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Tema 1: Mecanismos de Transducción de Señales por receptores de Membrana

TEMA 1
Mecanismos de Transducción de señales por receptores de membrana
1.1. Comunicación Celular El primer punto importante cuando se aborda el estudio de la transducción señales es la comunicación celular, la cual es necesaria para regular y coordinar las distintas funciones fisiológicas. Las células se comunican por sustancias químicas llamadas men-sajeros primarios, los cuales, de forma general, pueden agruparse en cuatro tipos principales: - Neurotransmisores.- Moléculas de señalización utilizadas por el Sistema Nervioso para comunicar entre si sus distintas estructuras o comunicarse con los órganos periféricos. - Hormonas.- Moléculas de señalización, formadas por las glándulas endocrinas que regulan la casi totalidad de las funciones fisiológicas ejercidas por los distintos órganos. - Factores de Crecimiento.- Moléculas de señalización por lo general asociadas al control de la proliferación, diferenciación y la muerte celular. - Citoquinas.- Moléculas de señalización implicadas en el control de la inmunidad del organismo frente a agentes extraños (virus, bacterias, parásitos) o propios (cáncer). Esta agrupación de señales por tipos tiene más un valor formativo que real, ya que las funciones fisiológicas humanas normalmente implican a distintas señales englobadas en los apartados anteriores. Un ejemplo ilustrativo lo constituye el ciclo ovulatorio. En la pubertad, el sistema nervioso central recoge informaciones del organismo, transmitidas por descargas hormonales, de factores de crecimiento y citoquinas, que quedan recogidas por el “Gonadostato”, estructura implicada en la regulación del comienzo y posterior continuidad del ciclo ovárico. El acumulo de información en el gonadostato, en un momento dado del desarrollo, es tal que provoca la activación de determinadas vías de neurotransmisión que confluyen en el Hipotálamo y activan la síntesis y secreción de factores estimulantes del ciclo (entre ellos, LHRH, Hormona Liberadora de LH). Estas sustancias llegan a la Hipófisis, donde activan la secreción de hormonas tales como LH (Hormona Luteinizante) y FSH (Hormona Estimulante de Folículos). Las hormonas hipofisarias estimularán en el ovario la maduración de ciertos folículos, lo cual implica la síntesis de estrógenos y progestágenos, de factores de crecimiento y ciertas citoquinas. Estas sustancias ejercen dos efectos fundamentales. Por un lado, provocan la maduración de un único folículo y la atresia del resto (procesos de proliferación,

diferenciación y muerte), así como la proliferación del endometrio para hacerle receptivo al oocito, en caso de fecundación, y, por otro, envían señales a las estructuras anteriores (SNC, hipotálamo e hipófisis), las cuales son integradas en su conjunto, regulando la secreción de las señales implicadas con el fin de asegurarse la culminación perfecta del ciclo ovárico. Si no hay fecundación, la suma de concentraciones de neurotransmisores, hormonas, factores de crecimiento y citoquinas, disparan otra serie de procesos como la involución del endometrio (apoptosis) y el comienzo de un nuevo ciclo ovárico. Los limites que definen a los distintos tipos de señales a veces no están demasiado claros, ya que se conocen ejemplos de sustancias neurotransmisoras que pueden actuar como hormonas (dependiendo de la concentración y de la célula diana). De igual forma, algunas hormonas en ocasiones se comportan como factores de crecimiento. 1.1.1. Tipos de Comunicación Intercelular. Tradicionalmente, basándose en la distancia que ha de recorrer el mensajero primario para ejercer su efecto en la célula diana, se han distinguido tres tipos generales de comunicación: - Señalización endocrina.- Las señales (usualmente hormonas) deben de recorrer distancias considerables (hasta más de 1 m) para actuar sobre la célula diana y normalmente son transportadas por la sangre. Dada la dilución que sufre la hormona en el sistema sanguíneo necesita que las moléculas receptoras presenten una elevada afinidad por estas. - Señalización paracrina.- Las señales liberadas por una célula afectan a células en su proximidad (menos de 1 µm). La conducción de un impulso eléctrico desde una neurona a otra neurona o a una célula muscular es un ejemplo de señalización paracrina. Dada la elevada concentración de neurotransmisor que se consigue en este tipo de señalización, la afinidad de las moléculas receptoras no necesita ser muy elevada. - Señalización autocrina.- En este caso, la célula responde a sustancias liberadas por ella misma. La mayoría de los factores de crecimiento actúan de esta forma o de forma paracrina, para estimular el crecimiento y la proliferación celular. Las células tumorales en muchos casos producen factores de crecimiento que, de forma descontrolada, promueven el crecimiento de la masa tumoral. Además de estos tipos generales de comunicación, las células pueden recibir señales del medio extracelular por dos tipos más de mecanismos: - Señalización Yuxtacrina o comunicación CélulaCélula. Son mecanismos bastante importantes de comunicación. En general, están mediados por proteínas de membrana plasmática de una célula que son reconocidas por proteínas receptoras de otra célula. La interacción de la proteína ligando con la

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proteína receptora dispara ciertas vías de señalización en la célula diana. Ejemplos de este mecanismo se dan en células del sistema inmune (adhesión de leucocitos, reconocimiento por células T citotóxicas de células infectadas, etc.). Otro mecanismo importante de resaltar en la comunicación intercelular es la existencia de “Gap Junctions” entre células vecinas. La estructura Gap Junction comunica los citoplasmas de células vecinas, mediante el establecimiento de “poros”, permitiendo el intercambio de metabolitos de pequeño peso molecular (usualmente no mayores de 1kd), incluyendo a la mayoría de segundos mensajeros. - Comunicación Célula-Matriz Extracelular. Son mecanismos de comunicación que permiten la adhesión de las células a las proteínas extracelulares de la matriz extracelular (fibronectina, laminina, colágenos, etc.). Es un mecanismo crucial para el modelado (desarrollo) o remodelado (tras algún tipo de lesión) de los órganos. Finalmente, en los últimos años, se han puesto de manifiesto diversos ejemplos de señalización que se engloban dentro del término de Señalización Intracrina. En este caso, un metabolito originado en la célula puede disparar vías de señalización en la propia célula sin necesidad de salir al exterior. Un ejemplo válido lo constituye la regulación de la biosíntesis del colesterol. Cuando las concentraciones de colesterol endógenas son muy elevadas, esta molécula es capaz de activar un represor transcripcional que inhibe la transcripción de los genes implicados en la biosíntesis de novo del colesterol. 1.2. Tipos de Receptores. Para que una molécula señal sea reconocida por la célula diana se necesita de la presencia de una molécula receptora que pueda modificar su actividad biológica al interaccionar con la señal. Las moléculas receptoras o Receptores se clasifican en dos tipos principales, dependiendo de la naturaleza química del ligando o señal. Así, si la señal o Ligando es de naturaleza liposoluble podrá atravesar la membrana plasmática sin mucha dificultad e interaccionar con sus receptores intracelulares. La interacción posibilita la activación del receptor y la posterior regulación de la expresión génica de un grupo determinado de genes. A estos receptores se les denomina Receptores Nucleares (ya que muchos presentan dicha localización) o Receptores Intracelulares, los cuales serán objeto de estudio en el tema 2. Por el contrario, si la señal es de naturaleza hidrosoluble, dado que no podrá atravesar la membrana plasmática, necesita de la existencia de receptores asociados a la membrana plasmática. La activación del receptor por el ligando promueve, en la mayoría de los casos, la formación de moléculas transductoras de la señal que reciben el nombre de

Segundos Mensajeros. Estas moléculas son las responsables de activar los procesos biológicos en las células diana mediante la activación de rutas de transducción específicas que, en último término, también modificaran la expresión de grupos de genes. A este tipo de receptores se les denomina Receptores de Membrana Plasmática, siendo objeto de este tema su estudio así como las rutas de transducción generadas por ellos. Los receptores de membrana se han agrupado en cuatro tipos generales (Figura 1.1): - Receptores Ionotrópicos.- La unión del ligando cambia la conformación del receptor de modo que permite el flujo de un determinado ion a través del receptor. El movimiento iónico resultante altera el potencial eléctrico de la membrana celular. Un ejemplo lo constituye el receptor de acetilcolina en la placa motora. - Receptores metabotrópicos.- También conocidos como receptores asociados a proteínas G o receptores Serpentínicos. Estos receptores están asociados a proteínas G. La unión del ligando activa a una proteína G, la cual a su vez activa o inhibe a una determinada enzima que genera un segundo mensajero, o bien modula la actividad de un canal iónico, causando un cambio en el potencial de membrana. Ejemplos de señales que actúan a través de este tipo de receptores son epinefrina, serotonina y glucagón.

Figura 1.1. Tipos de receptores en la señalización celular.

- Receptores con actividad enzimática intrínseca.- Como su nombre indica, la activación del receptor por el ligando propicia que el receptor muestre una actividad enzimática. Este grupo engloba a receptores con distintas actividades enzimáticas. Así por ejemplo, el factor natriurético atrial al interaccionar con su receptor activa su

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actividad guanilato ciclasa, la activación del receptor de leucocitos CD45 activa su actividad tirosina fosfatasa, la activación de los receptores de insulina y de muchos factores de crecimiento provoca la aparición de actividades tirosina quinasa (insulina, factor de crecimiento epidérmico) o serina/treonina quinasa (factor de crecimiento transformante tipo ß). - Receptores asociados a tirosin-quinasas citosólicas.También conocidos como superfamilia de receptores de citoquinas. Estos receptores carecen de actividad catalítica pero se asocian directamente, tras su activación, con proteínas citosólicas que tienen actividad tirosina quinasa. Ejemplos de señales que interaccionan con este tipo de receptores son prolactina y hormona del crecimiento (hormonas), la mayoría de citoquinas e interferones y ciertos factores de crecimiento (eritropoyetina). 1.3 Tiempo de Respuesta de Receptores. Una característica que conviene destacar en este punto es la rapidez o lentitud de los distintos receptores en generar una respuesta biológica precisa. Los receptores ionotrópicos se activan por ligando permitiendo el flujo de iones a favor de un gradiente de concentración. Esta respuesta que provoca cambios en el potencial de membrana puede observarse en ms después de la activación del receptor. Por otra parte, algunos segundos mensajeros, generados por receptores metabotrópicos, pueden modular canales iónicos. Dado que se requieren varios eventos (activación del receptor, interacción con proteínas G del receptor para su activación e interacción de la proteína G con el canal que va a modular) el cambio en potencial de membrana tarda más tiempo en producirse, por lo general varios segundos. La mayoría de receptores metabotrópicos y con actividad enzimática intrínseca a través de sus rutas de transducción modulan positiva o negativamente las actividades de enzimas citosólicas, pudiéndose observar dichas modulaciones tras varios minutos (entre 2 y 15) de la adición del factor. Finalmente, las rutas de transducción de la mayoría de los receptores (sean de membrana o intracelulares) modifican la actividad transcripcional de proteínas nucleares implicadas en la síntesis de ARNm específicos, en el primer caso de una forma indirecta y en el segundo de una forma directa.. En estos casos la cadena de eventos es aún mayor por lo que los efectos biológicos tardan en observarse varias horas. 1.4. Receptores Ionotrópicos Como se han definido anteriormente, la unión del ligando al receptor (canal) origina un cambio en la estructura de este que permite el flujo a favor de gradiente de iones específicos. La estructura prototipo de los receptores ionotrópicos queda

esquematizada en la figura 2.1. Estos receptores están formados por cinco subunidades proteicas que se disponen integradas en la membrana plasmática formando una estructura de anillo, quedando situado el “poro” iónico en el centro de dicha estructura.

Figura 1.2. Esquema de receptor ionotrópico.

Además del sitio de unión con el ligando, estos receptores, suelen presentar dominios de regulación de la actividad del canal. Dichos dominios pueden presentarse orientados al exterior celular o al interior citosólico. Los primeros suelen ser regulados por otras señales químicas que modifican la estructura del canal regulando el flujo iónico. Los segundos, si bien presentan la misma función de regulación, normalmente, reflejan cambios en el estado de fosforilación del canal, lo cual depende del estado de funcionamiento de otras rutas de señalización. Por lo tanto, podemos distinguir dos etapas de señalización: la primera donde la unión del neurotransmisor provoca la apertura del canal y la segunda donde la acción de otras señales (otros neurotransmisores o rutas de señalización disparadas por hormonas) modula el flujo iónico a través de dicho canal, siendo un control mucho más fino de modulación. Es conveniente distinguir en este punto la existencia de dos tipos generales de canales iónicos: operados por ligando (el caso que nos ocupa) y operados por voltaje. Estos últimos, a diferencia de los primeros, no necesitan de la unión de un ligando para activarse sino que responden a cambios del potencial de membrana de la célula. Ejemplos de este tipo de canales lo constituyen los canales para Na+ y K+, presentes en los axones de las neuronas y que están implicados en la transmisión del impulso nervioso, o canales de Ca2 + implicados fundamentalmente en procesos de exocitosis. El hecho de que estos canales no necesiten de ligando para su

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activación no implica que no puedan ser modulados por mecanismos similares a los descritos para los receptores ionotrópicos. 1.5. Receptores ligados a Proteínas G Muchos receptores en su ruta de transducción activan a proteínas transductoras denominadas proteínas G, las cuales a su vez modulan positiva o negativamente la actividad de enzimas capaces de originar segundos mensajeros. Si bien estos receptores unen diferentes hormonas y median diferentes respuestas celulares, tienen una serie de características estructurales y funcionales comunes: a- La secuencia aminoacídica del receptor contiene siete segmentos en α-hélice formados por 22-24 residuos hidrofóbicos que están integrados en la membrana plasmática (figura 3). b- El lazo de residuos aminoacídicos entre las αhélices 5 y 6 y el extremo C-terminal del receptor, ambos en la parte citosólica del mismo, son importantes para las interacciones con las proteínas G.

proteína quinasa A (PKA) en su ruta de transducción. - Fosfolipasa C (PLC).- enzima generadora de Inositol trifosfato (IP3) y Diacilglicerol (DAG), los cuales son capaces de activar, respectivamente, a las proteína quinasa Ca-calmodulina (PK Ca-CaM) y a la proteína quinasa C (PKC) en su ruta de transducción. - Fosfolipasa A2 (PLA2 ).- enzima generadora de Acido araquidónico (AA), el cual es capaz de activar a la proteína quinasa C (PKC) en su ruta de transducción. Por otra parte, con respecto a la modulación de canales iónicos se ha visto que median la apertura de canales de K+ y de Ca2+ .
E. Extracelular AC Membrana PLC PLA2 Canal Iónico AMPc PKA IP3 PKCaCaM DAG PKC AA PKC

G E. Intracelular Receptor Prot. G

Efector

Figura 1.4 Activación de diversos efectores por proteínas G.

Figura 1.3. Esquema de receptor acoplado a proteínas G.

c- La proteína G transductora asociada con el receptor funciona como un interruptor molecular, presentando su estado inactivo cuando se encuentra unida a GDP. La unión del ligando al receptor causa la liberación del GDP de la proteína G y su intercambio por GTP, presentando ahora su estado activo. d- La proteína G activada (unida a GTP) interacciona y modula (activa o inhibe) a una enzima efectora, la cual cataliza la formación de un segundo mensajero, o bien modula la actividad de canales iónicos. f- La hidrólisis del GTP unido a la proteína G revierte a la proteína G a su estado inactivo. Se han caracterizado distintos tipos de enzimas efectoras capaces de ser activadas por proteínas G (figura 1.4): - Adenilato Ciclasa (AC).- enzima generadora de AMPciclico (AMPc), el cual es capaz de activar a la

1.5.1. Proteínas G Como hemos dicho anteriormente, las proteínas G actúan como transductores de la información generada en la unión del ligando al receptor y son capaces, dependiendo del tipo celular y del receptor específico) de poder modular la actividad de proteínas efectoras o canales iónicos. Las proteínas G reciben este nombre por su capacidad de intercambiar los nucleótidos GTP/GDP, modulándose así su actividad biológica. Estas proteínas forman una superfamilia en la que se pueden distinguir dos familias a su vez: la familia de las proteínas G heterotrímericas y la familia de proteínas G pequeñas, cuyo nombre hace alusión a su bajo peso molecular comparado con el de las anteriores. En este punto nos referiremos a las proteínas G heterotrímericas ya que son las que tienen capacidad de interaccionar con receptores activados. Las proteínas G pequeñas también pueden estar implicadas en rutas de transducción de señales, como es el caso de p21-RAS que estudiaremos más adelante. Otros ejemplos de proteínas G pequeñas lo constituyen G-Tu (factor de elongación en la síntesis de proteínas, o rab-3, proteína implicada en los procesos de exocitosis. Las proteínas G heterotrímericas, están formadas por las subunidades α, β y γ . Si bien en

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los últimos años se ha descrito la implicación de las subunidades β y γ en la transducción de algunas señales, la mayoría de la acciones descritas implican a la subunidad α. En el caso de las proteínas G heterotrímericas, la capacidad de interacción con los nucleótidos GTP o GDP reside en la subunidad α, presentando para ello un dominio de interacción con nucleótidos, que presenta también una actividad enzimática GTPasa; es decir, la subunidad α es capaz de forma intrínseca de hidrolizar el GTP a GDP, función esencial en el control de las rutas de transducción donde está implicada. Aparte del dominio de interacción con el GTP, pueden distinguirse otros tres dominios: el dominio de interacción con las subunidades β y γ , situado en el extremo N-terminal, el dominio de interacción con la enzima efectora o el canal, y el dominio de interacción con el complejo receptor-ligando, en su extremo C-terminal (Figura 1.5).

Figura 1.5. Esquema de los principales dominios de las subunidades α.

La clasificación de las proteínas G heterotrímericas se hace en función del tipo de subunidad α que presenten, ya que se conocen diversos tipos de subunidades α. Se considera que proceden de un gen ancestral común y, si bien presentan una elevada homología de secuencia, existen pequeñas diferencias que son las que originan su especificidad. Así, por ejemplo, las subunidades α de tipo αi y αo presentan deleciones en el extremo N-terminal, lo cual origina variaciones en la interacción con las subunidades β y γ . Las subunidades β y γ (tienen fundamentalmente la función de anclaje a la membrana y son de menor peso molecular, 36 y 10 kd, respectivamente. Como se ha mencionado anteriormente, existen muchas clases de proteínas G, pudiendo mediar efectos de señalización de algunos neurotransmisores (acetilcolina, norepinefrina, etc.), hormonas (glucagón, adrenalina, TSH, etc.) y ciertas citoquinas; en concreto, las quimoquinas, que son citoquinas implicadas en la atracción de células del sistema inmune al foco infeccioso, siendo un ejemplo la Interleuquina 8. Además de la transducción estas señales, las proteínas G están implicadas en la transducción de señales sensitivas,

como lo constituyen los casos de transmisión de impulsos visuales (αt), olfatorios (αollf) o del gusto (αg ). En la actualidad, las distintas proteínas G se han agrupado en cuatro familias que se nombran con un subíndice que indica la primera función por la que se caracterizaron. Estudios posteriores han probado que pueden realizar más de una función, dependiendo del tipo celular donde se expresen. Estas subfamilias son: Gs (estimula adenilato ciclasa), Gi (inhibe adenilato ciclasa), Gq (estimula PLC) y G 12, de función desconocida. Por otra parte, muchas de las subunidades α pueden ser modificadas covalentemente y de forma irreversible por toxinas bacterianas, lo cual afecta a la actividad de dichas subunidades. Concretamente, la toxina colérica causa la ADP-ribosilación de un resto de Arg del dominio de interacción con el GTP, lo que hace que la subunidad alterada pierda la capacidad de hidrolizar el GTP y, por lo tanto, que la subunidad αs se encuentre siempre en estado activo (fig. 1.5). Una consecuencia de la activación irreversible son las diarreas típicas en personas infectadas de cólera. La toxina pertussis también produce la ADP-ribosilación de subunidades α (αi y αo), siendo en este caso la modificación en un residuo de Cys, en el dominio C-terminal o de interacción con el receptor. En este caso, la modificación produce la falta de interacción entre el receptor y la proteína efectora y la ausencia de señalización por esta vía. Esto influye en la sensibilidad a la histamina y en la bajada de las concentraciones de glucosa que se producen en la tosferina.

Figura 1.6. Activación de proteínas G heterotriméricas.

La tabla 1.1 resume las principales familias de proteínas G, destacando sus efectos, su posibilidad de ADP-ribosilación, su distribución por tejidos y algunos ejemplos de señales implicadas. 1.5.2. Mecanismos de Activación de Proteínas G. Las proteínas G heterotrímericas, en su estado inactivo, presentan GDP unido a la

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Familia/ Subfamilia Gs αs

Efecto +AC + Canal Ca2+ + Canal Na+ +AC -AC

ADPribosilación CTX

Distribución todos los tejidos

Ejemplos de Receptores

α olf Gi α i, α o

CTX PTX

epitelio olfatorio

Adrenalina Noradrenalina Histamina FSH, LH neuro- odorantes

αt αz αg Gq α q , α 11 , α 14 α 15 , α 16 G 12 α 12 , α 13

+ Canal K+ +PLC +PLA2 + Canal Ca2+ +Fosfodiesterasas CTX,PTX específicas de GMPc +PLC -AC +AC PTX +PLC

cerebro y otros Ach tejidos Noradrenalina opiáceos Angiotensina Muchos péptidos retina fotoreceptores (retinal) cerebro, adrenes plaquetas papilas gustativas quimoreceptores varios ACh Noradrenalina ?

?

ubicuas

Tabla 1.1. Principales características de las principales familias de proteínas G.

subunidad α. Cuando la hormona se une al receptor, el complejo interacciona con la proteína G, lo que permite el intercambio de GDP por GTP. Esta activación provoca además la disociación de la subunidad α de las subunidades β y γ La subunidad α-GTP esta preparada para actuar sobre el efector y modular su actividad. Dado que la subunidad α presenta una actividad GTPasa intrínseca, la hidrólisis posterior del GTP a GDP posibilita la reasociación de las subunidades α, β y γ , con lo cual obtenemos la configuración de partida (Fig. 1.6). 1.5.3. Ruta de transducción del AMPc. El objetivo de este apartado es resaltar algunas de las características más sobresalientes de las proteínas implicadas en esta ruta de transducción; así como poner de relieve la importancia del fenómeno de amplificación de señal a través de sucesivas etapas. La adenilato ciclasa (AC) fue la primera enzima caracterizada capaz de ser activada por proteínas G. La AC cataliza el ciclamiento del ATP (substrato) para originar AMP cíclico (AMPc), que es la molécula con actividad de segundo mensajero. En la célula existen enzimas (fosfodiesterasas)

capaces de catabolizar el AMPc, transformándolo en 5’-AMP. Experimentos realizados midiendo las concentraciones de AMPc intracelulares tras la exposición de las células a una hormona , como glucagón o adrenalina, demuestran que se alcanza un pico de concentración a los 2 minutos, el cual desciende rápidamente de tal manera que a los 5-7 minutos las concentraciones han vuelto a sus valores basales. Este dato nos demuestra que para la transmisión de la señal no se necesita mantener elevadas las concentraciones por tiempos largos. La ventaja de este mecanismo radica en que la célula puede responder a un nuevo impulso hormonal en un periodo relativamente corto de tiempo y, por otra parte, puede integrar al mismo tiempo las señales recibidas por otras rutas de transducción, las cuales pueden ser de signo contrario. La AC presenta dos dominios hidrofóbicos por los cuales permanece anclada a la membrana citoplasmática, separados por un dominio citosólico que es donde radica su actividad enzimática. Finalmente existe un cuarto dominio citosólico que es donde reside la capacidad de interacción con las proteínas G específicas.

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En la actualidad, se han caracterizado distintas proteínas con actividad adenilato ciclasa pero que difieren en sus propiedades, ya que pueden ser reguladas por distintas proteínas G, presentar localizaciones tisulares diferentes, y pueden ser reguladas positivamente por Ca2+ o por subunidades β−γ. Atendiendo a que puedan o no puedan ser activadas por el ion Ca2+ se clasifican como de Tipo I (ACI y ACIII) o de Tipo II (ACII y ACIV), respectivamente. A su vez, las AC de tipo I pueden ser reguladas o no de forma negativa por las subunidades β−γ . Así , la AC1, que presenta este tipo de regulación negativa, se diferencia de la AC3, que no lo presenta. La potencia de inhibición de las subunidades β−γ es unas 20 veces menor que la potencia de activación de la subunidad αs. Si imaginamos un sistema ideal celular con un único tipo de receptor acoplado a proteínas G y con una actividad ACI; en este sistema, dado que la relación αs/β−γ es de 1, la célula, tras la activación del receptor activaría la AC1 sin el menor problema. Sin embargo, en los sistemas celulares reales, coexisten distintos tipos de proteínas G, algunas de las cuales (Gq o G12) si bien no interaccionan de forma directa a través de su subunidades α con AC1 si pueden incrementar las concentraciones de las subunidades β−γ intracelu-lares, pudiendo llegar a compensar por este aumento de concentración su menor potencia para la inhibición.

Figura 1.7 . Modelo de disociación parcial.

Enlazando con lo anterior, es conocido que los receptores que activan a proteínas Gi son capaces de inhibir la actividad AC. Sin embargo, no se ha podido demostrar la asociación directa AC-subunidad αi, por lo cual se ha postulado que este tipo de proteínas G actuaría inhibiendo a la AC mediante el aumento de las concentraciones de subunidades β−γ , las cuales secuestrarían rápidamente a las subunidades αs (Fig. 1.7).

Finalmente, las AC de tipo II comparten dos características: la ya mencionada de no ser reguladas por calcio y la se ser positivamente moduladas por subunidades βγ . Hay que destacar en este punto que si bien tradicionalmente (los últimos 15 años¡¡) se pensaba que las subunidades βγ presentaban un único papel en el anclaje a la membrana, en los últimos años se están caracterizando diversos subtipos para ambas subunidades, lo cual puede afectar a las AC de diferentes maneras, todavía no identificadas. El incremento en los niveles de AMPc, como consecuencia de la activación de AC, pone en marcha el siguiente paso en la transducción de señal, que consiste en la activación de la protein-quinasa A (PKA). La PKA consta de cuatro subunidades: dos reguladoras y dos catalíticas. En el proceso de activación se requiere la unión de dos moléculas de AMPc por molécula reguladora. Dicha unión desplaza el equilibrio de interacción entre ambos tipos de subunidades de tal forma que las subunidades catalíticas se liberan de las reguladoras y quedan activadas pudiendo realizar la fosforilación de proteínas específicas en residuos Ser o Tre, utilizando como cosusbtrato el ATP (fig. 1.8). La identificación de proteínas substrato de la PKA ha permitido conocer que dichos substratos son proteínas modulables por fosforilación y que éstas presentan un amplio rango de actividades biológicas, ya que se han identificado proteínas del tipo de canales iónicos (proteínas de membranas), como canales de K+ que ven disminuida su actividad en la salida al exterior de dicho ion, enzimas citosólicas relacionadas con el metabolismo general (glucógeno fosforilasa, piruvato quinasa, etc) o factores transcripcionales nucleares, como es el caso de la proteína CREB (proteína de unión al elemento de respuesta activado por AMPc; ver tema 4), la cual puede modificar la expresión génica de determinados genes. Dado que existe una enzima específica (fosfodiesterasa), capaz de inactivar al AMPc, a medida que las concentraciones de AMPc vayan disminuyendo, las subunidades reguladoras de la PKA dejaran de interaccionar con el segundo mensajero y empezaran a desplazar el equilibrio hacia la forma inactiva. Si midiéramos las concentraciones de PKA activa en sistemas ideales (cultivo de células) observaríamos que la PKA empezaría a activarse a los 2 minutos, alcanzaría un pico máximo hacía los 5 minutos y prácticamente estaría en estado basal (no activo) a los 15 minutos. De igual forma existen enzimas fosfatasas específicas para las distintas proteínas substratos de la PKA (Serin-treonin-fosfatasas). La medición de las formas activas de estas proteínas substratos en nuestro sistema ideal nos daría curvas de activación similares pero retrasadas ligeramente en el tiempo. Así, considerando el caso del factor de transcripción CREB, veríamos una activación máxima a los 10-15

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minutos (CREB-P) y su vuelta al estado basal (no fosforilado, CREB, y por lo tanto inactivo) aproximadamente a los 30 minutos. 4 AMPc R C R C 4 AMPc C Modulación por fosforilación de: -Canales iónicos P -Enzimas citosólicas -P -Factores transcripcionales CREB-P C R R

Figura 1.8. Activación de Proteína quinasa A y de sus dianas moleculares.

A la vista de los datos anteriores podrían plantearse algunas preguntas: ¿Cómo una ruta de señalización con un tiempo de actuación tan relativamente corto puede generar cambios tan profundos en las células? ¿Qué ventaja evolutiva supone tener vías de señalización de corta duración? La respuesta a la primera pregunta se centra en el fenómeno de amplificación en cascada, el cual lo explicaremos con el ejemplo de una ruta activada por AMPc, la hidrólisis del glucógeno hepático para producir glucosa plasmática. El organismo responde a la bajada de concentración de glucosa en plasma (tras un periodo de ayuno, por ejemplo) incrementando las concentraciones de glucagón, hormona del páncreas endocrino, sintetizada por las células α, que al interaccionar con su receptor en la célula hepática, pondrá en marcha la ruta de activación de la PKA. Esta enzima es capaz de fosforilar, y en consecuencia activar, a la enzima citosólica Fosforilasa b quinasa, la cual a su vez fosforila y activa a la Glucógeno fosforilasa b, enzima que actúa sobre el glucógeno realizando la hidrólisis de enlaces α 1-4 y rindiendo restos de glucosa 1-fosfato, la cual tras sucesivos pasos, se transforma en glucosa que podrá abandonar la célula hepática con el fin de mantener la homeostasis de glucosa en plasma. Si suponemos que la célula hepática presenta 10 receptores de glucagón en su superficie, lo cual es un número muy conservador (se conocen ejemplos de tipos celulares con 20.000

receptores/célula), y que en cada paso de la ruta cada enzima es capaz de activar 10 moléculas del paso siguiente por minuto (número todavía más conservador ya que la actividad enzimática para estas enzimas está en el rango de nmoles-µmoles/min, el resultado sería la liberación de 1millón de moléculas de glucosa por célula y por minuto!! Para contestar a la segunda pregunta, y utilizando el ejemplo del ayuno, el glucagón también induce, a través de CREB, la expresión del gen de la fosfoenol-piruvato carboxiquinasa (PEPCK), enzima de la ruta gluconeogénica implicada en la síntesis de glucosa a partir de substratos no glucídicos. Mientras el organismo siga en ayuno, el hígado podrá responder a las nuevas moléculas de glucagón que, por vía sanguínea, lleguen procedentes del páncreas. Si en un momento dado el organismo ingiere alimento rico en carbohidratos, el páncreas dejara de liberar glucagón y empezará a liberar insulina (hormona con efectos metabólicos opuestos que estudiaremos más adelante en este tema). En este caso, cuando las concentraciones crecientes de insulina lleguen al hígado, encontraremos una célula adaptada a un metabolismo de ayuno (por las anteriores señales de glucagón) que empieza a recibir señales contrarias. En un tiempo de actuación similar al anterior la insulina revierte el metabolismo del glucógeno (inactivando a la glucógeno fosforilasa b y activando al mismo tiempo a la glucógeno sintasa, para completamente la transcripción del gen de la PEPCK (inhibe la funcionalidad de CREB), reduce la vida media de los RNAm de este gen y desestabiliza la proteína ya formada para que sea degradada rápidamente. Así, el organismo, en tiempos inferiores a 1 hora a cambiado su comportamiento metabólico con respecto a la glucosa. Otro ejemplo de adaptación todavía más corto en el tiempo lo constituye la preparación a una situación de peligro para el organismo (descarga de adrenalina, que actúa de forma muy similar al glucagón con respecto al sistema AC). Por tanto, la existencia de múltiples pasos en las rutas de señali-zación supone una mejor amplificación de respuesta, la posibilidad de que una misma ruta module muchos procesos moleculares distintos y también disponer de más puntos de regulación o control, lo cual proporciona un ajuste mucho mas fino o preciso. 1.5..4.- Ruta de transducción del Fosfatidil Inositol. De forma análoga a como las subunidades αs activan la AC, otras subunidades α (αi, αo o αq ) son capaces de activar a la enzima efectora Fosfolipasa C (PLC). En este caso el substrato de la enzima que al transformarse origina los segundos mensajeros son las moléculas de Fosfatidil Inositoles. Estas moléculas, además de ser precursoras de segundos mensajeros tienen importancia en el anclaje de proteínas extracelulares a la membrana plasmática.

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Tema 1: Mecanismos de Transducción de Señales por receptores de Membrana

Figura 1.9. Generación de segundos mensajeros (IP3 e 1,2-diacilglicerol) por Fosfolipasas C (ver texto).

Los fosfatidil inositoles (PI) son fosfolípidos que se caracterizan por poder presentar varios grados de fosforilación a través de las funciones alcohol de la molécula de inositol (ver figura 1.9), siendo el substrato de la PLC la molécula de Fosfatidil Inositol 4,5 bifosfato (PIP 2). La PLC causa la hidrólisis del enlace éster entre el grupo alcohol primario de la molécula de glicerol y el ácido fosfórico, originando las moléculas de diacilglicerol (DAG) y de Inositol 1,4,5-trifosfato (IP3). Los productos de la reacción tienen la característica de actuar como segundos mensajeros en sendas rutas de transducción. Así, el DAG, que queda unido a la membrana, es capaz de activar a la protein-quinasa C (PKC), la cual, de forma análoga a la descrita para PKA es capaz de modular por procesos de fosforilación la actividad de muchas proteínas, ya sean de membrana, citosólicas o factores de transcripción. Por su parte, el IP3, que es soluble en el citoplasma, mediante su interacción con canales de Ca2+ tetraméricos, situados fundamentalmente en el retículo endoplásmico, puede incrementar las concentraciones de Ca2+ citosólico de 10 a 1000 veces. El aumento en las concentraciones de este ion activa la función de varias proteínas que son dependientes de él. Entre estas proteínas dependientes de Ca2+ destaca la Calmodulina una proteína reguladora de ciertas proteína quinasas (PK CaCaM), las cuales, una vez activadas, tienen efectos análogos a los descritos para otras proteína quinasas.

Se conocen varios subtipos de PLC que, al igual que vimos para la AC, se clasifican en función de las moléculas implicadas en su activación. De los diversos tipos los más importantes son: -PLC β .- Son las activadas por proteínas G. Dependiendo de la subunidad a implicada en su activación, los receptores responsables de su activación se clasifican en Familia Gq y Familia Gi. Son bastantes las moléculas de señalización capaces de activar este tipo de efector: neurotransmisores (Noradrenalina, Acetilcolina o 5-hidróxi-triptamina), neuropéptidos (vasopresina, angiotensina, Péptido Intestinal Vasoactivo -VIP-, o colecistoquimina) u hormonas (glucagón, GnRH, TRH). -PLC γ .- Son activadas por receptores con actividad tirosin-quinasa intrínseca, tales como receptores de EGF, FGF o PDGF (factores de crecimiento epidérmico, fibroblástico y derivado de plaquetas, respectivamente). Este tipo de activación consiste en la interacción de la PLC γ con estos receptores a través de dominios SH2 (ver más adelante en el tema). Dentro de este tipo de PLC también se han descrito algunas que pueden ser activadas por Ca2+ . Al igual que vimos para la ruta activada por AC, la ruta de la PLC es inactivada de forma parecida. El catabolismo (inactivación) de los segundos mensajeros implica varios pasos enzimáticos (figura 1.10) que finalizan en la formación de Fosfatidil Inositol 4,5 bifosfato; es decir, el PIP 2, que era el substrato de la PLC, se

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recupera a partir de los productos del metabolismo de IP3 y DAG. Por tanto, para la síntesis de ambos compuestos es necesario el correcto funcionamiento de la ruta de degradación. El IP3 se defosforila, por acción de fosfatasas, en reacciones sucesivas para dar lugar a Inositol. Por su parte, el DAG se fosforila por acción de una quinasa para dar lugar a ácido fosfatídico, el cual mediante una citidil transferasa forma fosfatidil-CMP. El inositol y el fosfatidil-CMP son substratos de una sintasa que origina fosfatidilInositol (PI), que por sucesivas fosforilaciones origina Fosfatidil Inositol 4,5 bifosfato.

maniacodepresivos. En concreto se ha podido demostrar que el Li+ inhibe a las fosfatasas implicadas en la generación de inositol. Para terminar la transmisión de esta vía deben además de retirarse las elevadas concentraciones de Ca2+ . Existen en la célula varios sistemas capaces de realizar esta función (figura 11): - ATPasa Ca2+ dependiente.- expulsa Ca2+ al exterior de la célula en contra de gradiente y, por lo tanto con gasto energético. Presentan Km muy bajas (100-200 nM). - ATPasa del retículo endoplásmico. Similares a las anteriores con la excepción de que no son dependientes de Ca2+ . - Intercambiador Na+- Ca2+ .- Intercambia 3 Na+- por 1 Ca2+ .Sólo interviene si las concentraciones de Ca2+ son muy altas. - Mecanismo mitocondrial.- El funcionamiento de la cadena de transporte electrónico conlleva la salida de H+ al exterior de la mitocondria, creando un potencial de membrana que es aprovechado por la F1-ATPasa para la síntesis de ATP. Cuando las concentraciones de Ca2+ son elevadas este potencial de membrana puede ser aprovechado para la entrada de este ion al interior mitocondrial por los transportadores específicos.

Figura 1.11 Homeostasis de Ca2+ intracelular.

Figura 1.10. Metabolismo de IP3 y Diacilgliceroles.

Esta molécula puede servir de substrato para la generación de nuevos segundos mensajeros tras la correspondiente activación de la ruta. La inhibición farmacológica de esta ruta de resíntesis por Li+ se utiliza en el tratamiento de enfermos

PKC y PK Ca-CaM Como se ha mencionado anteriormente son las principales enzimas en la transducción de la señal por la ruta de la PLC. Ambas presentan actividad ser-tre quinasa. La PKC en realidad es una familia de proteínas (α, β, γ, δ, ε, µ, ζ) que si bien median la misma acción catalítica, difieren en sus características. Las conocidas como típicas (α, β, γ) se caracterizan por ser activadas, además de por DAG que es el verdadero desencadenante de su activación, por Ca2+ y fosfolípidos. La PKC se encuentra en forma

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inactiva en el citosol. La aparición de DAG en la membrana promueve su asociación con esta y, en presencia de Ca2+ sufre un cambio conformacional en su dominio regulador que activa a la enzima (dominio catalítico). Con respecto a la PK Ca-CaM, la calmodulina, el mediador proteíco de muchas reacciones enzimáticas reguladas por Ca2+ , contiene cuatro centros de unión a Ca2+ de alta afinidad. La unión del Ca2+ induce un cambio conformacional en la calmodulina que le permite interaccionar activamente con la PK que regula (figura 1.12).

calmodulina Ca2+

PK inactiva

PK Ca-CaM activa

dos tipos generales de regulación: regulación positiva, donde la activación de una vía coopera en la activación de otra, y regulación negativa, donde la activación de una vía conduce a la inhibición de otra. Considerando las dos rutas hasta ahora explicadas (AC y PLC) tenemos un ejemplo de regulación positiva si consideramos que la activación de PLC, vía IP3, aumenta las concen-traciones de Ca2+ , el cual es capaz de estimular algunos tipos de AC. En sentido contrario, la activación de PKA, vía AMPc, reduce los niveles de IP3. De igual forma, la fosfodiesterasa capaz de hidrolizar la estructura cíclica de AMPc es activada por el complejo Ca-CaM. Estos tipos de regulación que afectan a dos o más vías entre sí, a veces pueden encontrarse en una misma vía. Así, por ejemplo, la PKC es capaz de modular por fosforilación bombas de Ca2+ o el antiportador Na+/Ca2+ , contribuyendo por estos efectos a bajar las concentraciones de Ca2+ citosólico elevadas, lo cual necesita para ser activa. En este caso podemos hablar de efectos sinérgicos. En el lado opuesto estarían los efectos de retroalimentación, mediante los cuales una enzima o metabolitos situado en pasos posteriores de la vía de transducción puede modular negativamente pasos previos de la vía. Así, por ejemplo, la PKC activada tiende a disminuir las concentraciones de IP3. Todos los sistemas propuestos confluyen en la idea de que las rutas de señalización están altamente reguladas. 1.5.6. Ruta del Acido Araquidónico (AA). El ácido araquidónico es un segundo mensajero implicado en varias rutas de señalización. Su generación como segundo mensajero puede provenir de la activación de dos rutas distintas: la activación de fosfolipasa A2 (PLA2), enzima que cataliza la hidrólisis del enlace éster entre el alcohol secundario del glicerol y el ácido graso de varios fosfolípidos, o por la activación de la DAG lipasa que, catalizando la misma reacción, se distingue de la anterior por utilizar como substrato el DAG. Por tanto, el DAG no sólo funciona como segundo mensajero en la ruta de los fosfatidil inositoles sino que además funciona como precursor de otros mensajeros (Figura 1.13). Se conocen dos subtipos de PLA2 que se diferencian por su localización celular (membrana citoplasmática o citosol) y por el tipo de proteínas implicadas en su activación, ya que las asociadas a membranas son activadas por proteínas G mientras que las citosólicas resultan activadas por otras rutas de señalización (ver más adelante). Dentro de las funciones desempeñadas por el ácido araquidónico pueden distinguirse aquellas ejercidas en el interior de la célula donde se ha generado (movilización de depósitos de Ca2+ internos, activación de PKC de forma análoga al DAG) y las

Figura 1.12. Activación de PK Ca-CaM.

Al igual que vimos para la proteína PKA, tanto la PKC como la PK Ca-CaM son capaces de inducir, mediante procesos de fosforilación, la modulación de múltiples proteínas que manifiestan diversas activi-dades biológicas (transportadores iónicos, enzimas de rutas metabólicas, factores transcripcionales, etc). 1.5.5. Integración de rutas de transducción. En un momento dado de su desarrollo una célula puede recibir distintas señales, que pueden modular procesos biológicos comunes. Por lo tanto la célula debe de disponer de los mecanismos moleculares precisos mediante los cuales dirigir los efectos metabólicos de estas distintas rutas. Cabe distinguir en este punto dos posibles niveles de regulación: - en las propias rutas de transducción. - en las rutas diana modulables (glucogenolisis, contracción muscular, secreción endocrina, etc). Con respecto a la regulación de vías de transducción por otras vías de transducción hay numerosos ejemplos que demuestran la existencia de

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ejercidas al salir de la célula y poder funcionar como una molécula se señalización en células vecinas.

la PLA2 (AA). La PLD, a diferencia de otras fosfolipasas, se activa por ciertas proteínas G pequeñas (ARF, Rho; ver más adelante) en combinación con PIP 2. 1.6. Receptores con actividad enzimática intrínseca. Este grupo de receptores, a diferencia de los anteriores, no requiere de moléculas intermedias para la activación de enzimas efectoras sino que la unión del ligando al receptor es capaz de activar la catálisis del propio receptor. Los receptores de este tipo se clasifican dependiendo de la actividad enzimática que presenten. 1.6.1. Receptores con actividad Guanilato ciclasa. La unión del factor natriurético atrial a su receptor, en células colectoras renales, provoca la activación de la actividad guanilato ciclasa, presente en el dominio citosólico que cicla la molécula de GTP para dar GMP cíclico (GMPc). Esta molécula actua como segundo mensajero en la activación de la proteína quinasa G (PKG), que cataliza fosforilaciones de proteínas similares a las descritas para PKA o PKC (Figura 1. 14).

Figura 1.13. Metabolismo del ácido araquidónico.

El metabolismo del AA implica procesos de regulación por retroalimentación, ya que es capaz de inhibir a la PLA2, y procesos de transformación en metabolitos, ya que es substrato de diversas enzimas que lo transforman en otras moléculas también implicadas en señalización (leucotrienos, prostaglandinas, tromboxanos, epóxidos). Estos compuestos junto con el AA son conocidos como mensajeros retrógrados; es decir, tienen la capacidad para salir de la célula y unirse a receptores de membrana plasmática de la propia célula (S. autocrina) o de células vecinas (S. paracrina). 1.5.7. Ruta del Acido Fosfatídico (PA). Presente en diversos tipos celulares (neuronas, miocitos, hepatocitos, células endoteliales y del sistema hematopoyético) e implicada en la regulación de múltiples procesos fisiológicos (regulación metabólica, secreción, inflamación, proliferación) se encuentra la generación de ácido fosfatídico como segundo mensajero. En esta ruta el substrato fisiológico es la fosfatidil colina que sufre la hidrólisis del enlace éster entre el resto de fosfato y la colina, reacción calatizada por la Fosfolipasa D (PLD) para originar PA y colina. El PA además de actuar como segundo mensajero para la activación de varias proteína quinasas, puede servir como precursor de otros mensajeros como el DAG o el ácido araquidónico, mediante sendas reacciones enzimáticas catalizadas por la fosfatidato fosfohidrolasa (DAG) y

Figura 1.14. Activación de receptores con actividad Guanilato ciclasa.

Existe un segundo grupo de proteínas con actividad guanilato ciclasa que se diferencian de las anteriores por presentarse en el citosol. Las guanilato ciclasas solubles son activadas por el óxido nítrico (NO), un gas sintetizado a partir de arginina en una reacción catalizada por oxidasas de función mixta, denominadas óxido nítrico sintasas (NOS) y de las que se conocen varios subtipos. Las guanilato ciclasas presentan en su centro activo un grupo hemo necesario para su actividad y que es donde reside el dominio de interacción con el NO. Esta molécula esta implicada en la generación de procesos inflamatorios y se considera un neurotransmisor. 1.6.2 Receptores con actividad Tirosina Quinasa. Los receptores con actividad tirosina quinasa pueden agruparse, dependiendo de su composición, en receptores monoméricos, que incluye receptores para varios factores de crecimiento (EGF, NGF, PDGF, etc) o receptores multiméricos, cuyo

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paradigma es el receptor de insulina. Independientemente de la composición del receptor, estas proteínas presentan los dominios típicos de receptores de membrana: extracelular, por donde se une el ligando, transmembrana, por donde permanece anclado a la membrana, y citosólico, donde reside la actividad tirosina quinasa. En este tipo de receptores, la unión del ligando al receptor provoca la dimerización de estos. La proximidad física de ambas moléculas permite la activación de la actividad catalítica produciéndose la fosforilación cruzada de ambas en restos de tirosina; es decir, cada monómero del receptor activado es capaz de producir la fosforilación de algunos restos en la otra molécula, proceso que se conoce como autofosforilación. La fosforilación de determinados restos de tirosina produce la aparición de dominios de reconocimiento para otras proteínas lo cual es esencial en la ruta de transducción (figura 1.15).

específicos de las proteínas denominados dominios SH2 (dominio de homología con Src 2). Pequeñas variaciones en los dominios SH2 de las proteínas facilitan su unión a algunos restos fosfo-tirosina del receptor con mayor afinidad que a otros restos fosfotirosina, de tal manera que no todas las proteínas con dominios SH2 se unen con idéntica afinidad a un determinado resto fosfo-tirosina (figura 1.16).

Figura 1.16. Ciclo de activación-inactivación de Ras

Figura 1.15. Activación de receptores con actividad Tirosina quinasa. Los dominios SH2 aparecen coloreados en azul.

Se han identificado dos tipos de proteínas que pueden interaccionar con los receptores activados: - Proteínas adaptadoras que realizan el acoplamiento entre el receptor activado y otras moléculas de señalización pero que carecen de actividad intrínseca en la señalización, como es el caso de GRB2. - Proteínas con actividad enzimática implicadas en las rutas de señalización, como es el caso de GAP (proteína activadora de la función GTPasa de Ras; ver mas adelante), Syp, una proteína con actividad fosfatasa, y enzimas implicadas en la síntesis de derivados del fosfatidil inositol como la fosfatidil inositol-3 quinasa (PI3K) o la PLCγ (figura 1.9). La interacción entre estas proteínas y los receptores activados se lleva a cabo por dominios

Una proteína que juega un papel importante en la transducción de señal por este tipo de receptores es Ras, la cual pertenece a la familia de proteínas G pequeñas y está implicada en la regulación de procesos tales como la proliferación y la diferenciación celular. Como se mencionó anteriormente estas proteínas son interruptores moleculares que necesitan del intercambio de moléculas GDP-GTP para variar su actividad biológica. A diferencia de las proteínas G heterotriméricas, donde el intercambio de GTP por GDP era inducido por la interacción con los receptores activados, las proteínas G pequeñas necesitan de la presencia de otras proteínas, denominadas factores intercambiadores de nucleótidos de Guanina (GEF) que facilitan la disociación del GDP, con lo cual el GTP puede unirse de forma espontánea (figura 1.16). La unión de GTP provoca la disociación del intercambiador produciendo la forma activa de Ras. El paso de la forma activa de Ras a la forma inactiva es acelerado enzimáticamente por ciertas proteínas que reciben el nombre de GAP (proteína activadora de GTPasa). La existencia de GAP hace que en sistemas celulares la vida media de Ras-GTP no supere el minuto. Dado que Ras carece de dominios SH2 necesita para su activación por receptores con actividad tirosina quinasa de proteínas adaptadoras. Además de dominios SH2, existen otros tipos de dominios implicados en el reconocimiento de proteínas, tales como dominios SH3 (reconocen

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secuencias ricas en prolina) o PTB. La proteína GRB2 es una proteína adaptadora que presenta dominios SH2, mediante los cuales puede interaccionar con los receptores activados, y dominios SH3, mediante los cuales puede interaccionar con otras proteínas capaces de reconocerlos. Sos que es una proteína intercambiadora de nucleótidos de guanina (GEF) tiene la característica de poder reconocer dominios SH3, de tal manera que puede interaccionar con el adaptador GRB2 (unido al receptor activado) a través de los dominios SH3. El complejo Receptor-GRB2-Sos está en condiciones de activar a Ras que pone en marcha una cascada de fosforilación de proteínas que, eventualmente, finaliza en el núcleo modificando la expresión génica. La figura 1.17 esquematiza la activación de Ras en la transducción de señal generada por EGF.

Estudios recientes han confirmado la existencia de otros miembros de la familia de MAPKs. En la actualidad se distinguen tres subfamilias de MAPKs: A) -ERK (Extracellular Regulated Kinases) se corresponden con las mencionadas anteriormente como MAPKs, estando por tanto implicadas en los procesos de proliferación y diferenciación.

Figura 1.18 Activación de quinasas reguladas extracelularmente (ERK). Figura 1.17. Papel de proteínas adaptadoras en la activación de rutas de transducción por RAS.

La serie de eventos que siguen a la activación de Ras presenta una gran convergencia en todas las especies estudiadas. Los pasos más relevantes son (figura 1.18): - Ras activado se une al extremo N-terminal de Raf, una serina-treonina quinasa. - El complejo Ras-Raf interacciona y fosforila, a través de Raf, a MEK, una quinasa dual, ya que puede fosforilar a otras proteínas en restos serina y tirosina. - MEK fosforila y activa a las MAP quinasas (MAPK- Mitogen Activated Protein Kinase), otra serina-treonina quinasa. MAPK fosforila a muy diferentes proteínas que están implicadas en la regulación del ciclo celular y la diferenciación. Entre dichas proteínas cabe destacar otras proteína quinasas (pp90rsk) y ciertos factores transcripcionales.

B) -JNK (Jun N-terminal Kinasas) se denominan así por identificarse por primera vez su implicación en la fosforilación de la proteína JUN (que junto con FOS forman el factor transcripcional AP-1). Estas quinasas son activadas en respuesta a múltiples señales (citoquinas, hormonas) y están relacionadas con los procesos infeccioso-inflamatorios, de estrés celular y de supervivencia celular). C) -p38-MAPKs constituyen el tercer tipo de MAPKs. También pueden ser activadas por múltiples señales y se han relacionado con los procesos de estrés celular y de supervivencia/muerte celular. La finalización de señalización en rutas acopladas a la fosforilación de proteínas es realizada por proteín-fosfatasas (fosfo-tirosina o fosfoserina/treonina fosfatasas). Se conocen varias familias de fosfatasas que difieren en sus especificidades de acción y en su localización celular (citosol, núcleo, etc). Las proteína fosfatasas serán consideradas de nuevo en el tema 2.

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Figura 1.19. Activación de IRS-1 por el receptor de insulina.

Activación del receptor de Insulina A diferencia de los otros receptores de esta familia (por ejemplo EGF), el receptor de insulina una vez activado, no interacciona con proteínas a través de dominios SH2 (con la excepción de Shc), sino que fosforila a ciertas proteínas citosólicas de elevado peso molecular (aprox. 130 kDa) denominadas IRS (Insulin Receptor Substrates). En la actualidad se han descrito tres proteínas con esta característica (IRS 1, IRS 2 e IRS 3). La fosforilación de IRS por la actividad quinasa del receptor de insulina crea los sitios de reconocimiento para la interacción con otras proteínas (GRB2, PI3K, Syp) y su consiguiente activación, a través de dominios SH2 (figura 1.19). Así la actividad PI3K se incrementa 10 veces cuando esta proteína interacciona con IRS 1, incrementándose el tráfico de membranas. De forma análoga, Syp, con actividad fosfatasa, se activa al interaccionar con IRS 1 de modo que puede desfosforilar a esta proteína terminando así su señalización. IRS-1 se caracteriza por la presencia de dominios PH, que permiten la estabilización de la interacción con el receptor a través de su afinidad por fosfolípidos de la membrana. 1.6.3. Receptores con actividad Serina-Treonina Quinasa. Son también conocidos como receptores de la familia del TGFβ. El TGF-β1 es el prototipo de una familia de moléculas de señalización que incluye a los factores de crecimiento transformantes tipo beta, las activinas, las inhibinas, las proteínas morfoge-néticas óseas (BMP) y la hormona Antimülleriana. Los miembros de esta familia ejercen una gran variedad de efectos biológicos en diversos tipos celulares,

teniendo especial importancia durante el desarrollo embrionario y la formación de tejidos. En el adulto están implicados en procesos tales como la reparación de tejidos, la modulación del sistema inmune y la regulación del ciclo ovárico. Estas moléculas de señalización inician sus acciones celulares mediante su unión a receptores con actividad intrínseca serina/treonina-quinasa. La familia de receptores consta a su vez de dos tipos: tipo I y tipo II, que son estructuralmente muy similares, con regiones extracelulares ricas en cisteina y regiones intracelulares que consisten principalmente de los dominios quinasa. Los receptores de tipo I, pero no los de tipo II, presentan una región rica en residuos de glicina y serina (dominio GS) en el dominio yuxtamembranal. Cada miembro perteneciente a esta familia se une a una combinación característica de receptores tipo I y tipo II siendo necesaria esta interacción para desencadenar los procesos de señalización intracelulares (Tabla 1.2). El TGF-β1, como ejemplo, se une en primer lugar al receptor de tipo II, lo cual ocurre en la membrana celular formando oligómeros que presentan actividad quinasa. A continuación el receptor de tipo I (que carece de actividad quinasa intrínseca y no puede unirse al TGF-β en ausencia de receptor tipo II) es reclutado al complejo; El receptor tipo II fosforila al receptor tipo I en el dominio GS y lo activa presentando entonces actividad quinasa.

Figura 1.20. Activación del complejo de receptor para TGF-β.

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Como consecuencia de la activación del receptor de tipo I, este es capaz de fosforilar a ciertas proteínas citosólicas, denominadas SMAD, las cuales una vez activadas tienen la capacidad de translocarse al núcleo y ejercer sus efectos reguladores (figura 1.20) sobre la expresión génica. Estas proteínas SMAD, de las cuales se han descrito en la actualidad varios tipos, serán tratadas con más detalle en el tema 2.
_________________________________________________ Subfamilia TGF- β Activina BMP _________________________________________________ Ejemplo de TGF- β 1 Activina A BMP-2 Ligando TGF- β2 BMP-4 __________________________________________________ Rec. tipo II T β R-II ActR-II BMPR-II ActR-IIB ActR-II ActRIIB __________________________________________________ Rec. tipo I T β R-I ActR-IB BMPR-IB ActR-I __________________________________________________ SMAD Smad2 Smad2 Smad1 específicas Smad3 Smad3 Smad5 de vía Smad9? __________________________________________________ SMAD Smad4 Smad4 Smad4 comunes___________________________________________ SMAD Smad6 Smad6 Smad6 inhibidora Smad7 Smad7 Smad7 __________________________________________________ Respuestas Mitogénesis ↓ liber. FSH ↑ Cartílago ↑ matriz extraMesodermo Mesodermo celular ↑ dorsal ↑ ventral ↑ Apoptosis↑ Tabla 1.2. Miembros de la Familia del TGF-β, sus receptores, moléculas de señalización y principales respuestas biológicas.

siendo la formación del complejo ligando-receptortransductor el desencadenante de las rutas de transducción asociadas. Atendiendo a la homología entre los distintos receptores que componen esta superfamilia, estos se han clasificado en dos tipos generales: a) Receptores de Tipo I Los receptores de tipo I comparten una serie de motivos conservados en sus dominios extracelulares que consisten en 4 residuos de cisteina y el motivo WSXWS (Trp-Ser-X-Trp-Ser). Dentro de esta familia de receptores, las citoquinas pueden a su vez clasificarse dependiendo del tipo de proteína transductora que presenten. Así, la familia gp130 se caracteriza por la interacción de esta proteína (gp130) con los receptores específicos para IL-6, IL-11, IL-12, LIF (factor inhibidor de la leucemia), OnM (oncostatina M), CNTF (factor neurotrófico ciliar) y G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos). La familia gp140 engloba a IL-3, IL-5 y GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos). Por último, la familia γ-C engloba a las interleuquinas 2, 4, 7, 9, 13 y 15. Si bien algunas de estas citoquinas pueden inducir la fosforilación de determinadas proteína- quinasas, como Lyn, Lck o Fyn (por IL-2) o Lyn, Hck o Fps (por IL-3), la característica común de todas estas citoquinas es su capacidad de activar a uno o mas miembros de la familia de las JAK (Janus Kinase). Se conocen cuatro quinasas en esta familia: JAK1, JAK2, JAK3 y tyk2 y todas tienen actividad tirosina quinasa. b) Receptores de Tipo II Integrada por los receptores de interferones. Los interferones se clasificaron inicialmente por el tipo de célula productora como interferones de leucocitos, de fibroblastos o inmunes. La nomenclatura actual se basa principalmente en su secuencia; y así designa a los interferones de leucocitos como IFN- α e IFN- ω, a los de fibroblastos como IFN- β y a los de tipo inmunes como IFN- γ . Los IFNs α y β comparten el mismo tipo de receptor mientras que los IFN γ presentan un receptor específico. El último componente de esta familia lo constituye la IL-10. Independientemente del tipo de receptor (I o II) y del tipo de ligando, la unión del ligando al receptor desencadena la siguiente cadena de eventos moleculares (figura 1.21): 1- Dimerización de receptores o de receptorestransductores. 2- Activación de JAKs, las cuales producen la fosforilación cruzada de las mismas. 3- Las JAK fosforiladas son capaces de fosforilar a los receptores en residuos de tirosina creando sitios de reconocimiento para dominios SH2.

1.7. Receptores asociados a Proteína quinasas citosólicas. Un gran número de citoquinas, algunas hormonas (prolactina, hormona del crecimiento, leptinas) y ciertos factores de crecimiento (eritropoyetina, G-CSF) se caracterizan por presentar receptores sin actividad catalítica pero desencadenar procesos de fosforilación de proteínas en tiempos similares a los conseguidos por los receptores considerados en el apartado 1.6. Una característica que comparten muchas citoquinas y algunos factores de crecimiento es la implicación de una proteína transductora de membrana necesaria para la activación de rutas de señalización. Estas proteínas transductoras si bien por sí solas no son capaces de interaccionar con el receptor en ausencia de ligando (al igual que lo descrito para los receptores tipo I del TGF-β), interaccionan con el receptor activado por ligando,

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4- Estas secuencias fosforiladas son reconocidas por diversas proteínas con dominios SH2, de entre las cuales destacan las proteínas STAT (signal transducer and activators of transcription). 5- La interacción de proteínas STAT con los receptores permite la fosforilación de las STAT por las JAK. 6- Dichas fosforilaciones crean a su vez en las proteínas STAT sitios de reconocimiento para dominios SH2. Dado que cada proteína STAT presenta un sitio de reconocimiento y un dominio SH2, estas proteínas pueden dimerizarse y translocarse al núcleo para regular la expresión de juegos específicos de genes.

Figura 1.22. Activación de las rutas asociadas a Ras y JAK por IL-2

Figura 1.21. Cascada de fosforilaciones en la activación de STAT.

La fosforilación del receptor permite además la interacción de éste con otras proteínas que contienen dominios SH2 como Shc, proteína adaptadora implicada en la activación de Ras, que puede activar la ruta de las MAPK (ERK). Un ejemplo de este tipo de activación múltiple lo supone la fosforilación de STAT3 en células T, donde la interacción de IL-2 con su receptor controla la progresión de la fase G1 a S, la expansión clonal y la diferenciación funcional. La interacción de IL-2 con sus receptores supone la activación de JAK1 y JAK3 y la consecuente fosforilación de STAT3 en su residuo Tyr-705 (Figura 1.22). Por otra parte, la fosforilación del receptor de IL-2 (cadena β) favorece su interacción con Shc y la consecuente activación de Ras, que conduce a la fosforilación de STAT3 en su residuo Ser-727. Esta segunda ruta que lleva a la fosforilación del residuo de serina también puede desencadenarse por el receptor de la célula T (TCR). Especificidad de Respuesta Biológica por STATs En la actualidad se han clonado 4 proteínas de la familia JAK y siete proteínas de la familia STAT. Por otra parte se conocen más de 35 señales extracelulares, capaces de activar dicha ruta de transducción, que desencadenan respuestas biológicas de

lo mas variadas (activación de múltiples respuestas del sistema inmune, diferenciación del epitelio mamario, de linfocitos T, de eritrocitos, etc). La pregunta que surge es ¿Como un juego tan pequeño de proteínas puede generar tanta diversidad de efectos biológicos? La respuesta puede estar en parte explicada considerando la especificidad de las proteínas STAT en el reconocimiento de los receptores de esta familia, ya que sólo algunas STAT reconocen determinado receptor, por ejemplo, la proteína STAT 2 sólo se ha demostrado su interacción con el receptor para IFN α/β. La figura 1.23 esquematiza algunas de las posibles interacciones. Parte de la respuesta se explicará en el próximo tema cuando se aborde el estudio de la existencia de programas genéticos específicos para los distintos tipos celulares.

Figura 1.23. Especificidad de respuesta biológica (ver texto).

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Tema 1: Mecanismos de Transducción de Señales por receptores de Membrana

1.8. Receptores de la familia TNF/NGF Los receptores de esta familia están implicados, con algunas excepciones en la señalización yuxtacrina; es decir, tanto el ligando como el receptor son proteínas de membrana con dominios extracelulares a través de los cuales se establece la señalización. El TNF-α (Factor de Necrosis Tumoral), que tiene la característica de ser un ligando de señalización paracrina, es una citoquina pleiotrópica que funciona como un mediador de la regulación inmune, la respuesta inflamatoria y la apoptosis en algunos tipos celulares. Un exceso en la producción de TNF se ha ligado al desarrollo de ciertas enfermedades tales como el shock séptico y ciertos desordenes autoinmunes. Las respuestas celulares promovidas por el TNF se inician mediante su interacción con dos tipos distintos de receptores celulares, el receptor de tipo I (55 kDa) y el de tipo II (75 kDa). Ambos tipos de receptores forman parte de la familia de receptores del TNF entre cuyos miembros se incluyen el antígeno Fas (inductor de apoptosis, también llamado Apo-1 o CD95), CD27 (antígeno de activación de células T), CD30 (marcador del linfoma de Hodgkin) y CD40 (antígeno de células B), los cuales comparten la característica de secuencias ricas en cisteina en sus dominios extracelulares. Esta familia de citoquinas generan respuestas celulares que incluyen la diferenciación, la proliferación, la activación de NFκ B y la muerte celular, promoviendo la agregación de monómeros de receptores. En general los dominios citoplasmáticos de esta familia de receptores carecen de dominios comunes, lo cual sugiere que pueden utilizar mecanismos distintos. La excepción ocurre con el receptor tipo I del TNF y el antígeno Fas, ya que ambos presentan en su extremo carboxilo terminal un dominio de aproximadamente 80 aminoácidos que se ha denominado "dominio de muerte" (DD= death domain). A los dominios citoplasmáticos de los receptores pueden asociarse dos familias de proteínas denominadas TRAF (Factores Asociados al Receptor de TNF) y TRADD y que están implicadas en la transducción de la señal al núcleo (figura 1.24). En este caso de señalización podemos hablar del reclutamiento de proteínas al complejo receptor(es)ligando(s) del tal manera que una proteína transmite la señal a la siguiente proteína en la cascada a través de interacciones proteina-proteina, sin mediar procesos de modificación covalente (fosforilaciones) como hemos visto para otros tipos de receptores, mediante interacciones por dominios homólogos. Para el caso del receptor I del TNF las posibles secuencias de eventos moleculares, tras la formación del complejo receptor (trímero)-ligando, serían: - asociación de TRADD (mediante los dominios DD) al complejo.

- asociación de TRAF2 a TRADD. La activación de TRAF2 permite que esta proteína interaccione con otras como NIK (proteína quinasa que al activarse puede generar una ruta de fosforilaciones; ver tema 4) o RIP que puede asociarse con RAID y ésta activar algunas caspasas que están implicadas en la señalización de muerte celular. - asociación de MORT1/FAD (mediante dominios DD) con la consiguiente activación de algunas caspasas.

Figura 1.24 Rutas de transducción asociadas a TNF.

La activación de este tipo de receptores, además de las vías de quinasas consideradas de estrés (Jun quinasa, p38), conlleva la activación de dos procesos contrapuestos en la célula: la activación de caspasas, proteasas intracelulares que dirigen el proceso apoptótico, y la activación de los miembros de la familia del factor nuclear NF- κ B que, mediante la activación génica, actua como un factor de supervivencia (ver tema 2). Dependiendo del tipo celular y de la predominancia de unas rutas sobre otras (muerte/supervivencia) el efecto final una vez integradas las distintas vías de señalización puede ser de muerte (apoptosis) o proliferación celular. 1.9. Regulación de Receptores de Membrana El número y la actividad de receptores funcionales implicados en señalización sobre la superficie de la célula no es constante. El nivel de receptores para una determinada hormona puede incrementarse (up-regulation) o disminuir (downregulation), permi-tiendo de esta forma a la célula responder óptimamente a ligeras variaciones en los niveles hormonales. La exposición prolongada de una célula a elevadas concentraciones de un ligando normal-mente resulta en una reducción en el número de sus receptores funcionales, causando por consiguiente la desensibilización de la célula para ese ligando.

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Tema 1: Mecanismos de Transducción de Señales por receptores de Membrana

El fenómeno de la down-regulation de receptores de superficie celular puede ocurrir de varias formas. Los receptores pueden ser internalizados por endocitosis, disminuyendo así su número en la superficie y entonces ser destruidos o almacenados (secuestrados) en vesículas intracelulares. En cualquier caso se finaliza la acción del ligando. El que la célula elija uno u otro mecanismo depende del tiempo de duración del estímulo. Tras tiempos cortos de exposición a la señal (minutos) la célula secuestra en vesículas a los receptores: si el estímulo perdura en el tiempo (horas) entonces se activa la vía de degradación de receptores tras la fusión de vesículas lisosomales (figura 1.25). Es conocido que la activación de PI3K juega un importante papel en el tráfico de vesículas.

célula ajustar la sensibilidad del receptor a la concentración de ligando a la cual es estimulada, de modo que puede mantener una respuesta fisiológica normal. dado que los receptores fosforilados son continuamente desfosforilados por fosfatasas constitutivas, el número de grupos fosfato por moléculas de receptor refleja la cantidad de ligando unido en los últimos 1-10 minutos. Si ocurre un incremento en la cantidad de ligando, el correspondiente incremento en AMPc conduce a la fosforilación y desensibilización de más receptores, de modo que la producción de AMPc y las consiguientes respuestas activadas por éste permanecen más o menos constantes. Si el ligando desaparece, el receptor pasará a estar completamente desfosforilado y a un estado de alta sensibilidad, en cuyo caso podrá responder a concentraciones muy bajas de ligando. La figura 1.26 esquematiza el bucle de retroalimentación que controla la actividad de receptores acoplados a proteínas G.

Figura 1.25. Regulación de receptores de membrana.

Alternativamente, puede que el número de receptores no se modifique pero si su actividad, de modo que el receptor sea incapaz de unirse con el ligando o si bien puede unirse, el complejo receptorligando no induzca la respuesta celular normal. Los ejemplos mejor conocidos implican cambios en el estado de fosforilación de los receptores que causan la inactivación de estos (inactivación por fosforilación). Esta inactivación del receptor puede ser generada por mecanismos de retroalimentación (desensibilización homóloga); es decir, por moléculas diana de la propia vía activada por el complejo receptor-ligando (por ejemplo, las desensibilizaciones del receptor de EGF por PKC o del receptor ß-adrenérgico por PKA y ßARK, enzima activada por subunidades βγ y que solo fosforila a receptores que están acomplejados a ligando) o por otras vías de señalización. En este caso son bien conocidos los efectos de PKA en la inactivación de receptores, acoplados a proteínas G, activados por distintos ligandos (desensibilización heteróloga). La desensibilización de receptores tiene un papel importante en la regulación de la respuesta celular causada por el ligando, ya que permite a la

Figura 1.26. Control de la actividad de receptores acoplados a proteínas G.

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