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ANÁLISE DE ADENOCARCINOMA COLORRETAL POR

ESPECTROSCOPIA ÓPTICA

J. L. Rangel*, L. Raniero*, C. S. P. Lima**, C. Oliveira**, R. A. Canevari*, J. Ferreira*, E. A. L.


Arisawa*, J. A. A. C. Piva*, A. A. Martin*

*Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento/UNIVAP, São José dos Campos, Brasil


**Departamento de Clínica Médica/UNICAMP, Campinas, Brasil

e-mail: jlucasrangel@hotmail.com

Abstract: Colon cancer is the second most common Imageamento por Infravermelho próximo tem
cause of death in Brazil. In this study, we used the non- recentemente sido utilizada com sucesso no estudo de
destructive imaging technique by near infrared várias lesões cancerígenas[2,3,4].
spectroscopy. The sick and healthy tissues were A técnica de absorção de infravermelho analisa a
obtained from different patients. The results were interação de radiação eletromagnética com a matéria,
correlated with the histological images and classified in determinando os níveis de energia de átomos e
a dendrogram using the Ward’s algorithm. Analyses moléculas [5]. O método fornece um espectro de
showed biochemical differences related to lipids, absorção bioquímica devido às vibrações de ligações
proteins and DNA from tissues. químicas de componentes celulares, tais como proteínas,
ácidos nucléicos, carboidratos e lipídeos [6,7,8]. A
região principal de identificação molecular esta na faixa
Palavras-chave: Imagem Bioquímica, Cólon, compreendida entre 400 a 4000 cm-1, região do
Espectroscopia Óptica, Análise Morfológica. infravermelho próximo, que possibilita a identificação
do material. Nessa região, pequenas alterações na
Introdução estrutura e na constituição de uma molécula resultam
em mudanças significativas na distribuição das bandas
O câncer de colo-retal abrange tumores que atingem de absorção do espectro, que são relacionados com a
o cólon (intestino grosso) e o reto. Tanto homens como estrutura da molécula [9,10].
mulheres são igualmente afetados, sendo uma doença Assim, a fim de minimizar as desvantagens que
tratável e freqüentemente curável quando localizada no ocorrem nos diagnósticos histológicos convencionais, o
intestino (sem extensão para outros órgãos). O câncer de objetivo deste projeto foi utilizar a técnica de
colo-retal é a terceira causa mais comum de morte por espectroscopia de infravelho por transformada de
câncer no mundo [1]. A maior incidência dessa doença fourier (FT-IR) em modo imagem, no estudo das lesões
ocorre na faixa etária entre 50 e 70 anos, mas há a cancerígenas do intestino grosso e associar o
possibilidade de se iniciar a partir do 40 anos. Fatores imageamento bioquímico com o histológico.
como histórico familiar, dieta com alto índice de
gordura, obesidade e sedentarismo, entre outros Materiais e Métodos
aumentam as chances de risco [1].
Atualmente existem alguns tipos de diagnósticos, As amostras de tecidos estudas foram coletadas no
tais como: exame físico completo, toque retal, exame Hospital de Clínicas - UNICAMP, de acordo com as
radiológico contrastada com o intestino grosso, normas do comitê de ética e pesquisa, L166/CEP2004.
colonoscopia e biópsia com o estudo histopatológico da As mesmas foram armazenadas em frascos criogênicos
lesão. Esses métodos, porém, além de invasivos Nalgene® de 1,2 ml e identificadas, visando a
necessitam de vários dias para fornecerem os resultados, preservação e manutenção de todas as amostras até o
desta forma retardando o tratamento do indivíduo. A momento do transporte e análises espectroscópicas. O
medicina moderna busca novas técnicas de diagnósticos estudo foi conduzido no Laboratório de Espectroscopia
que possam ser menos traumática para o paciente e com Vibracional Biomédica da Universidade do Vale do
a possibilidade de fornecer o resultado em tempo real. Paraíba – São José dos Campos/SP.
Dentre as técnicas que estão sendo estudadas, destaca-se Neste estudo foram utilizadas duas amostras, sendo
a de espectroscopia óptica. A principal vantagem desta uma de tecido normal e outra de tecido neoplásico. As
técnica, comparada com a histologia convencional, é a imagens bioquímicas obtidas por FT-IR foram
possibilidade de realizar uma análise bioquímica das comparadas com as correspondentes lâminas
alterações moleculares ao invés da análise morfológica. histológicas ("padrão ouro"). A análise histológica foi
Dentre as técnicas ópticas aplicadas para este fim, a de realizada por um patologista, que as classificaram como

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sendo uma de tecido neoplásico e outra de tecido regiões foram escolhidas pois apresentam as maiores
normal. As amostras foram seccionadas com a espessura diferenças e características podendo diferenciar um
de 12µm, utilizando um Criostato modelo CM 1100, tecido do outro. A região de 3000-2800 cm-1 encontra-
marca LEICA, seguindo os parâmetros adequados do se as bandas de estiramento de lipídeos e proteínas e na
equipamento. região de 940-1500 cm-1 é conhecida como a região da
Os cortes foram realizados alternadamente, sendo impressão digital da amostra, isto é, a região que
que, a amostra obtida pelo primeiro corte foi colocado demonstra as minimas variações de cada amostra e
na janela de fluoreto de cálcio (CaF2), para análise no assim a melhor caracteriza. Como primeira medida para
FT-IR e a segunda amostra obtida pelo segundo corte análise estatística foi feita a aplicação do coeficiente de
foi colocado em uma lâmina histológica. As lâminas correlação linear de Pearson [11].
foram coradas utilizando os procedimentos de Depois de efetua-lo o próximo passo foi calcular a
hematoxilina e eosina (H&E) e levadas para dimensão do intervalo (Scaling first range) e aplicar o
confirmação patológica de um especialista. Este algoritmo Ward. Este algoritmo agrupa os dados de
procedimento foi realizado, tendo em vista a forma minimizar a soma das diferenças
necessidade de uma confirmação confiável das imagens (heterogeneidade) entre os elementos de cada amostra,
bioquímicas obtidas pelo equipamento de FT-IR e construindo grupos mais homogêneos [12].
atualmente, a histologia é o “padrão ouro” de
diagnóstico. Resultados
Para a análise espectroscópica não é necessário
nenhum tratamento prévio das amostras. A janela de A apresentação dos resultados foi dividida em duas
CaF2 serve de porta amostra, pois não possui bandas na partes. A primeira delas foi a correlação entre a imagem
região de interesse. Antes da análise as amostras foram bioquímica feita por meio da análise de FT-IR, com sua
mantidas em uma sala com baixa umidade por trinta respectiva lâmina histológica. Assim, foi possível
minutos com a intenção de manter o nivel mais baixo correlacionar as estruturas morfológicas do cólon com
possivel de água na amostra após a secção. as alterações bioquímicas ocorridas. A segunda etapa foi
As imagens bioquímicas foram obtidas em modo de a análise estatística dos espectros, segundo o laudo
imagem por transmitância, no intervalo de 4000-900 histológico, para verificar a possível diferenciação entre
cm-1, com 32 varreduras por pixel (6,25 µm2) e os tecidos normais e neoplásicos.
resolução de 4 cm-1, através da microespectroscopia FT- A Figura 1 mostra a correlação entre a lâmina
IR utilizando o microscópio de imageamento (Spotlight histológica de um tecido normal (lado esquerdo) e o
400 – Perkin-Elmer) equipado com detector MCT respectivo imageamento bioquímico por FT-IR (lado
operando a temperatura do nitrogênio líquido, acoplado direito) desta região, onde a análise de cluster foi feita
a um espectrômetro FT-IR (Spectrum 400 – Perkin- utilizando o programa CytoSpec. Nesta imagem é
Elmer). possível observar uma correlação entre a morfologia e
Após as medidas das amostras no FT-IR, os dados as mudanças bioquímicas do tecido, onde o tecido
foram analisados no programa Cytospec (versão 1.4.02) conjuntivo, o tecido epitelial, a secreção glandular e o
para verificação dos espectros da matriz de imagem. tecido inflamado foram separados em clusters distintos
Um parâmetro que deve ser avaliado é a formação de mantendo o mesmo mapa morfológico da lâmina
cluster na amostra. Essa formação consiste na separação histológica. Portanto, para além do aspecto morfológico
bioquímica que o programa realiza utilizando os pode-se dizer que existe diferenças bioquímicas que
espectros pertencentes a matriz de imagem. Esta caracterizam estes tecidos.
separação é de fundamental importância, a fim de
determinar pequenas alterações bioquímicas entre as
Tecido
amostras. Antes da análise estatística dos dados foi Conjuntivo
executado um pré-tratamento. O primeiro passo foi a
suavização espectral, que tem como objetivo diminuir a Secreção
interferência do ruído em cada espectro. Após a Glandular
suavização foi feito o cálculo da primeira derivada que
têm a intenção de evidenciar as mínimas diferenças no Inflamação
espectro. Após a análise das imagens pelo programa
Tecido
Cytospec e o pré-tratamento, foram obtidos espectros Epitelial
médios de cada amostra. Esses espectros foram (a) (b)
analisados utilizando-se o programa estatístico OPUS
(versão 4.2, Bruker), com este programa foi possível Figura 1: Correlação entre (a) lâmina histológica e (b)
visualizar as características de cada espectro e montar o imageamento bioquímico e de uma amostra normal.
dendograma.
Para calcular a distância da matriz, os dados foram A Figura 2 mostra o mesmo procedimento, mas
analisados estatisticamente através da análise de cluster agora para um tecido classificado histologicamente
onde duas regiões espectrais discriminantes foram como neoplásico. Do lado esquerdo a lâmina histológica
selecionadas: 3000-2800 cm-1 e 940-1500 cm-1. Essas

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e do direito é mostrado o mapa bioquímico, feito através
da análise de cluster. Discussão

Na mucosa colorretal, as células epiteliais formam


uma camada de epitélio colunar com arquitetura bem
Tecido preservada. Nas criptas (glândulas tubulares), estas
Conjuntivo células são organizadas juntamente com outros tipos de
células epiteliais (células goblet, células basais e vários
tipos de células endócrinas diferenciadas). A mucosa da
Tecido
lâmina própria, as criptas e a mucosa muscular constitui
Epitelial
a membrana mucosa do cólon.
A Figura 1 ilustra uma lâmina histopatológica
representativa do tecido classificado como normal.
(a) (b) Nesta figura, são mostradas as criptas seccionadas com
as células epiteliais (colonócitos), células goblet, a
Figura 2: Correlação entre (a) lâmina histológica e (b) mucosa da lâmina própria e a substância colóide
imageamento bioquímico e de um adenocarcinoma secretada pelas glândulas com predomínio de muco e
colorretal. proteínas, também é ilustrado o tecido conjuntivo, onde
existe um maior predomínio de fibras colágenas do tipo
Os mapas bioquímicos mostrados nas Figuras 1 e 2 I e III, além de prolina e hidroxiprolina.
são exemplos dos resultados obtidos. Entretanto, para As células do adenocarcinoma colorretal originam-
comparar/separar os espectros entre as imagens foi se de colonócitos transformados, sendo capaz de se
necessário fazer um espectro médio de cada cluster, ou infiltrarem nas camadas subjacentes (submucosa e
seja, para cada grupo representado pelas mudanças de muscular) do cólon e do reto. A grande maioria destes
tom de cinzas foi feito um espectro médio. tumores se origina pelo acúmulo de alterações genéticas
que ocorrem em células epiteliais, localizadas na
Após a análise de imagem, a fim de realizar a superfície da mucosa e nas criptas. O adenocarcinoma
classificação espectral de cada tecido, os espectros exibe sinais morfológicos típicos de malignidade: histo-
médios foram importados no software OPUS para arquitetura atípica tais como múltiplas camadas de
análise estatística. O resultado obtido separa os dados células que exibem pleiomorfismo e infiltração da
por similaridade utilizando o algoritmo de Ward (que submucosa.
consiste em clusterizar os dados que tem características A Figura 2 ilustra uma lâmina histopatológica
homogêneas) e são apresentados em forma de representativa de tecido maligno onde foi realizado o
dendograma, como mostrado na Figura 3. Observa-se na mesmo método de correlação utilizado com as amostras
Figura 3 uma diferenciação de 100 % entre as imagens normais.
bioquímicas dos tecidos normais e neoplásicos. Na análise de correlação das imagens bioquímicas
Observa-se também que dentro de cada cluster de oferecidas pelo FT-IR e das lâminas histológicas dos
amostras classificadas como normais e neoplásicas há tecidos normais, o resultado observado foi satisfatório,
sub-clusters. onde pela análise de FT-IR todas as estruturas e
constituintes do tecido puderam ser discriminadas e
relacionadas à lâmina histológica. Deste modo, a
C1.0

C2.0

C3.0

N1.0

N4.0

N6.0

N5.0

0
eficácia da técnica de imageamento por infravermelho
pode ser comprovada. Contudo, o mesmo resultado não
5
foi observado na análise de correlação das imagens
1 bioquímicas e das lâminas histológicas dos tecidos
10
neoplásicos. Isto pode ser explicado pela complexidade
Heterogeneity

da histo-arquitetura do tecido tumoral que direciona o


15
imageamento pelo FT-IR, onde as estruturas teciduais
estão alteradas pelo próprio processo neoplásico. Uma
20
explicação adicional, é que a amostra analisada além de
conter componentes de tecido neoplásico poderá conter
25
tecidos normais e tecidos com alterações não
Data Preprocessing: First Derivative
Ward's Algorithm
Correlation with
Frequency Ranges (Weights) =
940 - 1450 /cm (1.0)
neoplásicas, tais como infiltrado inflamatório. Contudo,
Scaling to 1st range 2800 - 3000 /cm (1.0)
Method File = TEMPVIEW.CLA
Date: 26/02/2010
apesar destas implicações, foi possível detectar pelo
imageamento bioquímico estruturas que correspondem à
lâmina histológica, demonstrando assim a
Figura 3: Dendograma de diferenciação dos tecidos potencialidade da técnica.
normais e neoplásicos, demonstrando a separação dos A análise de comparação dos tecidos foi realizada
tipos de tecidos (cluster) e as pequenas variações pela técnica de imageamento para auxiliar na
ocorridas em uma mesma amostra (sub-clusters). identificação dos tecidos de uma maneira mais rápida e

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eficaz. A técnica de imageamento por infravermelho é
capaz de distinguir as diferentes estruturas que [4] Lash, P., Naumann, D. ( 2006) “Spatial resolution in
constituem a amostra e de determinar com precisão a infrared microspectroscopic imaging of tissues”.
partir de um banco de dados qual o tecido que está
sendo analisado. [5] Sala, O. (1995) “Fundamentos da Espectroscopia
Antes do início do processo de comparação entre os Raman e no Infravermelho”. ED. UNESP/ São Paulo, p.
tecidos, todos os dados foram tratados pelo coeficente 244.
de Pearson a fim de remover as variações espectrais de
uma mesma amostra, em seguida os dados foram [6] Maquelin, K., Naumann, D., Puppels, G. J. (2002)
importados para o programa estatístico OPUS, os dados “Identification of medically relevant microorganisms by
passaram pelo o algoritmo de Ward. Observando o vibrational spectroscopy”.
dendograma pudemos notar que a separação foi
completa entre as amostras. Outro ponto a ser analisado [7] Baldauf, N. A. (2007) “Effect of selective growth
no dendograma é a separação em sub-clusters entre as media on the differentiation of Salmonella enterica
amostras de mesmo tipo, isso pode ser devido a serovars by Fourier-Transform Mid-Infrared
pequenas diferenças bioquímicas entre as mesmas, mas Spectroscopy”.
que não interferem na análise estatística.
Foi excluído locais que não fazem parte das [8] Amiali, N. M. (2007) “Rapid identification of
estruturas morfológicas da amostra, como por exemplo coagulase-negative staphylococci by Fourier transform
janela de CaF2, cola (utilizado no processo de corte), infrared spectroscopy”.
assim como, regiões contendo sinais de inflamações no
tecido, para que essas regiões não possam interferir no [9] Naumann, D. (2000) “Infrared Spectroscopy in
espectro das amostras, na analise dos dados e no Microbiology”.
dendograma.
[10] Wartewig, S. (2003) “IR and Raman Spectroscopy:
Conclusão Fundamental Processing”, Alemanha: Wiley p 171.

Os resultados preliminares apresentados neste estudo [11] Díaz, F. R; López, F. F. B. (2007) “Bioestatisca”,
demonstraram a potencialidade da utilização da técnica Ed.: unica São Paulo: Thomson, p. 57.
de espectroscopia de infravermelho na detecção de
mudanças bioquímicas que ocorrem nas células quando [12] Ward, J. H. (1963) “Hierarchical grouping to
sofrem alterações de um estado normal para alterado. optimize an objective function”, In: Journal of the
Este estudo conseguiu de maneira satisfatória American Statistical Association, v. 58, p. 236-244.
correlacionar também os resultados da imagem de FT-
IR com as estruturas celulares obtidas pela imagem
morfológica. No futuro, pretendemos identificar as
bandas vibracionais que podem ser consideradas como
as mais importantes para realizar este diagnóstico.
Assim, nossos resultados preliminares mostram a
potencialidade desta técnica para uma futura utilização
clínica na análise histopatológica de amostras com
diagnóstico duvidoso.

Agradecimentos

Ao CNPQ pela bolsa de iniciação científica.

Referências

[1] INCA, Ministério da Saúde “Incidência de câncer no


Brasil- Estimativa/ 2010”. Disponível em:
http://www.inca.gov.br/estimativa/2010/ Acesso em 25
mar. 2010.

[2] Krafft, C. (2008) “Raman and FTIR microscopic


imaging of colon tissue: a comparative study”.

[3] Lash, P., Naumann, D., Diem M. (2004) “Imaging of


colorectal adenocarcinoma using FT-IR
microspectroscopy and cluster analysis”.

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