro a O.5% lO.OOmt

Agua de tilada 90ml

1. Misture os ingredientes;

2. Autoclave por 15 rnirtutos a 120QCi

3. Esfrie ern banho-maria a 45± SoC;

4. Adicione 1 ml de solucao esteril dc cocarboxilase a 20%; e

5. Guarde em frasco esteril de 100 ml com tampa rosqueavel a 40C (esrdvel por varies meses).

11'1\1 1',\1' degrada~ao de acucares

Fsse meio e prcparado em trl!s erapas,

P 1'1

,lg.1I cistina tripucase, CTA 2,90g

•• ·.It O.7Sg

agua deslilada , .. 9 5,Om I

E111 LUll batao de fundo chato de 200 mi, coloque 95,0 ml de ngtht destiladu.

Adicione 2,9 g do rneio erA e 0.75 g de agar. Aqueca sob ~gita~aoconsmote em chama de bico de Busen ou de rogal a gas ate a cornplera dissolucao.

Evite que a rnistura atinja 0 ponto de ebulicao. Autoclave por 15 minutes a 121oC.

Se voce nao possuir 0 meio eTA prunto, au se prcfe: if. VOLe pudera furmular da seguinte maneira:

triptose , .. ,,,,, .. ,,,,, l.OOg

l-ei st i nil O.05g

cloreto ele sodio O,Sml

sulfite de sodio O,05g

vermelho de Ienol.. O,OOJ 7g

aga r : I.OOg

;'gua destilada ~5mI

Etapa 2.

Nesta etapa, voce preparani as solucoes esterers dos l\UCil-L'CS. Para 0 seu prepare, confira se voce dispoe dos seguintes cornponentes:

agua dcstilada J 00n11

gl icnse 20,Og

lactose 20 ,Og

saca rose 20.0g

maltose 20 Og

Coloquc 100 ml de agua ern urn br-llall de fundo chato de 250011 e adiclnne 20,0 gramas do a~Lu::ar a ser preparedo. Agite ale 11 complete &<;solur;ao. Hsterilize por filtracao em membrana de O,22V de diarnetro. Repita 0 procedirnento para LOtios 0); acucares. As solucoes estereis dos aeucares poderao SCI' guardadas em frascos-urnpola lacrados, estereis, ern geladeira (4cC) e pod rao ser utilizados par 6 rneses, Se voce tiver dlficuldades para acondicionar " slocar em condicoes ideais, dirninua 0 volume para 10 ml (adicionando 2 .. 0 S de 'ada aciicar para 10 1111 de ag1.l3 destilada). Jtstcrili2.c por fillnl\'80, como descrito acirna. Utilize 0 volume necessario e despreze 0 restante,

Hapa final

Em banho-mnna ajustado para 45 ± 5"'C,aque<;:a a meio de eTA prcparado na etapa 1, aLe q~~e 0 ,tgaresteja cornpletamente fundido, Asseptil unente, acrescente 5 ml da soJu'ilio do acucar a 2004), preparado na etapa 2 Misture hem e distrihua 4 ml em lubo. estereis de 12 X [20 mm, (om \ "Ill pu rosqueavol.

Rotulc adequadarnente e estoque a 4°C, ern geladeira por ate 30 dia .

IICI>(,lnte antes, se ()C~ observar a ocorrencia de desidratacao. l.ernbre- se I il que esla preparacao devera SCI' repetida para cada aciicar,

t~rcp ro de Iltas para prova de oxidase

11.'.1l1VO de kovacs

tetrametil-p-fenilodiamina O.tg

gua dest ilada 1 Om 1

I •• lIy() d Gord()n e Mcleod

dill1ctll·p-fenilocl iam ina O, 15g

.igU.1 debl ilada , 10n11

Mu I" I pr -paro

I. l orte papel de filtro em tiras de LXI (111;

2. Coloque as tiras em UJ1111 placa de Petri;

1. Pingue 3 galas do reagente sabre cada tira;

4. Deixe-as secar em estufa a 370C, rnantendo a place de Petri destampada:

5. Guarde as tiras em frasco de vidro escuro, limpo. sew e ideutlfi(ado com 0 nome do rcagcnte e a data do preparo;

6. Guarde em gcladcira; e

7. Teste a fita diariamente com Ulna cepa-controle,

Meio de BHI .. gltcerol para congelamento da cepas

BtU (Brain Heart Infusion BTOth) 3,7g

gllcerol 20,OOml

agua destilada ·· · 80.001111

Modo de prepare

L Em lim balao, rnisture todos OS componenles;

2. Autoclave por 15 minutes a 121 <lC;

3. Dispense, assepticamente, I m] em tubas para congclarneuto (criorubos) com tampa rosqueaveis;

4. Estoque a 4"C.

Para cuidar de sua seguran~a, da seS1>lriUl~a de seus colegas de t,ab lho ~ do meio ambiente, obedeca aos procedimentos b.isicos de biesseguranca em Iabcrarortcs:

PIKur 1: 5lmbolo do risco biol6gico

'1'101 I '~II Illi",MI"L I~rll' d" Smidt·

Todo cuidade e pouco na mani pu la-;.ao de materiais bio16g1C.OS, tais (01)10 sora, sangue au secre-roes, fluidos organicos, tecidos etc.

Bedobre suas precaucoes, pors esses rnateriais sao potencialmente rnfectantes e muitas ezes estao contarninados com agentes e.tio16gi cos diferentes do que se esta pesquisando, ou ainda desconhecidos.

Nunca pipete com a boca e jamais chetre placas de culture.

A inati a-rao do soro em banho-maria as6D( pOT 30 mmutos nao elimina 0 potential infectante da amostra.

Lerubre-se de que, com u autcmacao, aurncntou muilo 0 nurneru de amostras processadas em lahoratorio f.'. con~eq uememente, aumentou tambern 0 risco de contanunacao. Como voce sahe, ~ diffcil afirrnar que urn profissional se contaminou, de fate, em service. lsso faz com que JS

docncas infecto-contagiosas causadas par acidentcs de trabalho nao seiam devidamente notificadas: em consequencia, as rnedidas de .egunUl\a envoi vcndo 0 biorrisco acabum nao sen do implernentadas,

Use sem pre equipamento de protecao individual ([PI): avental ou jalew lOllgo de mangas compridas e punho retratil.lu as descartaveis

I .. ,

6culos de prote-;ao, pipetadores rnanuais ou automatfces e, quando

for 0 c.asu, protetor facial e mascara de "Prote~ao contra agentes tnfecciosos ou agentas quimicos.

Os. EPI sao regulamentados pelo Minlsterio do Trahnlho e sell usa visa a rninirnizar a exposicao do tecnico aos riscos e eviiar posslveis acidentes 11m; laboratories, Note que, as vezes, ns profissionais de laboratorio prcClsam de urn tempo para se adaprar ac USu des e(lu iparnentos na sua rnti na. t) importante e que voce se adapie e incorpore iJ utilizacao dos EPI a sua pranca prof sional.O USC} indevido do EPI, an inves de proteger, podera ocasionar acidentes,

Obs.:

o ideal e nao canter bolsos, para nao colocar objetos contaminados, canetas, etc. vela proxtmidade (om as It!lKOSaS da boca e nariz.

11K"" : Ilmll"l~() des principais equipamenros de prote~o individual (EPI)

[vite a ormacao e dispersao de aerosseis,

Aerossots sao microparttculas solidas e lfquidas com dimensoes apre imadas entre 0,1 e 50 micra que podem, caso centenham mic.roorganisrnos, permanecer ernsuspensao e plenamente viaveis pOT varias hora.

A pipetagem, Aam.bagem de alt;as, aber tura de frascos eampolas, maf1ip1Jla~ao de serlngas, agulhas, lancetas, laminas e outros assemelhados podem gerar e propagar aerossots.

A abertura de: trascos, ampolas, tubes e garrafas de cultura requer cuidados esperiais, Envolva a parte a ser aberta com urn pedaco de gaze. utilize lim pedaco de gaze para cada material, prevenindo assim a contarninacao cruzada. Descarte-s imediatamente em hipoclorito de s6dio a 2 %.

Centrffugas, agitudores e maceradores, quando manipulados scm as precaucees e abertos antes da total parade ou termino da operacao, igualmente podem contarninar 0 ambiente laboratorial.

Iamais recoJoque capas em agulhas. esse procedimento e uma das prhl ipais causas da contaminacao de prof'lssionais de saade por miroorgarrismos, existerrtes no sang-u€l e em outros fluidos organkos, como par example, 0 frus da hepattte B, hepatite ( eo HIV.

ApeS a coleta, voce deve descartar esse mater ial diretamente em recipiente de paredes l'fgidas corn tampa.

l.embre-se:

(ada mililitro de S<ltlgtle c.ontaminado com 0 Vi1'US da hepatrte B contem 1000,000.000 de partfcalas virais, que podem

p srma n ecer viave i 5 por ate uma seman a , Basta uma dessas pal' tim- 1.15 para contaminar a pe.ssoa, no entanto todo proflssional de saude deve ser acinado contra 0 frus da hepatite.8.

J iglll'U J: llustmfj:l'io do dcscarte de agulhll em recipiente spropriadc

Reduza ao maximo o manuseio de residuos, em especial es perf uro cortantes. Descarte 0 rejeito perfuro cortarrte diretamerrte em

re ipiente de paredes rfgidas, prnprios para des carte deste material.

Trata-se de caixas rfgidas revestidas inter narnente com plastrce e devidarnente tdentlficada com i'nstru~oes de descarte (caixa padrenizada em cor amarela), que nao devern ser preenchidos aenna do limite. de 2/3 de sua capacidade e devem ser colocados proximos do local que serao utilizados.

Esta e urna regra basics para diminuir I.)S ri t;OS de aciderue nos lob • ratorios. E fundamental que a materials perfuro cortante como agulhas, seringas, lancctas seiam descartados em recipien tes rigidos com tampa c que estejarn idcntiflcados Will simbolo c expressao de re {duo infectarue. As agulha nao dev m ser entortadas, quebrada ,recapeadas ou removidas do seringa apos 0 uso, Deve-se descontaminar ern autoclave 35 min a 125" C e entao encarninhar ao lixo hospitalar, 0 acondiclonamento dos re iduos de laboratorio dove eguir a Norma Brasileira (NBR1 91 0 da II ociacao Brasileira de Normas Tecnica - A.BNT, que recornenda sacos brancos leiloSQS para as residues potencialrnentc infectanres e hospitalares e e CUr!)5 para 0 lixo comum.

as profissionais responsaveis pela limpeza e corrservacio devern set bern orientados c usa! equiparuentos de protecso. Todos os rccipicnte pard descarte devern estar idenrif dos,

Lernbre-se de que, pela legisLa9io brasileira, quem gt'r::l 0 residuo co responsavcl pcla sua climinacao c controle.

No caso dos materiais reurillzaveis, como vidrarin e utensllius, deposite-os em re ipiente conteude 0 de infetante proprio, pclo tempo de contato recomendado e, em seguida, fU'ra a autoclavacao. Depois, la en rmalmente esses materials e guarde-os para uso posterior,

141 n iflque e sinalize os priucipats rtscos presentee em seu Iaborato, io. Prudutes e areas que oferecem risco devem ser marcados com os (I, ldos sfmbolos tnternacionais em e iquetas auto-adesrvas padrao.

Veja, a seguir, as principais sirnbolos associados aos riseos em I.illli 11 rios,

PERIGO .BIOLOGICO

entrada permitida somente para pessoas autorizadas

N llL1t~lil do risco: llilltlon rio respallsave1:

liP t I"U de emel'gQY1da, chamepor:

I ; I lellll' dnrmo.

Telet()ne residential:

RISCO BIOL6GICO

•••

RISCO RAIJIOATIVO

.EXPLOSIVO

INFLAMAVEL

CORROSIVO

IRRITANTE

COMSU:RENTE

l,igura 5: Principais simholos inrernacionals associados aos riscos ~11l !'Ii;)nnH6r:ios.

V· iflque ernpre as condicoes de funcionamento des equipamentos dE' Pro lec;io Coleriva (fPO: extintores de incendio, chuveiros de C9llran~a, lava-olhos, pia para lavagem de maos, tai a de areia e cabine de seg1.lranc;a bio16gica.

Lxistem tres tipos de cabincs de seguranca biologica de Ilu: 0 vertical pI nlvcis no rnercado: as de classe 1, classe [] e clas e III, 30 r eomendad.l para 0 lISO em laboratories clini os a de clas e H. As cal Ines de Ouxo III rizorual nao protegem 0 rrubalhador, Veja a figura, 11\1 pagina . egulrne.

Prccedimentos que devern ser observadcs 113. cabine de eguranca I,I dUSIG1:

Dcscoutamine a uperflcie interim e aguarde 15 minutos antes de IH,juipuisr materials e depois do uso replta a desconrarrunacao com gaze tt::l il ernbcbida em alcoa! 70 %;

II ue a Labine e a Iuz ultravioleta 20 rninulos antes e deixe tudo llgaI'd\! mesrno tempo ao final de sua uulizacao,

Usc avental de manges longas, luvas descartdveis e mascara;

Nao efetue movimentos rapidos ou bruscos demro da cabine evite \1 r I~O 'S que causern turbulencia,

Nun trabalhe com portas e janelas abertas e nao perrnita a aberlura I porl.,s 011 circulacao de pessoas atras do trabalhador quando cste sc enI int uu rnuurpulando-arnostras na cabine de segurau, biologica.

N n II bico de Bunsen, pois pode acarretar danos 00 filtro H6PA c 1\1 .11 dcsequiltbno do fluxo de ar. e necessario, usc incinerador elerrico \ I IIII~ lUI [ueimador au I omatico, e

1\.1.1111 nha as greihas anteriores e postcriores da cabine desobstrui('ihm nit lim deposit . Evite guardar equiparncntos ou quai quer

III 1,1'IIiI1IMln"d~lI.>ul

ClASSEl

CLASSE II

Cl.ASSE III

Figura 6: Ilustracso das cabine de: segur'dn~ biolcgica - classe I, 1I e TII.

k cabincs de classe I e II sao consideradas como barreira de prote~ao parcial e a de classe 111 e uma harreira de protecao total

Para descontammacao pessoal, de equipamentos e superficies fixas, u -lize desmfetanteseflctentes e adequados padronizados vela CCIH (Centra) de Controle d 'Jlfec~Oes Hospttalares). Use sempre produtos registrados no Ministeno da Saude,

Nao existe urn desirrfetante unico CJuc atenda a todas as necessidades, E fundamental conhecer 0 diversos agentes qulmicos e SU;] compatibilidade de lIS{) para ev i La r C usro excessi vas e uti! izac;aa irtadeq 113da.

Para a descontaminacao de amostras biologicas na retina dos laboratorios cllnicos, recornendamos 0 compostos liberador s de cloro. 0 mai comumente utilizado e 0 hipo lorito de odio a 2 %. u forma mais an .1 • 0 cido hip cloroso (H CI), que e formado em solucoes corn pH

l ntre S e 8. A eficacia do cloro decrescc com 0 aurnento do pH c vice-versa. ( .ibe lembrar que 3 atividadc desse addu e diminu kla na presence de 1113- IU'U organica, fate que dove ser cnnsiderado quando aplicado ern superfi-

k~ contendo sangue e outros liquidos corporeos. 0<; hipocloriros tern sua • tabllidadc depcndente de fatures como concentracao, temperatura, pl-l, liz. metal' e prazo de validade.

o hipo Joritos sall cerro sivos para rnetai bjetos de prala, aluml-

ni j e ale mesm: de aco inoxidavcl suo aungidos quando imersos em _0 luroes rotineiramente utilizadas em laboratorio, o hipo lorilo de sodio e II) !~(' e cau <l irritacao na pele C olhos, Se ingerido, prOVOGl corrosao das IJ1Cmbr<JmlS e 111UCOs,a e sua inalacao I..UI~a irrita~ao severs no trato resplralUI o, Iamais rnisture os hlpoclontos com outras substaucias quunicas, tais

omo desinfetante, alcool, olurt6es germicidi.1S, solucoes de amenia, etc.

Apos a tratamento par 24 horus com hipoclorito de sodio a 2%, os mntenais devern ser < ut ciavados A autoclavacao c rccornendada tendo III vista a possibilidadc de 0 hipoclorito nao atingir as partes do material .! ser esterilizado, ~a 0 isso nao seia po sslvel, a alternauva e 0 metoda de crvuru por perfodo nao inferior a 10 minutes,

ObseTve, nil. rabe la abaixo, a i ndlca~o de aJg lJilS agentes qUlm1cos e eu espectro de a~ao antimicrobiana.

I.: n lend a anti micro bi ana de alguns agentes quimi cos desinfetantes frente a agerrtes mtcrobtanos.

e.o;teria virus vlrw mlcobao;terlas funqos Esporros
Iipofni!;Q!> hldrmllltm bitCW"!lJnoJ
V
+ .. +
+ ... ..
+ ...
+ "t nha muito cuidado com a manrpulacao e estocagem de subsU,ncias qufrmcas, Leia com atenlrao as lnformacoes contidas nos retules.

A cstocugem de mareria-prirna deve ser feita em arrnarios apropriados, hem ventilados, ao abrigo da luz solar e calor. E irnportante ob ervar a incompatibilidade entre as diferentes substancias.

Sempre que recornendado pelo fabricante, os agentes quimicos devern set" rnanipulados em capela ... de exaustao qulmica devidamente instaladas. Atenc;.ao: Nao confunda capela de exaustdo'qufrnica con) cabine de segu r anita bioi 6giC<1.

Veja a seguir 05 rlSCOS relacionados a cada categoria qulmica:

Categoria qufm lea e riscos reladonagos

GRuPO Q1J(MI<.O

RISCO

Atidos

Bases

COrrosii"

Udnetos !? Sult~tos Uquido5 inflamavei5 Solido In.f1fJmtivel

EI1venenameJ1to

In~ndio

lnC@ndJo

Seja sernpre consciente da impor tancia de SUa5 a~oe na preservacao da biosseguranca em set; local de rabalho:

Lave as maos antes e depoi de qualquer procediruento laboratorial; Nunca pipete com a boca;

Iarnnis cheire places de culture ou qualquer material biologico au quirnico:

Dentre do laboratcrio, nao fume, nao coma, nao beba, 118 prepare refeicoes, nao aplique cosrneticos:

Quando estiver usando luvas, nao manuseie objetos de usa comUI11, .omu telefones, n iacanetas de portas e ja nelas, jornais, revistas: Deve ser proihido a prcsenc;a de jornais no ambientc delaborat6rlo;

Deve-se turnar cuidado com a utilizacao de canctas, lapis e marcad ores de textos e a contaminacac d~$lc~ obietus om material blO16gicu;

Nao guarde alirnentos ou bebidas em gdudciras e cougeladorcs para arrnazenagern de material biologico; e

Vacine-se contra a hepatite B e faca 0 cnntrole de titulo de Antil lbs rotineirarnenre.

C ljuindo essas recomendacoes, oce vai es ar contribuindo paraa diminuir;ao de acidentes.

1~41 .l(onte~a urn acidente de trabalho em seu laboratorial notiflque medratamente a sua chefia e certifique-se de que 0 mesmo tenha sido forma.1mente notificado,

Consideracoes Finais

Muitas das atividades aqui descritas ja Iazern parte do sell cotidiano Fuca urna reflcxao sabre 0 que acabou de ler e vcrifique 0 que po de ser manudo, moditicado e incorpurado a seu trabalho e ao ieu laboratorio para que a sua pnitica profissional sc desenvolva de acordo com os procedimeruos tecni .os e cuidados de hiu, seguranca recornendados pelo Programs Nadonal de Doencas Sexualmente Transmissiveis eflids, do r v 1inisteJ"ia da Saude, As que.'; toes co locadus a seglt i I" facili ta ra 0 essa ref exao,

ulldl~.Oe5 gerais do laberatdrio

As areas de circulacso estao desobstnndnst Qual a situacno gCJaJ quanta ao aspecto de llrnpeza!

Qual 0 estado de conservacao e rnanutencao de pisos, escadas, paredes e tctos?

o local de trabalho esta adequado para auvidades envolvcndo 0 risco biul6gictl?

As bancadas e os dernais mobili rios do laboratcrio estao em condlcoes de usn?

Exisrem bancadas apropriadas para trabalhos com solventes e dernais substancias quirnicas corrosivas? E. iste pia diferenciada para lavagem das maos no Iaboratririo!

Existern ruecanismos de contcncao que previnam a entrada de insetos e roedorest

Exi item programa.~ de manutencao preventive de equipamentosi

( s produtos armazcnados e a area de cst.ocagem estao orgil1117ados com as devidos cuidados de seguranca?

txi ue u cuidado de se estocar material e/ou substancia incornpi.lti ci: separndamcntet

! HI I J rI,' higi ne pessoal e de alimentacao

• 0 local e mantido lirnpo e em condicoc de htgiene? Existe agua pilI a vel disponi vel?

Exisrern sabao e toalha em condlcoes de usa?

E istc local para troca de roupa e guards de ObjClOS pessoaisi I' xistc area para alimentacao separada da arl'a de laboratorio!

Existe adequada organizacao para coleta de lixo e dernuis rcjenos (nao-infccciosos)!

Remge:Ta(,ao e Ventila~o

• A temperatura de trabalho csta entre 10 e 261lC?

A~ [anelas estao protegidas contra 0 cxcesso de luz solar?

Existe venula .au adequada, especialrnente nas salas com cabiues de fluxo laminar?

11 umina/Wao

A iluminacao geral e adequada]

Existe ilurninacao dirigida nas bancadas dt' trabalho?

laborutorio tern sufieicnte abastecimento de aguil, energia eletrica ega?

Existe adequada manutcncao de fusiveis.Iampadas c cabos eletricosi A lirnpeza e h ig:U:'!lli1A1~ao das caixas d'.lgua sao realizadas com pe riodicidade recom end ada ?

S ~rllran~ geral

o laboratorio e devidarnentc fechado e seguro quando uao esui ocupadoi

As portas e janelas sao mantidas devidarnente fechadas?

Os materials toxicos e equipamentos de risco sao estoeados em area scgura]

Preven~o de incendio

Exlste sistema de alarme?

As pa~sagellS pelas portas de ernergencia csLiio desuhstruidas!

() sistema de deieccao de incendio esta em hom funcinnarnento e e regula rille 11 te testado ~

Existe i nalizacao de crncrgencini

Exi tern extinrores de incendio para 0" divcrsos tipos de materims e em qunntidade suficiente?

Os extintores eslao dentro dn pi ,li'U de vahdade? Existe sinal de "nan Iurnar' na area de lahoratono] A equipe l$ta treinada em combaie J incendio?

tstoc.a.sel11 de Hquidos lnflamaveis

o local e HI separado do predio principal! Exisle ventilacao suficienle para retirar vaporesi o local esui devidarnente sinalizudo?

Existem lampadas seladas para protecao coni ra ignit;iio nos V~lpl\res? Exist e adve rt ~nL ia de "11<10 [U 111 a r"?

I\i~ 0 com eletricldade

As instalacoes estao de acordo cum os padroes estabele idos pel a ABNT?

Lxiste ho de terra? 01' equipurncntos cstao devidamente aterrados] Os equiparnenios com potencial de risco de deshgarnento estao devidamente ligados ZI lim circuito de emcrgenctn para ns ca os de queda au interrupcao de energiai

Os cabos de ronexan <lOS JiVl'fSOS equiparneruos eslfio em perfeitn csrado J 1113 Illlltlll;:.10?

C,uJa eqtupamcnui cst;} Iigad:l em uma romada: evira-se 0 usa de hcniarnim!

Todas as tornadas I~m ua voltagem identificada!

Voce sabe onde lila 0 quadro-geral de forca da sua unidade!

Gases e liquidos comprimidos

Os diversos tipos de gases estfio devidarnente identificadosi

· as cilindros pos. UCI1l valvulas de seguranca?

Exisre advertencia de nao-utilizacao de oleo nas valvulnsi as cilindros estao devidamente seguros contra quedasi

• Existe ventilacso suficiente para evitar a formacao de bolsoes de gases e explosoes]

Protecao pessoal

• Existern eru quantidade suficiente: Lava-olhosi Chuveiros de emergencia!

Protecoes contra radiacocs, incluindo os dozlmetrosi Mascara contra particulas]

Luvas descartaveis!

Pipetadores manuals e/ou automaticosi Oculos de protecao e outros?

Seguran~a e saude ocupacional

Existe service de saude ocupacionali

Exist.€! caixa com materials para prlrneiros- ocorros? Exis.tem profissionais I rei nados em pri meiros-sccorrosi

Existem informacdes sabre como agir em ... aso de ernergencia, tali; como; ielefone de hospitals, pronto- socorro e bornhelrosi

Existe urn program a de vacinacao atualizado?

Exist" sinalizacao educative para prevenir a risco?

f.quipamento de laboraUrrio

Os equipamentos estao validados e certificados quanto a sell usa?

• Existe proccdimento de desinfeccao de cquipamentos antes de envia-los a rnanutencao!

As cabines de seguramji:1 biologica e qulmica sao rcgularrnente testadas?

As autoclaves estao valldadas?

As centnfugus, rotores e frascos iem seus tempos de L1Liliza~50 devidarneure anotados!

Vidrarias quebradas e trincadas sao descartadasi

Existent recipientes adequados para descartar frescos quebrados e material perfurocortante!

As capclas de exaustao para mnnipulacao estiio devidarnente sinalizadasi

SU<l50 balancas estso certificadas pelo lnruetro?

Scus congeladores. geladeira, fornos, estufas au equipamentos termo-regulaveis possuem sinais de controle e registro de ternperalurai

Material tnfeccioso, qufmico e radioativc

0 .. materiais biologicos sao recebidos em condicoes de seguranca] Uulizarn-se luvas descartaveis, quando se esu rnarnpulando material bio16gico?

As bancadas sao desinfetadas com a devida lrequencia:

• Existc protocolo de descarte de material contamlnador

0); dcsmfctantes sao apropriados e devidamente validados?

As subsrancias estao devidamerue etiq uetadast

Exisre cartaz COI11 os riscose ca legnrias toxicclogicas das diversas S II bsta nciasi

o estoque de radioisotopos e dcvidamentc controlado!

Ex isle p meed i men lo de dcscarte de s ubstan cias q 11 i III leas e radioisotopes?

Existem procedimentos que visarn d evitar (01]1<1[0 entre substan cias quirnicas incornpatrveisf

Utilize este manual.junto como video, como fonte permanents de consulta, Man!enha este manual sempre ao seu alcance e fa\a dele urn instrumentoa mais de trabalho,

Voce tern cornunicacao direta e gratutta com:

TELELAB - PN-DST/AIDS-MS

Telefax gratuitc: 0800- 61 - 2436 e-rnnil: le'ld<1b@aids.goY.br

Referen d as Bib hogr afi cas

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Agradecirnen tos:

Aequipedo:

Insuturo de aude Publica do DI urito Federal-ISDF; o Laboratorio ConLrolBio, a Paulo; t'

atl Hospital Universitario - Unrversidade Federal de Santa Catarina - UFSC.

Piujeto Grafico, diagramacao, arte-finalizacao e Capa:

I UllJ Helena Saldanha Gomes· AS ,OM I PN DST e AIDS