LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

LAPORAN I
(ISOLASI DAN PEMETAAN DNA PLASMID)

KHAIRUL ANAM P051090031/BTK

BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010
0   

antara lain adalah : a). Lisis (pemecahan dinding sel). Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning. mempunyai penanda seleksi. Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan. yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti.. mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi. lipoprotein. DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia. karena relatif mudah dalam penanganannya. yaitu tahap kultivasi dan harvesting. 1994). et al. protein. plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi. b).ISOLASI DAN PEMETAAN DNA PLASMID TUJUAN Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA plasmid dan memetakan plasmid PGEM T Easy dengan digesti menggunakan beberapa enzim restriksi. e). c). membran luar terdiri atas lipopolisakarida. d). Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. fosfolipid. 2006). tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. dan peptidoglikan sedangkan 1    . membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam. TINJAUAN PUSTAKA Plasmid Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi.

yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti. Etanol berfungsi untuk memekatkan. sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. 1999). elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA.0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. 2    . DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid.membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. 2006) Elektroforesis Dalam kegiatan biologi molekuler. Spektrofotometer Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk menghilangkan protein dari larutan. EDTA (ethilendiamin tetraasetat). Ethidium mengikat molekul DNA. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi. memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno. digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). dan SDS (sodium dodesil sulfat). dan produk PCR. maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr). Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat.8-2. Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Untuk mengetahui jumlah DNA. Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. plasmid. kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi. 2002). Rasio OD260/OD280 antara 1.

iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli. DNA bermuatan negatif. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong 3    . Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. 2006). dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza. Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Ketika diletakkan di dalam medan listrik. yang berfungsi untuk i) menambah densitas. pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti. molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda). ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA. DNA merupakan molekul bermuatan negatif. Semakin besar arus yang diberikan. maka semakin cepat DNA bermigrasi. maka semakin lambat DNA bermigrasi. Selain itu. semakin tinggi prosentasenya. ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur. suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye). Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA.sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. sebagai asam organik. Sebelum dilakukan elektroforesis. Semakin rapat media yang digunakan. sehingga bila diletakkan dalam medan listrik. Enzim ini telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan dengan fenomena pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan modifikasi oleh virus bakteri. DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa. Bakteri pada mulanya tahan terhadap infeksi virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan dengan merusak molekul DNA asing yang masuk ke dalam selnya. Restriksi Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik.

Dnmt akan memetilasi basa DNA pada tiap untai sehingga sekuen yang dikenali oleh enzim restriksi tidak akan terpotong. dan ekspresi gen. kombinasi antara restriksi dan pemodifikasi yang memotong DNA pada area random yang jauh dari sisi pengenalan. coli memiliki enzim restriksi. misalnya DNA-metil transferase (dnmt). yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang dapat disambungkan kembali. Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam. Enzim tipe II memotong DNA pada posisi tertentu yang dekat atau berada di antara sekuen yang dikenalnya. kemungkinan infeksi virus akan menurun. Enzim ini memotong DNA di luar sekuen yang dikenal dan memerlukan 2 sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan pada untai DNA yang sama untuk dapat memotong. enzim restriksi dapat dibedakan ke dalam 3 tipe. Namun. Para peneliti dengan cepat segera mengetahui bahwa enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan untuk mempelajari organisasi. Enzim tipe II menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa. Enzim-enzim ini jarang menghasilkan potongan yang sempurna. Enzim-enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks. Enzim restriksi biasanya terdapat dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang melindungi DNA-nya sendiri dari pemotongan. Meskipun demikian. dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. maka sebagian besar partikel virus mampu menyebabkan infeksi. fungsi. Enzim tipe inilah yang dipakai untuk berbagai percobaan dalam analisis DNA dan kloning gen. jika bakteri E. Rasio enzim : DNA : volume reaksi ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam menentukan reaksi. Di antaranya adalah: gunakan jumlah DNA. coli yang tidak memiliki enzim restriksi diinfeksi virus. posisi pemotongan. Enzim tipe I secara biokimia mungkin banyak berfungsi di dalam sel. sebagian besar peneliti mengikuti pedoman umum reaksi digesti di mana 10 kali over-digesti direkomendasikan untuk mengatasi 4    . Secara umum. Jika bakteri E. Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan dengan enzim restriksi (enzyme digestion). berdasarkan pada komposisi sub unit. enzim.DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik. multisubunit. spesifisitas sekuen DNA. dan perlu tidaknya kofaktor. Enzim ini berperan dalam sistem imun pada mikroorganisme. Enzim restriksi melindungi bakteri dari infeksi virus. Enzim tipe III juga merupakan kombinasi restriksi dan enzim pemodifikasi. tetapi mereka kurang menguntungkan untuk digunakan dalam percobaan di laboratorium.

dapat dilakukan penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA. Jumlah dan ukuran fragmen yang dihasilkan oleh tiap-tiap endonuklease restriksi harus ditentukan dengan elektroforesis gel. EDTA. kloroform. Selain stabilitas. Hasil yang didapat harus didukung oleh hasil rangkaian digesti ganda. 5    . sebaiknya disimpan pada suhu -20°C untuk sebagian besar enzim. Pemetaan Plasmid Menurut Brown (1991) dan Glick and Pasternak (1994). Untuk menghentikan reaksi enzim. Sentrifus dengan cepat selama beberapa detik jika ada cairan yang menempel di dinding tabung.variasi dalam sumber. deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. alkohol. Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan memungkinkan pemetaan banyak tempat restriksi. Campur reaksi dengan baik dengan cara pemipetan atau menggoyang tabung reaksi. jumlah dan kemurnian DNA. dalam menyusun peta restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti restriksi. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. yaitu DNA dipotong dengan dua enzim restriksi secara bersamaan. Oleh karena itu. kemudian dibandingkan dengan ukuran marka. DNA plasmid superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya memerlukan lebih dari 1 unit/ug untuk dapat terpotong sempurna. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70°C. harga enzim restriksi pun mahal. Metilasi DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA harus terbebas dari kontaminan seperti fenol.

NaCl 10 g/l) lalu diinkubasi di atas shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37°C selama semalam. nilai absorbansi 260 nm dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA. yaitu 1 OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml. dilakukan sentrifugasi 10.2M NaOH. coli yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam 10 ml media LB (bacto tryptone 10g/l. Selanjutnya pelet dilarutkan ke dalam TE (Tris-HCl pH 8 10 mM.000 rpm (Tomy MRX-150) 4°C selama 10 menit. 6    . Untuk mengetahui kemurnian DNA terhadap kontaminan protein. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. Satu koloni bakteri E.BAHAN DAN METODE KERJA Isolasi DNA Plasmid Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini adalah E. coli yang telah tersisipi plasmid.5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung 1. Kemudian 1.000 rpm selama 10 menit pada 4°C. bacto-yeast extract 5g/l. Suspensi dihomogenkan dengan membolakbalik tabung (6-8kali) lalu didiamkan 3 menit.32M Na-asetat pH 4.000 rpm 4°C selama 10 menit.000 rpm 4°C selama 10 menit. Kemudian ditambah 200 ul buffer lisis (0.5 ml lalu diendapkan dengan sentrifugasi 10. Bufer netralisasi (1.2 sehingga larutan menjadi netral dan etanol absolut untuk mengikat air. EDTA 1 mM). Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. dilakukan sentrifugasi 10. 1% SDS). Setelah diinkubasi pada 30°C selama 2 jam. Pelet dibilas dengan etanol 70% kemudian disentrifugasi kembali 10.8) ditambahkan sebanyak 300 ul dan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung.5 + EDTA) dan di-vortex. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam konsentrasi. Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan mengambil 1 ul dalam 99 ul H2O atau TE. Kemudian DNA diendapkan dengan penambahan Na-asetat pH 5. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C semalam. Lalu endapan bakteri disuspensikan ke dalam 100 ul buffer suspensi sel (Tris HCl pH 7. Setelah itu.

EcoRI.3 40 mM. 3. 2. 2 ul larutan penyangga reaksi 10x (10%). 8. NotI dan EcoRI. 1 ul enzim restriksi (10 unit/ul) dan dH2O hingga volume larutan menjadi 20 ul dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 500 ul (dengan urutan: dH2O. Bila telah terpotong. 4. DNA plasmid. Selesai inkubasi. EDTA 1 mM). Sebanyak 1-2 ul DNA dicampur dengan larutan pewarna (loading dye. lalu dibiarkan beku. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas 10. DNA dimigrasikan kemudian setelah selesai migrasi. HindIII dan SacI. Selanjutnya. HindIII. 7.25%. Kemudian larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C. NotI. Enzim-enzim restriksi yang digunakan antara lain: 1. dilakukan elektroforesis kembali untuk menentukan ukuran plasmid dan fragmen-fragmennya. dan dilihat di atas UV setelah dicuci dengan H2O. Setelah suhu tidak terlalu panas (60°C). asam borat 83 mM. Bila DNA belum terpotong sempurna. xylene cyanol FF 0. 6. Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel. Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid Sebanyak 5-10 ug DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-fragmen. asam asetat pekat 1. EcoRI dan HindIII.Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam buffer TAE 1x (Tris-HCl pH 8. 7    . waktu inkubasi dan/enzim restriksi ditambahkan lagi. Sisir dilepas kemudian gel dipindah ke dalam electrophoresis chamber. 20 dan 50 ng. direndam dengan larutan etidium bromide. EDTA 1 mM) atau TBE 1x (Tris-HCl 100 mM. sukrosa 40%). NotI dan HindIII. enzim). dipanaskan hingga jernih dengan microwave. λ yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa. 5. gel dicetak dengan menggunakan gel tray (cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat sumuran. dilakukan elektroforesis untuk mengecek apakah enzim telah memotong DNA. aktivitas enzim dihentikan dengan memanaskan larutan DNA pada suhu 65-70°C. bromofenol biru 0. Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker.25%. larutan penyangga. SacI.98 mM.

Ekstraksi DNA dengan PCI   8  . yaitu 1. Gambar 2. 2. Pengendapan DNA. Gambar 1. ada tiga tahap penting yang perlu dilakukan. Lisis membran sel bakteri.HASIL DAN PEMBAHASAN   Isolasi DNA Plasmid Dapat diketahui bahwa dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri. 3. Kemudian larutan disentrifugasi untuk diambil supernatannya berupa lautan suspensi. Terjadinya proses lisis ditandai dengan terbentuknya lendir. Ektraksi DNA. Lisis dinding dan membran sel bakteri Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana SDS (sodium dodesil sulphate) merupakan deterjen yang berperan untuk melisis dinding atau membran sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA (DNA double strain menjadi single strain).

Protein. Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA plasmid berada. terdapat senyawa DNA plasmid.   9    . Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA setelah dilakukan pemurnian dan proses vakum dengan bantuan larutan buffer TE ataupun dH2O. Pelet yang didapat kemudian dimurnikan dengan penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi lagi untuk didapatkan pelet. Pada tahap ini tidak perlu dilakukan resuspensi karena apabila dilakukan resuspensi DNA akan sulit mengendap karena pH nya tidak netral lagi. Pemurnian DNA dengan etanol Fase air yang diambil kemudian diendapkan menggunakan sodium acetat untuk menciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi.Pada larutan suspensi sebelum diekstraksi. RNA. Senyawa Organik dan Komponen Lipid. protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya besar. Gambar 3. Ekstraksi dilakukan dengan adanya penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid.

Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer Dari DNA plasmid yang diisolasi diperoleh dilakukan kuantifikasi dengan menggunakan metode spektrofotometri.6 Dari data spektrofotometri dapat diketahui bahwa larutan DNA plasmid kemungkinan masih terdapat protein sebagai kontaminan dimana rasio antara absorbansi λ260/λ280 sebesar 1. 20 ng/ul.8 sehingga DNA plasmid yang didapatkan belum murni.66 konsentrasi ng/ul 110.333 Abs λ260/ Abs λ280 1.           Gambar 4. Hasil elusi isolasi DNA Plasmid 10    .66 adalah lebih kecil dari 1. Elektroforesis dilakukan sampai larutan pewarna menjauhi sumuran. Tabel 1. Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa Analisis menggunakan gel agarose dilakukan dengan melakukan elektroforesis DNA sampel bersama dengan DNA penanda kuantitas. 40 ng/ul. didapatkan hasil seperti pada Tabel 1. Nilai absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 dan 280 nm Kel 6 Abs λ260 2. Untuk kuantifikasi. jarak migrasi yang ditempuh tidak perlu terlalu jauh dan untuk menganalisis bentuk DNA.213 Abs λ280 1. Konsentrasi DNA penanda kuantitas yang digunakan adalah 10 ng/ul.

sehingga apabila larutan DNA yang dimiliki adalah 50 ul maka konsentrasi DNA yang diisolasi adalah 2000 ng/50 ul atau 40 ng/ul. pada praktikum diperoleh pita-pita hasil elektroforesis DNA plasmid yang telah direstriksi seperti yang terlihat pada Gambar 5. sedangkan yang bermigrasi paling dekat dengan sumur adalah pita DNA plasmid yang berbentuk open sirkuler. Dari hasil elektroforesisi pun dapat dikuantifikasi konsentrasi dari larutan DNA yang di dapatkan seperti pada kelompok 5. EcoRI  NotI  HindII SacI EcoRI  HindIII  NotI  I HindIII  SacI  HindIII    Gambar 5.5 ul untuk mendapatkan 100 ng DNA. DNA superheliks lebih kompak dibandingkan dengan DNA plasmid dalam keadaan open sirkuler atau linier.Dari hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa DNA plasmid yang terbentuk ada beberapa macam karena terbentuknya beberapa pita. untuk 1 ul DNA plasmid yang dielektroforesis mengandung bobot 40 ng. Hasil digesti DNA plasmid mengunakan beberapa enzim restriksi 11    . Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid   Hasil pemotongan DNA plasmid dengan beberapa enzim restriksi menghasilkan pita-pita dengan ukuran basa yang berbeda dan unik sesuai dengan enzim restriksinya masing-masing. pita DNA plasmid yang berada di tengah berbentuk linear. Kemungkinan pita-pita tersebut adalah DNA plasmid dimana plasmid berbentuk superheliks (ccc = covalently closed circular) bermigrasi paling jauh dari sumur. Semakin kompak suatu DNA maka akan bermigrasi semakin cepat sehingga pada saat yang bersamaan akan bermigrasi lebih jauh dibandingkan dengan bentuk yang kurang kompak. Sehingga ketika akan dilakukan restriksi maka larutan DNA yang dibutuhkan adalah sekitar 2.

sedangkan HindIII hanya memiliki satu situs pengenalan. SacI: 3711 bp + 113 bp 5. HindIII: 3824 bp 4. NotI: 3018 bp + 806 bp 2. EcoRI. pGEM T Easy  3824 bp HindIII  EcoRI. NotI dan HindIII: 3018 bp + 762 bp + 44 bp Maka dari data tersebut dapat diperoleh pemetaan enzim restriksi pada plasmid pGEM T Easy seperti yang terlihat pada Gambar 6. HindIII dan SacI: 3062 bp + 649 bp + 113 bp 7. Pemetaan plasmid pGEM T Easy Dari hasil pemetaan dapat diketahui bahwa SacI. EcoRI dan NotI memiliki dua situs pengenalan restriksi dimana satu situs pengenalan restriksi pada tempat yang sama. 1. NotI  SacI.                     Gambar 6. NotI  SacI  12    . EcoRI: 3018 bp + 806 bp 3.Dari hasil elektroforesis untuk proses restriksi diperoleh panjang fragmen sebagai berikut. EcoRI dan HindIII: 3018 bp + 762 bp + 44 bp 6. Situs pengenalan pengenalan EcoRI dan NotI memiliki jarak restriksi yang sama.

ASM Press. T. EcoRI dan NotI dan HindIII. D. DAFTAR ACUAN Brock. Washinton D. Muladno. Pengantar Kloning Gena (terjemahan). and J. IPB Bahan Kuliah dan Praktikum Rekayasa Genetika   13    . john M. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Glick. Biology of microorganisms. open sirkular dan diperoleh konsentrasi DNA 40 ng/ul.R. Brown. T.C. 1994. 3. Principles and applications of Recombinan DNA. sirkular. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi. Martinko and Paker. Teknik Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda. 1991. B. Dari hasil elektroforesis diperoleh beberapa tipe plasmid dari linear. 1994. Michael T. Yayasan Essentia Medica.6 ng/ul 2. diperoleh DNA plasmid yang kurang murni dan diperoleh konsentrasi plasmid sebesar 110. Bogor.J.. Dari isolasi DNA plasmid. Madigan. Molekuler Biotechnology. 2002.SIMPULAN 1.A. Pasternak. Prentice Hall. U. Suharsono dan Widyastuti. Dari hasil restriksi untuk pemetaan Plasmid diketahui pGem T Easy memiliki 4 situs restriksi dengan enzim SacI. 2006.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful