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Introducción: las enzimas so proteínas que tienen como función catalizar todas las

reacciones químicas que ocurren dentro de un organismos vivos, los procesos a evaluar serán la determinación de concentración de proteínas, Purificación de una enzima, actividad enzimática y actividad específica, las cuales revelara el funcionamiento y comportamiento frente a factores externos. Tubo 1 2 3 4 5 Albumina de bovino 0 µL 50 µL 100 µL 150 µL 200 µL agua 2000µL (2mL) 1950µL (1,95mL) 1900µL (1,9mL) 1850µL (1,85mL) 1800µL (1,8 mL) Reactivo Bradford 500µL 500µL 500µL 500µL 500µL

Extracción de αamilasas: Tras la

obtención de semillas de cebas ya pesadas, prosigue la homogeneización del tejido con mortero y 1,0 mL de buffer, trasladar a tubo sppendorf y centrifugar por 5 min. El sobrenadante se trasvasija a otro tubo de la misma naturaleza y se calienta a 55°C por 5 min. , se centrifuga nuevamente y tras trasvasijar se deja en hielo para ser utilizado

mas adelante, obteniendo el almidón.

Determinación de concentración de proteínas.: El método utilizado para determinar la concentración de proteínas fue el método de Bradford. Para esto es necesario obtener la curva de calibración midiendo la absorbencia de una serie de soluciones de concentraciones conocidas ( 0, 2, 4, 6 y 8 µg) de una proteína de albumina de bovino, las cuales se amplificaron por 2,5 para luego determinar la cantidad de rectivo de Bradford y agua como se muestra en la siguiente tabla:

Tubo 1 2 3 4 5

µg/mL de albumina de bovino 0 2 4 6 8

Absorbencia a 595nm 0 0,088 0,178 0,278 0,423 Una vez preparados los tubos, se lee la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda de 595 nm. La absorbancia obtenida en el tubo blanco debe ser restada a cada uno de los tubos restantes, (tubo blanco

absorbancia igual a cero) obteniendo los siguientes valores:

En este gráfico se aprecia una curva notablemente creciente.61 7 0. × 1X min×1X mL.0994 µg de almidonminx gpf 190. (1.655 5 0.48 1351.57 mggpf Medición de La actividad enzimática.691 1.4016 2230.61 7 0. es posible realizar una curva de calibración de proteína (gráfico A595 vs µ g/mL).69 mgmL La concentración expresada por gramo de peso es: mg proteinagpf=AA595nm p× FdXml× 11000×volúmen totalgpf→0. → 1.720 – 0.049×10.630 0.899 1.4336 4375.09940.00125A620 nm final). × 1X min×1X mL×volumen .228 5 0.061 5 0.312≅1.×15 min×1 0.466 --------1.48 2786.266 1. mayor color desarrollado y por lo tanto mayor absorbancia.69mgmL×0.618 0.1536 2122.88 1420. A620 nm inicial= 1.309 1.622 0.490.619 0.05mL µg de almidon =min×gpf(A620 nm inicial-PA620 nm final).690 1.680.68 Por lo tanto µg de almidon =minx mL . Pero estaproporcionalidad es sólo lineal hasta un cierto límite de concentración Para La determinación de La concentracion de proteínas de muestras conocidas se utiliza La siguiente ecuación: mg proteinaml=AA595nm p× FdXml× 11000 → 0.1376 µg de almidonminx mL 0° 20° 50° 70° 90° 121.617 1.322 µg de almidon =minx mL(A620 nm inicial-PA620 nm final). lo cual demuestra que a mayor cantidad de proteína .02×11000 = 0. Temperatura (°C) 0° 20° 50° 70° 90° B1 B2 M1 M2 Afina l 1.240 1.256 0.28 1124.6206= 1.720Donde promedio de blancos.62 8 0.677 0.748 0.61 9 0.61 9 0.4096 1765.Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la cantidad de proteínas que contienen.

88µg de almidonminx mL0. × 15min×10. Actividad especifica actividad enzimatica a t° optimaconcentración de proteina = 2786. la actividad enzimática.05 mL×0.490. donde a la temperatura de 50 grados Celsius.312 . Se se demuestra que a mayor proteína mayor absorvancia gracias a gráficos y cálculos . . Variación de la actividad enzimática en función de la temperatura En este gráfico da a conocer trás los datos entregados em las tablas anteriores.totalgpf→(A620 nm inicial-PA620 nm final). la enzima alcanza su máxima actividad denominada “temperatura optima”.69mgmL= 4038.956 µg de almidonminx mg Discusión : la Cuantificación de proteínas ocupando técnicas espectroscópicas como el método Bradford son de mucha utilidad tanto para demostraciones teóricas como para comparación con otros estudios o variaciones de condiciones.La actividad enzimática es muy sensible a condiciones experimentales de temperatura.