PRAKTIKUM IZ FIZIOLOGIJE BILJA

Poljoprivredni fakultet u Osijeku, 2009.

Miroslav Lisjak, dipl. inž. Marija Špoljarević, prof. Dejan Agić, prof. dr.sc. Luka Andrić

SADRŽAJ
1. 1.1. 1.1.A 1.1.B 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.5.A 1.6. 1.7. 1.8. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.3.A 3.3.B 3.4. 3.4.A 3.4.B 3.4.C 3.4.D 3.5. 3.6. 4. 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. METABOLIZAM BILJAKA Određivanje kloroplastnih pigmenata................................................................................. Spektrofotometrijsko određivanje koncentracije pigmenata po Holmu i Wetstteinu......... Razdvajanje pigmenata kromatografijom na papiru........................................................... Određivanje intenziteta fotosinteze kemijskom metodom................................................. Mjerenje intenziteta disanja protočnom metodom............................................................. Izolacija proteina iz biljnog materijala............................................................................... Određivanje koncentracije proteina................................................................................... Određivanje koncentracije proteina Lowry metodom........................................................ Sadržaj ukupnih kiselina u voću......................................................................................... Određivanje sadržaja reducirajućih šećera u plodovima.................................................... Spektroskopsko određivanje ukupnih antocijanina po metodi ekstrakcije uz različit pH.. FIZIOLOGIJA MINERALNE ISHRANE BILJAKA Razaranje i analiza elementarnog sastava biljne tvari........................................................ Određivanje koncentracije fosfora u suhoj tvari biljaka..................................................... Određivanje koncentracije dušika u biljnom materijalu..................................................... Određivanje sadržaja nitrata u svježem povrću.................................................................. Određivanje aktivnosti nitrat reduktaze.............................................................................. FIZIOLOGIJA RASTA I RAZVOJA Život rezanog cvijeća u vazi............................................................................................... Mjerenje površine lista........................................................................................................ Nastijska gibanja................................................................................................................. Termonastije........................................................................................................................ Fotonastije........................................................................................................................... Klijavost i vigor sjemena.................................................................................................... Standardna klijavost i energija klijanja sjemena................................................................. Cold test.............................................................................................................................. Električni konduktivitet sjemena........................................................................................ Zdravstveno stanje sjemena................................................................................................ Analiza rasta biljaka............................................................................................................ Utvrđivanje alelopatskih odnosa u klijanju......................................................................... FIZIOLOGIJA STRESA KOD BILJAKA Određivanje deficita difuznog pritiska (DDP).................................................................... Određivanje evapotranspiracije lista................................................................................... Određivanje sadržaja prolina.............................................................................................. Određivanje sadržaja vitamina C........................................................................................ Zaštitno djelovanje šećera pri niskim temperaturama......................................................... Aktivnost enzima katalaze..................................................................................................

1. 3. 5. 7. 9. 12. 14. 16. 18. 20. 22. 24. 28. 30. 32. 35. 37. 40. 42. 43. 44. 46. 46. 50. 52. 54. 57. 61. 63. 68. 70. 72. 74. 76.

1. METABOLIZAM BILJAKA
1.1. ODREĐIVANJE KLOROPLASTNIH PIGMENATA

Uvod u vježbu Osnovna uloga kloroplastnih pigmenata, posebno klorofila, je apsorpcija svjetlosne energije koja se zatim procesima fotosinteze transformira u kemijsku energiju. Pigmenti fotoreceptori su obično obojeni, kompleksni organski spojevi čije se optičke osobine zasnivaju na kemijskoj strukturi njihovih molekula. Apsorpcija vidljivog dijela spektra, a s tim u vezi i boja pigmenata, zavisi o prisustvu sistema konjugiranih dvostrukih veza u njihovim molekulama: -C=C- , -C=N- , -N=N- , -N=O- , -C=S-. U fotosintetskom aparatu viših biljaka najznačajniji su klorofili i karotenoidi. Dosada poznati klorofili su -a, -b, -c, -d i -e, a više biljke sadrže klorofil -a (C55H72O5N4Mg) i klorofil -b (C55H70O6N4Mg) koji se nalaze u tilakoidima kloroplasta (slika 1). Klorofili su esteri dikarbonske kiseline klorofilina i alkohola fitola. Osnovna građevna jedinica je porfirinski prsten u čijem je središtu atom Mg vezan na N četiriju pirolovih prstena s dvije kovalentne i dvije koordinatne veze. Na porfirinsku jezgru vezan je fitolni rep bogat –CH3 skupinama, slika 1. Porfirinska jezgra je hidrofilna a fitolni rep je hidrofoban i lipofilan. Pri osvjetljavanju klorofila dolazi do ekscitiranja elektrona i stvaranja transportnog lanca elektrona kojim se usvojena svjetlosna energija prenosi do određenih akceptora koji dalje omogućuju korištenje te energije u tamnoj fazi fotosinteze. Modrozeleni klorofil a i žutozeleni klorofil b apsorbiraju vidljivi dio spektra i imaju maksimume apsorpcije u crvenom (600-700 nm) i plavom (400-500 nm) dijelu spektra. Njihov kvantitativni odnos u većine biljaka je otprilike 3:1. Karotenoidi (provitamini A) su narančasto-žuti pigmenti koji su po kemijskoj strukturi derivati izoprena (8 izoprenskih jedinica), a mogu biti aciklični, monociklični i Slika 1. Strukturna formula klorofila a i klorofila b; biciklični. Dijele se na karotene i prostorni izgled klorofila b (gore desno) ksantofile. Karoteni su žutonarančaste boje, a ksantofili imaju kisik u hidroksiketo- ili metoksi- grupi i žute su boje. Najpoznatiji karoteni su β-karoten (slika 2.) i likopen. Poznati ksantofili su: lutein, neoksantin, astaksantin, violaksantin i zeaksantin. Uloga im je dvostruka: prijenos energije na klorofil čime se proširuje spektar apsorpcije svjetlosti i zaštita fotolabilnog fotosintetskog aparata od oksidativne destrukcije. 1

Slika 2. Strukturna formula β karotena ( preuzeto s http://www.kii2.ntf.uni-lj.si/ekemija/file.php/1/output/barvila3/index.html )

2

škare.1.2 g i prenese u tarionik (mogu se koristiti i kružni isječci poznate površine). Smjesa lista i dodanih kemikalija izmacerira se tučkom u tarioniku. guč br. tarionik i tučak. Slika 3.1 g ili 0. te se macerat kvantitativno prenosi acetonom na guč postavljen na epruvetu umetnutu u vakuum bocu. Put kretanja zrake svijetlosti od emisijske lampe preko zrcala i uzorka do detektora (desno) 3 . ukupnih klorofila -a. filtrat se kvantitativno prenosi u odmjernu tikvicu od 25 mL. kvarcni pijesak Način izvođenja vježbe Postupak ekstrakcije i određivanja pigmenata treba izvoditi brzo. odmjerna tikvica od 25 mL. epruvete na stalcima. u zamračenim uvjetima ili uz difuznu svjetlost zbog fotosenzibilnosti pigmenata. 644 i 440 nm koristeći aceton kao slijepu probu (transmisija (T) = 100). Spektrofotometrom (slika 3) se očitava transmisija u dobivenom filtratu na 662.A SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PIGMENATA PO HOLMU I WETSTTEINU Cilj Odrediti koncentraciju kloroplastnih pigmenata (klorofila a. b i karotenoida) u acetonskom ekstraktu biljnog materijala te preračunati koncentracije na mg/g svježe tvari. klorofila b. vakuum pumpa na vodeni mlaz. bušač za čepove poznatog promjera (prema potrebi). koja se nadopunjuje do oznake acetonom. Odvaže se uzorak lista mase 0. magnezijev karbonat (MgCO3). menzura od 10 mL biljni materijal: listovi veće površine (0. vakuum boca. Na uzorak se dodaje oko pola žličice kvarcnog pijeska. Materijal pribor i oprema: vaga.1. Spektrofotometar (lijevo). malo praha MgCO3 (na vrh noža) radi neutralizacije kiselosti i 10-ak mL acetona. žlica.1 g svježe tvari lista ili narezani listovi odgovarajuće površine) reagensi: aceton. spektrofotometar. 3 ili 4. Nakon što se macerat profiltrira vakuum pumpom uz ispiranje guča acetonom.

Formula za izračun koncentracije pigmenata na mg/g svježe tvari lista (SvT): c = c1 × v × r m c [mg/g] . odmjerne tikvice) izražen u mililitrima = 25 mL r .426 × A644 – 4.volumen filtrata (tj.268 × (klorofil a+b) [mg/dm3] Brojevi u jednadžbama su molarni apsorpcijski koeficijenti po Holmu i Wetstteinu.784 × A662 – 0.razrjeđenje filtrata m [mg] . računa se odnos klorofila a i klorofila b.695 × A440 – 0.990 × A644 [mg/dm3] klorofil b = 21. Rezultati Dobivene vrijednosti koncentracije pigmenata i omjeri kl a/b i kl/kar kl a kl b kl a+b kar kl a/b koncentracija omjeri u mg/dm3 pigmenata koncentracija u mg/g SvT kl/kar 4 .65 × A662 [mg/dm3] klorofil a+b = 5. Vrijednosti treba upisati u tablicu.masena koncentracija pigmenta izražena u miligramima po decimetru kubnom v [mL] .Očitana transmisija (T) preračunava se u apsorpciju (A) po jednadžbi: A = 2 .134 × A662 + 20.odvaga uzorka izražena u miligramima = 100 mg Zbog značajnosti koncentracije i odnosa pojedinih pigmenata. A644 i A440) uvrštavaju se u Holm-Wetstteinove jednadžbe za izračunavanje koncentracije pigmenata u mg/dm3: klorofil a = 9. te odnos njihovog zbroja i karotenoida.logT Dobivene vrijednosti apsorpcije (A662.436 × A644 [mg/dm3] karotenoidi = 4.masena koncentracija pigmenta izražena u miligramima po gramu svježe tvari lista c1 [mg/dm3] .

B RAZDVAJANJE PIGMENATA KROMATOGRAFIJOM NA PAPIRU Uvod u vježbu Metoda odjeljivanja zasnovana na različitoj distribuciji smjese tvari koju razdvajamo između mobilne faze (otapala) i neke stacionarne faze fronta nazivamo kromatografija. mikropipeta.1.1. a gornji kraj trake učvrsti se pomoću čepa i ostavi stajati 15-30 minuta na sobnoj temperaturi.2 mL ekstrakta pigmenata.)) reagensi: otapalo-razdvajač (sastoji se od petroletera. Kod ovakve kromatografije otapalo se uspinje Slika 4. smjesa petroletera. Cilj Vizualno određivanje pigmenata na kromatografskom papiru. Teško topive tvari će s otapalom prevaliti najmanji dio puta.1. a fronta je mjesto najveće udaljenosti mobilne faze tj. Kromatografija na papiru uz papir zbog kapilarnih sila samog papira. Na startno mjesto (ili mjesta) mikropipetom se nanosi 0. Brzina prolaska tvari po pločici proporcionalan je prevaljenom putu. kromatografija na papiru. O brzini prelaska tvari možemo zaključiti iz omjera prijeđenog puta tvari od starta (x) i udaljenosti fronte od starta (y). Traka kromatografskog papira s nanešenim ekstraktom uroni se donjim rubom u otapalo. Na donjem kraju trake grafitnom olovkom se označi startna linija (3 cm od donjeg ruba trake) i startno mjesto (jedno startno mjesto u sredini startne linije ili dva startna mjesta na istoj liniji s razmakom 2 cm). kolona za razdvajanje biljni materijal: acetonski ekstrakt pigmenata (1 g svježe tvari lista ili 25 mL ekstrakta (vidi u vježbi 1. Izračunati R za svaki pigment uočen na kromatografskom papiru nakon razvijanja. acetona i n-propanola) i start stacionarne faze krutog adsorbensa (npr. Mjesto na koje nanosimo uzorak naziva se start. acetona i n-propanola u omjeru 90:10:0. ali postupno uz sušenje mrlje fenom tako da mrlja ne bude šira od 10 mm.A.1. ekstrakt pigmenata) između otapala kao tekuće mobilne faze (npr. Slabije topljive tvari u smjesi otapalo će sporije otopiti te samim time i prenijeti kraći dio puta. prenoseći bolje topljive tvari iz smjese dalje od starta. tankoslojna y kromatografija. Ovisno o dvije faze između kojih dolazi do raspodjele smjese tvari koju razdjeljujemo kromatografija može biti na stupcu. plinska kromatografija… Kromatografija na papiru zasniva se na razdiobi x tvari koju razdjeljujemo (npr. Materijal pribor i oprema: kromatografski papir Whatman br. Tijekom navedenog vremena otapalorazdvajač se uzdiže po kromatografskoj traci i sobom 5 . fen.45) Način izvođenja vježbe Razdvajanje pigmenata izvodi se uzlaznom kromatografskom tehnikom na kromatografskom papiru pomoću otapala koje služi kao razdvajač pigmenata.1-0. papir). R= x/y. Kromatografski papir se izreže u trake širine 3-5 cm u smjeru valjanja papira. U kolonu za razdvajanje usipa se otapalorazdvajač tako da visina otapala u koloni bude oko 1 cm. otapala od starta (slika 4).

nosi pigmente koji se razdvajaju i ostaju grupirani na 4 različite razine od dna kolone. 3. Redoslijed pigmenata od vrha do dna kromatografske trake je slijedeći (slika 5): 1. klorofil a – zatvoreno-zelene boje. a najveća kružnica karotena. karoteni – narančaste boje. karoten ksantofil klorofil a klorofil b linija nanošenja Slika 5. Potrebno je izračunati R za svaki pojedini pigment razdijeljen na kromatografskom papiru. a zatim se od ruba do središta kruga izreže traka širine 1 cm koja će poslužiti za uranjanje u otapalo-razvijač. 2. Redoslijed pigmenata razdvojenih kromatografijom na papiru Rezultati 6 . Otapalo se usipa u Petrijevu zdjelicu nešto manjeg promjera od kromatografskog papira. u otapalo se uroni vrh izrezane trake kružnog papira koji se položi na Petrijevu zdjelicu i poklopi se s drugom zdjelicom istog promjera. ksantofili – žute boje. Navedeno razdvajanje pigmenata može se obaviti i na kružnom kromatografskom papiru (φ 150 mm) tako da se ekstrakt pigmenata nanese u središte papira. klorofil b – žuto-zelene boje. 4. Najmanja će biti kružnica klorofila b. Nakon razdvajanja pigmenti će opisivati oko središta papira 4 kružnice (ili elipse) različitih boja.

Pipetom se dodaje 10 mL 0. električno kuhalo. sadržaj iz tikvica se kvantitativno prenosi u čaše od 500 mL sa 300-350 mL destilirane vode. sulfatne kiseline (H2SO4) i fosfatna kiselina (H3PO4) u omjeru 1:1. Pojednostavljeno. Mohrova sol (0. ODREĐIVANJE INTENZITETA FOTOSINTEZE KEMIJSKOM METODOM Uvod u vježbu Gledano sa kemijskog aspekta fotosinteza predstavlja niz reakcija oksidacije i redukcije u kojima se pomoću svjetlosne energije iz niskomolekularnih organskih spojeva (vode i ugljikovog(IV) oksida) u zelenima biljkama sintetizira organska tvar (ugljikohidrati). sulfatnu kiselinu (H2SO4). reakcija procesa fotosinteze može se prikazati sljedećom jednadžbom: svjetlost nCO2 + nH2O (CH2O)n + nO2 Prema tome. Cilj Određivanje intenziteta fotosinteze analizom asimilirane količine ugljika po lisnoj površini u jedinici vremena.1 M Mohrovom soli do prelaska ljubičaste boje u zelenu. Ljubičasta boja obično je vidljiva malo prije točke ekvivalencije. kemijska metoda određivanja intenziteta fotosinteze zasniva se na određivanju asimilirane količine ugljika u određenom vremenskom intervalu. magnetna miješalica. pa se preporučuje titrirati iznad izvora svjetlosti.2. U svaku čašu dodaje se 2 mL smjese sumporne i fosforne kiseline.1 M FeSO4(NH4)2SO4×6H2O). Razlika u količini ugljika između dva mjerenja tijekom određenog vremenskog intervala preračunava se u intenzitet fotosinteze izražen u mg CO2/dm2/h. srebrov(II) sulfat (Ag2SO4) Način izvođenja vježbe Izbuše se kružni isječci lista fotosintetski aktivne biljke (4 isječka φ 8-10 mm) i prenesu u Erlenmeyer tikvicu od 100 mL. 2 staklena lijevka (φ 6 cm). Kao slijepu probu u drugu Erlenmeyer tikvicu bez biljnog materijala dodaje se 10 mL 0. Zapiše se utrošak Mohrove soli u titraciji.067 M K2Cr2O7 i na vrh noža Ag2SO4. smjesa conc.1. te 10-15 kapi difenilamin indikatora. Nakon hlađenja. čaše od 500 mL. ako je utrošak Mohrove soli u titraciji slijepe probe manji od 20 mL. te istovremeno zagrijavaju sve tikvice s uzorcima (ili slijepom probom) do ključanja i ostave se da ključaju 5 minuta (istovremeno zagrijavanje neophodno je zbog termičke nestabilnosti K2Cr2O7). bireta. pipeta od 10 mL. Tikvice se zatvore staklenim lijevcima ili zračnim hladilom. difenilamin indikator. analizu treba 7 . Metoda se temelji na razaranju organske tvari biljke jakim oksidansom do CO2 pri čemu je utrošak oksidacijskog sredstva mjera za određivanje količine ugljika. kružni bušači biljni materijal: biljka u punoj fotosintetskoj aktivnosti reagensi: 0. Materijal pribor i oprema: vaga. iz koje se kasnijim procesima resinteze sintetiziraju ostali organski spojevi. Potom se titrira sa 0.067 M K2Cr2O7 i na vrh noža Ag2SO4.067 M kalijev dikromat (K2Cr2O7) u conc. 2 Erlenmeyer tikvice od 100 mL.

Rezultati 8 . što predstavlja omjer molarne mase CO2 i atomske mase ugljika. Formula za izračun intenziteta fotosinteze: X mgC/dm2 = [ ] (a − b) × 0.faktor za preračunavanje cm2 u dm2 S [cm2] .utrošak Mohrove soli za titraciju slijepe probe b [mL] .3×100 S a [mL] .3 .utrošak Mohrove soli za titraciju uzorka 0.ponoviti s manjom količinom organske tvari jer je premalo oksidansa u prethodno izvršenoj analizi.površina isječaka lista uzetih za analizu Za preračunavanje rezultata intenziteta u mg CO2/dm2 množi se s faktorom 44/12.faktor preračunavanja za odgovarajuću količinu ugljika 100 .

Erlenmeyer tikvica od 200 mL. NADH. Materijal pribor i oprema: vaga. Energija se pohranjuje u energetski bogate spojeve poput ATP. a kisik reducira do vode uz oslobađanje kemijske energije. staklena i gumena crijeva. Uobičajeno disanje u kome se oksidira glukoza predstavlja se jednadžbom: C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 2822 kJ Stoga se protočna metoda mjerenja intenziteta disanja zasniva na određivanju oslobođenog ugljikovog(IV) oksida u određenom vremenskom intervalu.5 M 9 zrak s CO2 crpka . graha) ili svježa tvar lista reagensi: 40% natrijev hidroksid (NaOH).5 M kalijev hidroksid (KOH). FADH2 i kao toplinska energija koja se u manjem postotku zadržava u biljci te stimulira stanične procese a u većem postotku oslobađa u atmosferu ili tlo. 0. lipidi. plinska ispiralica Slika 6. aktivna stanica kontinuirano diše usvajajući kisik i oslobađajući ugljikov(IV) oksid u jednakim količinama. metiloranž Način izvođenja vježbe zrak s CO2 zrak bez CO2 zrak s CO2 zrak bez CO2 CO2 izdvojen disanjem 1. a predložak s 100 mL 0. 100 g uzorka. titrator biljni materijal: klijanci (soje. Kao supstrat za disanje može poslužiti škrob. Cilj Utvrđivanje intenziteta disanja analizom oslobođenog CO2 po jedinici mase supstrata u određenom vremenskom intervalu. suncokreta. saharoza i drugi šećeri. plinska ispiralica komora 2. NADPH. Disanje se može opisati kao proces oksidacije i redukcije organske tvari u kojem se supstrat oksidira do ugljikovog(IV) oksida. MJERENJE INTENZITETA DISANJA PROTOČNOM METODOM Uvod u vježbu Svaka živa. 3 tikvice od 1000 mL sa čepovima.1. pipeta od 10 mL. fenolftalein. Potrebno je utvrditi da li plinska ispiralica s NaOH dobro pročišćava zrak od CO2. kukuruza. organske kiseline i iznimno proteini. Shematski prikaz aparature potrebne za pokus mjerenja intenziteta disanja protočnom metodom Aparatura potrebna za mjerenje intenziteta disanja spoji se kao što prikazuje slika 6.1 M kloridne kiseline (HCl). električna vakuum crpka. Dovodna cijev u obje plinske ispiralice mora se uroniti u otopinu (40 % NaOH u prvoj. 0.3.

Zabilježi se utrošak HCl.1 M HCl.volumen predloška odpipetiran za titraciju (20 mL) 2.2 mg CO2 budući da je HCl jednobazna.4.1 M HCl veže 2. Pri tome se odvija slijedeća reakcija: 2KOH + CO2 → K2CO3 + H2O Pošto u zraku nema dovoljno CO2 za potpunu neutralizaciju KOH.2 mg CO2 1000 – za preračunavanje g u 1 kg m[g] .utrošak 0.8) i titrirati s 0.5 M KOH prije početka pokusa (100mL) vt[mL] . a H2CO3 dvobazna kiselina.1 M HCl se iskoristi za dobivanje 0. pa se ukupna reakcija može prikazati jednadžbom: K2CO3 + 2HCl → CO2 + H2O + 2KCl vp[mL] . KHCO3 + HCl → KCl + H2O Formula za izračunavanje disanja: X[mg CO2/h/kg] = a × 2 × (vp/vt) × 2.2 i 9.početna masa biljne tvari (100 g) 10 .05 mM CO2 = 2. u predlošku nakon pokusa preostane i dio KOH.2 .5 M KOH potrebno utrošiti 50 mL 0. vrijedi: 1 dm3 1 M HCl se iskoristi za dobivanje 0.volumen predloška 0.1 i 4. pH između 8. Za određivanje intenziteta disanja se u komoru (srednja posuda) stavi 100 g svježe naklijalog sjemena (ili svježe tvari lista).1 M HCl dok se otopina ne obezboji. Reakcija neutralizacije je u ekvivalentnim količinama pa je za 10 mL 0. dodaje nekoliko kapi indikatora fenolftaleina (otopina postaje ljubičasta. komora se zamrači ako se ispituje fotosintetski aktivni dio biljke. Nastali K2CO3 je dvobazna sol za čiju neutralizaciju se također utroši određena količina HCl-a pa je postupak pri titraciji slijedeći: Odpipetira se 20 mL predloška iz druge plinske ispiralice. (otopina postaje narančasto-žuta) i nastavi titracija s HCl do točke neutralizacije (prelazak boje otopine u ružičastu) te se zabilježi utrošak 0. indikacija pH između 3.1 M HCl.utrošak HCl iz druge titracije množi se s 2 jer je to pola reakcije neutralizacije nastalog K2CO3.1 mL 0. Pri opisanoj titraciji se odvija neutralizacija preostalog KOH a istovremeno prevođenje K2CO3 u KHCO3.KOH u drugoj plinskoj ispiralici). Zrak se provlači kroz cijelu aparaturu pomoću vakuuma kojeg stvara crpka i bilježi se trajanje pokusa (1 sat).1 M HCl u drugoj titraciji 2 .5 M CO2 = 22 g CO2 1 cm3 (mL) 0. KOH + HCl → KCl + H2O K2CO3 + HCl → KHCO3 + KCl Obezbojenom predlošku se doda nekoliko kapi metiloranža. Utrošak HCl za titraciju nakon provedenog pokusa će biti manji jer je jedan dio KOH neutraliziran vezivanjem CO2.2 × (1000/m) a [mL] .

Rezultati 11 .

Dobar ekstrakcijski pufer trebao bi također biti primjenjiv s obzirom na različitu prisutnost velikog broja sekundarnih staničnih metabolita kako između biljnih tkiva (list. Sljedeći postupak u izolaciji jest ekstrakcija proteina usitnjenog uzorka korištenjem pogodnog ekstrakcijskog pufera. U posljednjem koraku izolacije proteina. Prigodom izbora metode za izolaciju proteina iz biljnog tkiva susrećemo se s određenim problemima koje svakako moramo uzeti u obzir.4. stabljika. Iako je era proteomike donijela veća poboljšanja u pogledu primjene tehnika i metoda u izolaciji proteina. Općenito se za pripremu sirovog ekstrakta biljnih proteina može upotrijebiti fosfatni ili Tris pufer određene pH vrijednosti i ionske jakosti. lužine.). kiseline. Cilj Upoznati se s biokemijskim metodama izolacije proteina.1. Pri usitnjavanju i homogeniziranju uzorka također se može upotrijebiti kvarcni pijesak ili drugo abrazivno sredstvo. mješača ili rezača. još nije moguće preporučiti jedinstvenu metodu kojom bi se izvršila izolacija svih proteina. IZOLACIJA PROTEINA IZ BILJNOG MATERIJALA Uvod u vježbu Pored celuloze proteini čine glavne strukturne polimere biljnih stanica i tkiva. Biljne stanice sadrže krutu staničnu stjenku pa je prvi korak u izolaciji razbijanje biljnog materijala radi izdvajanja staničnog sadržaja. sjeme i plod) tako i između različitih biljnih vrsta. organska otapala i zračenje. pročišćavanje proteina i sl. 12 . Kako se pri mehaničkom razbijanju uzorka razvija toplina. Pri izboru pufera treba obratiti posebnu pozornost na vrstu proteina i svrhu zbog koje se izolacija vrši (npr. Pojam izolacije obuhvaća sve radnje kojima se koristimo prigodom prevođenja proteina iz njihova prirodnog okružja u otopinu. određivanje koncentracije proteina. Supernatant dobiven centrifugiranjem predstavlja sirovi ekstrakt proteina i služi za daljnju analizu i obradu. cjelokupan se postupak uglavnom izvodi pri temperaturama između 0 i +4°C kako bi se spriječila denaturacija proteina. Čest je postupak da se svježe biljno tkivo prelije tekućim dušikom i usitni trenjem u tarioniku. Prirediti sirovi ekstrakt proteina iz biljnog materijala. Unatoč velikoj raznovrsnosti količina proteina u biljnim tkivima relativno je niska. Dodatak polivinilpolipirolidona (PVPP) ekstrakcijskom puferu također se često koristi za sprječavanje interakcije velikog broja fenolnih i polifenolnih spojeva s proteinima i time štiti njihova nativna struktura. To se uglavnom postiže mehaničkim postupcima kojima se biljno tkivo usitnjava korištenjem različitih miksera. čime se sprječava razgradnja proteina. Zbog prisutnosti uglavnom serinskih proteaza u uzorku biljnoga tkiva. puferu se dodaje fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF) koji inhibira njihovu aktivnost. Kemijske metode kojima se uobičajeno koristimo za izolaciju organskih tvari ne mogu se primijeniti pri izolaciji proteina jer su oni osjetljivi na toplinu. a neki su od njih navedeni u daljnjem tekstu. što predstavlja dodatni izazov pri njihovoj izolaciji. korijen. homogenat se najčešće centrifugira radi odvajanja netopljivih dijelova stanica od otopine.

U koje svrhe koristimo izolaciju proteina ? 2.000xg. Kako bi ste u nedostatku centrifuge odvojili netopivi dio homogenata od otopine ? 13 . škare. tarionik. Način izvođenja vježbe Priprema sirovog ekstrakta biljnih proteina: Odvagati 2 g biljnog materijala. pipeta od 5 mL. Prije upotrebe podesiti puferu pH vrijednost na 7. O čemu ovisi izbor pH vrijednost ekstrakcijskog pufera ? 5. 20 mg KCl. stakleni lijevak. Kada je važno izolaciju proteina obavljati pri niskim temperaturama ? 3. Koja je uloga ekstrakcijskog pufera pri izolaciji proteina ? 4. Usitnjeni materijal homogenizirati u tarioniku uz dodatak kvarcnoga pijeska i 2 mL hladnoga ekstrakcijskog pufera (pufer dodavati u 3 porcije. 15 minuta na 4°C. posuda s ledom. *PBS (Phosphate buffer saline) Pitanja 1. Ovako pripremljen homogenat kvantitativno preliti u praznu kivetu za centrifugiranje i centrifugirati pri 5.Materijal pribor i oprema: vaga. škarama ga usitniti na manje komade i prenijeti u tarionik (hlađen na ledu).1 L dH2O. centrifuga. biljni materijal. kvarcni pijesak biljni materijal: list biljke reagensi: PBS pufer (Phosphate buffer saline): priređuje se otapanjem 800 mg NaCl. 140 mg Na2HPO4 i 24 mg KH2PO4 u 0. Dobiveni supernatant (sirovi ekstrakt) pažljivo dekantirati u čistu epruvetu i koristiti za određivanje koncentracije proteina Lowry metodom.4. analitička vaga kiveta za centrifugiranje. a zadnjom isprati tarionik).

1.0 mg/mL. brzog razvijanja boje i niskoga praga osjetljivosti. Biuret metoda: Ovom se metodom prvenstveno dokazuje prisutnost peptidne veze. Nastali je kompleks ljubičaste boje s apsorpcijskim maksimumom pri 540 nm. Koncentracija se proteina određuje pri valnoj duljini od 750 nm. slika 7. Kod navedenih kolorimetrijskih metoda koncentracija proteina ovisna je o broju i sastavu aminokiselina. Donji prag osjetljivosti ove metode iznosi 0.5. Kao standard koristi se protein koji je po sastavu jednak ili sličan proteinu koji se analizira. Lowry metoda i Bradford metoda. Bradford metoda: Ova se metoda često koristi zbog jednostavne priprema reagensa. Najčešće korištene metode za određivanje koncentracije proteina u sirovom nepročišćenom ekstraktu jesu Biuret metoda. Naziv je dobila po kondenzacijskom produktu dviju molekula uree . 14 . Kompleks peptidnih veza i iona Cu2+ plavo-ljubičasto obojenje.biuretu. a prikladna je za određivanje proteina u koncentracijama između 0. Određivanje koncentracije proteina ovim metodama temelji se na vezanju specifičnoga bojenog reagensa na molekulu proteina. Metoda je prikladna za analizu otopina proteina u koncentracijama između 1. glavna je prednost ove metode u tome što je manje osjetljiva na vrstu proteina koji se određuje. Intenzitet nastale boje pod određenim uvjetima slijedi Lambert-Beerov zakon te je proporcionalan koncentraciji proteina. kada se postiže maksimum apsorpcije reduciranog oblika Folin-Ciocalteau reagensa. koji također daje pozitivnu reakciju. te ovakva mjerenja zahtijevaju primjenu standarda. Ova je metoda osjetljivija u odnosu na prethodnu. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA Uvod u vježbu Postoji više metoda i postupaka za određivanje koncentracije proteina.5 µg/mL proteina.0 i 10 mg/mL . Pritom dolazi do pomaka apsorpcijskoga maksimuma boje vezanog reagensa u odnosu na apsorpcijski maksimum boje nevezanog reagensa.01 i 1. Metoda se temelji na pomaku apsorpcijskoga maksimuma slobodne boje Coomassie Brilliant Blue G-250 (slika 8) valne duljine 465 nm na 595 nm prilikom njezina vezanja na protein. Pokazala se osobito praktičnom prigodom određivanja koncentracije proteina u sadržaju određene stanične frakcije kao i pri procjeni količine proteina potrebne za gel elektroforezu. Metoda se temelji na osobini peptidne veze da u alkalnoj otopini tvori kompleks s ionima Cu2+. Osim što je točna i vrlo ponovljiva. Lowry metoda: Metoda kombinira reakciju bakrovih iona s peptidnim vezama u alkalnoj otopini (Biuret metoda) i reakciju redukcije Folin-Ciocalteau reagensa (smjesa molibdata i volframata) s fenolnom skupinom tirozina i triptofana dajuću Slika 7. a izbor metode može ovisiti o vrsti materijala i količini uzorka te koncentraciji proteina u uzorku.

Slika 8. Strukturna formula Coomassie Brilliant Blue G-250 15 .

S20. Materijal pribor i oprema: 7 odmjernih tikvica od 100 mL.A ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA LOWRY METODOM Cilj Upoznati se s kolorimetrijskom metodom određivanja koncentracije proteina Lowry metodom. Alkalni reagens : priprema se miješanjem 50 mL reagensa A s 1mL reagensa B 2. S40. Usporedno s pripremom standardnog niza. S40. 10 i 20 mL. kolorimetar ili spektrofotometar biljni materijal: list biljke reagensi: Reagens A: 2% Na2CO3 u 0. pipete od 1. S20. Reagens B: 0. S100 i U. 16 .1. S40. S10. S60 i S100). Za baždarenje uređaja upotrjebljava se slijepa proba (epruveta s oznakom S0). stakleni lijevak. 5. izraditi baždarni dijagram i odrediti koncentraciju proteina. Nakon 15 minuta u svaku epruvetu dodaje se 0. Za pripremu standardnog niza priprema se osam čistih epruveta te ih se označi: S0. S10. 8 epruveta.2 mg/mL. Nakon razvijanja boje na kolorimetru (uz korištenje crvenog filtra) ili spektrofotometru (λ 750 nm) očitava se vrijednost apsorbancije za sadržaj svake epruvete standardnog niza i uzorka. Sirovi ekstrakt proteina iz biljnog materijala (razrijeđen s dH2O u omjeru 1:100) Način izvođenja vježbe Potrebno je pripremiti sedam odmjernih tikvica od 100 mL i označiti ih: S0. S10. S60 i S100). S40. načinom izrade i uporabom baždarnoga dijagrama.2 mg mL-1) mL dH2O Koncentracija BSA mg mL-1 So 0 100 S5 5 95 S10 10 90 S20 20 40 S40 40 60 S60 60 40 S100 100 0 Potrebno je izračunati koncentracije BSA u svakom pojedinom standardu i podatke upisati u posljednji red tablice. S60. Tablica 1. Priprema standarda otopine BSA Oznaka odmjerne tikvice → mL BSA (0.5.1 mol/L NaOH. S20. sadržaj se promućka i smjesa ostavi 15 minuta na sobnoj temperaturi. iz odmjerne tikvice uzorka pipetira se 1 mL otopine i dodaje u praznu epruvetu s oznakom U. Standardna otopina albumina goveđeg seruma (BSA) koncentracije 0. smjesa se dobro promućka i ostavi 15 min. S5. Za pripremu razrjeđenja standardne otopine BSA potrebno je odpipetirati količine navedene u tablici 1. na sobnoj temperaturi kako bi se razvila boja 3. S20. S5.5% CuSO4 x 5H2O u 1% K Na-tartaratu 1 . S60 i S100. Folin-Ciocalteu reagens : kupovni reagens razrijediti destiliranom vodom u omjeru 1:1.5 mL Folin-Ciocalteau reagensa. Prirediti standardni niz otopina. pipetira se po 1 mL otopine i dodaje u pripadnu epruvetu (oznaka S0. U svaku epruvetu potom dodaje se 5 mL alkalnog reagensa. Iz svake odmjerne tikvice (oznaka S0. S10. S5. S5.

Što bi ste učinili sa sirovim ekstraktom ukoliko ima nisku (kolorimetrijski nemjerljivu) koncentraciju proteina ? 1 2 3 Pripremiti svježu otopinu reagensa B Otopinu alkalnog reagensa pripremiti neposredno prije pipetiranja. Izračunati ukupnu količinu proteina u biljnom ekstraktu i rezultat izraziti u mg proteina po gramu svježega biljnog materijala. Zašto se u našem slučaju sirovi ekstrakt razrjeđuje prije mjerenja koncentracije proteina ? 5. Na temelju kojeg zakona se vrši kolorimetrijsko određivanje koncentracije proteina ? 2. Što je standardni niz ? 4. 17 .Rezultati Na osnovi dobivenih vrijednosti apsorbancije uzoraka standardnog niza i poznatih koncentracija BSA izraditi baždarni dijagram s pravcem. Zašto kolorimetrijsko mjerenje koncentracije proteina zahtjeva upotrebu standarda ? 3. Kiseli Folin-Ciocalteau reagens je nestabilan u jako lužnatoj otopini (alkalni reagens) te se mora brzo dodati i dobro promućkati. Pitanja: 1. Vrijednost ekstinkcije uzorka (epruvetu s oznakom U) ucrtati na koordinatu baždarnoga dijagrama te preko baždarnoga pravca očitati koncentraciju proteina u uzorku.

Ukupne kiseline (kiselost. grožđe i dr. pipeta od 25 – 100 mL. Određivanje kiselosti se vrši titracijom s otopinom NaOH. Filtrirati kroz naborani filter-papir u EM tikvicu od 250 mL. mmol/100 g ploda) = (250/m) * V1 * C * (100/V0) V0 [mL] . Sadržaj miješati na magnetnoj miješalici dok tekućina ne bude homogena. Tikvicu spojiti s povratnim hladilom i zagrijavati na vodenoj kupelji 30 min. Volumen NaOH utrošenog za titraciju se zabilježi.6. uz fenolftalein kao indikator. Cilj Utvrditi sadržaj ukupnih kiselina u plodu voća. te nadopuniti s dest. SADRŽAJ UKUPNIH KISELINA U VOĆU Uvod u vježbu U pokazatelje kakvoće voća (plodova) ubraja se i ukupan sadržaj kiselina. vodena kupelj.1 M otopina natrijavog hidroksida (NaOH) poznatog faktora (točne koncentracije). povratno hladilo. Ohlađeno kvantitativno prenijeti u odmjernu tikvicu od 250 mL. do pojave svijetlo ružičaste boje u trajanju od najmanje 30 sek.volumen NaOH utrošen za titraciju C [mol/L] . stakleni lijevak za filtriranje.) 1 Erlenmeyerova (EM) tikvica s brušenim grlom od 250 mL.) reagensi: 0. vaga biljni materijal: uzorci svježeg ili zamrznutog ploda voća (jabuke. filter-papir. magnetna miješalica i stirer. mikser ili sl. 1 odmjerna tikvica od 250 mL. Materijal pribor i oprema: pribor za maceraciju tkiva (keramički tarionik s tučkom. bireta ili titrator. uz fenolftalein kao indikator. dodati 150 mL destilirane vode. One se nalaze u voćnom soku kao slobodne ili u obliku soli. te se izračuna sadržaj ukupnih kiselina. menzura do 250 mL.1.1 M NaOH poznatog faktora. 1 Erlenmeyerova (EM) tikvica s neubrušenim grlom od 250 mL. fenolftalein Način izvođenja vježbe Odvagati 25 g usitnjenog i homogeniziranog uzorka ploda u EM tikvicu s brušenim grlom od 250 mL. jagode. Ovisno o očekivanoj kiselosti odpipetirati 25 . odmjerne tikvice od 250 mL. vodom do oznake i promućkati. Kiselost voćnih plodova čine organske kiseline kao što su limunska ili jabučna.100 mL u odgovarajuću EM tikvicu i titrirati s 0.odvagana masa ploda za analizu 18 .točna koncentracija otopine NaOH m [g].volumen uzorka V1 [mL] .

(2009. V. Zavod za prehrambenu tehnologiju i biotehnologiju.. Str.Rezultati Literatura Generalić. 45. 19 . I. Katalinić. Skroza. D..): Skripta za vježbe iz kolegija: Kemija mediteranskog voća i tehnologija prerade. Kemijsko-tehnološki fakultet Sveučilišta u Splitu.

Materijal pribor i oprema: pribor za maceraciju tkiva (keramički tarionik s tučkom. vode umjesto filtrata iz plodova uzetih za analizu. 3 Erlenmeyerove (EM) tikvice od 250. Saharoza u svojoj molekuli nema slobodnu aldehidnu grupu.7. 5 mL Carrez I i 5 mL Carrez II. Sadržaj reducirajućih šećera (prirodnog inverta) = X * 100 / mg uzorka u alikvotu X [mg] . 0. nakon čega kuhati 10 min uz povratno hladilo. stakleni lijevak.1 M otopina natrijeva tiosulfata (Na2S2O3).1 i 1 M otopina natrijevog hidroksida (NaOH). kuhalo. 0.1% otopina škroba. kalcijev karbonat (CaCO3) Način izvođenja vježbe Odvagati 10 g usitnjenog i homogeniziranog uzorka ploda u EM tikvicu od 250 mL. Paralelno treba raditi slijepu probu.1. dodati 10 mL otopine KJ i oprezno 25 mL otopine H2SO4. Reducirajući šećeri su svi šećeri. vaga. Volumen Na2S2O3 utrošenog za titraciju zabilježiti.) reagensi: 3 M otopina sulfatne kiseline (H2SO4). na čemu se zasniva metoda određivanja šećera. 10 mL prethodno dobivenog filtrata uzorka i 15 mL dest.miligrami prirodnog inverta. magnetna miješalica i stirer. naborani filter-papir. staklene kuglice biljni materijal: uzorci svježeg ili zamrznutog ploda voća (jabuke. te kao takva ne može reducirati Fehlingovu otopinu. Ostaviti da se istaloži nakon čega filtrirati u suhu EM tikvicu od 300 mL. te izračunati sadržaj reducirajućih šećera. bireta ili titrator. vode. dodati 100 mL destilirane vode. odgovarajuće pipete. 30% otopina kalijevog jodida (KJ). vaga. s 25 mL dest. U EM tikvicu od 500 mL odpipetirati 25 mL Luffove otopine. mikser ili sl. 30% otopina fenolftaleina. Ohladiti pod vodenim mlazom. 0. odmjerne tikvice 200 mL. koji imaju keto ili aldehidnu funkcionalne skupine. Dodati staklene kuglice i zagrijavati direktno na plamenu do vrenja. Luffov reagens. promiješati i grijati na vodenoj kupelji 10 -15 min. kao što su glukoza i fruktoza te pentoze. grožđe i dr. Ohlađeno kvantitativno prenijeti u odmjernu tikvicu od 200 mL. dodati 1-2 g CaCO3.500 (ako se izvaže 10 g uzorka i razrijedi na 200 mL otopine te se uzme 10 ml alikvota) 20 .). nadopuniti s dH2O do oznake i promućkati. na azbestnoj mrežici. povratno hladilo.1 M otopina kloridne kiseline (HCl). Dodati nekoliko mL otopine škroba i nastaviti titraciju do potpunog nestanka plave boje. prema razlici utroška Na2S2O3 između slijepe probe i uzorka mg uzorka u alikvotu . otopine Carrez I i Carrez II. ODREĐIVANJE SADRŽAJA REDUCIRAJUĆIH ŠEĆERA U PLODOVIMA Uvod u vježbu Saharoza je disaharid čijom hidrolizom (inverzijom) nastaje jedna molekula glukoze i jedna molekula fruktoze. jagode. koje se zajedničkim imenom nazivaju invertni šećeri. 0. Nakon toga titrirati s Na2S2O3 dok boja ne postane žuta. očitani iz tablice 2. 300 i 500 mL. vodena kupelj. Cilj Utvrditi sadržaj reducirajućih šećera u plodu voća.

1 50.7 17.6 2.0 3.5 41.4 2.Rezultati Tablica 2.2 19.0 27.3 33.3 44.6 2.doc 21 .9 2.2 9.6 30.0 53.2 47.8 22.1 62.9 3.2 14.5 2.1 3.6 2.6 2.mps.7 2. fruktoza.4 4.1 mol/l (Na2S2O3) ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Glukoza.5 2.9 2.1 Literatura http://www.8 7.7 38.4 2. invertni šećeri C6H12O6 (X)mg 2.7 12.5 2.0 56.hr/pdf/zakoni/Pravilnik_o_seceru_i_ostalim_saharidima_njihovim_otopinama_te_skrobu_i_skro bnim_sirupima_NN_174_04.8 2.0 3.0 35.8 2.7 2.0 59.5 2. Vrijednosti prema Luff-Schoorlovom reagensu: 0.4 25.2 razlika 2.7 2.

plodova i latica različitih biljnih vrsta Svojstvo obojenosti u velikoj mjeri utječe na prihvatljivost biljnih proizvoda od strane potrošača i njihovu tržišnu vrijednost. peteljke. čine ih sve interesantnijim biljnim funkcionalnim komponentama.0 su obojeni. slika 9. potencijalna zdravstveno-promotivna svojstva antocijanina poput zaštite od slobodnih radikala. uslijed čega pokazuju različitu apsorpciju svjetlosti valne duljine 510 nm.1. dakle njihova antioksidacijska svojstva. Metoda se temelji na strukturalnoj razlici antocijanina pri različitoj pH vrijednosti medija (pri pH 1. 22 . SPEKTROSKOPSKO ODREĐIVANJE UKUPNIH ANTOCIJANINA PO METODI EKSTRAKCIJE UZ RAZLIČIT pH Uvod u vježbu Crveno-ljubičasta boja biljnog tkiva (listovi. cvijeća i ratarskih usjeva potječe uglavnom od grupe vodotopljivih flavonoidnih spojeva antocijanina. poput nedostatka dušika i fosfora. pri pH 4. akumuliranih u vakuolama stanica. Akumulacija antocijanina u vegetativnim dijelovima biljaka je često pokazatelj reakcije biljke na stres uvjetovan okolišnim činiteljima. godina). plodovi.8. povrća. Analiza sastava antocijanina nije moguća bez HPLC i MS tehnike. Specifično antocijansko obojenje listova. korijen) kod različitih vrsta voća. latice. Također. dok se njihov ukupan sadržaj može odrediti spektrofotometrijski na 510 nm te izraziti kao mg cijanidin-3-glukozid klorida u kg svježe mase biljnog tkiva. Slika 9.5 bezbojni). Sinteza antocijanina u biljkama polazi od fenilalanina te je poznato više od 550 antocijanina (2006.

Branca.. koristeći čiste pufere kao slijepe probe. Supernatanti se koriste za mjerenje apsorpcije na 510 nm. Wrolstad.sadržaj antocijanina u mg po kg svježe mase biljnog tkiva ApH 1. S.5) x (484... Journal of AOAC International. M. 23 . Barnes. 240 mL 1 M HCl i 360 ml deionizirane H2O) Način izvođenja vježbe Nekoliko grama biljnog tkiva (3-5 g) se tekućim dušikom macerira do finog praha.8 – molekularna masa cijanidin-3-glukozid klorida 24 825 – molarni apsorpcijski koeficijent cijanidin-3-glukozid klorida 20 000 – faktor za preračunavanje na mg/kg svježe mase Rezultati Literatura Lee.A. T. M. Vol.2 M HCl).0 – apsorpcija u uzorku s puferom I ApH 4. (2005): Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices. obje suspenzije se centrifugiraju dva puta po 15 minuta na 5000 G pri 4oC. oleracea L. Koswig. S. Hofsommer. Genna. 125 mL 0. 107(1): 136-144.D. D.. spektrofotometar sa staklenim kivetama. Skrede. Lo Scalzo. J. natural colorants..2 M KCl i 375 mL 0. Eisele.) reagensi: pufer I: pH 1.5 g u posebno označene dvije plastične epruvete od 15 mL.C. Trenn.ApH 4.. R. 400 mL 1 M CH3COONa. latice. capitata) and its stability in relation to thermal treatments. Haché.Materijal pribor i oprema: vaga.... A. odgovarajuće pipete i odmjerne tikvice. R. Chedin and H. Martinsen. plastične epruvete od 15 mL s čepom biljni materijal: uzorci svježeg ili zamrznutog biljnog tkiva (list. Food Chemistry. beverages.K. 88(5): 1269-1278. vortex. H. F. B. Chassaigne (2008): Anthocyanin composition of cauliflower (Brassica oleracea L.8/24 825) x 20 000 ANT[mg/kg] . Formula za izračun ukupnog sadržaja antocijanina: ANT (mg/kg svježe mase) = (ApH 1. tekući dušik s priborom za maceraciju (keramički tarionik s tučkom). centrifuga s hlađenjem. F.E. plod i dr.0 (10 mL po uzorku..M. J. A.5 – apsorpcija u uzorku s puferom II 484. R.0 .. J. Nakon homogenizacije vorteksiranjem (10-tak sekundi). T. pufer II: pH 4.W... Vol.K. Martin. S. botrytis) and cabbage (B. G. Giusti. Kupina. Ryabkova. and wines by the pH differential method: Collaborative study. K. var. var. analitička vaga. Wightman.... Krueger. U. U jednu se dodaje 10 mL pufera I a u drugu isti volumen pufera II.. Paquette.. nakon čega se odmah odvaže po 0.W. Durst.5 (10 mL po uzorku. Miller.

nitratna kiselina (HNO3). conc. FIZIOLOGIJA MINERALNE ISHRANE BILJAKA 2.05 M HCl + 0. As… kojih ima u vrlo malim količinama s obzirom na zastupljenost mineralnih makroelemenata: P. Cu… i toksični elementi: Hg. vrsti biljnog materijala i dostupnosti opreme. automatska pipeta od 10 mL (za razaranje u mikrovalnoj peći).. Zbog različitih koncentracija može se posebno pripremati osnovna otopina za analizu različitih elemenata (mikroelementi: Fe. B. aktivacije pojedinih enzima. K. svega oko 3%. filter-papir. Mg. prenošenje elektrona… Zbog toga su vrlo velikog fiziološkog i praktičnog značenja za biljku. 2 staklene pipete od 25 mL i propipeta (za razaranje na bloku). nitratna kiselina (HNO3) 24 . Pb. vodikov peroksid (H2O2). Stupaju u različite fiziološke procese poput osmoregulacije. vodikov peroksid (H2O2). koji se primjenjuju ovisno o elementima koje će biti analizirani. smjesa za razaranje (4% HClO4 u H2SO4) za razaranje u mikrovalnoj peći: conc. RAZARANJE I ANALIZA ELEMENTARNOG SASTAVA BILJNE TVARI Uvod u vježbu Mineralne tvari (biogeni mineralni elementi: P. Postoji više različitih načina razaranja biljne tvari.05 M H2SO4) za mokro spaljivanje na bloku: conc. kivete za razaranje (staklene za razaranje na bloku. teflonske za razaranje u mikrovalnoj peći).. Temelj kemijske analize mineralnog sastava biljne tvari čini priprema osnovne otopine uzorka (oksidacijom biljne tvari razaranjem ili spaljivanjem) i određivanja koncentracije elemenata u osnovnoj otopini. K. Ca…). biološke katalize. boca špricalica. Cd.2.1. Mn.) čine mali dio ukupne suhe tvari biljke. Mn. Zn. stakleni lijevci. Cu. Ca. Fe. Cilj Odrediti sadržaj mineralnih elemenata biljne ishrane. ekstrakcijska smjesa (0. plastične bočice od 100 mL biljni materijal: osušeni samljeveni uzorak biljne tvari bilo kojeg dijela biljke reagensi: za suho spaljivanje: conc. Zn. Materijal pribor i oprema: vaga. S. odmjerne tikvice od 100 ili 50 mL.

metoda): Na 1 do 2 g suhe biljne tvari doda se 5 mL smjese za razaranje (4% HClO4 u H2SO4). U odmjernu tikvicu se doda 1 mL conc.05 M H2SO4).Način izvođenja vježbi Suho spaljivanje: 1. Mokro spaljivanje: Na 1. HNO3. Ohlađeni uzorak se kvantitativno prenosi u odmjernu tikvicu od 25. 25 . Blok za razaranje deioniziranom vodom te se nadopuni istom vodom do oznake. Ako se iz matične otopine žele daljnjim analizama odrediti elementi u tragovima ili teški metali tada je prikladnije raditi po metodi razaranja mikrovalovima. prilikom razaranja na bloku gube isparavanjem već pri temperaturama od oko 200°C.05 M HCl + 0. stoga valja dati prednost metodi mokrog spaljivanja. jer se neki elementi. 50 ili 100 mL ispirući Slika 11. te se ohladi. Slika 10.05 M H2SO4) prenosi pepeo i istom smjesom dopuni do 100 mL. HNO3 i 2 mL conc. Prilikom suhog spaljivanja mogućnost kontaminacije uzorka je veća kao i stvaranje teže topivih oksida željeza i mangana tijekom žarenja. H2SO4 te se zagrijava iznad plamenika do prestanka stvaranja bijele pare. Nakon toga uzorak se prelije sa 10 mL conc. Ako uzorak nakon razaranja bude i dalje mutan prema potrebi se dodaje od 5-10 mL vodikovog peroksida i razara još dodatnih 20-30 min. Peć za žarenje Mokro spaljivanje (II.05 M HCl + 0. Uzorak sa smjesom kiselina i vodikovim peroksidom se zagrijava na bloku za razaranje (slika 11) pri temperaturi od 340-360°C oko sat vremena (ovisno o vrsti razaranog biljnog materijala) do gubitka boje i potpunog razbistravanja. zatim se u istu tikvicu ekstrakcijskom smjesom (0.0 g suhe biljne tvari zagrijava se 4 sata na 500°C u peći za žarenje (slika 10). Ohlađeni uzorak se u odmjernoj tikvici nadopuni do 100 mL smjesom kiselina (0. poput selena. H2O2 i stavi na blok za razaranje.0 g suhe biljne tvari doda se 5 mL conc.

Slika 13. preračunavaju se u koncentraciju elemenata u µg/g ili g/kg suhe tvari biljke. Mikrovalna peć za razaranje Određivanje koncentracije mineralnih elemenata AAS-om i ICPS-om: Koncentracije mineralnih elemenata u osnovnoj otopini određuju se apsorpcijskom i/ili emisijskom tehnikom pomoću AAS-a (atomskog apsorpcijskog spektrofotometra. ICPS analizator – plazma 26 .Razaranje mikrovalovima: U teflonske kivete odvaže se 1 g suhe biljne tvari. Ohlađeni uzorak se kvantitativno uz ispiranje deioniziranom vodom prelijeva u odmjerne tikvice od 25. Kivete se hermetički zatvore i umetnu u za njih predviđeno kružno postolje koje se postavi u mikrovalnu peć (slika 12). 50 ili 100 mL i nadopuni vodom (dH2O) do oznake. Očitane vrijednosti koncentracije analiziranih elemenata nakon mjerenja. Biljni materijal se razara pod tlakom od 180 psi u trajanju od 20 min.atomski adsorpcijski spektrofotometar Slika 14. Slika 12. slika 14). te njima kalibrirati AAS ili ICPS. slika 13) ili emisijskom tehnikom pomoću ICPS-a (plazme. Za mjerenje je potrebno pripremiti koncentracijski niz standardnih otopina poznatih koncentracija elemenata koje želimo analizirati. te prelije sa 8-10 mL koncentrirane HNO3 i 2-4 mL koncentriranog H2O2. AAS analizator . Rezultati koje očitavamo s AAS-a ili ICPS-a izraženi su u µg/mL ili mg/L (prijašnje oznake ppm) i označavaju koncentraciju ispitivanog elementa u osnovnoj otopini.

koncentracija ispitivanog elementa u uzorku suhe tvari biljke c [µg/mL] .masena koncentracija ispitivane otopine uzorka (očitanje s AAS-a) v [mL].Formula za izračunavanje koncentracije mineralnih elemenata u analiziranom uzorku biljne tvari: X [µg / g ] = c∗v m X[µg/g] .volumen osnovne otopine m [g] .odvaga suhe tvari biljke za analizu Rezultati 27 .

Nakon toga se spektrofotometrom mjeri apsorpcija na 725 nm te pomoću kalibracijskog dijagrama ili kompjuterskog programa za izračun koncentracije na temelju serije standarda. na temelju specifične apsorpcije svjetlosti (725 nm) u plavo obojenom fosfor-molibdatskom kompleksu. U sve tikvice (standardi i uzorci) doda se oko 50 mL destilirane vode. odnosno preračunavanjem na odvagu suhe tvari uzorka uzetu za dobivanje matične otopine. Fosfat je lako pokretljiv u biljnom organizmu. Tikvice se začepe i promućkaju te ostave da se razvije boja tijekom 1 h u mraku. Cilj Odrediti koncentraciju fosfora u suhoj tvari biljnog materijala. u sastavu je nukleotida koji čine DNA i RNA te fosfolipida u sastavu biomembrana.6 µg P/mL). fosfor ne podliježe redukciji u biljkama već ostaje u obliku fosfata u slobodnom obliku ili organski vezan u esterima. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE FOSFORA U SUHOJ TVARI BILJAKA Uvod u vježbu Biljke usvajaju fosfor iz tla najvećim dijelom kao jednovalentni fosfatni anion (H2PO4 -. Način izvođenja vježbe Priredi se serija standardnih otopina poznate koncentracije fosfora tako da se u odmjerne tikvice od 100 mL prenese 0.5% hidrokinon. Nezamjenjiva uloga ovog makroelementa je u brojnim transformacijama tvari i energije u stanici. disanja i drugih metaboličkih procesa. Od matične otopine uzorka u kojem se određuje koncentracija fosfora pipetom se prenese 10 mL u odmjernu tikvicu od 100 mL. 0. prethodno razorenog uz pomoć smjese kiselina i vodikovog peroksida. 11% natrij sulfit (Na2SO3). doda 2. dihidrogen fosfat) ili dvovalentni anion (HPO4 2-.4394 g KH2PO4 se otopi u 1 L destilirane vode. Za razliku od dušika i sumpora.8 mL koncentrirane sulfatne kiseline i dopuni do 100 mL destiliranom vodom). 4. izračuna koncentracija fosfora u µg/mL otopine. osnovni standard za fosfor (0. hidrogen fosfat). u % na suhu tvar analiziranog biljnog materijala. esencijalan je dio fosfatiziranih šećera koji sudjeluju kao metaboliti u procesima fotosinteze. 5 i 10 mL) biljni materijal: suha tvar biljaka (nadzemni dijelovi ili korijen) dobivena sušenjem na 105oC ili matična otopina uzorka biljne tvari razorena mokrim postupkom (pogledaj vježbu 2. Određivanje koncentracije fosfora se u načelu vrši spektrofotometrijski.2. 28 . 2. po 1 mL natrijevog sulfita i hidrokinona i dopuni destiliranom vodom do 100 mL. Materijal pribor: spektrofotometar sa staklenim kivetama.2.1. odmjerne tikvice od 100 mL. 1. odgovarajuće pipete (110. 5 mL amonijevog molibdata. gdje sudjeluje u obliku spojeva bogatih energijom poput ATP i sl. 5 i 6 mL osnovnog standarda (koncentracija 0 .) reagensi: 5% amonijev molibdat (5 g (NH4)6Mo7O24 x 4H2O se otopi u 80 mL destilirane vode. 3.

Postotak fosfora treba prema sljedećoj jednadžbi: (c * (100 ))*10−2 v %P = m c [µg/mL] .alikvot matične otopine (10 mL) m [g] .koncentracija P v [mL] .odvaga suhe tvari uzorka u 100 mL matične otopine Rezultati 29 .

E) predložak. 2% borna kiselina (H3BO3) pH 4. u plinovitom stanju. Ovom reakcijom hidronijevi ioni borne kiseline postaju ponovo slobodni u otopini predloška i svojom aktivnošću spuštaju pH vrijednost do 4.6 .3. Prolazom kroz hladilo A) 30% NaOH. titrator sa pH metrom. pH vrijednost ne smije porasti preko 7 jer bi se u protivnom amonijak gubio isparavanjem. D) kiveta sa plinoviti oblik amonijaka uzorkom. F) hladilo.25 M sulfatnom kiselinom (H2SO4). te kaplje u sondom predložnu čašicu u kojoj se nalazi borna kiselina. C) 2% H3BO3. Natrijev hidroksid istikuje dušik iz uzorka u obliku amonijaka (NH3). Destilacijska jedinica i titrator se uključe. te titrator počinje sa titracijom otopine u predlošku s 0. te nastaje sol amonij sulfat ((NH4)2SO4). Određivanje koncentracije dušika temelji se na istiskivanju dušika u obliku amonijaka (NH3) iz uzorka jakom bazom u predložak sa kiselinom poznate A B C D E G koncentracije i pH vrijednosti. Vrijednost postotka dušika određuje se prema utrošku kiseline za titraciju po formuli koja je unesena u memoriju titratora. te otvori voda za hlađenje. automatska pipeta od 10 mL. tips reagensi matična otopina prethodno razorenog biljnog tkiva. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE DUŠIKA U BILJNOM MATERIJALU Uvod u vježbu Aparat za određivanje koncentracije (slika 15) dušika sastoji se od dvije međusobno povezane jedinice: destilacijske F jedinice i titratora. a pH vrijednost raste.1. U reakciji borne kiseline i amonijaka nastaje njihova kompleksna sol.2. Generiranjem vodene pare. Sonda titratora za mjerenje pH uroni se u spremnik sa 30 .25M sulfatna kiselina (H2SO4) Način izvođenja vježbe Potrebno je pripremiti matičnu otopinu razorenog biljnog tkiva kojeg želimo upotrijebiti kao uzorak za određivanje koncentracije dušika (vidi vježbu 2.6 (početna pH vrijednost borne kiseline). G) titrator sa pH prelazi u tekući. Aparatura za određivanje sadržaja dušika. Materijal pribor destilacijska jedinica. Slika 15. Sulfatna kiselina je jaka kiselina koja istiskuje borne anione iz kompleksne soli amonijaka i borata. 30% natrijav hidroksid (NaOH). Cilj Odrediti postotak dušika u matičnoj otopini razorenog biljnog tkiva. B) deH2O. uzorak ključa otprilike 4-5 min. 0.).

2%-tnom bornom kiselinom i izmjeri se pH vrijednost.7 (za pšenicu) ili s 6.25 (u prosjeku) daje približnu koncentraciju sirovih proteina.25M H2SO4 (1mL 0. Ako pH vrijednost odstupa od 4. te se ona pažljivo postavi u nosač na aparaturi za destilaciju.25 M H2SO4 za titraciju otopine iz predloška do pH 4.25 M H2SO4 veže 7 mg N) Postotak dušika pomnožen s 5.6 potrebno ju je podići ili spustiti dodavanjem 1M NaOH ili 1M HCl automatskom pipetom u spremnik s bornom kiselinom.25 M H2SO4 . U kivetu za uzorak odpipetira se 10 mL matične otopine. Postotak dušika u uzorku računa se po formuli: 7 * V * (100 )*10−2 v %N = m V [mL] . Nakon toga pH sonda se uranja u predložnu čašicu.volumen utrošene 0. Rezultati 31 .odvaga suhe tvari uzorka u 100 mL matične otopine 7 . sada se na zaslonu titratora mogu pratiti promjene pH vrijednosti. Nakon završetka titracije potrebno je zabilježiti volumen utrošene 0.alikvot matične otopine (10 mL) m [g] .6 v [mL] .faktor za preračunavanje količine vezanog N na 0. Na destilacijskoj jedinici pritisne se tipka start a na upravljaču jedinice za titraciju tipka MEAS/HOLD/8.

loše uskladišteno ili uskladišteno na duže vrijeme.7 mg/kg/danu što je ekvivalent 222 mg/danu za čovjeka teškog 60 kg a nitrita do 0. Sadržaj nitrata u pitkoj vodi od strane WHO ograničen je na 50 mg/L. Špinat posijan zimi a ubran ljeti (naročito u vrijeme sušnog perioda) sadrži više nitrata od špinata posijanog ljeti koji se ubire tijekom jeseni i zime. Povrće poput salate. kao i prilikom uzgoja povrća u staklenicima.2. Drugi problem prekomjerne razine nitrita u organizmu je što u reakciji s sekundarnim i tercijarnim aminima u kiselom mediju želuca nastaju kancerogeni nitrozamini. a to može rezultirati višim sadržajem nitrata u povrću i voću od dozvoljenog. koje se često konzumira svježe. Prekomjerna razina nitrita u organizmu može izazvati methemoglobinemiju. ukiseljeno i fermentirano povrće. Glavni izvor unosa nitrata u organizam predstavljaju pitka voda i namirnice biljnog porijekla. Nitiriti se putem povrća i voća unose u manjim količinama. Kontrola sadržaja nitrata u biljnim proizvodima sustavno se provodi u razvijenim zemljama svijeta. Nitriti su štetniji za zdravlja čovjeka od nitrata. Akumulacija nitrata u biljci je posljedica prekomjernog usvajanja nitrata iz tla ili neadekvatne redukcije u biljci (redukcija do amonijaka i sinteza aminokiselina). Na obiteljskim gospodarstvima često se prekomjerno gnoji mineralnim ili organskim gnojivima koja u svom sastavu sadrže dušik. a u manjim količinama mogu se pronaći u suhomesnatim proizvodima. U dnevni unos treba računati nitrate u hrani i u vodi.4. slika 16. godine potvrđen je dozvoljeni dnevni unos nitrata u organizam odraslog čovjeka te iznosi do 3. Intenzitet boje razmjeran je početnoj koncentraciji nitrata. 32 . Testne trakice imaju dvije reakcijske zone koje sadrže reagense za redukciju nitrata do nitrita i reakciju nitrita s Griess-ovim reagensom. koji može posredno utjecati na zdravlje ljudi. Prehranom čovjek unese više nitrata nego nitrita ali se djelovanjem bakterija u probavnom sustavu nitrati reduciraju u nitrite. bez termičke obrade. Prema odredbama FAO i WHO od 2002. Reflectoquant® nitratni test i testne trake poljoprivrednih proizvoda u EU. iznimka su oštećeno povrće. ODREĐIVANJE SADRŽAJA NITRATA U SVJEŽEM POVRĆU Uvod u vježbu Sadržaj nitrata (NO3-) i nitrita (NO2-) u poljoprivrednim proizvodima je značajan pokazatelj kvaliteta proizvoda. U reakciji nitrata s reagensima testne trakice nitrati se reduciraju u nitrite a oni reagiraju s Griess-ovim reagensom gdje kao produkt nastaje azospoj crvenkaste boje određenog intenziteta. Naročito je primijećena intenzivna akumulacija nitrata u lisnatom povrću. te postoje utvrđene smjernice za nadzor kvaliteta Slika 16. Najjednostavnija analitička metoda za utvrđivanje sadržaja nitrata u biljnom materijalu je određivanje pomoću Reflectoquant® nitratnog testa i testnih trakica za nitrate. U području umjerene klime gdje se povrće uzgaja u uvjetima niskog intenziteta svjetlosti razina nitrata u biljci može biti povećana jer je proces redukcije nitrata u nitrite u biljci povezan s procesom fotosinteze.07 mg/kg/danu. bolest u kojem hemoglobin prelazi u methemoglobin koji ne može vezati kisik i time ga prenositi u tkiva te time može rezultirati smrću. koju instrument određuje kolorimetrijski. kelja i celera se smatra pravim „akumulatorima dušika“. špinata.

Zvučni signal se čuje 5 sekundi nakon kojih aparat mjeri koncentraciju nitrata. filter-papir. laboratorijska čaša od 100 mL.Cilj Odrediti koncentraciju nitrata u otopini nitrata pomoću instrumenta Reflectoquant. Ohlađeni uzorak se filtrira kroz naborani filter-papir u odmjernu tikvicu odgovarajućeg volumena i dopuni deioniziranom vodom. Erlenmeyerova tikvica od 250 mL. U skladu s tablicom 3 se odvaže određena količina homogeniziranog biljnog materijala te se kvantitativno prenese u Erlenmeyerovu tikvicu od 250 mL uz dodatak destilirane vode ili deionizirane vode prema zapisu u tablici 1. testne trakice za mjerenje nitrata. od trenutka pritiska tipke START. Tikvica s biljnim materijalom se petnaest minuta zagrijava u kipućoj vodenoj kupelji. Tablica 3. Dio filtrata se presipa u čistu i suhu laboratorijsku čašu. vaga. deionizirana voda Način izvođenja vježbe Potrebno je homogenizirati oko 0. stakleni lijevak. Odnosi volumena vode i biljnog materijala pri pripravi otopine za mjerenje nitrata instrumentom Reflectoquant Vrsta povrća brokula salata endivija salata glavatica krastavac mrkva paprika radič rajčica kupus krumpir Odvaga [g] 10 10 5 10 10 25 10 25 10 10 Dodatak vode [mL] 50 50 50 50 40 20 50 40 40 40 Konačni volumen [mL] 100 100 100 100 50 25 100 50 50 50 Faktor 10 10 20 10 5 1 5 2 5 5 Prije mjerenja koncentracije nitrata potrebno je kalibrirati instrument Reflectoquant. grijače tijelo . Na otvor tikvice treba staviti mali stakleni lijevak ili zračno hladilo kako bi se pare kondenzirale i slijevale nazad u tikvicu. Nakon 2 sekunde testna traka se izvadi iz filtrata a višak tekućine se odstrani povlačeći traku preko ruba čaše. vodena kupelj. Kada je instrument kalibriran treba pritisnuti tipku START i istovremeno uroniti testnu traku u filtrat u laboratorijskoj čaši. tučak i tarionik biljni materijal: krumpir ili neki drugi biljni materijal naveden u tablici reagensi: otopina nitrata. lonac. Na digitalnom zaslonu automatski se pojavljuje vrijednost koncentracije nitrata u mg/L filtrata.5 kg povrća. kako bi dobili vrijednosti nitrata u mg/kg biljne mase. Dobivenu vrijednost potrebno je pomnožiti s faktorom preračunavanja iz tablice 3. Reflectoquant instrument. instrument daje zvučni signal tada je potrebno uložiti traku na odgovarajuće mjesto u aparat. Materijal pribor i oprema: odmjerna tikvica. Nakon isteka 55 sekundi. 33 .električni rešo.

34 .Rezultati Sadržaj nitrata u ______________________________ je ________________________.

i NH4+ iz tla. ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI NITRAT REDUKTAZE Uvod u vježbu Nitrat reduktaza je enzim koji katalizira redukciju nitratnog oblika dušika.2). sulfanilna kiselina. Usvojeni amonijačni oblik se ne može nakupljati u biljci jer djeluje toksično te se direktno ugrađuje u organsku tvar. α-naftilen amid. spektrofotometar biljni materijal: svježi uzorak lišća reagensi: inkubacijski medij (otopine kalij dihidrogenfosfat i nitrat. n-propanol u omjeru 3:0. Ovi anorganski (mineralni) oblici dušika se razlikuju po svom fiziološkom djelovanju.5. odmjerne tikvice od 25 mL. ali da bi se mogao iskoristiti za sintezu dušičnih organskih spojeva. Cilj Određivanje aktivnosti enzima nitrat reduktaze u svježem uzorku lišća. Materijal pribor i oprema: epruvete. Biljke dušik usvajaju tijekom cijele vegetacije . kao NO3. Intenzitet boje ovisi o koncentraciji nitrita u otopini pa se ona utvrđuje spektrofotometrijski na 536 nm uz seriju standardnih otopina poznate koncentracije. termostat. Pomoću njihove koncentracije i očitanja na skali spektrofotometra konstruira se kalibracijski dijagram na kojem se očitava nepoznata koncentracija nitrita u uzorku. koju katalizira nitrat reduktaza u korijenu ili nadzemnim dijelovima biljke i to u citoplazmi. Zatim slijedi daljnja redukcija u kloroplastima (nitrit reduktaza). Nitratni oblik nije toksičan za stanicu te se može nakupljati u vakuoli. Dobivena vrijednost koncentracije nitrita u µg NO2/mL otopine množi se s koeficijentom 15 zbog preračunavanja na ukupni volumen otopine u epruveti s uzorkom lista i preračuna na 24 h. ovisno o trajanju inkubacije. 35 . Nakon inkubacije epruveta s uzorkom se izvadi iz termostata. mora se reducirati do amonijačnog oblika. Visoka aktivnost ovog enzima javlja se u mladom lišću i može poslužiti za prognozu prinosa i utvrđivanju potrebe za prihranom dušikom. natrij nitrat Način izvođenja vježbe 10 cm2 lisne površine ili 1 g svježe mase lista se potopi u epruvetu s 10 mL inkubacijskog medija i stavi na inkubaciju u termostat na 36oC oko 30-60 min. Redukcija nitrata odvija se u više stupnjeva od kojih je prvi redukcija do nitrita NO2. najčešće aminacijom organskih kiselina pri čemu nastaju aminokiseline i slijedi sinteza proteina.8:1. pipete.2.. doda se 3 mL otopine sulfanilne kiseline za blokiranje djelovanja enzima i 2 mL α-naftilen amida koji s nastalim nitritima stvara kompleks ružičaste boje. Proces nitratne redukcije zahtijeva visok utrošak energije jer se oksidacijski broj dušika mijenja od +5 do –3.

koeficijent za preračunavanje na razrjeđenje od 15 mL (ukupni volumen otopine u epruveti) 24 .aktivnost nitrat reduktaze c(NO2) [µg NO2/mL] . X[µg NO2/g/24 h]= c(NO2)*15*24 µ X[µg NO2/g/24 h] .koeficijent za preračunavanje na 24 sata (ako je inkubacija trajala 1 sat) Rezultati U svježem uzorku aktivnost nitrat reduktaze je __________________________________ ________________________________________________________________________ 36 .Konačna aktivnost enzima izražava se kao koncentracija nastalog NO2 po gramu svježe tvari u 24 sata.koncentracija NO2 15 .

Povišenjem temperature utječemo na intenzitet transpiracije i brzinu otvaranja pupova ali smanjujemo život rezanog cvijeća u vazi. Materijal pribor i oprema: škare za obrezivanje.). tulipani. karanfili. Postavljeni pokus . reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Staklenke napuniti s 500 mL vodovodne vode. tijekom transporta i prilikom skladištenja. papirnati ručnici. božuri. Vremenski period života cvijeta može se produžiti pravilnim rukovanjem i smanjivanjem mogućih stresnih uvjeta nakon branja. Temperatura i dobra opskrbljenost vodom su vanjski čimbenici koje možemo kontrolirati a koji utječu na fiziološke procese cvijeta. komora za klijanje biljaka biljni materijal: rezani vrhovi cvjetovi ruže određene sorte Prilikom odabira cvjetova potrebno je odabrati jednako razvijene pupoljke koje nakon rezanja treba uroniti u vodu i što prije transportirati u laboratorij. Cilj Utvrditi utjecaj vanjskih čimbenika na duljinu života rezanog cvijeća te odrediti vremenski period otvaranja pupova od trenutka njihova ubiranja do njihova venuća. Osim navedenih karakteristika dobro je znati koliki je vremenski period života cvijeta od trenutka njegova ubiranja do trenutka njegova venuća.3. veličine i mirisa određene vrste cvijeća određuju vizualni i mirisni dojam cvijeta. menzura od 500 mL. Kroz poklopac svake staklenke provući 5 stabljika tako da prilikom stavljanja u staklenku dodiruju dno a lišće ispod poklopca potrebno je ukloniti. Za ovu vježbu dobro je koristiti cvijeće koje ima krupan i zrakasto simetričan cvijet koji ne raste u cvatovima (ruže. laboratorijska čaša od 250 mL. oblika. Mjehurići zraka bi onemogućili apsorpciju 37 Slika 17. gerberi. staklenke s probušenim poklopcem na pet mjesta.1. flomaster. Karakteristike poput boje. hibiskusi. pomična mjerka ili ravnalo. Kako bi se spriječio ulazak mjehurića zraka u ksilem škarama za obrezivanje treba odrezati oko 1 cm od reza na stabljici. Fiziološki procesi unutar cvijeta utječu na njegovu dugovječnost. traka za izoliranje ili samoljepljivi papirići. ŽIVOT REZANOG CVIJEĆA U VAZI Uvod u vježbu Rezano cvijeće ima određene karakteristike koje su važne uzgajivačima i trgovcima. FIZIOLOGIJA RASTA I RAZVOJA 3. Obilježiti cvjetove trakom za izoliranje ili samoljepljivim papirićima te flomasterom napisati oznake od 1 do 15 K (kontrolirani uvjeti) i od 1 do 15 N (nekontrolirani uvjeti). ljepljiva traka i škare za papir. plastična posuda napunjena vodom iz slavine. dalije itd.

Tri ponavljanja obilježena oznakama od 1 do 15 N ostaviti tijekom tjedan dana pri sobnim nekontroliranim uvjetima gdje temperatura oscilira a jačina i trajanje osvjetljenja variraju. Stabljike odrezati ispod površine vode u posudi napunjenom vodom iz slavine. Kako bi se odredio intenzitet transpiracije potrebno je izmjeriti volumen vode koji je preostao u staklenci nakon određenog vremenskog perioda te izračunati koliki volumen vode je utrošilo 5 cvjetova Slika 19. Potrebno je donijeti zaključak usporedbom rezultata dobivenih prilikom samog postavljanja vježbe i rezultata dobivenih nakon određenog vremenskog perioda.). Mjerenje promjera (na temperaturu od cvijeta 15°C. Ako se pokus ostavi duže od tjedan dana potrebno je promatrati promjene na cvjetovima do početka smanjivanja promjera cvjetova zbog venuća ocvijeća ili do vremena venuća cvjetne stapke prilikom kojeg se ona savije (slika19. Nakon tjedan dana izmjeriti i izračunati srednju vrijednost promjera svih cvjetova koji su sada značajnije većeg promjera. Biljni materijal sa poklopcem premjestiti u staklenku s odmjerenim volumenom vode i staklenku dobro zatvoriti. nakon nekoliko dana izloženi nekontroliranim uvjetima Intenzitet transpiracije = VU – V1 VU [mL] .volumen H2O nakon određenog vremena Usporedbom rezultata može se donijeti zaključak o intenzitetu transpiracije pri kontroliranim i nekontroliranim uvjetima. Pukotine između poklopca i stabljike kroz koje bi mogla isparavati voda te mjesto navoja staklenke i poklopca dobro oblijepiti ljepljivom trakom (slika 17). Tri ponavljanja (repeticije) odnosno tri staklenke u kojima se nalaze cvjetovi obilježeni od 1 do 15 K staviti u komoru za klijanje biljaka u vremenskom periodu od tjedan dana pri kontroliranim uvjetima Slika18.ukupni volumen H2O V1[mL] . Gerberi u vazi procesom transpiracije. Pomičnom mjerkom ili ravnalom izmjeriti najveći i najmanji promjer pupoljka cvijeta a rezultate zabilježiti kao srednju vrijednost minimalnog i maksimalnog promjera pupoljka (slika 18).i daljnji transport vode u biljci što bi uzrokovalo venuće biljnog materijala. bez svjetla). 38 . Prema potrebi treba dodati vodu u staklenke a količinu dodanog volumena zabilježiti i zbrojiti s prethodnim ukupnim volumenom. Tijekom tjedan dana biljke su nastavile proces transpiracije te se volumen vode iz staklenke smanjio.

K 14. K 12. K 13. N 6. K 6. N 3. K 2. N 8. N 10. N 5. N 11. N 15.Rezultati Ø1 [cm] 1. K 10. N 7. K 15. N 12. K 11. K 7. K 8. N 2. N 9. N Promjer cvijeta Ø2 [cm] Ø2 – Ø1 [cm] V1 [mL] Volumen vode V2 [mL] VT [mL] Ø1 [cm] 1. K 5. K 4. N 13. K Promjer cvijeta Ø2 [cm] Ø2 – Ø1 [cm] V1 [mL] Volumen vode V2 [mL] VT [mL] Ø1 Ø2 V1 V2 VT [cm] – početni promjer pupa (cm) [cm] – promjer cvijeta nakon određenog vremenskog perioda (cm) [mL] – početni volumen vode u staklenci (mL) [mL] – izmjereni volumen vode nakon određenog vremenskog perioda (mL) [mL] – volumen vode utrošen u procesom transpiracije (mL) 39 . K 9. K 3. N 4. N 14.

Transpiracijom biljka izlučuje vodu u obliku vodene pare sa površine nadzemnih organa te time čini najveću pokretačku silu protoka vode. Svi listovi se poslože na izvagani papir za koji nam je poznata površina. Površine likova listova s jednog i drugog papira se zbroje. olovka biljni materijal: listovi ruže ili gerbera (može i neki drugi biljni materijal) reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Papir A4 formata potrebno je izvagati. metar. Treba paziti da se ne pomiješaju likovi koji su bili nacrtani na jednom papiru s likovima koji su bili nacrtani na drugom papiru. P [cm2] = a * b Sa jedne biljke se odvoje svi listovi pazeći da ostanu cjeloviti. Cilj Utvrditi površinu lisne biomase biljnog materijala.3. Izrežu se likovi lišća s papira. Biljka vodu iz zemLje preuzima korijenom pomoću procesa transpiracije i korijenovog tlaka koji provode vodu kroz ksilem prema nadzemnim organima biljke. 40 . Materijal pribor i oprema: vaga. izmjeriti njegovu dužinu i širinu te izračunati njegovu površinu. O ukupnoj površini biomase lišća ovisi i proces fotosinteze. sastavljeni i razdijeljeni. Lišće biljke su najznačajniji transpiracijski organi o čijoj površini ovisi i količina transpirirane vode. Svaki list se obcrta prema rubovima što vjerodostojnije. Likovi lišća s prvog papira se izvažu te se izračuna njihova površina. nekoliko papira A4 formata. škare. Ako svi listovi jedne biljke nisu stali na jedan papir ostatak listova stavi se na novi papir poznate mase i površine.2. P L [cm2] = P P * m L / m P P L – površina lista P P – površina papira m L – masa lista m P – masa papira Izrezani likovi s drugog papira se izvažu i izračuna se njihova površina. Važno je obratiti pažnju na anatomske karakteristike lista jer listovi mogu biti jednostavni. MJERENJE POVRŠINE LISTA Uvod u vježbu Dovoljna količina vode u biljci osigurava normalne fiziološke procese a time i njen kvalitetan rast i razvoj.

N 11. N 1. K 15. Izračunaj koliko će vode biljka transpirirati preko površine lista od 1 dm2? 41 . K 3. K 10. N 6. U sedam dana biljka koja ima lisnu površinu od 5 dm2 transpiracijom izgubi 250 mL vode.Rezultati Ovu tablicu treba upotpuniti rezultatima dobivenim iz biljnog materijala korištenog u vježbi „Život rezanog cvijeća u vazi“. N 5. N 10. K 12. K 6. N 9. Ukupno Srednja Srednja Površina Površina lista Ukupno [cm2] vrijednost [cm2] vrijednost lista [cm2] [cm2] [cm2] [cm2] 1. K 14. N 2. N 4. N 3. K 9. N 12. N 14. K 2. N 7. K 8. K 7. K 5. N 15. K 4. N 13. N 8. K 13. K 11. K N – biljke postavljene u nekontroliranim uvjetima K – biljke postavljene u kontroliranim uvjetima Problemski zadaci 1.

Poznate su još i kemonastije kod kojih su gibanja uvjetovana kemijskim podražajem. Ako su nastije uvjetovane promjenama temperature zovemo ih termonastije. Gibanje listova ocvjećja moguće je uočiti i prilikom promjena u intenzitetu osvjetljenja. seizmonastije kod kojih su gibanja uzrokovana mehaničkim podražajima. Različite biljne vrste različito su osjetljive na promjene temperature npr. Šafrani i tulipani listove ocvjećja mogu otvarati i zatvarati i nekoliko puta tijekom dana ovisno o temperaturnim prilikama a promjene se kod njih očituju već nakon nekoliko minuta. tigmonastije kod kojih su gibanja uvjetovana trenjem biljke o čvrstu podlogu itd. cvjetovi tulipana reagiraju na razliku u temperaturi od 1 . Većina biljnih vrsta otvara cvjetove ili listove prilikom jačeg intenziteta svjetlosti a zatvara prilikom slabijeg.3.3. Neke biljne vrste se očituju i obrnutim gibanjem svojih organa u odnosu na intenzitet svjetlosti. Nastijska gibanja rjeđe su rezultat nejednolikog rasta suprotnih strana organa a češće promjenama turgora koje su reverzibilne.0.blogcu. ako su uvjetovane promjenama intenziteta svjetlosti zovemo ih fotonastije (slika 20). Slika 20.com/eksi-yoncanin-faydalari_30376161.3°C a cvjetovi šafrana reagiraju na razliku u temperaturi već od 0.5°C.html ) 42 . fotonastijska gibanja listova kiselice (Oxalis acetosella) (slike preuzete: http://bitkiselumit. NASTIJSKA GIBANJA Uvod u vježbu Nastijska gibanja ili nastije su gibanja biljnih organa određena njihovom građom a pokrenuta podražajem iz okoline koji biljci služi samo kao signal. Termonastije su uočljive kod cvjetova mnogih biljaka koji se otvaraju tijekom dana kada je temperatura zraka povišena a zatvaraju se kada je temperatura zraka snižena.2 .

). Brzina otvaranja cvijeta odnosno cvata ovisi o biljnom materijalu. na način opisan u vježbi vase life. Materijal pribor i oprema: vaza ili lonac za cvijeće sa zemljom.) reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Biljni materijal korišten za ove vježbe može biti u loncima za cvijeće sa zemljom ili u vazi s vodom. Kako bi promatrali termonastije nekoliko biljaka treba staviti u prostoriju u kojoj je temperatura zraka oko 20°C.3. Pomičnom mjerkom se može izmjeriti promjer cvijeta. Biljke iz prostora s temperaturom zraka 20°C prenijeti u prostor s temperatura zraka 5°C a biljke koje su bile na 5°C prenijeti u prostor s temperaturom zraka 20°C. Rezultati i zaključak 43 . a nekoliko biljaka iste vrste treba staviti u prostoriju u kojoj je temperatura zraka oko 5°C. prije i nakon nastalih promjena. komora za klijanje cvijeća. U nemogućnosti postavljanja pokusa u prostorije s odgovarajućom razlikom u temperaturi biljke se mogu staviti i u komoru za klijanje biljaka na 20 -tak°C i u hladnjak na 5°C. Kada se biljke prilagode uvjetima treba ih zamijeniti na slijedeći način. Rezultate i zaključak zapisati. pomična mjerka. cvjetovi šafrana (Crocus sp. hladnjak biljni materijal: cvjetovi tulipana (Tulipa sp. Nakon nekog vremena biljke će reagirati a pomaci u gibanju organa će se lako uočiti vizualnim pregledom.3.A TERMONASTIJE Cilj Uočiti i dokazati gibanje organa biljnog materijala u odnosu na temperaturu kao vanjski faktor utjecaja.

Rezultate i zaključak zapisati.). cvatovi nevena (Calendula sp.). cvatovi tratinčice (Bellis perenis).B FOTONASTIJE Cilj Uočiti i dokazati gibanje organa biljnog materijala u odnosu na svijetlost kao vanjski faktor utjecaja.3. Rezultati i zaključak: 44 . listovi kiselice (Oxalis acotesella) reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Biljni materijal korišten za ove vježbe može biti u loncima za cvijeće sa zemljom ili u vazi s vodom. Kako bi promatrali fotonastije jednu biljku izložimo direktnom svjetlu a drugu iste vrste zamračimo ili je stavimo u komoru za klijanje biljaka pri čemu treba paziti kako bi obje biljke bile izložene jednakoj temperaturi i vlažnosti zraka. Nakon 1 do 2 sata biljke će reagirati na promjenu intenziteta svjetlosti. cvatovi maslačka (Taraxacum officinale). Pomičnom mjerkom se može izmjeriti promjer cvijeta.3. prije i nakon nastalih promjena. pomična mjerka biljni materijal: cvjetovi tulipana (Tulipa sp. veća kartonska kutija ili komora za klijanje biljaka. na način opisan u vježbi vase life. Materijal pribor i oprema: vaza ili lonac za cvijeće sa zemljom.

Skupljanje liski se odvija vrlo brzo no faza potpunog oporavka traje 30-tak minuta. Razmisli i zaključi kako se zove takvo nastijsko gibanje? 2. dodir rukom) skuplja svoje liske. Razmisli i zaključi kako se zove takvo nastijsko gibanje? 45 .Problemski zadaci: 1. Grašak je biljka za koju je karakteristično penjanje uz čvrstu podlogu pomoću vitica. Poznato je kako stidljiva mimoza (Mimosa pudica) prilikom mehaničkih podražaja listova (npr.

a podudarnost ovih parametara s poljskim nicanjem je neupitna. pa se u okviru istoga testa prvo utvrđuje energija klijanja. Ovi parametri usko su vezani i s potencijalnim prinosom.20 5 4 4 4 4 4 8 10 7 10 8 7 80 85 85 80 85 90 Biljna vrsta Glycine max (L.) 25000 Merr. 25.A STANDARDNA KLIJAVOST I ENERGIJA KLIJANJA SJEMENA Uvod u vježbu Standardna klijavost i energija klijanja prihvaćeni su kao glavni pokazatelji fiziološke kvalitete sjemena. Oba pokazatelja predstavljaju broj normalnih klijanaca građenih na način da nije ugrožen rast i razvoj mlade biljke što se. Najveća vrijednost ovih testova upravo je u preciznom predviđanju nicanja biljaka u polju. Helianthus annuus L. U okviru ovoga testa utvrđuje se i energija klijanja kao informativni podatak.20 20 20 20 20-30. 20000 Hordeum vulgare L.4. izdanak. ali i značajnim utjecajem na rani porast biljaka (više je vezan uz energiju klijanja). KLIJAVOST I VIGOR SJEMENA 3. kotiledone i koleoptilu). Standardna klijavost predstavlja broj normalnih klijanaca prema ukupnom broju sjemenki stavljenih na naklijavanje. Uvjeti za ispitivanje standardne klijavosti i energije klijanja pojedinih ratarskih kultura značajno se razlikuju. Neizostavni su parametri za određivanje norme sjetve u cilju postizanja željenog sklopa biljaka u polju te su kao takvi naišli na široku primjenu u praksi. Uvjeti za ispitivanje standardne klijavosti i energije klijanja pojedinih ratarskih kultura Period Temperatura Period za za Masa Veličina Masa °C ocjenu Minimalna ocjenu partije prosječnog radnog (stalna ili standardne klijavost energije sjemena uzorka uzorka izmjenjiva) klijavosti (%) (kg) (g) klijanja (g) (dani) (dani) 1000 1000 1000 50 1000 1000 500 200 120 5 120 900 20-30. a zatim standardna klijavost.3. Triticum aestivum Zea mays L.25. 10000 25000 40000 46 . odnosi na njezine osnovne dijelove (korijenov sustav. tablica 4. ovisno o biljnoj vrsti. 25000 Medicago sativa L.4.25 20-30. uglavnom preko ostvarenog sklopa biljaka u polju. a razlika u odnosu na standardni test klijavosti je u vremenu naklijavanja koje je kraće. Tablica 4. Ispitivanje se obavlja na radnom uzorku jedne partije sjemena u laboratorijskim uvjetima.

Elastičnim metrom izmjeri se koliko su dugačke klice svake proklijale sjemenke i izračuna srednju vrijednost klijanaca za svaku sortu. Izračuna se prosječna masa klijanaca. elastični metar. Tako složen filter-papir se čvrsto zarola od jednog kraja prema drugom poput štrudle a smotuljak dodatno učvrsti gumicom za zimnicu. komora za klijanje biljaka biljni materijal: sjeme graha dvije sorte (pri izboru sorte graha dobro je izabrati jednu sortu niskog rasta a drugu visokog rasta) reagensi: destilirana voda Način izvođenja vježbe Prije vježbe potrebno je izbrojati i izvagati 100 sjemenki graha od svake sorte. Ovisno o sorti koju smo izabrali sjemenke mogu biti različite veličine te u skladu s tim na arak treba složiti 20 do 50 sjemenki graha. Nakon tjedan dana napravi se analiza rasta. Smotuljke je potrebno obilježiti kako bi znali koja sorta Slika 21. svi metodom na filter-papiru smotuljci se zajedno s kalupom stave u neprozirnu vreću za smeće kako bi gubitak vode bio sveden na minimalnu količinu. Sjemenke neka budu jednako okrenute kako bi klice neometano mogle klijati jedna pokraj druge. Sjemenke graha se slože u jednom redu na sredinu dva sloja filter-papira (slika 21). Smotuljak okomito treba postaviti u kalup za nasađivanje cvijeća (slika 21). flomaster. Kako bi osigurali dovoljnu količinu vlage potrebne za klijanje sjemena pomoću boce špricalice filter-papir se natopi vodom.Cilj Odrediti klijavost sjemena dvije različite sorte graha. boca špricalica. Prilikom postavljanja smotuljaka u kalup neka smotuljci budu orijentirani otvorom prema gore kako bi sjemenke prilikom rasta mogle proklijati izvan filter-papira. Postavljanje testa za graha je u kojem smotuljku. Sjeme graha se stavlja u komoru za klijanje biljaka na 20°C u periodu od tjedan dana. vaga. Noktom se pažljivo odvoje kotiledoni od hipokotila te se hipokotili izvažu za svaku sortu graha posebno. laboratorijska čaša. Nakon što je sjeme absorbiralo dovoljnu količinu vode višak je potrebno isipati a sjemenke složiti na arak filter-papira. gumica za zimnicu. 47 . Arak filter-papira treba postaviti horizontalno te ga podijeliti na tri jednaka dijela po dužoj stranici. Jedna trećina filter-papira se presavije po dužini. crna vreća za smeće. Materijal pribor i oprema: kalupi za cvjetne nasade. Ako nije pristupačna klima ispitivanje klijavosti standardnom komora sa mogućom regulacijom vlage (fitotron). Pri tome je potrebno pripaziti kako se ne bi nasipalo suviše vode. filter-papir. Prebroji se koliko sjemenki graha je proklijalo a koliko nije te se izračuna postotak klijavosti za svaku sortu graha. Nekoliko sati prije vježbi sjeme je potrebno potopiti u vodu kako bi se potaklo njegovo klijanje. plastična čaša. Nakon toga se preostala jedna trećina filter-papira presavije preko sjemenki graha.

– postotak neproklijalih sjemenki graha d hip [mm] – srednja vrijednost dužine klica sjemenki graha izražena u milimetrima m [g] – srednja vrijednost mase klijanaca graha izražena u gramima m [g] 2 sorta graha % NEP. Za razliku od normalnih klijanaca. a nedovoljno razvijeni i deformirani klijanci. d hip [mm] m [g] 48 . klijanci za koje se ocijeni da nemaju sposobnost razvitka u normalnu biljku ne uračunavaju se u postotak klijavosti. Utvrđivanje klijavosti sjemena graha (lijevo) i soje (desno) standardnom metodom na filter-papiru Rezultati 1 sorta graha % NEP. 2. Pri tome partija sjemena koja je namijenjena za distribuciju mora zadovoljiti propisanu minimalnu klijavost (tablica 4). 3. a i ostalih ocijenjivanja izdvajaju se normalni klijanci. U postotak klijavosti također se ne uračunava niti mrtvo sjeme koje ne pokazuje znakove razvoja klice. deformirani (na jednoj ili više osnovnih struktura prisutan je deformitet) ili istruli.Usporedbom dobivenih rezultata može se zaključiti koja sorta graha ima bolje kvalitete sjemena. Takvi klijanci su oštećeni (nedostaje ili je oštećena neka od osnovnih struktura). Slika 22. prazno sjeme te sjeme oštećeno napadom kukaca. kao i neklijavo sjeme. Prilikom prvog. Ukupno % NEP. a suma postotaka normalnih i deformiranih klijanaca te neklijavog sjemena mora biti 100. d hip [mm] 1. Energija klijanja i klijavost utvrđuju se brojanjem normalnih klijanaca nakon perioda predviđenog za naklijavanje (slika 22). Rezultat se izražava u %. ostavljaju se do kraja ispitivanja klijavosti.

Izračunaj koliko grama sjemena treba posaditi na 10 m2 ako želimo da nam proklija 200 biljaka? Pri računanju uvrsti podatke dobivene iz postavljenog pokusa. 49 .Problemski zadaci 1.

3.4.B COLD TEST Uvod u vježbu Za podrobniju ocjenu kvalitete sjemena uz test standardne klijavosti i energije klijanja preporučuje se provesti i druge testove vigora sjemena od kojih posebnu važnost ima cold test. Ovaj test ima osobiti značaj kod analize partija sjemena s graničnim vrijednostima standardne klijavosti i energije klijanja, dulje skladištenih partija sjemena, osobito ako je skladištenje bilo neuvjetno, te partija sjemena loših fizikalnih pokazatelja i narušenog zdravstvenog stanja. Nadalje, cold test ima veliku važnost ukoliko se prakticiraju rani rokovi sjetve kada postoji velika opasnost od redukcije sklopa biljaka (hladno tlo saturirano vlagom, prisutnost patogena, produljen period od sjetve do nicanja) jer će tada, u odnosu na ostale testove vigora sjemena, cold test dati najbolju procjenu poljskog nicanja. Generalno se može reći da partije sjemena s većim vrijednostima cold testa u pravilu ostvaruju bolje poljsko nicanje, osobito u lošijim uvjetima u polju. Cilj Odrediti postotak klijavosti sjemena ratarskog usjeva, po dale opisanoj metodi cold testa Materijal pribor i oprema: rolani filter-papir, plastične vrećice, klima komora, tlo i pijesak u omjeru 1:1 biljni materijal: sjeme kukuruza ili soje reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Pripremi se podloga za sjetvu uzimanjem prosječnog uzorka tla s table na kojoj je prethodne godine uzgajana testirana kultura. Uzorak tla se osuši, usitni i prosije, kako bi se postigla fina mrvičasta struktura. Tako pripremljen uzorak tla pomiješa se s pijeskom u omjeru 1:1. Postupak naklijavanja je sljedeći: prethodno navlaženi filter-papir stavi se na hlađenje (10°C) 24 h prije sjetve, kao i pripremljena smjesa pijeska i tla. Na navlaženi i ohlađeni filter-papir rasporedi se sjeme koje se zatim pospe sa 100 g smjese pijeska i tla. Radni uzorak čini 4x50 sjemenki, sjemenke se iz uzorka uzimaju nasumce i raspoređuju na podlogu za klijanje. Filter-papir Slika 23. Cold test sjemena soje po modificiranoj se zatim preklopi i dodatno «Rolled towel» metodi navlaži s onoliko vode koliko mogu upiti papir i podloga. 50

Posijani uzorak zamota se u tuljak, stavi u plastičnu vrećicu i vertikalno odloži u termostat na temperaturu 10°C, bez utjecaja svjetla. Potom slijedi naklijavanje na temperaturi 25°C u trajanju od 5 dana, također bez prisutnosti svjetla. Konačno očitavanje klijavosti slijedi nakon ukupno 12 dana (slika 23). Ovoj metodi, uz moguće modifikacije, podliježu slijedeće kulture: kukuruz, soja, grašak i suncokret. Kao i kod testa standardne klijavosti, i cold test se utvrđuje brojanjem normalnih klijanaca nakon perioda predviđenog za naklijavanje i izražava se u %. Za razliku od normalnih klijanaca, klijanci za koje se ocijeni da nemaju sposobnost razvitka u normalnu biljku ne uračunavaju se u postotak klijavosti (oštećeni, deformirani i istruli klijanci te mrtvo sjeme). Rezultati

51

3.4.C ELEKTRIČNI KONDUKTIVITET SJEMENA Uvod u vježbu Gubitak vigora sjemena uvelike je vezan uz stanje staničnih memebrana i sjemenjače, a povećanjem propusnosti navedenih struktura redovito dolazi do opadanja vigora sjemena. Upravo na ovim činjenicama utemeljena je metoda testiranja vigora sjemena putem utvrđivanja električnog konduktiviteta sjemena kojim se mjeri intenzitet ispiranja elektrolita iz biljnog tkiva tijekom namakanja sjemena u vodi. U osnovi, vrijednost električnog konduktiviteta predstavlja stupanj provodljivosti otopine u kojoj je sjeme namakano i bit će veći ukoliko tijekom namakanja otpuštanje elektrolita bude veće. Nadalje, intenzivnije otpuštanje elektrolita tijekom namakanja veće je što je propusnost sjemenjače i staničnih membrana veća pa otuda pad vigora sjemena redovito prati porast električnog konduktiviteta sjemena. Ovdje treba naglasiti i činjenicu da što je sjeme nižeg vigora, ima nižu klijavost, energiju klijanja i cold test, dok mu je električni konduktivitet u porastu, pa je korelacija konduktiviteta sjemena s ostalim laboratorijskim pokazateljima, kao i s poljskim nicanjem, redovito negativna. Cilj: Odrediti promjene električnog konduktiviteta sjemena soje u fazi imbibicije kroz određeni vremenski period. Materijal pribor i oprema: konduktometar, plastične čašice biljni materijal: sjeme bilo kojeg ratarskog usjeva reagensi: destilirana voda Način izvođenja vježbe Radni uzorak čini 4x50 sjemenki koje se prethodno izvažu, a zatim stavljaju na namakanje u Erlenmeyerove tikvice u 250 mL deionizirane vode. Voda je temperirana na 20°C, a uzorci se zatim odlažu u termostat na istu temperaturu od 20°C u trajanju od 24 h. Po isteku vremena predviđenog za namakanje sjemena obavlja se mjerenje električnog konduktiviteta. Neposredno prije mjerenja Slika 24. Utvrđivanje električnog pripremljeni uzorak lagano se miješa u konduktiviteta sjemena soje trajanju od 10-15 sekundi, a zatim se konduktometrom konduktometrom izvrši mjerenje (slika 24) i očitaju dobivene vrijednosti. Ova metoda razvila se na grašku, primjenjuje se na ostalim krupnozrnim leguminozama, ali i na kukuruzu, pšenici i nekim drugim kulturama.

52

Rezultati i zaključak Očitane vrijednosti s konduktometra (µScm-1) odnose se na ukupnu masu namakanog uzorka (50 sjemenki). Stoga se utvrđena vrijednost preračuna na masu od 1 g sjemena i izrazi u µScm1 -1 g . Dobiveni rezultati ocjenjuju se prema skali za krupnozrne leguminoze (Powell i Matthews, 1981., tablica 5).

Tablica 5. Skala za ocjenu vrijednosti električnog konduktiviteta za krupnozrne leguminoze Električni konduktivitet (µScm-1g-1 ) <25 25-29 30-43 >43 Ocjena kvalitete sjemena i preporuka za sjetvu sjeme prikladno i za ranu sjetvu sjeme može biti prikladno za ranu sjetvu, ali uz određeni rizik sjeme nije prikladno za ranu sjetvu i nepovoljne uvjete sjeme neprikladno za sjetvu

53

stagnacije usjeva. sjeme može biti zaraženo velikim brojem gljivica. Nadalje. a) Metoda pregleda naturalnog sjemena Metoda se svodi na vizualni pregled uzorka uz moguću upotrebu stereo-mikroskopa. metodom vizualnog pregleda.D ZDRAVSTVENO STANJE SJEMENA Uvod u vježbu Važan činitelj vigora sjemena je i njegovo zdravstveno stanje. partije sjemena lošijeg zdravstvenog stanja neće ostvariti željene sklopove biljaka u polju. ali i štetnih fizioloških stanja. 54 . kukaca i grinja. smanjenja prinosa i komercijalne vrijednosti usjeva uopće. Metode zdravstvene analize sjemena mogu se podijeliti na dvije osnovne skupine ovisno o tome prethodi li im proces inkubacije: 1. Tikvica se začepi i mućka u trajanju od 10 minuta (ručno ili na automatskoj mućkalici). cisti nematoda. bakterije i virusi i ostale). a uslijed infekcije patogenima može značajno opasti vigor sjemena.4. Kao prvo. Pregled sjemena na plamenjaču provodi se na netretiranom sjemenu. U konačnici. Metode ocjenjivanja zdravstvenog stanja bez inkubacije Ove metode ne daju podatke o vijabilnosti patogena. Ex Gaum). zdravstvenu analizu treba uvažiti kao nadopunu ostalim testovima vigora sjemena i boljem uvidu u stvarno stanje pojedine partije sjemena. Ispitivanje zdravstvenog stanja sjemena provodi se primjenom različitih metoda. Radni uzorak (50 g sjemena za strna žita) stavlja se u tikvicu i prelije sa 70 mL destilirane vode uz dodatak 2 kapi tekućeg deterdženta za pranje suđa. bolesni klijanci oslabit će i zaostati rastom i razvojem. Iz svake kivete mikroskopira se najmanje 4 kapi.od prorjeđivanja sklopa. bakterija i virusa. a konačan rezultat izražava se u postotku sjemena zahvačenog plamenjačom. radni uzorak čini 4x50 sjemenki. parazitskih nematoda i kukaca. prisutnost sklerocija. rezultati ispitivanja zdravstvenog stanja sjemena mogu ukazati na nužnost provođenja tretiranja sjemena u cilju iskorjenjivanja patogena koji se prenose sjemenom ili smanjenja opasnosti od prijenosa zaraze. te napravi suspenzija taloga. Tako se vizualnim pregledom sjemenjače utvrđuje prisutnost plamenjače na sjemenu soje (Peronospora manshurica (Naum) Syd. veća zaraženost sjemena uzročnicima bolesti utvrđenim zdravstvenom kontrolom upućuje na potrebu tretiranja sjemena. Prisutne hlamidospore izbroje se korištenjem hemacitometra. pa se generalno može reći da se vigor sjemena proporcionalno smanjuje s povećanjem intenziteta zaraze. razvoja bolesti u polju. Posebnu važnost ima zdravstvena analiza uvezenih partija sjemena zbog mogućeg unosa novih patogena i opasnosti za domaću proizvodnju. Odlije se tekućina iznad taloga i dodaje destilirana voda do 2 mL. 10 mL suspenzije dobivene mućkanjem centrifugira se 4 minute na 2400 okretaja. mogu utvrditi promjene boje i oštećenja sjemena. Brojni radovi potvrđuju negativnu korelaciju između intenziteta zaraze sjemena pojedinim patogenima i vigora. Većina uzročnika bolesti prenosi se sjemenom pa korištenje zdravog sjemenskog materijala ima važno mjesto i u prevenciji i smanjivanju pojavnosti bolesti. Zatim treba navesti rizik koji sa sobom nosi sjetva zaraženim sjemenom . Nadalje se. a sve to negativno će se odraziti na prinos. Osim toga.3. Stoga treba izdvojiti nekoliko aspekata koji daju veliku važnost provedbi zdravstvene analize sjemena. b) Metoda ispiranja sjemena Metoda ispiranja sjemena koristi se za analizu sjemena strnih žita i trava na prisutnost patogena Tilletia spp. a odnosi se na utvrđivanje prisutnosti uzročnika bolesti (gljivice. Naime.

prisutnost štetnika i štetnih fizioloških stanja na ili u sjemenu te na klijancima. pri točki ključanja.prosječan broj spora u kvadratu hemacitometra (ukupan zabilježeni broj/8) V [mL] . Petrijeve zdjelice prethodno su obložene Slika 25. Zatim se embriji premjeste u mješavinu jednakog omjera glicerola i vode. Pregledava se 1000 embrija iz svakog ponavljanja pod povećanjem 16 – 25 puta. Može se odrediti površinska ili dubinska zaraza. Nakon toga cijeli se uzorak premjesti u prikladni kontejner i ispere u toploj vodi. c) Metoda pregleda embrija Ova metoda koristi se na sjemenu ječma za određivanje zaraze prašnom snijeti (Ustilago nuda). Embriji se u laktofenolu drže 30 sekundi. Rezultat pregleda izražava se u % zaraženog sjemena. Dodatno čišćenje embrija obavlja se u digestoru tako da se embriji premjeste u laboratorijsku posudu u kojoj se nalazi 75 mL čistog svježe pripravljenog laktofenola. Utvrđivenje zdravstvenog stanja sjemena soje po metodi na filter-papiru 55 . lagano zagrijani glicerol. Radni uzorak mase 200-240 grama tretiranog ili netretiranog sjemena podijeli se na dva ponavljanja. Na kraju se embriji premjeste u svježi. simptome razvoja bolesti. a) Metoda na filter-papiru Radni uzorak od 400 sjemenki rasporedi se u Petrijeve zdjelice (po 10 zrna u jednoj Petrijevoj zdjelici). s prikladnim osvjetljenjem (odozdo). koji izlaze kroz smekšani perikarp. Embriji se izdvoje pomoću sita s otvorima promjera 1 mm. Traži se karakterističan zlatno-smeđi micelij gljivice Ustilago nuda.volumen suspenzije (2 mL) W [g].0001 .volumen tekućine u kvadratu hemacitometra. gdje se odvajaju od eventualnih ostataka sjemena. da se odvoje embriji.masa sjemena 0.Broj spora u gramu sjemena se izračunava po formuli: X = N ∗V 0. Metode ocjenjivanja zdravstvenog stanja nakon inkubacije Nakon razdoblja inkubacije radni se uzorak ispituje na prisutnost uzročnika bolesti. Ekstrakcija i čišćenje embrija obavlja se tako da se radni uzorak stavi u jednu litru svježe pripremljene 5%-tne vodene otopine natrijeve lužine (NaOH) i drži 24 sata na 20°C.0001 ∗ W N . 2. kako bi se obavio pregled.

Inkubacija za netretirano sjeme traje 10 dana. c) Metoda na hranjivoj podlozi Metoda na hranjivoj podlozi koristi se za utvrđivanje zaraze sjemena pšenice sa smeđom pjegavosti pljevica.) brzo se šire na filter-papiru. Hranjiva podloga izlijeva se u petrijive zdjelice promjera 9 cm. Pri tome je nužno rabiti znanstvena imena uzročnika bolesti. uz izmjenično osvjetljenje (12 sati osvjetljenja u spektru od 320 do 420 nm. gustog bijelog ili kremastog micelija. d) Predtretman (prethodna obrada) Pojedine gljivice (npr. Nakon inkubacije slijedi determinacija i utvrđivanje postotka zaraze sjemena. Prije stavljanja radnog uzorka (400 sjemenki) na hranjivu podlogu obavlja se predtretman (dezinfekcija) u 1%-tnoj otopini natrijeva hipoklorita. na koji se sjemenke rasporede tako da je njihova međusobna udaljenost najmanje 2 cm. zatim sljedećih 24 sata u zamrzivaču na -20°C. Kod stavljanja sjemenki u Petrijeve zdjelice razmak treba biti najmanje 2 cm. a 14 dana za tretirano sjeme pri temperaturi od 20°C. Nakon 7 dana golim okom se određuje broj sjemenki s karakterističnim kolonijama. Septoria nodorum). Nakon toga se Petrijeve zdjelice sa sjemenkama stavljaju na inkubaciju 7 dana na 20°C u mraku. u koji se kod pripreme dodaje 100 ppm streptomicin sulfata. ako je proveden. Na taj način ugrožavaju sam ishod analize jer mogu „maskirati“ konačan rezultat. spororastućeg. sucokreta i jarog graška. Rezultati Rezultati zdravstvene analize prikazuju se kao postotak zaraženih sjemenki ili kao broj organizama po težini ispitanog uzorka. a primjenjuje se na sjemenu ozime pšenice i ozimog ječma. b) Metoda izmrzavanja Metoda izmrzavanja predstavlja modificiranu metodu na filter-papiru. Tako „posijano“ sjeme odlaže se u termostat na inkubaciju. Rhizopus spp. 56 . Metoda se primjenjuje na sjemenu soje (Slika 25). Naime. Rezultat analize izražava se u % zaraženog sjemena. koje često prekrivaju cijelo sjeme. Iz tog je razloga za pojedine metode poželjno izvršiti predtretman koji se odnosi na bilo kakav fizikalni ili kemijski tretman radnog uzorka proveden u laboratorijskim uvjetima. Modifikacija se odnosi na temperaturu inkubacije. 12 sati u tami).navlaženim filter-papirom. prilikom inkubacije sjeme se prvo stavlja u komoru za naklijavanje na 20°C kroz 24 sata. mogu prorasti zdravu biljku ili se razvijati s patogenom na zaraženom sjemenu. Tako se u slučaju potrebe za površinskom dezinfekcijom sjemena može provesti predtretman natrijevim hipokloritom namakanjem sjemena u trajanju od 10 minuta u otopini natrij hipoklorita koja sadrži 1 volumni % aktivnog klora. gljivicom Leptosphaeria (Stagonospora) nodorum (syn. naznačiti metodu zdravstvene analize koja je korištena. Nakon toga Petrijevke sa sjemenom drže se u komori za naklijavanje na 20°C do kraja inkubacije (osim kod determinacije gljive Microdochium nivale gdje temperatura u komori za naklijavanje mora biti 15-18°C). Kao hranjiva podloga obično se koristi krumpir-dekstroza agar (PDA) ili malc agar. uključujući i podtretman.

Kod linearnog oblika zavisnosti jednadžba se raščlani prema Wiliamsu: 57 .3. osvjetljenje i dovoljna količina vode važni su faktori koji utječu na dobivanje zdrave i snažne biljke s dobro razvijenom lisnom površinom i dobrim prirastom. količina klorofila a i sl. Cilj Naučiti modele analize rasta biljaka te na primjerima utvrditi naučeno. ANALIZA RASTA BILJAKA Uvod u vježbu Visokoproduktivni uzgoj biljaka zahtjeva postizanje optimalnih uvjeta prilikom rasta i razvoja biljaka. Kvalitetna gnojidba također ima značajan učinak na povećanje poljoprivrednog uroda i priroda.00625g / dan 100 80dana NETO ASIMILACIJA (E) Vrijednost čistog efekta asimilacije izračunava se na slijedeći način: E= 1 dW × A dt Neto asimilacija (E) je prirast suhe tvari izražen na jedinicu veličine koja pokazuje aktivnost fotosintetičkog aparata biljke (površina lišća. RELATIVNA BRZINA RASTA (R) Relativna analiza rasta ili njenih pojedinih organa u određenom vremenskom razdoblju izražava se kao prirast u jedinici suhe tvari: R= 1 dW × W dt W dW dt = ukupna masa suhe tvari biljke = prirast mase suhe tvari = vremenski interval Primjer: Nakon 100 dana vegetacije prosječna masa suhe tvari korijena šećerne repe iznosi 50 g. Zavisnost između A (asimilacijska površina) i W (suha tvar biljke) može biti linearna ili kvadratna. ukupni i proteinski dušik u lišću.). Temperatura. a nakon 180 dana 100 g.5. Kakva je relativna brzina rasta u ispitivanom razdoblju od 80 dana? R= 1 50 g × = 0.

Zavisi od doba vegetacije.5 t/ha nakon 160 dana vegetacije. a masa suhe tvari 60 g.E= dW × (ln A2 − ln A1 ) dA × dt Kod kvadratnog oblika zavisnost jednadžbi glasi: E = 2× dW ( A2 + A1 ) × dt Primjer: Nakon 60 dana vegetacije prosječna površina lišća jedne repe je 22 dm2 uz masu suhe tvari od 25 g. Nakon 30 dana lisna površina bila je 34 dm2.1 t/ha. F) Proporcionalna lisna površina je omjer lisne površine i ukupne mase suhe tvari. F= A W Ovaj pokazatelj je relativna mjera fotosintetičke aktivnosti lišća i značajan je za utvrđivanje razlika između pojedinih sorti i biljnih vrsta. 58 .1 − 6. Kolika je prosječna neto asimilacija uz pretpostavku linearne zavisnosti između lisne površine i suhe tvari biljke? E= (60 − 25) × (ln 34 − ln 22) = 0. Kolika je produktivnost usjeva? C= 8.5 = 0. a 20 dana kasnije 8.04 g / dan / dm 2 (34 − 22) × (90 − 60) PRODUKTIVNOST (C) Veličina prirasta ili produktivnost izražava se prema jednadžbi: C= dW dt × P dW = razlika između dva uzastopna mjerenja produktivnosti (primarne – prinos ili biomase kod utvrđivanja prirasta populacije) P = površina tla na koju se produktivnost odnosi Primjer: Na 10 ha utvrđen je biološki prinos šećera šećerne repe 6.008t / ha / dan (180 − 160) × 10 PROPORCIONALNA LISNA POVRŠINA (lisnatost.

FP = ( A2 − A1 ) × dt( m 2 dan ) 2 59 .72 m2/m2 tla FOTOSINTETIČKI POTENCIJAL (FP) Veličina fotosintetičkog potencijala povezana je s otpornošću sorata prema nepovoljnim uvjetima. a za travne fitocenoze 7 do 10 i zavisi uglavnom od vertikalne strukture fitocenoze. Koliki je LAI ako je sklop usjeva 700 biljaka/m2? 700 × 10 = 700 × 12 = 700 × 17 = 700 × 25 = 700 × 32 = Σ= 7000 8400 11900 17500 22400 67200 cm2 = 6. 17. Primjer: Jedna biljka pšenice ima razvijenih 5 listova prosječne površine 10. zbog čega je naročito značajna veličina FP u razdoblju poslije klasanja. LAD se može brojčano iskazati kao površina ispod krivulje lisne površine u razdoblju vegetacije. 25 i 32 cm2. Optimalna vrijednost LAI ima vrlo značajnu ulogu u produktivnosti biljaka. Teorijski optimum LAI je onda kada i najniži listovi dobivaju toliko svjetla da je omjer između fotosinteze i disanja veći od 1 (iznad kompenzacijske točke).LISNA POKROVNOST (LAI) Lisna pokrovnost (LAI) je omjer između lisne površine populacije i površine tla kojoj ona pripada. 12. Prinos zrna pšenice stvara se uglavnom fotosintetičkom aktivnošću asimilacijskih organa u drugoj polovini vegetacije. Integralna površina (LAD) je mjerilo sposobnosti biljaka da održe stvorenu lisnu površinu. što podrazumijeva i regeneraciju izgubljenog lišća. Razlike između sorata mogu većim dijelom potjecati upravo od razlika u LAI jer je produktivnost fitocenoza (C) umnožak prosječne lisne pokrovnosti i čistog efekta asimilacije (E): C = L× E Optimalna veličina LAI za poljoprivredne vrste je između 3 i 5.

ŽETVENI INDEKS (ŽI) Žetveni indeks (ŽI) je postotni udjel poljoprivrednog prinosa (urod) u ukupnoj biomasi (poljoprivredni prinos ili prirod).001 g koliki je udjel uroda u prinosu biljke? Biološki prinos biljke = 4.893 g (Pp) ŽI = 2.502 60 . ŽI = Pp × 100 [%] Bp Primjer: Ako je biološki prinos biljke (Bp) 4.395 g (Bp) Prinos zrna biljke = 1.001× 100 [%] 4.502 g a prinos zrna (Pp) je 2.

a također postoji i u odnosu prema mikroorganizmima. što ne bi bio realan pokazatelj alelopatskih odnosa između biljaka. kako bi provjerili uspješnost ispiranja. 1%-tna otopina AgNO3-reagens za kontrolu uspješnosti ispiranja (1 g AgNO3 otopiti u 60-ak mL destilirane vode. ječam. UTVRĐIVANJE ALELOPATSKIH ODNOSA U KLIJANJU Uvod u vježbu Alelopatiju predstavljaju međusobni odnosi između biljnih vrsta koji se uspostavljaju putem specifičnih kemijskih supstanci koje biljke sintetiziraju i izlučuju u okolinu. Cilj Utvrditi postojanje alelopatskih odnosa u fazi klijanja sjemena između različitih biljnih vrsta. Dezinfekcija se vrši potapanjem sjemna 3-5 minuta u 0. graha. zob 4. soja 2. npr. zobi.1%-tni HgCl2 .3. kao što su klijanje. kukuruz. klima komora biljni materijal: sjeme: kukuruza. te na kraju utjecati na postotak klijavosti. Postojanje alelopatski odnosi u fazi klijanja sjemena se utvrđuje se izračunavanjem postotka isklijalih sjemenki različitih biljnih vrsta bez prisustva drugih sjemenki i u kombinacijama sa sjemenkama jedne ili dvije druge biljne vrste.5 mL koncentrirane HCl i nadopuni destiliranom vodom do 1000 mL). rotkvica 6. rast. pšenica.1 % otopinu HgCl2. U destiliranu vodu kojom je sjeme isprano dodaje se nekoliko kapi 1 % otopine AgNO3. fotosinteza i disanje. 61 . Djelovanje sintetiziranih kemijskih supstanci se odražava na karakter i intenzitet fiziološkobiokemijskih procesa u biljkama. dodati 1-2 kapi dušične kiseline i nadopuniti vodom do 100 mL). ječam. Sjeme se na klijanje postavlja u Petrijeve zdjelice istih dimenzija ili u filter papir.otopina za ispiranje sjemena (1 g HgCl2 otopa se u 2. pšenica. Za pokus se koristi sjeme tri različite biljne vrste. potrebno je ponoviti ispiranje sve dok voda nakon dodavanja AgNO3 ne ostane bistra. suncokret. Ova pojava se javlja između različitih biljnih vrsta “divljih” i “kulturnih” biljaka. grah 3. suncokret. Nakon dezinfekcije sjeme se ispire destiliranom vodom. suncokreta. ječma.: 1. a može se javiti u svim fazama razvoja biljnog organizma. soje. Materijal pribor i oprema: Petrijeve zdjelice. raži reagensi: 0. Ako se voda zamuti.6. Način izvođenja vježbe Prije postavljanja pokusa potrebno je obaviti dezinfekciju sjemena kako bi se uklonila epifitna mikroflora koja može biti specifična za pojedinu vrstu sjemena. grahorica. ljulj. kukuruz. filter-papir. gorušica. pšenice. raž 5. konoplja. ali sličnih dimenzija sjemena. minerqalna ishrana. folija za konzerviranje. lucerna.

Nakon 7 dana broj proklijalih sjemenki bio je slijedeći: pšenica ječam % razlika ukupno % 10/50 3/25 1/25 3/17 zob % posuda ukupno 1. 25 sjemenki biljne vrste broj 1 i 25 sjemenki biljne vrste broj 2 (pšenica i ječam) 5. Biljke se mogu uzgajati u istim kombinacijama 15 dana. 62 .2. 50 sjemenki biljne vrste broj 1 (npr. zob) 4.3 40/50 4 14/25 5 20/25 6 7 6/17 razlika ukupno 35/50 10/25 15/25 0/17 razlika U tablicu je potrebno upisati postotke klijavosti.Na Petrijeve zdjelice postavi se filter papir i navlaži destiliranom vodom te se na papir ravnomjerno rasporedi 50 sjemenki po slijedećoj shemi: 1. Rezultati Radi utvrđivanja alelopatije pri klijanju postavljen je pokus sa sjemenjem pšenice. pšenica) 2. 50 sjemenki biljne vrste broj 2 (npr. te razlike u postotku klijavosti između sjemena pojedinih biljnih vrsta. po 17 sjemenki svake od tri ispitivane biljne vrste (pšenica. ječam) 3. te se alelopatski odnosi utvrđuju kao razlika u postotku klijanja sjemena u jednovrsnim. Postotak klijanja sjemenki evidentira se svaki dan nakon početka klijanja . dvojnim i trojnim uzorcima. 25 sjemenki biljne vrste broj 1 i 25 sjemenki biljne vrste broj 3 (pšenica i zob) 6. 50 sjemenki biljne vrste broj 3 (npr. Ako se sjemenke postavljaju na filter papir veličine A3 formata. ječma i zobi. ječam i zob) Sjemenke se prekriju drugim filter papirom koji se također navlaži destiliranom vodom. 25 sjemenki biljne vrste broj 2 i 25 sjemenki biljne vrste broj 3 (ječam i zob) 7. te se utvrđuju alelopatski odnosi preko razlika u masi svježe ili suhe tvari razvijenih biljaka. papir je potrebno navlažiti i smotati u "rolu" te također postaviti na 25°C u klima komoru. do sedmog dana klijanja. zdjelice se prekriju zaštitnom foliju i postave na 25°C u klima komoru.

U slučaju da se ta vrijednost nalazi između dvije 63 . metalna žlica. sat. 5 odmjernih tikvica od 50 mL. Otopina u kojoj nema promjene koncentracije (% suhe tvari) ima osmotsku vrijednost jednaku osmotskoj vrijednosti biljnog tkiva. odnosno koncentracija otopljenih tvari jednaka onoj u stanicama biljnog tkiva. milimetarski papir. stalak za epruvete. Slika 26. U otopinama bez biljnog tkiva se odredi refraktometrom refrakcijski indeks ili % suhe tvari. nož. U jedan niz otopina se potope komadići ispitivanog biljnog tkiva (podjednakog broja i veličine). ODREĐIVANJE DEFICITA DIFUZNOG PRITISKA (DDP) Uvod u vježbu Određivanje sile usvajanja vode (DDP) tkiva ili čitavih organa biljke obavlja se pronalaženjem otopine čiji osmotski pritisak odgovara ispitivanom uzorku te u njemu ne dolazi do usvajanja odnosno izdvajanja vode. Otopine s većom početnom koncentracijom zbog svog većeg osmotskog potencijala “izvlače” vodu iz stanica tkiva (plazmoliza).0 mol/dm3 i prenese po 10 mL u dva niza epruveta. pipeta od 10 mL. otopine saharoze od 0. refraktometar biljni materijal: gomolj krumpira reagensi: destilirana voda. ravnalo. Takve otopine nazivaju se hipertonične. vaga. te pri tome smanjuju svoju koncentraciju (sadržaj suhe tvari im se smanjuje) a volumen tkiva se smanjuje. odnosno koncentraciju otopljenih tvari u odnosu na stanice biljnog tkiva su hipotonične i u njima dolazi do povećanja koncentracije otopljenih tvari uslijed prelaska vode u ispitivano tkivo koje povećava svoj volumen. FIZIOLOGIJA STRESA KOD BILJAKA 4.2 do 1 mol/dm3 Način izvođenja vježbe Priredi se niz otopina saharoze od 0. Materijal pribor i oprema: 10 kemijskih epruveta. Otopine koje imaju manji osmotski potencijal.4. Praktično mjerenje DDP uz pomoć refraktometra (slika 26) vrši se prema promjeni težine ili volumena biljnog tkiva kao i promjene koncentracije otopine u koju je tkivo potopljeno. Refraktometar Cilj Odrediti silu usvajanja vode biljnog materijala pomoću refraktometra.2 do 1.1. Nakon 30 minuta utvrđuje se koncentracija otopina saharoze u kojima je bilo biljno tkivo. Izotonične otopine su otopine čiji je osmotski potencijal.

a podaci za otopine s biljnim tkivom daju pravac broj 2. Iz sjecišta ovih pravaca se spuštanjem okomice na apscisu očitava koncentracija (c) izotonične otopine saharoze. za elektrolite > 1.3 12.0 M) a na ordinatu % suhe tvari otopine.6 0. DDP se računa prema izrazu: DDP= −R×T ×i ×c R [kPa dm3K-1mol-1] .izotonični koeficijent Van’t Hoffa (za neelektrolite = 1.6 18.5) 1. 8. 4.0 17. koncentracija saharoze [mol/dm3] 0.opća plinska konstanta (8. Na apscisu koordinatnog sustava se nanosi koncentracija saharoze (0. nakon uranjanja biljnog tkiva u seriju otopina saharoze (plavi pravac). a desno od sjecišta su otopine s višom početnom nego konačnom koncentracijom (hipertonične otopine) i u njima je došlo do pada koncentracije nakon potapanja biljnog tkiva zbog izlaska vode iz tkiva u okolnu otopinu. Unošenjem podataka za otopine bez biljnog tkiva i povezivanjem dobivenih točaka dobije se pravac broj 1.apsolutna temperatura (K = 273 + °C) c [mol dm -3] .molarne koncentracije saharoze. za NaCl i KCl = 1.3 30. primjer rezultata analize. 5.8 12. npr. 3.9 Na grafikonu je prikazan pravac % ST u seriji otopina saharoze bez biljnog tkiva (crveni pravac) i pravac % ST 30 min.314 kPa dm3K-1mol-1 .4 24.4 0.2 0. konstrukcije dijagrama i izračunavanja DDP: br.2-1.0 1.314 JK-1mol-1) T [K].8 1.koncentracija izotonične otopine saharoze i . tražena koncentracija se izračuna interpolacijom uz pomoć kalibracijskog dijagrama. nakon potapanja biljnog tkiva u otopine (očitanje refraktometrom) 6.4 26.285 mol/dm3).3 22. 64 .0 % ST 30 min. % ST u otopinama bez biljnog tkiva (očitanje refraktometrom) 6.2 mol/dm3) su hipotonične i u njima je došlo do povećanja koncentracije nakon potapanja tkiva u otopinu. Sve otopine saharoze s nižim početnim koncentracijama saharoze (lijevo od sjecišta: samo otopina 0. 2. Spuštanje okomice na X os iz sjecišta navedenih pravaca daje koncentraciju izotonične otopine (0.

2 28.2 i 0.6 18.8 1. % ST u otopinama bez biljnog tkiva (očitanje refraktometrom) 6.47 mol/dm3). koncentracija saharoze [mol/dm3] 0.0 izotonična otopina hipertonične otopine (c) otopina saharoze nakon 3/4 h Izračunavanje DDP za tkivo gomolja krumpira (temperatura pri analizi je bila 18°C): DDP = . 4. 2. a desno od sjecišta su otopine s višom početnom nego konačnom koncentracijom (hipertonične otopine) i u njima je došlo do pada koncentracije nakon potapanja biljnog tkiva zbog izlaska vode iz tkiva u okolnu otopinu. Spuštanje okomice na X os iz sjecišta navedenih pravaca daje koncentraciju izotonične otopine (0.314 [kPa dm3 K-1mol-1]× 291[K] × 1 × 0.4 Na grafikonu je prikazan pravac % ST u seriji otopina saharoze bez biljnog tkiva (crveni pravac) i pravac % ST 30 min. nakon potapanja biljnog tkiva u otopine (očitanje refraktometrom) 7.35 hipotonična otopina 30 25 % ST 20 15 10 5 0 0.4 mol/dm3) su hipotonične i u njima je došlo do povećanja koncentracije nakon potapanja tkiva u otopinu. 5.4 0. konstrukcije dijagrama i izračunavanja DDP: br.2 0.3 12.2 0. primjer rezultata analize.5 kPa 2.4 24.8 18.0 1.3 30.0 23.8 1.285 0.689.6 0. 3.6 0.6 12. Sve otopine saharoze s nižim početnim koncentracijama saharoze (lijevo od sjecišta: otopine 0.4 0. nakon uranjanja biljnog tkiva u seriju otopina saharoze (plavi pravac).8.0 % ST 30 min. 65 .285 [mol dm-3]= .

2 0.30 25 % ST 20 15 10 5 0 0.0 (c) otopina saharoze nakon 1/2 h Izračunavanje DDP za tkivo gomolja krumpira (temperatura pri analizi je bila 18°C): DDP = .1137.1 kPa 66 .8.4 hipotonične otopine izotonična otopina 35 hipertonične otopine 0.8 1.314 [kPa dm3 K-1mol-1] × 291[K] × 1 × 0.47 [mol dm-3] = .47 0.6 0.

2 0. nakon potapanja biljnog tkiva u otopine 67 . 3.6 0.4 0.Rezultati br. 1. koncentracija saharoze [mol/dm3] 0.0 % ST u otopinama bez biljnog tkiva % ST 30 min. 2. 5.8 1. 4.

u mraku: Konačna masa lista nakon 2 h: g Intenzitet evapotranspiracije: % Početna masa lista na 25oC. u mraku: Konačna masa lista nakon 2 h: g Intenzitet evapotranspiracije: % g Početna masa lista na 25oC. Ovisno o kemijskom sastavu kutikule. odnosno mraka. koja predstavlja gubitak vode evapotranspiracijom. Evapotranspiracija se izrazi kao postotna razlika u masi lista. klima komora biljni materijal: list neke zeljaste bijke (salata. Rezultati List zeljaste biljke Početna masa lista na 15oC. slika 27. list bršljana Način izvođenja vježbe Vaganjem se utvrdi svježa masa lista. Cilj Utvrditi prosječni gubitak vode iz lista zeljastih biljaka u određenom vremenskom periodu. Voda u obliku vodene pare izlazi iz lista najvećim dijelom kroz puči (stomatalna transpiracija). ali i evaporacijom s površine. ponovnim vaganjem utvrdi se razlika u masi lista. Nakon određenog perioda (npr.4. kupus). Vaganje lista g g 68 . 30oC). 25. na svjetlu: Konačna masa lista: g Intenzitet evapotranspiracije: % g Slika 27. Materijal pribor i oprema: laboratorijska vaga. biljne vrste se značajno razlikuju po intenzitetu gubitka vode evaporacijom (kutikularna transpiracija). ODREĐIVANJE EVAPOTRANSPIRACIJE LISTA Uvod u vježbu Gubitak vode iz zeljastih biljnih dijelova značajno ovisi o temperaturi sredine i uvjetima osvjetljenosti. List se izloži djelovanju različitih temperaturnih tretmana (15.2. kao i utjecaju svijetlosti. na svjetlu: Konačna masa lista: g Intenzitet evapotranspiracije: % List bršljana Početna masa lista na 15oC. 2 h). nakon prolaska kroz kutikulu.

Zbog čega se javlja razlika u intenzitetu evapotranspiracije lista zeljaste biljke i bršljana? 69 .

koji s amino i imino grupama aminokiselina daje crvenkasto obojenje čiji intenzitet ovisi o koncentraciji prolina se mjeri spektrofotometrijski na 520 nm nakon odvajanja prolin-ninhidrin kompleksa (Ruheman's purple) toluenom. http://commons.png ) Akumulira se u citoplazmi gdje u stresnim uvjetima može činiti i više od 80% slobodnih aminokiselina. tučak. Cilj Odrediti sadržaj aminokiseline prolin u biljnom materijalu. filter-papir Whatman br. posuda za inkubaciju na kupelji ili sušionik za suhu inkubaciju biljni materijal: 0. ODREĐIVANJE SADRŽAJA PROLINA Uvod u vježbu Jedna od najčešćih reakcija živih organizama na vodni deficit je stvaranje i akumulacija osmotski aktivnih neutralnih organskih spojeva kao što su šećeri i neke aminokiseline (prolin. špatula. plastične epruvete sa čepovima. Strukturna formula prolina vrste stresa. slijedi reakcija s ninhidrinom. Otpornost genotipova prema stresnim uvjetima može se ocijeniti prema sposobnosti akumulacije slobodnog prolina. Materijal pribor i oprema: tarionik. stoga ovakvi spojevi imaju važnu ulogu u adaptaciji citoplazme na različite Slika 28. toluen. spajanjem ninhidrina i aminokiselina 70 . s koncentracijom i do 200 mM. 2. staklene epruvete. ninhidrin aminokiselina Ruheman's purple Slika 29.4.3. Povećanje koncentracije osmolita omogućuje da se iz vanjske sredine usvoji dodatna količina vode a osim toga kompatibilni osmoliti stabiliziraju strukturu proteina. slika 28).5 g biljnog tkiva reagensi: sulfosalicilna kiselina. slika 29. ninhidrin reagens. lijevci.org/wiki/F ile:(S)-Prolin. čime značajno doprinosi osmotskoj regulaciji citoplazme. Prolin štiti membrane i proteine od (preuzeto s štetnog djelovanja visokih koncentracija anorganskih iona i temperaturnih ekstrema. osnovni standard prolina Način izvođenja vježbe Ekstrakcija prolina iz stanica vrši se pomoću sulfosalicilne kiseline. kvarcni pijesak. Prikaz nastanka kompleksa Ruhenan’s purple koji daje specifično crvenkasto obojenje.wikimedia.

standarda + 1.0 konc: 0 0. vode 20 µg prolina /2 mL Formula za preračuna sadržaja prolina na svježu tvar biljke: Sadržaj prolina ( µg/gS SvT) = 5* X odvaga uzorka u g X [µg prolina/2 mL] .6 1. uz vorteksiranje 15-20 s.0 mL dest.2 1. Radni standardi: .8 1.5 g biljnog materijala se homogenizira s 10 mL sulfosalicilne kiseline uz dodatak kvarcnog pijeska (na vrh noža) i profiltrira kroz filter papir Whatman br 2 u staklenu epruvetu.conc. Otpipetira se 2 mL filtrata u plastičnu epruvetu i doda 2 mL ninhidrin reagensa i 2mL ledene octene kiseline.6 8 0.0 mL razr. automatskom pipetom se pipetira toluenski sloj s ekstrahiranim prolinom u kivetu za spektrofotometar. osn.4 1. Standardi se rade paralelno sa uzorcima.8 4 0.0 2. od toga 2 mL uzeto za određivanje) Rezultati 71 . prolina s kalibracijskog dijagrama (conc. Mjeri se transmisija na 520 nm uz podešavanje 0 čistim toluenom a 100% transmisije s a standardom 0.u 6 epruveta otpipetira se: 0.0.2 16 1.4 12 0.razrjeđenje pri ekstrakciji (1 g uzorka u 10 mL sulfosalicilne kiseline. Ekstrahirati prolin dodavanjem po 4 mL toluena. standarda µg prolina/2 mL) 5 . dodavanjem ninhidrina i octene kiseline. Nakon što se epruvete zagriju na sobnu temperaturu i odvoji toluenski sloj. Inkubacija se vrši na 1000C 1 h. te se nakon inkubacije reakcija prekida prenošenjem epruveta na led.

4. Cilj Odrediti koncentraciju C vitamina (askorbinske kiseline) u biljnom materijalu Materijal pribor i oprema: digitalni titrator. AK (askorbinska kiselina). lijevci. Kada se pri titraciji AK ekstrahirane iz biljnog tkiva metafosfornom kiselinom dodaje DCIP.4. koja inaktivira prisutnu oksidazu u stanicama. stoga se ekstrakcija AK iz tkiva vrši pomoću metafosforne kiseline. AK ga reducira u bezbojni oblik pri čemu se sama oksidira do DHAK (dehidroaskorbinska kiselina. Daljnjim dodavanjem DCIP otopina ostaje ružičasta što označava kraj titracije. 1 mL otopine askorbinske kiseline (AK) titrira se sa DCIP (diklorofenolindofenol). filter-papir. U prisustvu enzima oksidaze askorbinske kiseline dolazi do oksidacije AK u DHAK (dehidroaskorbinsku kiselinu). Erlenmeyer tikvica 200 mL biljni materijal: plod paprike reagensi: DCIP (2.6-diklorofenol-indofenol) ima plavu boju u alkalnoj a ružičastu u kiseloj sredini. tarionik. tučak. Predstavlja značajan reducens I poznato je da štiti klorofile od oksidativne fotodestrukcije kisikom koji se oslobađa fotolizom vode. AK se prevodi u DHAK (slika 30). metafosforna kiselina Način izvođenja vježbe Reagens DCIP (2. ODREĐIVANJE SADRŽAJA VITAMINA C Uvod u vježbu Askorbinska kiselina (C vitamin) se nalazi u različitim tkivima biljaka. Također sudjeluje u zaštiti stanica od oksidacijskog stresa uzrokovanog prisustvom slobodnih kisiskovih radikala. Strukturne formule askorbinske kiseline (lijevo) i dehidroaskorbinske kiseline (desno) 72 . a otopina ostaje bezbojna sve dok se ne potroši sva količina AK u uzorku. Količina utrošenog DCIP preračunava se na mg AK/100 g uzorka.6-diklorofenol-indofenol). profiltrirati i 5 mL ekstrakta titrirati s DCIP. Prema tome. Slika 30. Pri titraciji ružičasta boja treba ostati 15 s. slika 30). 1 g tkiva izmacerirati s metafosfornom kiselinom.

faktor DCIP = 4mgAK mL DCIP Izračun sadržaja vitamina C se dobije prema sljedećoj jednadžbi: Sadržaj C vit (mg AK/100 g uzorka) = mg AK u alikvotu x Faktor DCIP x 2 x 100 Rezultati 73 .

4. Nakon 20-ak minuta zamrzavanja. Međutim. epruvete. Preparati se vade iz otopine (ili se otopina filtrira kroz filter papir) i promatraju morfološke promjene stanica i promjene u boji tkiva i otopine. ili naglo spuštanje temperatura ispod 0°C imaju za posljedicu narušavanje vodnog režima biljke. koji specifično bojaju otopinu u koju je biljno tkivo potopljeno. a mogu se pojaviti i mehanička oštećenja membrana kristalićima leda. neke biljke bez većih posljedica na kasniji rast i razvoj mogu prezimiti i puno niže temperature zraka. Sadržaj otopine u epruvetama zamrzava se pomoću smjese za hlađenje na temperaturi oko -20°C. Bitno je da sloj odrezanih stanica bude što tanji. tikvice od 100 mL.5. Skalpelom ili žiletom se odreže površinski sloj stanica lista crvenog kupusa ili lisne drške cikle. gumeni čepovi. Cilj Dokazati da šećeri štite stanicu od pucanja membrana biljnog tkiva izloženog djelovanju niskih temperatura. Dugotrajno djelovanje niskih temperatura. narušavanje proteinsko pigmentskih struktura. (oko 25 mm2). Materijal pribor i oprema: skalpel.5 M otopine saharoze. narušavanje staničnih fizioloških procesa. Biljni organizam koji nepripremljen ulazi u hladan period tokom rasta. smjesa za hlađenje (led u koji se dodaje 33g NaCl na 100 g leda ili 59 g NaNO3 na 100 g leda) Način izvođenja vježbe Pripremi se 100 mL 1 M i 0.5 M ili 1. Priređeni preparati stave se u tri epruvete napunjene s 8 mL destilirane vode. ZAŠTITNO DJELOVANJE ŠEĆERA PRI NISKIM TEMPERATURAMA Uvod u vježbu Na temperaturama ispod 0°C životna aktivnost je jako umanjena te prestaje na oko -10°C.5 M i 1 M otopina saharoze. Građa protoplazme narušava se djelovanjem niskih temperatura te iz staničnog soka obojenih biljnih tkiva izlaze pigmenti. pinceta biljni materijal: list crvenog kupusa ili lisna drška cikle reagensi: 0.0 M otopinom saharoze i zatvore čepovima. često zbog navedenih posljedica smrzavanja odumire ili se narušavanje fiziološko-biokemijskih procesa odražava na kasnije etape rasta i razvoja. 74 . epruvete se stave u posudu s vodom gdje se otapa zaleđeni sadržaj epruveta. odnosno 0.

manifestira zaštitna uloga šećer 75 . a koji se odnose na usvajanje i otpuštanje vode. Potrebno je zaključiti preko kojih se staničnih fizioloških procesa. smrzavanju.Rezultati i zaključak Detaljno opiši morfološke i fiziološke promjene koje su se dogodile na ispitivanim uzorcima uslijed izloženosti niskim temperaturama tj.

nitrit ili elementarna živa) pri čemu nastaje voda: supstrat + 2H2O2 → oksidirani supstrat + 2H2O Velika važnost brze katalize vodikova peroksida potrebna je stoga jer je on snažan i jako reaktivan oksidans koji može oštetiti biološke molekule i time uzrokovati metaboličke poremećaje. Unutar stanice katalaze ima dosta u peroksisomima i katalitički je vrlo aktivna. katalaznu i peroksidaznu.6. fotosustav II. ciklus limunske kiseline.ref) 76 . AKTIVNOST ENZIMA KATALAZE Uvod u vježbu Katalaza (EC 1. Slika 31. životinjama i aerobnim mikroorganizmima gdje katalizira brzu razgradnju vodikova peroksida. formaldehid. Ślesak et al. etanol. superoksid dismutaza.4.1. PSI. CLK. NADPH oksidaza i razne aminokiselinske oksidaze. SOD. Vodikov peroksid nastaje kao produkt u mnogim reakcijama procesa fotosinteze i staničnog disanja (slika 31). molekulske mase od 54 do 59 kDa te sadrže hem kao prostetičku skupinu.6. Biljne su katalaze tetramerni enzimi. Ovaj enzim pokazuje dvojnu katalitičku aktivnost. PSII. H2O2:H2O2 oksidoreduktaza) je enzim pronađen u biljkama. Pri katalaznoj aktivnosti enzim katalizira razgradnju vodikova peroksid na vodu i kisik: 2H2O2 → 2H2O + O2 dok pri peroksidaznoj aktivnosti enzim katalizira oksidaciju supstrata (metanol. fotosustav I. Glavni izvori vodikova peroksida tijekom fotosinteze u C3 biljkama. ( Preuzeto iz I. a javlja se i kao produkt djelovanja oksidaza kao što su primjerice glukoza oksidaza.11.

Ispitati kako vrijeme inkubacije utječe na aktivnost enzima.Određivanja aktivnosti katalaze Aktivnost katalaze određuje se u inkubacijskoj smjesi sastavljenoj od pufera.volumen enzimskog ekstrakta u mililitrima 50 – µmoli vodikova peroksida ekvivalentni s 1 mL 0. centrifuga biljni materijal: gomolj krumpira reagensi: 0. ribež. 5H2O2 + 2KMnO4 + 4H2SO4 → 2MnSO4 + 2KHSO4 + 5O2 + 8H2O (1) (2) (3) (VS-VP) x 50 [µmol] (VS-VP) x 50 / t x 10 [µmol min-1 mL-1] VP [mL] . filter-papir.05M fosfatnom puferu (pH = 7. koristeći formulu (2) dobiva se količina vodikova peroksida koji je tijekom inkubacije razgrađen katalazom.5 %-tna otopina H2O2 u 0. supstrata i enzimskog ekstrakta. 5 i 10 mL. gaza. Preko utroška otopine kalijeva permanganata za titraciju slijepe probe i probe. Prirediti enzimski ekstrakt i inkubacijske smjese te izračunati aktivnost katalaze.0) 77 . laboratorijska čaša od 500mL. a koristeći formulu (3) dobiva se aktivnost katalaze izražena kao količina razgrađenog vodikova peroksida po jedinici vremena i volumena enzimskog ekstrakta.volumen utrošenog KMnO4 za titraciju slijepe probe (S) t [min] . Uz svaki uzorak-probu radi se slijepa proba koja sadrži pufer i enzimski ekstrakt koji je prethodno zagrijan do ključanja. 0. Materijal pribor i oprema: 8 Erlenmeyerovih tikvica. ekstrakt katalaze iz biljnog tkiva (gomolj krumpira).vrijeme inkubacije u minutama 10 [mL] . Nakon prekida inkubacije vodikov peroksid koji nije izreagirao titrira se sa standardnom otopinom kalijeva permanganata (1).0). kuhinjski nož.02 M KMnO4 Cilj Upoznati se s metodom određivanja aktivnosti katalaze. Inkubacija se vrši pri sobnoj temperaturi u vremenu do 30 minuta nakon čega se reakcija prekida. sat. 0. pipete od 1.02 M otopina KMnO4.05M otopina fosfatnog pufera (pH = 7.volumen utrošenog KMnO4 za titraciju probe (P) VS [mL] . 5 %-tna otopina H2SO4.

Određivanje aktivnosti Pripremiti uzorke prema tablici 6. 2. Priprema enzimskog ekstrakta Odvagati 100 grama gomolja krumpira. 10 minuta na 4°C. Izračunati količinu razgrađenog vodikova peroksida.5 %-tna otopina H2O2 Inkubacija 22oC (min) Nakon proteklog vremena inkubacije. 78 . Nakon ekstrakcije. Dobiveni filtrat (sirovi enzimski ekstrakt) koristiti za određivanje aktivnost katalaze. Ovako pripremljen homogenat ostaviti u hladnjaku 30 minuta. Dobiveni sadržaj potom titrirati otopinom KMnO4 do nastanka svijetlo ljubičaste boje titrirane otopine. 3. Prikaz redosljeda dodavanja i količine reagensa u uzorak Uzorak Reagensi (mL) S1 10 10 5 (5) P1 10 10 5 S2 10 10 5 (10) P2 10 10 5 S3 10 10 5 (15) P3 10 10 5 S4 10 10 5 (30) P4 10 10 5 0. Utječe li vremenski tijek reakcije na aktivnost katalaze? Objasnite. u tikvicu s uzorkom odmah dodati 5 mL 5% otopine H2SO4 i promućkati.Način izvođenja vježbe 1. 2.05M fosfatni pufer Enzimski ekstrakt Prokuhani enzimski ekstrakt 0. nožem ili pomoću ribeža usitniti ga na manje komade i prenijeti u laboratorijska čašu. Što je specifična enzimska aktivnost? Možete li je izraziti za katalazu u našem slučaju. sadržaj procijediti preko gaze i profiltrirati kroz filter papir ili centrifugirati pri 5000 G. Problemski zadaci: 1. Tablica 6. 4. a aktivnost katalaze izraziti kao količinu razgrađenog vodikova peroksida po jedinici vremena i volumena enzimskog ekstrakta. Koja je uloga fosfatnog pufera u inkubacijskoj smjesi ? Gubi li katalaza svoju aktivnost zagrijavanjem ? Kako bi ste dobili aktivnost katalaze izraženu u količini razgrađenog vodikova peroksida po gramu biljnog materijala? 5. Usitnjeni materijal homogenizirati miješanjem uz dodatak 100 mL hladnog fosfatnog pufera. Za potrebe slijepe probe 50 mL enzimskog ekstrakta zagrijati do ključanja i ohladiti na sobnu temperaturu prije upotrebe.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful