Agrobiotecnología

Curso 2009

Ingeniería metabólica
Alejandro Mentaberry

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Sumario Factores relevantes en ingeniería metabólica
Modificaciones en las rutas de síntesis
de hidratos de carbono
Modificaciones en las rutas de síntesis
de ácidos grasos
Modificaciones en las rutas de síntesis
de aminoácidos
Modificaciones en las rutas de síntesis
de hormonas
Metabolitos secundarios
Modificación genética del metabolismo secundario
Modificaciones en las rutas de síntesis de
terpenoides
Modificaciones en las rutas de síntesis de
Agrobiotecnología
flavonoides y antocianinas

Ingeniería Modificaciones en las rutas de síntesis de alcaloides

metabólica
Referencias
 Factores relevantes
en ingeniería metabólica

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Factores
relevantes en
ingeniería • Conocimiento de las rutas metabólicas involucradas
metabólica • Regulación de las enzimas implicadas

• Disponibilidad de sustratos y afinidades enzimáticas

• Efectos fisiológicos

• Compartimentalización subcelular de la ruta

. metabólica

• Localización de la expresión en determinados

. tejidos u órganos

Agrobiotecnología • Regulación de la ruta metabólica durante el desarrollo

. y durante el fotoperíodo
Ingeniería
metabólica
Estrategias
para modificar
• Producir más cantidad del producto deseado
el metabolismo
mediante - Aumentar el flujo de la ruta biosintética
- Inhibir el catabolismo del producto
manipulación - Aumentar el número de células productoras
genética
• Producir menor cantidad del producto deseado
- Reducir el flujo de la ruta biosintética
- Aumentar el catabolismo

• Expresión de nuevos componentes

- Completar rutas metabólicas a partir de
precursores de la planta por inserción de
genes heterólogos
Agrobiotecnología
- Crear nuevas rutas metabólicas mediante
Ingeniería inserción de genes heterólogos
metabólica
Modificación Las técnicas
de rutas A disponibles permiten
prolongar (4,5),
metabólicas ↑
1, 1↑
ramificar (6, 7)
y bloquear
mediante 8 (8) rutas
ingeniería H B metabólicas.
El flujo metabólico
genética 2, 2*
puede también
incrementarse
por expresión
6 7 constitutiva
C F G de enzimas
claves (1↑)
3 o por neutralización
de los mecanismos
de retroalimentación
D por acumulación
de producto (2*).
4
Agrobiotecnología
5
Ingeniería
metabólica
E
 Modificaciones en las rutas
de síntesis de hidratos de carbono

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Aplicaciones de la celulosa, el almidón y otros azúcares

PRODUCTO APLICACIÓN

CELULOSA PAPEL, TEXTILES, FIBRAS QUIMICAMENTE MODIFICADAS,

COSMETICOS, EXPLOSIVOS.

ALMIDÓN PAPEL, CARTON, MATERIAL DE CONSTRUCCION,

ADHESIVOS, PLASTICOS, LAVANDERIA, COSMETICOS,
FARMACOS, BIOCOMBUSTIBLES.

AZÚCARES FARMACOS, TINTURAS, PINTURAS, ADHESIVOS, JABONES,

POLVOS PARA LAVAR, PLASTIFICANTES.

Producción mundial de hidratos de carbono

Materias primas Toneladas métricas (millones)
Celulosa 190 (2004)
Almidón 48,5 (2000)
Sacarosa 135 (2000)
Posibles
modificaciones
al metabolismo • Cambios de composición
de hidratos - Alto contenido de almidón
de carbono
- Almidón con alto y bajo contenido de amilosa
- Almidones con distinto grado de ramificación
- Almidones libres de amilopectina

• Reorientación de las rutas biosintéticas

- Obtención de ciclodextrinas a partir de almidón
- Síntesis de fructanos a partir de sacarosa
Agrobiotecnología - Obtención de azúcares-alcoholes
Ingeniería - Obtención de trehalosa
metabólica
Estructuras
de los
polisacáridos
componentes
del almidón

Amilosa: glucano α-1-4. Amilopectina: glucano α-1-4 glucano α-1-6

AGPasa: ADP-glucosa pirofosforilasa; GBSS: almidón sintetasa unida
al gránulo; SSS: almidón sintetasa soluble; BE: enzima ramificante

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica A B C
Tomado de: Visser and Jacobs, Trends in Biotechnology, 1993.

Estructura de gránulos de almidón A) maíz, B) papa y C) mandioca.

Rutas metabólicas de algunos hidratos de carbono

ATP ADP
AGPasa: ADP-glucosa
glucosa glucosa-6-P pirofosforilasa
2,3 Pi GBSS: almidón sintetasa
unida al gránulo
sacarosa 1 SSS: almidón sintetasa
ATP 2,
ADP soluble
3, 4
5 BE: enzima ramificante
6 fructosa

Pi
7 AGPasa
UDP-glucosa glucosa-1-P ADP-glucosa

UDP PPi UTP ATP PPi

1: invertasa GBSS SSS
8
2: hexoquinasa
3: hexosa-6-fosfatasa
amilosa
4: glucosa-fosfato isomerasa
5: fosfoglucomutasa BE SSS
6: sacarosa sintetasa
7: UDP-glucosa pirofosforilasa
amilopectina

8: fosforilasa del almidón Adaptado de: Visser and Jacobs, Trends in Biotechnology, 1993.
Sobreexpresión
de un gen • Problema:
mutado − La fructosa 1,6-bifosfato y el Pi actúan como efectores
positivo y negativo respectivamente sobre las ADP-glucosa
de ADP- pirofosforilasas vegetales regulando la síntesis de almidón.
glucosa
• Objetivo:
pirofosforilasa
− Superproducción de almidón.
de Escherichia
coli en plantas • Estrategia:
de Solanum − Clonar el gen glgC16 (ADP-glucosa pirofosforilasa)
de Escherichia coli mutada insensible a regulación por Pi.
tuberosum
p35S CPT glgC16 t-nos

• Resultados:
Agrobiotecnología

− La enzima transgénica se procesa correctamente y es

Ingeniería
metabólica activa en las células vegetales. Se transformó tomate,
tabaco y papa vía Agrobacterium tumefaciens.
Tomado de: Stark et al. Science, 1992.
Sobreexpresión Contenido de almidón en extractos de callos de tabaco transformados
de un gen con un gen glgC16 de Escherichia coli. Las líneas 1 a 6 expresan el
transgen; la línea 13 corresponde a una planta control no transformada.
mutado
de ADP-
glucosa
pirofosforilasa
de Escherichia
coli en plantas
de Solanum
tuberosum Tomado de: Stark et al. Science, 1992.

Porcentaje promedio de almidón en tubérculos de plantas transgénicas y control

Tipo Línea Gravedad SD % promedio

Agrobiotecnología de tubérculo vegetal Específica de almidón*

CTP-glg16 15 1,088 0,012 15,4

Ingeniería
metabólica
Control 21 1,068 0,010 11,4
* El porcentaje de almidón se calculó a partir de la gravedad específica.
Transformación de Solanum tuberosum con un gen
antisentido de la enzima ramificante del almidón
• Problema:
- El almidón de alta amilosa tiene gran demanda en la industria por sus
. propiedades funcionales. Existen pocos cultivos disponibles que lo producen.
• Objetivo:
- Producción de almidón con alta amilosa.
• Estrategia:
- Se transformaron plantas de papa con secuencias antisentido de los genes de las
enzimas ramificantes del almidón (genes sbe A y sbe B) obtenidas de papa.
• Resultados:
- El nivel de amilosa se incrementó. El Pi se incrementó en más de 5 veces.

Línea Actividad SBEa Contenido de amilosaa Fósforo

(U.g – 1 de peso fresco) (% de almidón total) µg g – 1 de almidón)
(µ

Tubérculo Hoja Colorimétrico Potenciométrico

Planta control 36,38 ± 1,07 10,05 ± 0,03 27,75 ± 1,9 25,59 498
201 0,32 ± 0,18 0,07 ± 0,07 59,37 ± 5,3 77,45 2600
202 0,05 ± 0,02 0,00 ± 0,03 62,01 ± 1,4 80,84 3000
208 0,13 ± 0,04 0,01 ± 0,02 64,58 ± 1,4 77,04 2600
a La media y el desvío estándar fueron calculados a partir de cuatro muestras. Tomado de: Schwall et al. Nature Biotechnology, 2000.
Transformación
Microscopía de luz de gránulos de almidón
de Solanum
A B
tuberosum
con un gen
antisentido
de la enzima
ramificante
del almidón C D

Tomdado de: Schwall G., et al. Nature Biotechnology, 2000.

Agrobiotecnología
A Vista de gránulos de una planta control con luz polarizada.
B Vista de gránulos de la línea transgénica 208 con luz polarizada.
Ingeniería C Tratamiento a 95oC durante 5 minutos y tinción con iodo de almidón
metabólica de una planta control.
D Tratamiento a 95oC durante 5 minutos y tinción con iodo de almidón
de la línea transgénica 208.
Modificaciones en las rutas de síntesis de hidratos de
carbono para obtener moléculas de utilidad económica

CITOSOL
trehalosa
VACUOLA
sacarosa
sacarosa
4 ciclodextrinas
1
UDP-glucosa
6
almidón
fructanos
amilopectina amilosa
glucosa-1-fosfato

2 5
glucosa-6-fosfato ADP-glucosa
almidón
libre de
manitol mio-inositol amilosa
hexosa-fosfato
fructosa-6-fosfato
3
CO2
pinitol
triosa-fosfato triosa-fosfato

1. Levano sacarasas y fructosil transferasas Pi

2. Manitol-1P-deshidrogenasa Pi
3. Mioinositol-O-metil transferasa GLUCOLISIS PLASTIDO
4. Trehalosa sintetasa
5. Antisentido de almidon sintetasas
6. Ciclodextrin-glicosil transferasas

Tomado de: Goddijn and Pen, Trends in Biotechnology, 1995.

Otros hidratos de carbono expresados en plantas
• Ciclodextrinas
- Oligosacáridos cíclicos α-1,4 compuestos por seis (ciclodextrina α), siete (ciclosdextrina β)
u ocho (ciclodextrina γ) unidades piranósicas.
- De estructura cilíndrica. Se usan como portadores de moléculas de interés o para remover
compuestos indeseables.
- La expresión de ciclodextrin glicosil transferasa de Klebsiella pneumoniae en amiloplastos
de papa permitió obtener ciclodextrinas α y β.
- El nivel de expresión alcanzado es de 0,001-0,01% del contenido total de almidón.

• Fructanos
- La expresión de levano sacarasa de Bacillus subtilis permitió acumular fructano
en tabaco y papa.
- El nivel de expresión alcanzado en tubérculos de papa es de 1-7% del peso seco
de los microtubérculos y de 1-30% en hojas.

• Alcoholes azúcares
- La expresión del gen de manitol-1-fosfato deshidrogenasa de Escherichia coli en tabaco
permitió la síntesis de manitol en hojas y raíces.
- La expresión del gen de myo-inositol O-metil transferasa de Mesembryanthemun crystallinum
permitió la síntesis de pinitol en tabaco.
Transformación de plantas de Solanum tuberosum
con genes de fructosiltransferasas y levanosacarasas

• Problema:

- Los fructanos y los levanos se producen en algunos órganos de las plantas

y en microrganismos en pequeñas cantidades.

• Objetivo:

- Producción de fructanos y levanos en tubérculos y raíces.

• Estrategia:

- Introducción de genes bacterianos o de hongos en plantas de papa y

remolacha.

35S 35S AIMV

AIMV cpy
cpy sacB
sacBooftfftf t-nos
nos

35Sl35S: Promotor doble del transcripto de 35S del CaMV; AIMV: enhancer traduccional del virus AlMV;
cpy: señal de transporte a vacuola de carboxipeptidasa Y de levadura; sacB: levano sacarasa de Bacillus subtilis;
ftf: fructosiltrasferasa de Streptococcus mutans; nos: terminador de nopalina sintetasa de A. tumefaciens
Tomado de: van der Meer et al. The plant cell, 1994.
Transformación de plantas de Solanum tuberosum
con genes de fructosiltransferasas y levanosacarasas

Comparación
de los niveles
de almidón y
fructano en
microtubérculos
de plantas
transgénicas
y controles

Tomado de :van der Meer et al. The plant cell, 1994.

WT1 a WT4: Plantas controles;
TP26, TP15, TP25 y TP11: Plantas transformadas con el gen ftf (Streptococcus mutans);
KP24, KP1, KP18, KP25, KP29 y KP15: Plantas transformadas con el gen sacB (Bacillus subtilis)
Transformación de plantas de Solanum tuberosum
con genes de fructosiltransferasas y levanosacarasas
Contenido de carbohidratos en hojas en diferentes estadíos de plantas
transgénicas y control

El nivel de carbohidratos totales se determinó en hojas jóvenes (y), de edad intermedia

(m) y viejas (o; casi senescentes) obtenidas de plantas control (WT) y de la línea KP29
que expresa el gen sacB de Bacillus subtilis

Tomado de: van der Meer et al., The Plant Cell, 1994.

Comparación de los contenidos Comparación de carbohidratos neutros

de almidón y de fructano en hojas. no estructurales totales (almidón,
glucosa, sacarosa, fructosa y fructano).
Transformación • El gen de la fructosiltransferasa
de Beta vulgaris 1-sst de Helianthus tuberosus
(Topinambo o Papa de Jerusalem) fue
con el gen 1-sst introducido en plantas de Beta
vulgaris.
de la fructosil-
• Esta enzima convierte la sacarosa en
transferasa de una mezcla de fructanos de bajo peso
molecular (GF2, GF3 y GF4).
Helianthus
tuberosus Tomado de: Sevenier et al., Nature Biotechnology, 1998.

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica

Planta joven de remolacha Planta de remolacha

no transformada transformada con el gen 1-sst
Transformación Cromatografía de intercambio aniónico de alta
de remolacha presión para detectar carbohidratos solubles

con el gen 1-sst Extractos de

bulbo de raíz
Extractos
de hojas
de la fructosil-

Respuesta PAD (unidades arbitrarias

transferasa de
Helianthus
tuberosus

Agrobiotecnología
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
Tiempo (min)
Ingeniería a) Remolacha no transformada; b) Línea transformada
Metabólica con el gen 1-sst; c) Mezcla de 20 mg/mL de glucosa
(G), fructosa (F), sacarosa (S), rafinosa (R), 1-kestosa
(GF2), nistosa (GF3) y fructofuranosil nistosa (GF4)
 Modificaciones en las rutas de síntesis
de ácidos grasos

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Producción mundial de los principales aceites y grasas
(en miles de toneladas)

Puesto Tipo de aceite 1990 1994 1998 2002 Part

(%)
1 Aceite de soja 15.386 17.819 23.123 25.790 24,13
2 Aceite de palma 11.445 14.723 18.304 25.084 21,89
3 Aceite de colza 8.178 9.818 11.538 12.445 12,48
4 Aceite de girasol 5.659 7.525 9.013 8.178 8,75
5 Manteca y ghee 7.795 6.627 6.931 7.925 7,32
6 Aceite de maní 3.838 4.783 5.400 5.348 5,00
7 Aceite de semilla de algodón 3.796 3.690 3.620 4.003 3,78
8 Aceite de coco 3.359 3.016 3.474 3.560 3,38
9 Aceite de almendra de palma 1.674 1.996 2.324 2.890 2,70
10 Aceite de oliva virgen 1.512 1.806 2.400 2.446 2,48
11 Aceite y grasas hidrogenadas 1.940 2.417 2.262 2.503 2,37
12 Aceite de maíz 1.323 1.625 1.911 2.017 1,95
13 Aceite de sésamo 667 609 737 754 0,75
14 Aceite de pescado 1.289 1.502 878 0 0,71
15 Aceite de linaza 667 686 694 679 0,69
16 Aceite de ricino 461 384 448 525 0,50
17 Otros aceites vegetales 420 454 442 454 0,45
18 Aceite de oliva residual (orujo) 138 173 217 217 0,21
19 Manteca de karité 145 166 176 184 0,18
20 Sebo de origen vegetal 116 119 120 125 0,12
21 Aceite de nueces de tung 76 81 80 88 0,08
22 Aceite de mostaza 54 51 55 61 0,06

Total 69.936 80.072 94.147 105.274 100 %

Tomado de: FAO Cálculos Observatorio Agrocadenas
Tipos de
ácidos grasos 22
erúcico

presentes 18
16
en aceites 14
12
vegetales cáprico
10
caprílico
linolénico

laurico 8

linoleico
mirístico COOH

palmítico
ricinoleico

esteárico oleico
Agrobiotecnología petroselínico

Ingeniería
metabólica Adaptado de: Töpfer and Martini W. Agricultural Biotechnology, 1998.

Los símbolos sólidos indican dobles enlaces ( ) y grupos funcionales

( ; hidroxilo). Los círculos indican el largo de la cadena carbonada.
Rutas biosintéticas de ácidos grasos
1: ∆4-palmitoil-ACP desaturasa
2 y 2’: β-cetoacil-ACP sintetasas
acetil-CoA + malonil-CoA plástido 3: acil-ACP tioesterasa
3 4: ∆9-estearoil-ACP desaturasa
C8:0 caprilato

3 5: oleoil CoA elongasa

C10:0 caprato

3 6: ∆12-oleoato desaturasa
C12:0 laurato
7: ∆12-oleoato hidrolasa
3
C14:0 miristato
8: ∆15-linolato desaturasa
3
C16:0 palmitato
9: ∆6-linolato desaturasa
1
∆4C16:1 ∆4C18:1 petroselinato
2’
2 3
3
C18:0 estearato

4 3
∆9C18:1 oleato

5 7
6
erucato linolato ricinoleato
CITOPLASMA 8 9
α-linolenato γ-linolenato

Adaptado de: Töpfer and Martini W. Agricultural Biotechnology, 1998.

Composición de ácidos grasos
de los aceites comestibles más comunes
Composición porcentual
Ácido graso
Acido Manteca de cacao Nuez Maíz Oliva Soja
6:0 0 <1,2 0 0 0
8:0 0 3,4-15 0 0 0
10:0 0 3,2-15 0 0 0
12:0 0 41-56 0 0 0
14:0 0,2-0,16 13-23 >0,1 0 <0,1
16:0 23,6-30,5 4,2-12 8,0-19 7-17,8 7,0-14
16:1 0,1-0,4 0 <0,5 0 <0,5
17:0 0,1-0,2 0 0 0-0,1 0
18:0 30,2-36,5 1,0-4,7 0,5-4,0 2,2-4 1,4-5,5
18:1 33,2-38,6 3,4-12 19-50 43,7-78,2 19-30
18:2 2,2-4,8 0,9-3,7 34-62 5-32,3 44-62
18:3 ~0,3 0 <2,0 0-1,5 4-11
20:0 0,7-1,4 <0,1 <1,0 0 <1,0
20:1 0 0 0 0-0,5 <1,0
22:0 ~0,2 0 <0,5 0 <0,5
24:0 0 0 <0,5 0 0
C 6:0 caproico; C 8:0 caprílico; C 10:0 cáprico; C 12:0 láurico; C 14:0 mirístico; C 16:0 palmítico; C 16:1 palmitoleico;
C17:0 margárico; C 18:0 esteárico; C 18:1 oleico; C 18:2 linoleico;C 18:3 linolénico; C 20:0 araquídico; 20:1 gadoleico;
C 22:0 behénico; C24:0 lignocérico
Tomado de: Broun et al., Annu. Rev. Nutr., 1999.
Acidos grasos no comestibles de semillas oleaginosas

Acido graso tipo Ejemplo Fuente real o potencial

Saturado de cadena corta C12-láurico cocotero, palma, Cuphea,

Umbelliferae

Monosaturado cadena larga C22:1-erúcico Cruciferae, Meadowfoam,

Lunaria

ω-hidroxilado C18:1-OH-ricinoleico poroto de ricino

Poliinsaturado C18:3-α-linolénico semilla de lino, Salvia hispanica

Conjugado C18:3 conjugado tung, caléndula

Dicarboxílico C6-adípico Umbelliferae

Ésteres de ceras C20, C22 éster Jojoba

Epoxi C18, C20 epoxi Vernonia, Crepis palaestina

Modificación
del
metabolismo
lipídico
• Obtención de ácidos grasos saturados

• Obtención de ácidos grasos monosaturados

• Obtención de ácidos grasos de cadena media

• Obtención de ácidos grasos con distintas

sustituciones

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Transformación de Brassica con un gen
antisentido de la estearoil-ACP desaturasa
• Problema:
- Los aceites con alto contenido de ácidos grasos saturados como palmítico y
esteárico tienen gran demanda industrial. La mayoría de las plantas producen
aceites con bajo contenido de ácidos grasos saturados.

• Objetivo:
- Producción de semillas de Brassica napus y Brassica rapa con altos niveles de
ácidos grasos saturados.

• Estrategia:
- Introducción de genes antisentido de la estearoil-ACP desaturasa de Brassica
rapa.

BI 35S npt II tml 3´ napin 5´ anti-desat napin 3´ ACP 5´ anti-desat ACP 3´ BD

Tomado de: Knutzon. et al., PNAS, 1992.

Construcción con dos copias en antisentido del gen de la estearoil-ACP desaturasa. napin 5’ y napin 3’: promotor
y terminador de napina; ACP 5’ y ACP 3’: promotor y terminador de la proteína transportadora de ácidos grasos.
Transformación
de Brassica Composición de ácidos grasos de dos clases de semillas obtenidas
de plantas de la línea transgénica 3242-T-1 de Brassica rapa.
con un gen
antisentido
de estearoil-
ACP
desaturasa

Porcentaje

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica

Tomado de: Knutzon et al., PNAS, 1992.

Transformación de Brassica con un gen antisentido
de estearoil-ACP desaturasa
Contenido de estearato
y de estearoil-ACP desaturasa
en semillas derivadas de la
línea transgénica 3242-T-1
y de plantas control
de Brassica rapa

Las barras representan el porcentaje

de estearato de cada semilla individual.
Debajo de los graficos de barras se
observan los Western blots
correspondientes revelados con un
anticuerpo contra estearoil-ACP
desaturasa.
Tomado de: Knutzon et al., PNAS, 1992.
Transformación • Problema:
de Arabidopsis - Los ácidos grasos saturados de cadena media son utilizados
en la industria cosmética. No se los encuentran en grandes
thaliana con cantidades en semillas de cultivos extensivos.
el gen de • Objetivo:
12:0 acil-ACP- - Producción de semillas de Arabidopsis thaliana con altos
tioesterasa de niveles de ácidos grasos saturados de cadena media.

Umbellularia • Estrategia:
- Se transformó Arabidopsis thaliana con un gen de la 12:0
californica acil-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica, que
interrumpe la elongación para producir ácido láurico .

Act. TE / 12:0 /semilla 12:0 (% mol

Planta
semilla (mU) (nmol) de AG totales)

21
21 324
324
4,4
4,4
10,6
10,6
Agrobiotecnología 16 16 260
260 4,6
4,6 12,1
12,1
19 19 903
903 6,7
6,7 16,4
16,4
Ingeniería 13 1080 6,4 23,5
metabólica 13 1080 6,4 23,5
Tomado de: Voelker et al., Science, 1992.
Acumulación de ácido láurico en líneas individuales de Arabidopsis
thaliana transformadas con el gen de la 12:0 acil-ACP-tioesterasa
Transformación
• Resultados:
de Arabidopsis - Se observó un alto contenido de ácido láurico con descenso
thaliana con concomitante de algunos ácidos grasos de cadena larga.
el gen de
12:0 acil-ACP-
tioesterasa de
Umbellularia
californica

Agrobiotecnología

Tomado de: Voelker et al., Science, 1992.

Ingeniería
metabólica Se determinó la composición de ácidos grasos por cromatografía
gas-líquido en 100 semillas maduras de cada planta. Barras verdes:
Plantas controles. Barras violetas: Línea transgénica 3828-13.
Alteraciones porcentuales en el perfil
de ácidos grasos de Brassica napus
• El aceite producido por Brassica napus posee en un alto contenido de ácido erúcico que
no resulta adecuado para uso alimentario.
• Con la inhibición de la expresión de la oleoil-CoA-elongasa se redujo a 0 la cantidad de
ácido erúcico, con el consecuente aumento de ácido oleico. El aceite obtenido resulta
comestible y fue denominado aceite de canola (canadian oil).

8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C22:1
Colza [+ a. erúcico] 3 1 17 14 9 50
Colza [–a. erúcico] [Canola] 4 2 62 22 10 0
ClTEg100 1 3
ClTEg200 7 15
ChTE 11 27
UcTE 50
CtTE 25
Bc ∆9DES 0.7
Bc ∆9DESas 40
Bn ∆12DES(fad2)as 83
Bn ∆12DES(fad2)as X IMC 129 88
ScKAS elong X Canola 20
Adaptado de: Töpfer and Martini. Agricultural Biotechnology, 1998.
ClTEg100 y ClTEg200: genes de acil-[ACP] tioesterasa de Cuphea lanceolata; ChTE: gen de acil-[ACP] tioesterasa de Cuphea hookeriana;
UcTE: gen de acil-[ACP] tioesterasa de Umbellularia californica; CtTE: gen de acil-[ACP] tioesterasa de Carthamus tinctorius; Bc∆9DES: gen
de ∆9 desaturasa de Brassica rapa (campestris); Bc∆9DESas: gen antisentido de ∆9 desaturasa de Brassica rapa; Bn∆12DES(fad2)as: gen
antisentido de ∆12 desaturasa de Brassica napus; Bn∆12DES(fad2)as x IMC129: planta Bn∆12DES(fad2)as cruzada con el mutante IMC129
de colza; ScKAS elong x Canola: gen de la β-cetoacil-[ACP] sintetasa de la elongasa de Somodnsia chinensis cruzada con Canola
 Modificaciones en las rutas
de síntesis de aminoácidos

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Posibles
Muchas semillas, frutas o turbérculos que se
estrategias utilizan para alimentación animal o humana son
para modificar deficientes en aminoácidos esenciales. En
el contenido de particular, se busca incrementar el contenido
aminoácidos de lisina en los cereales y el de metionina en
esenciales las leguminosas.

Existen diversas estrategias para cambiar la

composición aminoacídica :
1. Alteración de la regulación de la ruta de síntesis
de aminoácidos esenciales.

2. Expresión tejido específica de proteínas con

mejor composición aminoacídica.
Agrobiotecnología
3. Modificación de la secuencia de proteínas
Ingeniería de reserva.
metabólica
Modificación de la biosíntesis de aminoácidos esenciales para
eliminar la retroalimentación por acumulación de producto
La síntesis de lisina, treonina, isoleucina y metionina ocurre a nivel del cloroplasto

aspartato
aspartato
kinasa
inhibición por
feedback inhibición por
feedback

DHDPS

múltiples pasos
enzimáticos

treonina

isoleucina metionina
lisina

DHDPS: dihidrodipicolinato sintetasa

Tomado de: Tabe and Higgins, Trends in Plant Science, 1998.

Transformación de soja con los genes DHDPS de
Corynebacterium (dapA) y AK de Escherichia coli (lysC)
• Problema:
- En soja y en colza el contenido de lisina es del 7,2% y 12%, respectivamente
• Objetivo:
- Incrementar el contenido de lisina en semillas de soja y colza por la introducción
de genes de enzimas insensibles a la regulación por lisina.
• Estrategia:
- Utilizar los genes DHDPS de Corynebacterium glutamicum (dapA) y AK mutado
de Escherichia coli (lysC) insensibles a regulación.

35S gus tnos Pv 5´ cts dapA Pv 3´ Pv 5´ cts lysC Pv 3´

Pv 5’ y Pv 3’: promotor y terminador de faseolina
cts: péptido señal de transporte al cloroplasto Tomado de: Falco et al., Biotechnology, 1995.

• Resultados:
- La expresión del gen dapA produce un incremento de lisina libre unas 100 veces
mayor en canola y de hasta 25% más en soja. La expresión de ambos genes,
aumentó varios cientos de veces los niveles de lisina libre y hasta 5 veces el total
de lisina en semillas de soja.
Transformación de soja con los genes DHDPS de
Corynebacterium (dapA) y AK de Escherichia coli (lysC)
Contenido de lisina libre en semillas individuales de soja

Tomado de: Falco et al., Biotechnology, 1995.

Se extrajeron los aminoácidos libres de 10 semillas segregantes R1 para cada línea transgénica
y se determinó su composición. Se compara la línea A2396 (barras sólidas) con la línea A2396 (barras
vacías). Ambas líneas expresan los dos transgenes. Se indica la determinación de GUS, DHDPS y AK.
Contenido de metionina de distintas especies y modificación
de la composición proteica en cultivos de interés
Los niveles
Proteína tipo Proteína Contenido de Contenido de de aminoácidos
metionina metionina sulfurados en todas
( g 100 . g-1 proteína)a (% de residuos) las semillas
mencionadas varían
entre diferentes
Proteínas de Proteína de arveja 0,8 No determinada variedades;
semilla Proteína de lupino 0,6 No determinada sólo se mencionan
Proteína de soja 1,2 No determinada las más relevantes
en el contexto
Proteínas Zeína de maíz de 21 kDa 37 28 de modificar la
ricas en Albumina 2S B. excelsa 23 composición de
18 proteínas vegetales.
metionina Albúmina de girasol 20 16

Incremento Incremento
Cultivo Gen introducido de proteína de metionina
Maíz Zeína rica en medionina de 10 kDa 0,9 % 30 %
Tabaco Albúmina 2S de B. excelsa 8% 30 %
Canola Albúmina 2S de B. excelsa 4% 33 %
Soja Albumina 2S de B. excelsa 10 % 50 %
Haba Albumina 2S de B. excelsa 4,8 % 100 %
Lupino Albúmina 2S de H. annus 5% 100 %
Arveja Albúmina 2S de H. annus 2-5 % -----
Garbanzo Albumina 2S de H. annus 2-5 % -----
Tomado de: Tabe and Higgins, Trends in Plant Science, 1998.
Transformación de Brassica napus con el gen de la
albúmina 2S de Bertholletia excelsa (nuez del Brasil)
• La albúmina 2S de B. excelsa contiene 18,8 % de metionina
- El gen 2S se expresó bajo un promotor específico de semilla
(promotor de faseolina) y se introdujo en plantas de canola vía Agrobacterium.
- Se muestra la acumulación de albúmina 2S durante el desarrollo de las semillas.
- Se extrajeron las proteínas solubles totales a los 19, 22, 26, 29, 32, 36 y 40 días
luego de la antésis y se las analizó por PAGE y ELISA.

Niveles de albúmina 2S
acumulados en semillas de canola
determinados por ELISA a distintos
tiempos luego de la floración.
% de albumina 2S
de nuez del Brasil
Transformación de Brassica napus con el gen de la
albúmina 2S de Bertholletia excelsa (Nuez del Brasil)
• Las semillas de canola transgénica acumulan 1,7- 4,0 % de albumina 2S de
B. excelsa y pueden contener hasta 33 % más metionina que los controles

pARC12 B10-6 B13-1

metionina 2,64 2,94 3,52
(0,14) (0,12) (0,39)
Los números entre paréntesis corresponden a las desviaciones estándar. La columna pARC12
muestra los datos para una planta control transformada con el vector vacío. Las columnas B10-6 y
B13-1 muestran datos de líneas transgénicas que expresan el gen de la albúmina 2S de B. excelsa.

• Las semillas de tabaco contienen aproximadamente 16,5 % más de metionina

que los controles

Tob pARC12 3 32 34 67
metionina 3,60 3,54 4,47 4,74 3,95 4,31
(0,23) (0,13) (0,31) (0,16) (0,14) (0,31)
Los números entre paréntesis corresponden a las desviaciones estándar. Tob y PARC12 representan
proteínas de plantas control (tabaco no transformado o transformado con el vector vacío).
Las columnas 3, 32, 34 y 67 corresponden a líneas transgénicas de tabaco que expresan la albúmina
2S de B. excelsa.
Transformación de Solanum tuberosum con el gen de la
albúmina AmA1 de semillas de Amaranthus hypocondriacus
• Problema:
- El valor nutritivo de Solanum tuberosum está limitado por el contenido de
aminoácidos sulfurados, lisina y tirosina.
• Objetivo:
- Introducir una proteína con una composición balanceada en términos
de aminoácidos esenciales.
• Estrategia:
- Introducir el gen AmA1 de la albúmina de Amaranthus hypocondriacus en
Solanum tuberosum. Se expresó el gen en forma constitutiva o tubérculo
específica (pSB8 y pSB8G respectivamente).

pSB8 BD pnos nptII tnos 35S AmA1 tnos BI

pSB8G BD pnos nptII tnos pGBSS AmA1 tnos BI

Tomado de: Chakraborty et al., PNAS, 2000.

• Resultados:
- Se observaron incrementos en prácticamente todos los aminoácidos.
Las plantas transgénicas contienen más proteína en los tubérculos en
comparación con los de las plantas control.
Transformación de Solanum tuberosum con el gen de la
albúmina AmA1 de semillas de Amaranthus hypocondriacus

Transformación de plantas de papa Composición de aminoácidos

Con el gen AmA1 de Amaranthus de tubérculos de las plantas
hypocondriacus. Características transgénicas de papa pSB8G-5 y pSB8-3
de los tubérculos de plantas transgénicas en comparación con la de las plantas
(derecha) y controles (izquierda). controles no transformadas.

Tomado de: Chakraborty et al., PNAS, 2000.

El histograma muestra la cantidad de veces en que se incrementó el contenido de cada

aminoácido en las plantas transgénicas respecto de los controles.
 Modificaciones en las rutas
de síntesis de hormonas

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Modificaciones
genéticas
para controlar metionina

la síntesis
del etileno S-adenosil metionina
ACC sintasa

ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico
(ACC)
ACC deaminasa ACC oxidasa
(Pseudomonas spp)

etileno

Agrobiotecnología
α-cetobutirato + NH3
Ingeniería Tomado de: Stearns and Glick, Biotechnology Advances, 2003.
metabólica
Transformación • Problema:
de especies - El tiempo requerido para la comercialización de flores y
frutos se reduce debido a la producción de etileno que
de interés acelera su maduración y/o senescencia.
para controlar • Objetivo:
la síntesis - Inhibir la producción de etileno para retardar
de etileno la maduración y la senescencia.
• Estrategia:
- Introducir el gen antisentido de la ACC-sintetasa o
de la ACC-oxidasa, o el gen de la ACC-deaminasa de
Pseudomonas para reducir la síntesis de etileno. Se
transformaron melón, tomate, clavel, brócoli y tabaco
con dichas construcciones.

35S npt II tnos 35s´ ACC-oxidasa tnos

Tomado de: Stearns and Glick, Biotechnology Advances, 2003.

Agrobiotecnología
• Resultados:
Ingeniería
metabólica - En melones se obtuvo una inhibición en la producción de
etileno. Las plantas controles produjeron hasta un 340%
más de etileno que las plantas transgénicas.
Transformación Melones obtenidos
A
de especies a partir de plantas
de interés transformadas con
el gen antisentido
para controlar de la ACC-oxidasa
la síntesis de manzana (AS1)
de etileno B
y control a los15 d
postcosecha

A: cortes de melones control

y transgénico AS1
B: Aspecto externo de melones
control y transgénico AS1

Plantas de clavel
transformadas con
un gen antisentido
Agrobiotecnología de la ACC oxidasa

Ingeniería
metabólica
Planta transgénica (izquierda)
Planta control (derecha).
Transformación Distintas vías utilizadas para lograr la inhibición
de especies reversible de la maduración de tomate
de interés
A B C
para controlar Genes antisentido
la síntesis de ACC sintetasa
de etileno
D E F
Genes antisentido
ACC oxidasa

G H
Expresión de
un gen de ACC
deaminasa
Tomado de: Theologis, Current Opinion in Biotechnology, 1994.
Agrobiotecnología
A: fruto de planta control mantenida en aire por 60 días. B: fruto de planta transgénica
mantenida en aire por 78 días. C: fruto de planta transgénica mantenida en atmósfera
Ingeniería de 10 ppm de etileno por 78 días. D: frutos de planta no transformada mantenidos en
metabólica aire. E: frutos de planta transgénica mantenidos en aire. F: frutos de planta transgénica
mantenidos en atmósfera de 10 ppm de etileno. G y H: fruto de planta no transformada
y de planta transgénica respectivamente mantenidos a 20oC en aire por 138 días.
Transformación de Petunia hybrida con el gen de isopentenil
transferasa bajo un promotor específico de senescencia

• Problema:
- Las flores comienzan su senescencia una vez polinizadas.
• Objetivo:
- Evitar la senescencia por la inducción de síntesis de citoquininas.

• Estrategia:

- La isopentenil transferasa es la enzima limitante en la síntesis de

citoquininas. Su sobreexpresión durante la senescencia incrementa
el nivel de citoquinina y retrasa este proceso.

pSAG12 ipt tnos

Tomado de: Chang et al., Plant Physiology, 2003.

Transformación de Petunia hybrida con el gen de isopentenil
transferasa bajo un promotor específico de senescencia
• Resultados:
- Las líneas transformadas retrasaron su senescencia de las flores
de 6 a 10 días luego de la polización respecto a las controles.

Flores controles sin transformar

0 24 48 72 96 120
Flores psag12-ipt

0 24 48 72 96 120

144 168 192 216 240 264

Tomado de: Chang et al., Plant Physiol., 2003.
 Metabolitos secundarios

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Los metabolitos La producción de metabolitos secundarios:
secundarios
no son - No es necesaria para el crecimiento y desarrollo
de la planta per se y no forma parte de las
esenciales principales estructuras celulares.
per se para
- Distribuidos en forma especie-específica.
las funciones
vitales - Depende de condiciones determinadas .
de control hormonal.
de las plantas
- Es paralela al desarrollo de tejidos especializados .
y órganos (raíces, tallos, hojas y glándulas).

- La biosíntesis y acumulación suele estar .

. fuertemente compartimentalizada a nivel
. intracelular, celular, de tejidos y de órganos.

Agrobiotecnología - La biosíntesis puede ser inducida por estreses

Ingeniería
. abióticos (radiación UV, presión osmótica, metales
metabólica . pesados, etc.) bióticos (elicitores microbianos:
. oligosacáridos, proteínas, metiljasmonato, etc).
Los metabolitos
secundarios El metabolismo secundario regula
Concepto
son necesarios muchas de las relaciones
general
para la de la planta con el medio circundante
supervivencia
Propiedades biológicas de importancia ecológica
en el
ecosistema - Protección contra herbívoros y microorganismos:
fitoalexinas y fitoanticipinas
- Atracción de polinizadores y animales que
dispersan semillas: pigmentos y esencias
volátiles
- Agentes alelopáticos: aleloquímicos que influyen
en la competencia entre diferentes especies
Agrobiotecnología
de plantas
- Estreses abióticos: pigmentos y osmolitos que
Ingeniería
metabólica
protegen de la radiación UV, presión osmótica,
toxicidad de metales pesados, etc.
Las plantas • Potencial:
como fuente
- 75% de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de las
de metabolitos . plantas.

secundarios - Sólo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-300.000

. especies vegetales que se creen existentes en el planeta.
de interés
- 25% de los medicamentos de las industrias farmacéuticas son de origen
comercial . vegetal.
- 75% de la población mundial utiliza la medicina tradicional que consiste
. principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas.

• Metabolitos secundarios de importancia

económica:
- Compuestos que determinan la calidad de los alimentos (color, sabor y
. aroma).
- Compuestos que determinan la calidad de las plantas ornamentales
Agrobiotecnología . (color y aroma).

Ingeniería - Compuestos utilizado en la producción comercial de colorantes,

metabólica . fragancias e insecticidas.
- Compuestos de uso medicinal con actividad antioxidante y antitumoral.
Ejemplos de
terpenoides
producidos
en plantas Se conocen
unos 25.000
AzadiractinaA
AzadiractinaA terpenoides
( antinutriente dedeinsectos)
( antinutriente insectos) α-Ecdisona
(disruptor de la muda de insectos)
presentes
en plantas

Ecogenina Digitoxigenina
( aglicona de una saponina; ( aglicona de digitoxina; tratamiento
detergente) de congestiones cardíacas)

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica Taxol Forbol Costunólido
( droga anticancerígena) ( irritante y co-carcinogénico) ( repelente de insectos ;
antinutriente de mamíferos)
Ejemplos de Rizoma de ginger

fenólicos
derivados de Unos 8.000 fenólicos
fenilpropanoides se forman en las
Pimiento rojo y negro
gingeroles plantas por las rutas
del ácido shikímico o
del malonato/acetato

norhidrocapsaicina

capsaicina
Granos de café

piperina

ácido clorogénico

Corteza de canela
Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
cinnamaldehido
Ejemplos de alcaloides producidos en vegetales

Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina

Cinchona
officinalis

Cocaína

Quinina

Erythroxylon coca
Coffea arabica Cafeína

Se han caracterizado unos 12.000 alcaloides en plantas

Algunas de las medicinas más importantes o sus
precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002
Nombre Tipo Origen Uso terapéutico
Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$
Hiosciamina, Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinérgicos
escopolamina
Camptotecina Alcaloide indólico Camptotheca Antineoplásico
acuminata
Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgésico local
Codeína, morfina Alcaloide opiáceo Papaver somniferum Analgésico
Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota
Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa
Pilocarpina Alcaloide imidazólico Pilocarpus jaborandi Colinérgico
Nicotina Alcaloide pirrolidínico Nicotiana spp. Terapia antitabaco
Quinina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Antimalárico
Quinidina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Cardiotónico
Reserpina Alcaloide indólico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrópico
Vinblastina, Alcaloide indólico Catharanthus roseus Antineoplásico
vincristina
Yohimbina Alcaloide indólico Apocynaceae, Afrodisíaco
Rubiaceae
Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$
Artemisinina Lactona sesquiterpénica Artemisia annua Antimalárico
Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales
Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Antitumoral
Glicósidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$
Digoxina, digitoxina Glicósidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotónico
Sennósidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante
Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$
Ipecac Mezcla de alcaloides de Cephaelis Emético
ipecacuana ipecacuanha
Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplásico
 Manipulación genética del metabolismo
secundario

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Limitaciones
• Se ha estudiado bien el metabolismo secundario de
para la unas pocas plantas; los metabolitos secundarios son
manipulación especie-específicos.
genética del
• Existe un conocimiento limitado de las vías de
metabolismo biosíntesis, tanto a nivel de sus componentes como
secundario a nivel regulatorio.

• Se han aislado pocos genes y en muchos casos

se desconocen las funciones de las proteínas
codificadas por los mismos.

• Existe un riesgo potencial de toxicidad en alimentos

asociado con el aumento o producción de nuevos
metabolitos.
Agrobiotecnología
• Se requiere conocer el perfil exacto de los
Ingeniería metabolitos (metaboloma) que produce una planta
metabólica modificada genéticamente. Los métodos
de análisis están actualmente en desarrollo.
Requerimientos
para la Se requieren conocimientos sobre:
manipulación
genética del • Intermediarios y productos finales de las rutas
metabolismo biosintéticas

secundario • Enzimas que regulan las rutas biosintéticas

• Pasos limitantes, enzimas alostéricas, vías

competitivas de la ruta biosintética principal

• Compartimentalización subcelular de las rutas

biosintéticas

• Células o tejidos productores específicos

Agrobiotecnología
• Rol que cumple el metabolito secundario en
Ingeniería la planta
metabólica
Los factores
de transcripción Factores de transcripción
pueden • Permiten la modificación del metabolismo
utilizarse como induciendo o reprimiendo un subconjunto
de genes estructurales dentro de una vía
herramientas metabólica específica.
para la
modificación
del
metabolismo Ejemplos:
secundario
• Familias de factores de transcripción R.
. y C1 (regulación positiva de la síntesis de
. antocianinas en maíz)
Agrobiotecnología • Factores de transcripción de tipo C1
Ingeniería
. (regulación negativa de la síntesis de
metabólica . flavonoides por Myb4 en frutilla)
Los factores
de transcripción Ventajas y limitaciones del uso de factores
pueden de transcripción:
utilizarse como
herramientas • Permite la activación o inhibición simultánea
de los genes involucrados en una vía
para la metabólica.
modificación
del • Evita efectos no deseados producidos
por la existencia de pasos limitantes
metabolismo en la vía metabólica.
secundario
• Permite la modulación del flujo de una ruta
metabólica sin un conocimiento profundo
de los componentes que la conforman.
Agrobiotecnología
• Se limita a modificar vías metabólicas
Ingeniería preexistentes sin originar nuevas rutas.
metabólica
Blancos de la
manipulación • Modificación de la síntesis de terpenoides
genética del
- Alteración de las fragancias y sabores de
metabolismo los alimentos
secundario - Producción y sobrexpresión de vitaminas
- Producción de compuestos farmacológicos

• Modificación de la síntesis de flavonoides

- Producción de compuestos nutracéuticos
- Modificación de la coloración floral

• Modificación de la síntesis de alcaloides

Agrobiotecnología
- Aumento y producción de compuestos
Ingeniería farmacológicos
metabólica - Modificación de la calidad de los alimentos
 Terpenoides

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Terpenoides
• Monoterpenos
- Esencias volátiles de flores y frutos
- Aceites esenciales de hierbas y especias
- Compuestos defensivos

• Sesquiterpenos
- Aceites esenciales de hierbas y especias
- Compuestos defensivos
- Repelentes de herbívoros

• Diterpenos
- Acidos de resinas coníferas y legumbres
- Drogas farmacológicas

• Triterpenos
- Compuestos defensivos
Agrobiotecnología - Repelentes de herbívoros
- Drogas farmacológicas
Ingeniería
metabólica • Tetraterpenos
- Carotenoides
Aumento • Problema:
de los niveles Los tomates sin aroma son percibidos por el público como
de s-linalol productos de baja calidad. El aroma está determinado por la
relación azúcares/ácido cítrico y por unos 400 compuestos
por volátiles.
modificación
• Solución:
de la vía Aumento del nivel de s-linalol, un alcohol monoterpeno
de los preponderante en el aroma y sabor del tomate.
monoterpenos • Estrategia:
Transformación con el gen heterólogo de la s-linalol sintetasa
(LIS) de Clarkia breweri bajo la dirección del promotor E8,
específico del estadío tardío de maduración del tomate.

pE8 Linalol sintetasa t-tml

Agrobiotecnología

Ingeniería Se transformaron 2 variedades de tomate con poco aroma:

metabólica UC82B: variedad de tomate para procesado
CB3: variedad de tomate fresco
Aumento
Linalol: alcohol monoterpeno acíclico presente en los
de los niveles tomates frescos que le otorga un aroma dulce y floral.
de s-linalol
por
modificación
de la vía
de los
monoterpenos

Agrobiotecnología
g

Ingeniería
Se desvió la vía de los terpenoides que lleva a la formación
metabólica
de carotenoides por sobrexpresión de la linalol sintetasa en
plástidos, lo que lleva a la producción de s-linalol.
La modificación de la vía de los monoterpenos en tomate produce un
aumento de los niveles de s-linalol pero no de su enantiómero r-linalol

Presencia de s-linalol y 8-hidroxilinalol Composición enantiomérica del linalol

en tomates transgénicos maduros acumulado en los tomates transgénicos

Tomado de: Lewinsohn et al., Plant Physiol., 2001.

Niveles de s-linalol y otros terpenoides en tomates maduros
de plantas control y transgénicas para linalol sintetasa

µg g-1 peso fresco (±

± DE)

Líneas γ-tocoferol α-tocoferol β-caroteno S-linalol

CB3 Transgénica LIS 10,45 (0,31) 8,49 (0,82) 5,53 (0,56) 0,31 (0,01)

CB3 Control 11,07 (0,09) 7,02 (0,09) 3,00 (0,48) 0,00 (0,00)

UC82B Transgénica LIS 11,83 (0,34) 7,45 (0,75) 3,35 (0,60) 0,25 (0,05)

UC82B Control 10,40 (0,98) 6,40 (1,82) 4,80 (0,14) 0,00 (0,00)
Tomado de: Lewinsohn et al., Plant Physiol., 2001.

• Se observa la producción de s-linalol en las dos variedades de tomates

transgénicos; las plantas control no producen este compuesto.
• El nivel de carotenoides y otros terpenoides no se ha modificado
sustancialmente.
Modificación
de la Mentha piperita (menta)
composición
del aceite
esencial de
Mentha piperita

Tomado de: Katzer, http://www-ang.kfunigraz.ac.at/~katzer/engl/generic_frame.html?Ment_pip.html

Los monoterpenos son los principales componentes del

Agrobiotecnología
aceite esencial de la familia de la menta (Lamiaceae),
Ingeniería
siendo el mentol y la mentona los principales
metabólica monoterpenos (50 y 10-30%, respectivamente) presentes
en el aceite esencial de Mentha piperita.
Modificación • Problemas:
de la La falta de luz, sequedad y altas temperaturas favorecen la
producción y acumulación de los monoterpenos mentofurano
composición y pulegona en el aceite esencial de menta. Estos componentes
del aceite disminuyen el aroma y gusto de la menta.

esencial de • Solución:
Disminuir la acumulación de metabolitos indeseables como
Mentha piperita mentofurano, y maximizar la producción de mentol.

• Estrategia:
- Sobrexpresión de la enzima 1-deoxi-xilulosa-5-fosfato
reductoisomerasa (DXR).
- Supresión de la expresión de la enzima mentofurano
sintetasa (MFS) por expresión transcriptos antisentido del
del gen de MFS.

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica

Tomado de: Katzer, http://www-ang.kfunigraz.ac.at/~katzer/engl/generic_frame.html?Ment_pip.html

Desregulación de la síntesis de monoterpenos para modificar
la composición de aceites esenciales de Menta piperita

DXR: 1-deoxi-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa

MFS: mentofurano sintetasa
Niveles de ARNm de 1-deoxixilulosa-5-fosfato
reductoisomerasa en plantas transgénicas y control
Hojas inmaduras Hojas maduras

Modificado de: Mahmoud et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2001.

De las plantas transgénicas, la mayoría presentó un fenotipo normal, y algunas presentaron una pigmentación
anormal (sugiriendo inhibición de la síntesis de clorofila) y en mosaico. La utilización de un promotor constitutivo
permitió la expresión del gen dxr en hojas jóvenes y maduras de plantas transgénicas. Por el contrario, en las
hojas maduras de plantas no transformadas la expresión de este gen se encuentra normalmente reprimida.
Composición de aceites esenciales en plantas
transgénicas y control de Menta piperita
Porcentaje
Planta Mentona Mentofurano Pulegona Mentol

Salvaje 45,9 16,8 8,0 6,9

DXR6 45,0 15,7 6,1 12,7

DXR
SENTIDO DXR32 46,1 12,5 5,7 13,9

DXR46 45,3 5,1 1,7 27,0

MFS1 35,0 2,5 0,2 23,1

MFS
MFS3 63,7 2,5 0,7 12,7
ANTISENTIDO
MFS7 53,5 2,5 0,8 19,5

Modificado de: Mahmoud et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 98: 8915-8920, 2001.

• En las plantas DXR, la producción total del aceite esencial se incrementó en un 50% y se
observó un aumento en los niveles de mentol.
• En las plantas MFS, la producción total del aceite esencial fue similar a la de las plantas
control. Los niveles de mentofurano y pulegona disminuyeron y los de mentol aumentaron.
Expresión
Artemisia annua L.
del gen
de la farnesil
difosfato
sintetasa
en Artemisia
annua L.

• Hierba aromática utilizada en la medicina

tradicional china para el tratamiento de la fiebre.
Agrobiotecnología • Unica fuente de artemisina, sesquiterpeno
Ingeniería
con actividad contra Plasmodium falciparum,
metabólica parásito que es el agente causal de la malaria.
Expresión Problema:
del gen Aparición de cepas de Plasmodium falciparum
de la farnesil resistentes a las tradicionales drogas antimaláricas

difosfato Objetivo:
sintetasa Desarrollo de fuentes alternativas de drogas
antimaláricas
en Artemisia
Solución:
annua L.
Obtención de plantas transgénicas de Artemisia
annua L. que expresen altos niveles de artemisina.
Estrategia:
Sobrexpresión de la enzima farnesil difosfato
sintetasa (FDS) de Gossipium arboreum en plantas
de Artemisia annua L.

Agrobiotecnología

Ingeniería 35S CaMV Farnesil difosfato sintetasa t-nos

metabólica
Expresión Transgénica Control
del gen
de la farnesil
difosfato
sintetasa
en Artemisia
annua L.

Se observa
un aumento
de 2-3 veces
de artemisina
Agrobiotecnología en plantas
transgénicas.
Ingeniería
metabólica

Tomado de: Chen et al., Plant Science, 2000.

Expresión y
sobreproducción
de provitamina A
en plantas de Problema:
Oryza sativa
• Las deficiencias en distintas vitaminas afectan a
muchos millones de personas que se alimentan
con dietas restringidas.

• Particularmente, la carencia de vitamina A,

cuyo precursor es el β-caroteno, causa ceguera,
xeroftalmia y muerte prematura.

• Se estima que 124 millones de niños padecen esta

deficiencia a escala mundial y sólo en el sudeste
asiático 250.000 niños quedan ciegos cada año por
esta causa.
Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Expresión y
sobreproducción
Solución:
de provitamina A
• En términos generales, muchos cultivos alimentarios
en plantas de podrían ser suplementados con vitaminas, lo que
Oryza sativa permitiría cubrir fácilmente los requerimientos
alimentarios mínimos.

• Una posible solución es sobrexpresar pro-vitamina A

en alimentos básicos de las poblaciones carenciadas,
tales como el arroz.

• En el caso de la vitamina A, la administración de

su precursor, el β-caroteno (pro-vitamina A) tiene
ventajas sobre el producto final porque puede
acumularse en el organismo sin efectos nocivos.

Agrobiotecnología • Las rutas de síntesis de vitaminas pueden ser

introducidas en las especies que no las poseen
Ingeniería en la medida en que se conozcan bien las enzimas
metabólica participantes.
La ruta de síntesis de β-caroteno fue introducida en arroz
por transformación con genes heterólogos
Estrategia:
• El arroz produce geranil-geranil difosfato,
precursor de los β-carotenos, pero carece
de las enzimas correspondientes
a esta ruta biosintética.
• Se sobrexpresaron enzimas que completan
la vía biosintética del β-caroteno que no
están presentes en arroz.
• Para producir la pro-vitamina A en arroz,
la planta fue transformada con los genes de
fitoeno desaturasa de Erwinia uredovora y de
fitoeno sintetasa y licopeno ciclasa de
Narcissus pseudonarcissus

glutelina Fitoeno sintetasa t-nos

CaMV35S Fitoeno desaturasa t-nos

CaMV35S Licopeno ciclasa t-nos

Desarrollo de líneas de “Golden Rice” que cumplan
con las regulaciones para consumo humano

A B
pmi 35S Gt-1 psy 35S ps crtl

pmi: fosfomanosa isomerasa

psy: fitoeno sintetasa, crtl: fitoeno desaturasa bacteriana
psy
SSU-ps: péptido señal de la subunidad menor de la RUBISCO
35S: promotor de 35S del CaMV; Gt-1: promotor - de glutelina
C D

E F

IR 64 control (A) y transgénicas (B a F)

G H

Taipei 309 control (G) y transgénicas (H)

Análisis de carotenoides en semillas T1 control y transgénicas
Tomado de: Hoa et al., Plant Physiology, 2003.
 Flavonoides

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Flavonoides
• Los flavonoides son un grupo diverso formado
por compuestos polifenólicos de bajo peso molecular.

• Se producen principalmente en la epidermis de

las hojas, frutos, semillas y flores.

• En las plantas cumplen diversas funciones:

- Protección contra luz UV (pigmentos UV-B)
- Atracción de polinizadores
- Defensa contra patógenos (fitoalexinas) o plagas
(compuestos antinutricionales)
- Activadores de los genes de nodulación
- Fertilidad y germinación del polen

• Son importantes componentes de la dieta debido

a sus efectos benéficos en la salud humana y animal:
Agrobiotecnología - Antioxidantes (quercetina y epicatequina)
- Antitumorales (genisteína)
Ingeniería
metabólica
- Antiarterioescleróticos
- Antiinflamatorios
Biosíntesis de flavonoides

Los flavonoides se clasifican en cinco grupos según su estructura central (aglicona)

Estructuras de las antocianinas

Pelargonidina Cianidina Delfinidina

Pelargonium Rosa Delphinium

Modificación
genética • La producción de flores de corte se ha convertido
del color en una industria en el siglo XX y la floricultura
en flores continúa en expansión.

• Se han obtenido variedades con características

deseables, tales como color, forma, arquitectura
floral, vida en el vaso y resistencia a patógenos
por mejoramiento clásico. Un obstáculo de este
proceso es el reservorio genético limitado
existente para cada especie individual.

• Se pueden alterar los caracteres agronómicos

y ornamentales si se conocen los genes
apropiados y si existen métodos de transformación
para estas especies.

Agrobiotecnología • Una vez obtenidas las variedades transgénicas,

su viabilidad comercial depende de la estabilidad
Ingeniería y mantenimiento en el tiempo del fenotipo modificado.
metabólica
Modificación
de la coloración
floral en petunia
por expresión
del gen de la
dihidroflavonol-4-
reductasa (dfr)
Cultivar transgénico que
expresa el gen dfr de maíz

La expresión del gen

de dihidroflavonol-4-
reductasa (dfr) de maíz
en una línea de petunia
que acumula
dihidrokemferol debido
a dos mutaciones en los
genes de flavonol
3’ hidroxilasa (f3’h) y
Agrobiotecnología flavonol 3’-5’ hidroxilasa
(f3’5’) induce la síntesis
Ingeniería del pigmento
metabólica pelargonidina,
Tomado de: Mol et al., Tredns in Biotechnology,1995.
de color ladrillo.
La rosa azul:
• En los 90, los investigadores de la compañía australiana
una promesa Florigene clonaron los genes de dos enzimas de petunia
pendiente que producen el pigmento azul delfidinidina: la flavonoide
3’5’ hidroxilasa (F3’5’H) y la dihidroflavonol reductasa (DRF).
de la
pH vacuolar alcalino Delfinidina = azul
biotecnología
pH vacuolar ácido Delfinidina = rosa
de plantas
• Obtuvieron rosas transgénicas estables pero las flores no
ornamentales eran azules debido al pH vacuolar ácido de la rosa.
• Finalmente, la compañía logró transformar claveles (Dianthus
carophyllus) obteniendo seis variedades comerciales de
claveles transgénicos que van desde el lila hasta el violeta.

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Biosíntesis de flavonoles y antocianinas

Los flavonoides se clasifican en cinco grupos según su estructura central (aglicona)

Transformación de Dianthus carophyllus con los genes flavonoide
3’5’ hidroxilasa y dihidroflavonol reductasa de Petunia hybrida

Claveles transgénicos con diferentes coloraciones de azul comercializados por Florigene

Incremento
• Objetivo:
del nivel de
flavonoles en Mejorar la capacidad nutritiva del fruto del tomate
aumentando los niveles de flavonoles en su pulpa
tomate por
sobrexpresión • Estrategia:
de factores de Activación de la vía de síntesis de los flavonoides por
expresión de los factores de transcripción C1 (familia
transcripción . MYB) y L1 (familia MYC) de maíz en fruto de tomate.

L1

L1

Agrobiotecnología L1

Pe8: promotor E8 de tomate

Ingeniería
Pds35S: promotor 35S CaMV doble
metabólica Trbc: terminador transcripción subunidad menor de rubisco
Tnos: terminador transcripción de nopalina sintetasa de Agrobacterium
El uso de dos factores de transcripción permite la activación
simultánea de la vía de síntesis de flavonoles en tomate
35SC1/E8LC
Líneas transgénicas Transgén Producción de flavonoides
(No de serie) en pulpa de tomate

100 35SC1 -
200 E8LC -
2500 35SC1/E8LC +
3000 E8C1/E8LC +
500

• Ambos factores de transcripción son

requeridos para activar la vía de síntesis
de flavonoides en la pulpa de tomate.

• Se observa un aumento de la actividad

antioxidante de los tomates
transgénicos 35SC1/E8LC debido a la
acumulación de los flavonoles kemferol

control
y naringenina. Se obtuvieron resultados
similares con la construcción E8SC1/E8LC
Tomado de: Bovy et al., Plant Cell, 2002.
 Alcaloides

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica
Modificación
• Existe un gran interés comercial en incrementar
de la síntesis el contenido de ciertos metabolitos secundarios
de alcaloides de uso medicinal en las plantas que los producen.
en Atropa • El alcaloide del tropano escopolamina es un importante
anticolinérgico presente en varias plantas Solanáceas.
belladona
• Atropa belladona produce altos niveles hiosciamina
y muy poca escopolamina.
• La enzima que realiza la conversión entre estos dos
compuestos (hiosciamina 6 β-hidroxilasa) fue aislada
de Hioscyamus niger.

Hiosciamina Hiosciamina
6 β-hidroxilasa 6 β-hidroxilasa
H6H H6H

Agrobiotecnología

Ingeniería
metabólica Hiosciamina 6 β-Hidroxihiosciamina Escopolamina
Modificación
de la síntesis • Objetivo:
de alcaloides Aumentar la expresión de
escopolamina, importante
en Atropa droga anticolinérgica, en
belladona Atropa belladona.

• Estrategia:
Transformación de Atropa belladona con el gen
que codifica la enzima hiosciamina hidroxilasa (H6H)
de Hyosciamus niger bajo la regulación del promotor
constituvo 35S de CaMV.

Agrobiotecnología
35S CaMV H6H Hyosciamus niger t-nos
Ingeniería
metabólica
Modificación de la síntesis de alcaloides en Atropa belladona

Tomado de: Yun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992.

• Más del 92% del total de los alcaloides presentes en hojas, tallos y raíces principales
de las plantas control es hiosciamina.
• Las plantas transgénicas T0 y T1 expresaron casi exclusivamente escopolamina
en las partes aéreas. En las raíces la conversión a escopolamina no fue tan eficiente.
Desarrollo
de plantas • Problema:
de café con - Existe una creciente demanda de
bajo nivel café descafeinado debido a los
efectos adversos que la cafeína
de cafeína produce en personas sensibles.
- La obtención de café descafeinado
por métodos industriales es cara
y el café pierde sabor.

• Objetivo:
- Obtención de plantas de café (Coffea canephora)
que produzcan menos cafeína

• Estrategia:
Agrobiotecnología
- Disminución de la expresión de la enzima teobromina
Ingeniería sintetasa por ARN de interferencia. La secuencia 3´ no
metabólica codificante del gen CaMXMT1 se utilizó para diseñar
fragmentos cortos y largos de ARNi.
Desarrollo de plantas de café con bajo nivel de cafeína

En la biosíntesis de la cafeína están

involucradas tres N-metiltransferasas: reducción de
teobromina
del 30-80%
- CaXMT1 teobromina sintetasa
- CaMXMT1 teobromina sintetasa
- CaDXMT1 cafeína sintetasa

reducción de
cafeína del
50-70%

Salvaje ARN-S

• Se obtuvo una reducción de hasta

un 70% en los niveles de cafeína.
Tomado de: Ogita et al., Nature, 2003.
Conclusiones
y perspectivas • La sobrexpresión de uno o mas genes de una vía metabólica
puede resultar en un aumento en la producción
de un determinado metabolito.

• En otros casos, dicha sobrexpresión resulta en la acumulación

de compuestos no deseados o inhibe la acumulación del
compuesto que se desea sobrexpresar.

• Se requiere una mejor caracterización de las enzimas que

intervienen en las rutas del metabolismo secundario:
especificidad, cofactores requeridos, regulación, control por
retroalimentación de producto.

• La inducción de toda una ruta metabólica por sobrexpresión

de factores de transcripción ha demostrado ser eficiente
y marca una tendencia en el futuro de la ingeniería metabólica.
Agrobiotecnología
• Los conocimientos adquiridos en el futuro permitirán establecer
Ingeniería modelos de flujo metabólico en plantas superiores similares a
metabólica los desarrollados en el caso de los microorganismos.
Referencias 1. Stearns, J.C. and Glick, B.R. Transgenic plants with altered ethylene biosynthesis
or perception. Biotechnology Advances, 21:193-210, 2003.
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Abbadi, A., and Heinz, E. Metabolic engineering of fatty acids for breeding of new
oilseed crops: strategies, problems and first results. Journal of Plant Physiology,
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Plant Phisiology,160:811-820, 2003.
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caroternoids. Nature, 5:406-409, 2000.
10. Mol, J., Cornish, E., Mason, J. and Koes, R. Novel coloured flowers. Current
Agrobiotecnología Opinion in Biotechnology, 10:198-201, 1999.

Ingeniería
metabólica