LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

LAPORAN I
(ISOLASI DAN PEMETAAN DNA PLASMID)

KHAIRUL ANAM P051090031/BTK

BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010
0   

Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning.. antara lain adalah : a). yaitu tahap kultivasi dan harvesting. et al. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti. DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia. mempunyai penanda seleksi. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. b). yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock. tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. dan peptidoglikan sedangkan 1    . 2006). Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA.ISOLASI DAN PEMETAAN DNA PLASMID TUJUAN Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA plasmid dan memetakan plasmid PGEM T Easy dengan digesti menggunakan beberapa enzim restriksi. lipoprotein. membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam. plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi. karena relatif mudah dalam penanganannya. protein. Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan. TINJAUAN PUSTAKA Plasmid Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Lisis (pemecahan dinding sel). 1994). e). membran luar terdiri atas lipopolisakarida. mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi. fosfolipid. d). c). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi.

maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). EDTA (ethilendiamin tetraasetat). 1999).8-2. plasmid. elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA. Untuk menghilangkan protein dari larutan.0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim. Rasio OD260/OD280 antara 1. Spektrofotometer Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk dapat divisualisasikan. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. 2006) Elektroforesis Dalam kegiatan biologi molekuler. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi. Etanol berfungsi untuk memekatkan. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno. yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti. Ethidium mengikat molekul DNA. digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi. sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk mengetahui jumlah DNA. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. dan SDS (sodium dodesil sulfat). Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. dan produk PCR. 2002). maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr). kemudian dilihat di atas sinar ultra violet.membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers. 2    .

DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Semakin rapat media yang digunakan. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong 3    . sebagai asam organik.sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. sehingga bila diletakkan dalam medan listrik. ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. semakin tinggi prosentasenya. pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. Enzim ini telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan dengan fenomena pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan modifikasi oleh virus bakteri. DNA merupakan molekul bermuatan negatif. sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur. DNA bermuatan negatif. ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA. Semakin besar arus yang diberikan. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA. maka semakin lambat DNA bermigrasi. Bakteri pada mulanya tahan terhadap infeksi virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan dengan merusak molekul DNA asing yang masuk ke dalam selnya. yang berfungsi untuk i) menambah densitas. molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda). suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye). Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli. iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Ketika diletakkan di dalam medan listrik. Sebelum dilakukan elektroforesis. Selain itu. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. 2006). Restriksi Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. maka semakin cepat DNA bermigrasi. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa. dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza.

Namun. Enzim-enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks. Enzim restriksi melindungi bakteri dari infeksi virus. maka sebagian besar partikel virus mampu menyebabkan infeksi. sebagian besar peneliti mengikuti pedoman umum reaksi digesti di mana 10 kali over-digesti direkomendasikan untuk mengatasi 4    . fungsi. Enzim tipe III juga merupakan kombinasi restriksi dan enzim pemodifikasi. Enzim ini berperan dalam sistem imun pada mikroorganisme.DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik. Enzim tipe II memotong DNA pada posisi tertentu yang dekat atau berada di antara sekuen yang dikenalnya. Enzim tipe II menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa. spesifisitas sekuen DNA. Di antaranya adalah: gunakan jumlah DNA. dan ekspresi gen. berdasarkan pada komposisi sub unit. Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan dengan enzim restriksi (enzyme digestion). enzim restriksi dapat dibedakan ke dalam 3 tipe. Jika bakteri E. kemungkinan infeksi virus akan menurun. multisubunit. Enzim ini memotong DNA di luar sekuen yang dikenal dan memerlukan 2 sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan pada untai DNA yang sama untuk dapat memotong. Enzim restriksi biasanya terdapat dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang melindungi DNA-nya sendiri dari pemotongan. dan perlu tidaknya kofaktor. Enzim tipe inilah yang dipakai untuk berbagai percobaan dalam analisis DNA dan kloning gen. coli yang tidak memiliki enzim restriksi diinfeksi virus. Meskipun demikian. Secara umum. enzim. yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang dapat disambungkan kembali. Rasio enzim : DNA : volume reaksi ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam menentukan reaksi. kombinasi antara restriksi dan pemodifikasi yang memotong DNA pada area random yang jauh dari sisi pengenalan. dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. misalnya DNA-metil transferase (dnmt). Enzim tipe I secara biokimia mungkin banyak berfungsi di dalam sel. Enzim-enzim ini jarang menghasilkan potongan yang sempurna. Para peneliti dengan cepat segera mengetahui bahwa enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan untuk mempelajari organisasi. tetapi mereka kurang menguntungkan untuk digunakan dalam percobaan di laboratorium. jika bakteri E. posisi pemotongan. Dnmt akan memetilasi basa DNA pada tiap untai sehingga sekuen yang dikenali oleh enzim restriksi tidak akan terpotong. Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam. coli memiliki enzim restriksi.

Metilasi DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. kloroform. 5    . yaitu DNA dipotong dengan dua enzim restriksi secara bersamaan. Jumlah dan ukuran fragmen yang dihasilkan oleh tiap-tiap endonuklease restriksi harus ditentukan dengan elektroforesis gel. Pemetaan Plasmid Menurut Brown (1991) dan Glick and Pasternak (1994). Selain stabilitas. Hasil yang didapat harus didukung oleh hasil rangkaian digesti ganda. dalam menyusun peta restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti restriksi. jumlah dan kemurnian DNA. kemudian dibandingkan dengan ukuran marka.variasi dalam sumber. deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan memungkinkan pemetaan banyak tempat restriksi. EDTA. DNA harus terbebas dari kontaminan seperti fenol. Oleh karena itu. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70°C. alkohol. Sentrifus dengan cepat selama beberapa detik jika ada cairan yang menempel di dinding tabung. DNA plasmid superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya memerlukan lebih dari 1 unit/ug untuk dapat terpotong sempurna. Campur reaksi dengan baik dengan cara pemipetan atau menggoyang tabung reaksi. Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Untuk menghentikan reaksi enzim. harga enzim restriksi pun mahal. sebaiknya disimpan pada suhu -20°C untuk sebagian besar enzim. dapat dilakukan penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA.

5 + EDTA) dan di-vortex. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37°C semalam. Satu koloni bakteri E. 6    . Suspensi dihomogenkan dengan membolakbalik tabung (6-8kali) lalu didiamkan 3 menit. bacto-yeast extract 5g/l. 1% SDS).5 ml lalu diendapkan dengan sentrifugasi 10. Lalu endapan bakteri disuspensikan ke dalam 100 ul buffer suspensi sel (Tris HCl pH 7. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan mengambil 1 ul dalam 99 ul H2O atau TE. Selanjutnya pelet dilarutkan ke dalam TE (Tris-HCl pH 8 10 mM. yaitu 1 OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml.000 rpm 4°C selama 10 menit. coli yang telah tersisipi plasmid. EDTA 1 mM). coli yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam 10 ml media LB (bacto tryptone 10g/l. Kemudian ditambah 200 ul buffer lisis (0. Untuk mengetahui kemurnian DNA terhadap kontaminan protein. Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemudian 1.000 rpm 4°C selama 10 menit.32M Na-asetat pH 4.000 rpm (Tomy MRX-150) 4°C selama 10 menit. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam konsentrasi.2M NaOH.2 sehingga larutan menjadi netral dan etanol absolut untuk mengikat air.000 rpm selama 10 menit pada 4°C. Pelet dibilas dengan etanol 70% kemudian disentrifugasi kembali 10. dilakukan sentrifugasi 10. NaCl 10 g/l) lalu diinkubasi di atas shaker dengan kecepatan 250 rpm pada suhu 37°C selama semalam. Setelah diinkubasi pada 30°C selama 2 jam. Kemudian DNA diendapkan dengan penambahan Na-asetat pH 5.5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung 1. Bufer netralisasi (1.8) ditambahkan sebanyak 300 ul dan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung. dilakukan sentrifugasi 10.BAHAN DAN METODE KERJA Isolasi DNA Plasmid Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini adalah E. Setelah itu. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan kandungan lipid-protein dengan DNA. nilai absorbansi 260 nm dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm.

DNA plasmid. 7.Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam buffer TAE 1x (Tris-HCl pH 8. EDTA 1 mM) atau TBE 1x (Tris-HCl 100 mM. DNA dimigrasikan kemudian setelah selesai migrasi. direndam dengan larutan etidium bromide. asam borat 83 mM. EcoRI. EDTA 1 mM).25%. Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid Sebanyak 5-10 ug DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-fragmen. Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker. HindIII dan SacI. bromofenol biru 0. SacI. larutan penyangga. Bentuk DNA plasmid ditentukan dengan melihat jumlah pita di dalam gel. Selesai inkubasi. 2.25%. Sebanyak 1-2 ul DNA dicampur dengan larutan pewarna (loading dye. NotI dan HindIII. Bila DNA belum terpotong sempurna.98 mM. 7    . 3. dipanaskan hingga jernih dengan microwave. aktivitas enzim dihentikan dengan memanaskan larutan DNA pada suhu 65-70°C. Setelah suhu tidak terlalu panas (60°C). Enzim-enzim restriksi yang digunakan antara lain: 1. Selanjutnya. 6. 2 ul larutan penyangga reaksi 10x (10%).3 40 mM. Kemudian larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C. enzim). λ yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa. HindIII. gel dicetak dengan menggunakan gel tray (cetakan gel) dan dipasang sisir untuk membuat sumuran. asam asetat pekat 1. 4. Sisir dilepas kemudian gel dipindah ke dalam electrophoresis chamber. NotI dan EcoRI. NotI. lalu dibiarkan beku. 20 dan 50 ng. dilakukan elektroforesis untuk mengecek apakah enzim telah memotong DNA. sukrosa 40%). 1 ul enzim restriksi (10 unit/ul) dan dH2O hingga volume larutan menjadi 20 ul dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 500 ul (dengan urutan: dH2O. dan dilihat di atas UV setelah dicuci dengan H2O. xylene cyanol FF 0. EcoRI dan HindIII. waktu inkubasi dan/enzim restriksi ditambahkan lagi. 8. 5. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas 10. Bila telah terpotong. dilakukan elektroforesis kembali untuk menentukan ukuran plasmid dan fragmen-fragmennya.

Ektraksi DNA.HASIL DAN PEMBAHASAN   Isolasi DNA Plasmid Dapat diketahui bahwa dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri. 2. Ekstraksi DNA dengan PCI   8  . Terjadinya proses lisis ditandai dengan terbentuknya lendir. 3. Gambar 2. Gambar 1. Lisis membran sel bakteri. ada tiga tahap penting yang perlu dilakukan. yaitu 1. Pengendapan DNA. Lisis dinding dan membran sel bakteri Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana SDS (sodium dodesil sulphate) merupakan deterjen yang berperan untuk melisis dinding atau membran sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA (DNA double strain menjadi single strain). Kemudian larutan disentrifugasi untuk diambil supernatannya berupa lautan suspensi.

Ekstraksi dilakukan dengan adanya penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Senyawa Organik dan Komponen Lipid. Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA plasmid berada. Gambar 3. Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA setelah dilakukan pemurnian dan proses vakum dengan bantuan larutan buffer TE ataupun dH2O. protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya besar. Protein. Pada tahap ini tidak perlu dilakukan resuspensi karena apabila dilakukan resuspensi DNA akan sulit mengendap karena pH nya tidak netral lagi. RNA. Pelet yang didapat kemudian dimurnikan dengan penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi lagi untuk didapatkan pelet. Pemurnian DNA dengan etanol Fase air yang diambil kemudian diendapkan menggunakan sodium acetat untuk menciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi.Pada larutan suspensi sebelum diekstraksi. terdapat senyawa DNA plasmid.   9    .

40 ng/ul. Hasil elusi isolasi DNA Plasmid 10    .Analisis Kemurnian DNA dan Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer Dari DNA plasmid yang diisolasi diperoleh dilakukan kuantifikasi dengan menggunakan metode spektrofotometri.8 sehingga DNA plasmid yang didapatkan belum murni. Analisis Kualitatif dan Kuantifikasi DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa Analisis menggunakan gel agarose dilakukan dengan melakukan elektroforesis DNA sampel bersama dengan DNA penanda kuantitas. Elektroforesis dilakukan sampai larutan pewarna menjauhi sumuran. 20 ng/ul.6 Dari data spektrofotometri dapat diketahui bahwa larutan DNA plasmid kemungkinan masih terdapat protein sebagai kontaminan dimana rasio antara absorbansi λ260/λ280 sebesar 1. Nilai absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 dan 280 nm Kel 6 Abs λ260 2. Tabel 1.333 Abs λ260/ Abs λ280 1. Konsentrasi DNA penanda kuantitas yang digunakan adalah 10 ng/ul.           Gambar 4. didapatkan hasil seperti pada Tabel 1.66 adalah lebih kecil dari 1. Untuk kuantifikasi.66 konsentrasi ng/ul 110.213 Abs λ280 1. jarak migrasi yang ditempuh tidak perlu terlalu jauh dan untuk menganalisis bentuk DNA.

pada praktikum diperoleh pita-pita hasil elektroforesis DNA plasmid yang telah direstriksi seperti yang terlihat pada Gambar 5.5 ul untuk mendapatkan 100 ng DNA. Hasil digesti DNA plasmid mengunakan beberapa enzim restriksi 11    . pita DNA plasmid yang berada di tengah berbentuk linear. Semakin kompak suatu DNA maka akan bermigrasi semakin cepat sehingga pada saat yang bersamaan akan bermigrasi lebih jauh dibandingkan dengan bentuk yang kurang kompak. sedangkan yang bermigrasi paling dekat dengan sumur adalah pita DNA plasmid yang berbentuk open sirkuler. sehingga apabila larutan DNA yang dimiliki adalah 50 ul maka konsentrasi DNA yang diisolasi adalah 2000 ng/50 ul atau 40 ng/ul. DNA superheliks lebih kompak dibandingkan dengan DNA plasmid dalam keadaan open sirkuler atau linier. untuk 1 ul DNA plasmid yang dielektroforesis mengandung bobot 40 ng. Dari hasil elektroforesisi pun dapat dikuantifikasi konsentrasi dari larutan DNA yang di dapatkan seperti pada kelompok 5.Dari hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa DNA plasmid yang terbentuk ada beberapa macam karena terbentuknya beberapa pita. Sehingga ketika akan dilakukan restriksi maka larutan DNA yang dibutuhkan adalah sekitar 2. Digesti dengan Enzim Restriksi pada Pemetaan DNA Plasmid   Hasil pemotongan DNA plasmid dengan beberapa enzim restriksi menghasilkan pita-pita dengan ukuran basa yang berbeda dan unik sesuai dengan enzim restriksinya masing-masing. Kemungkinan pita-pita tersebut adalah DNA plasmid dimana plasmid berbentuk superheliks (ccc = covalently closed circular) bermigrasi paling jauh dari sumur. EcoRI  NotI  HindII SacI EcoRI  HindIII  NotI  I HindIII  SacI  HindIII    Gambar 5.

 EcoRI.                     Gambar 6. EcoRI: 3018 bp + 806 bp 3. NotI  SacI. HindIII dan SacI: 3062 bp + 649 bp + 113 bp 7. HindIII: 3824 bp 4. sedangkan HindIII hanya memiliki satu situs pengenalan. NotI dan HindIII: 3018 bp + 762 bp + 44 bp Maka dari data tersebut dapat diperoleh pemetaan enzim restriksi pada plasmid pGEM T Easy seperti yang terlihat pada Gambar 6. EcoRI dan NotI memiliki dua situs pengenalan restriksi dimana satu situs pengenalan restriksi pada tempat yang sama. EcoRI dan HindIII: 3018 bp + 762 bp + 44 bp 6. 1. Situs pengenalan pengenalan EcoRI dan NotI memiliki jarak restriksi yang sama. NotI: 3018 bp + 806 bp 2. SacI: 3711 bp + 113 bp 5.Dari hasil elektroforesis untuk proses restriksi diperoleh panjang fragmen sebagai berikut. pGEM T Easy  3824 bp HindIII  EcoRI. Pemetaan plasmid pGEM T Easy Dari hasil pemetaan dapat diketahui bahwa SacI. NotI  SacI  12    .

Dari hasil elektroforesis diperoleh beberapa tipe plasmid dari linear.6 ng/ul 2. diperoleh DNA plasmid yang kurang murni dan diperoleh konsentrasi plasmid sebesar 110. 2006. Washinton D. Glick. Michael T. U. Suharsono dan Widyastuti. Martinko and Paker. 2002. Pengantar Kloning Gena (terjemahan). Bogor. Brown. Muladno. 3. Dari hasil restriksi untuk pemetaan Plasmid diketahui pGem T Easy memiliki 4 situs restriksi dengan enzim SacI. john M. T. IPB Bahan Kuliah dan Praktikum Rekayasa Genetika   13    . 1994. D. open sirkular dan diperoleh konsentrasi DNA 40 ng/ul. Molekuler Biotechnology. Pasternak. Yayasan Essentia Medica. Biology of microorganisms..SIMPULAN 1. DAFTAR ACUAN Brock. B. EcoRI dan NotI dan HindIII.J. ASM Press.A. and J. 1994. sirkular. Teknik Rekayasa Genetika. 1991. Madigan.C.R. Pustaka Wirausaha Muda. Principles and applications of Recombinan DNA. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi. T. Dari isolasi DNA plasmid. Prentice Hall. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful