PARCIAL PRACTICO - Resumen

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PARCIAL PRACTICO - Resumen
por keichi_saotome » 25 Jun 2010 15:59

Bueno, ahi va un pequeño

resumen de detalles a tener en cuenta para el parcial de este sábado:

TP 1: Preparación de DNA plasmídico
Lo más importante es entender qué se hizo, y básicamente, el TP gira en torno a:

Lisis alcalina - Resuspensión diferencial - Centrifugación

SOLUCIONES UTILIZADAS:

1) Solución de resuspensión (Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM pH8). Su función es resuspender a las bacterias y "dejar todo listo" para el paso siguiente. Tris-HCL es un sistema buffer a pH 8. A pH básico (es decir, a baja concentración de H+ ), se favorecen dos cosas: • • La repulsión entre cargas negativas de los grupos fosfato de los ácidos nucléicos. La repulsión entre cargas negativas entre cabezas polares de los fosfolípidos de membrana.

EDTA es un quelante de cationes divalentes Ca2+ o Mg2+. Esto produce también dos cosas:

• •

Secuestra iones Mg2+, que son cofactores de las nucleasas, impidiendo que estas enzimas "hagan su trabajo". Secuestra iones Ca2+, desestabiliza las membranas de las bacterias.

Además, al ser una solución hipotónica ("menor concentración de sales de este lado de la membrana que del otro") el agua entra a las células por ósmosis y se favorece su ruptura por el aumento de presión.

2) Solución de lisis alcalina (NaOH 200 mM, SDS 1%). Su función es lisar las bacterias. El SDS es, como ya sabemos (obvio ) un detergente iónico que forma micelas con los fosfolípidos de

membarna y, por ende, los hace solubles. Desnaturaliza también a las proteínas al romper uniones débiles que prducen su estructura 3D. El NaOH aumenta el pH y desnaturaliza todo!

Eso sí, recuerden que el DNA plasmídico, si bien se desnaturaliza, sus dos hebras quedan "concatenadas" (o sea, juntas ), el DNA genómico se fragmenta durante la lisis y el RNA es parcialmente degradado.

3) Solución de renaturalización (K+AcO- 3M pH 4.8, o "Acetato de Potasio" para los amigos...) Bueno, este es ácido, por lo que lo primero que hace es neutralizar todo lo básico que veníamos agregando.

¿Sólo se renaturaliza el DNA plasmídico? ¡Ni a ganchos! El DNA genómico también y lo que que haya quedado de RNA también. 5)Alcohol 70% Simplemente se utiliza para lavar el pellet. Básicamente. que hace que las moléculas rápidamente pierdan energía cinética y no se puedan despegar si "no les gusta su pareja". sacándonos de encima las sales que puedan haber quedado. no detectaríamos actividad de la &beta -galactosidasa. hace que con menos volumen se logre el mismo efecto. pero como están fraccionados. si ponemos un inserto en el plásmido. apuntan uno para cada lado..Además los iones K+ ahora vienen a aportar su carga positiva para compensar las cargas negativas de las hebras de DNA permitiendo su renaturalización. ahora quedan "pedazos" de ácidos nucléicos que se van hibridando al azar. la solución en conjunto va a ser menos polar. Teniendo en cuenta que el isopropanol tiene una cadena carbonada (no polar) más grande que el etanol. Los promotores PT3 y PT7. hay una que por ahí está un poco complicada la explicación en la guía (o al menos a mí me costó entenderla). obvio). que es la parte del gen Lac Z. Los demás. no es tan difícil. y si ponemos algo menos polar. por lo que. el Polylinker (la parte donde uno corta con enzimas de restricción para meter algún inserto) esta DENTRO del gen Lac Z. las interacciones entre el soluto (DNA) y el solvente (agua + isopropanol) son más débiles.. podemos transcribir en uno u otro sentido. si nos basamos solamente en lo que hicimos en el TP. La pregunta 5. centrifugación". Pregunta 6: Acá no se si hay mucho para decir. renaturalización diferenciada.. Toooodo eso se ve favorecido por la incubación en frío. que es "Lisis alcalina. 4) Isopropanol Primero y principal: Es un alcohol.. SOBRE LAS PREGUNTAS DE LA GUIA: Las primeras 3 están respondidísimas en la explicación de los plásmidos que hay en la misma guía. este gen estará "apagado" o knockeado. a las proteínas las sacamos con la renaturalización rápida y al RNA lo sacaron solo algunos grupos tratando la muestra con RNasas. Esto sumado a que el K+ reemplaza al Na+ en el SDS. y por ende. .. Al agregar un alcohol en una solución hace que disminuya la polaridad el medio (es menos polar que el agua. De estas. si se fijan en el dibujo.) Al ser la solución menos polar. Estos son promotores de esos dos fagos (T3 y T7) y si tenemos RNA pol de alguno de esos fagos. favorecida por haber mantenido al concatenación de sus hebras. creo que se entienden bien en la guía. que nos pregunta en qué se basan los métodos de extracción plasmídica. En la pregunta 4 preguntan sobre las partes del plásmido.. forma una malla entre los DNA y las proteínas mal renaturalizadas. se respondería con lo primero que dije (con un poco de explicaciones. disminuyendo la solubilidad de este.

Para eliminar proteínas. OJO. las fuerzas de rozamiento o fuerza de viscosidad.. La segunda es la lineal. también disminuye su aceleración con el aumento de masa. en la que la molécula "ocupa más lugar". forma una red estabilizada por interacciones débiles que forma estos poros de los que hablamos recién. lavás con etanol al 70% (que es lo que hicimos en el TP) --------------------------------------------------------------------------------- TP 2: Electroforesis en geles de agarosa El fundamento es simple: Las moléculas de ADN están TODAS cargadas negativamente por su esqueleto de grupos fosfato. recuerden la fórmula de la Fuerza que vimos en dinámica: F = m x a. Básicamente. requiere que entendamos las 3 formas topoisoméricas del DNA plasmídico. los 10 microlitros no nos interesan. Al ser más chica la molécula.. al ser disuelta. pero solo en una dimensión y la más lenta es la forma circular abierta (CA) que es más grande en el plano (o sea. y entonces "pierde tiempo" moviéndose buscando la forma de avanzar. como la molécula de DNA tiene más cargas negativas cuanto más grande es. va a haber menos cantidad de poros por los que esta pueda pasar.La pregunta 7 está también bastante explicada en la guía. la aceleración de las moléculas es también constante. que es la forma superenrollada o CCC (coiled-coil circle) y bueno. pasa más fácilmente por los poros. (Se entiende???) La velocidad final a la que migren las moléculas tiene que ver con la resistencia del medio. Si además tenés sales. El DNA plasmídico se renaturaliza de manera correcta porque es chiquitito y las proteínas se unen unas con otras y forman una red que precipita con la centrifugación. Si las sometés a un campo eléctrico. desnaturalizás y renaturalizás rápido. Lo de la forma. Esto ya está explicado (read above) En la pregunta 9. Si bien aumenta la fuerza con el aumento de carga de la molécula. La agarosa. ¿no? La pregunta 8 habla sobre las soluciones. es decir. Otra forma que se me ocurre es tratar la muestra con proteasas. que es lo que queremos. Mientras más cargada esté una molécula. Si es un plásmido con alto número de copias.. es muy compacta. . por lo que corre con mucha facilidad. al clonar vamos a tener mucho plásmido. Como la relación carga/masa en las moléculas de DNA es relativamente constante. mientras más grande es la molécula. ya que depende de cuánto "le cuesta" a la molécula pasar por los poros del gel de agarosa. van a ir al polo positivo (ánodo). ¿De que forma afectan la forma y el tamaño a la corrida de las partículas? Lo del tamaño es bastante fácil de entender. el polo positivo "tira con más fuerza" de ella y.. ya lo dijimos dos veces. la cual depende del tamaño y la forma de la molécula. La primera es la forma en la que la molécula se encuentra in vivo. la fuerza con la que el ánodo atrae a la molécula es mayor. pero te quedan las proteasas! A esta la eliminás como dijimos antes. en dos dimensiones).

Si nos vamos hacia los extremos. pero solamente en los valores medios.5 M pH 8 100 ml y H2O hasta llegar a un litro). EDTA 0. El bromuro de etidio es un compuesto aromático que se intercala entre las bases nitrogenadas del DNA. Azul de bromofenol 0. pero al estar intercalado entre las bases. simplemente cumple la función de ejercer resistencia a la corrida de las partículas. . esta fluorescencia aumenta 20 veces. por lo que los valores obtenidos cercanos a estos extremos van a ser cada vez menos precisos. que lo vamos a ver después. Con el glicerol nos aseguramos de que quede depositada en nuestra calle de corrida.8%. si no lo pusiéramos. Bromuro de etidio 10 mg/ml y TAE 1X) La agarosa.1% y glicerol 15%). El Xilene-cianol y el Azul de bromofenol son colorantes que corren como moléculas de DNA de 5kpb y 500pb respectivamente. echamos la muestra en el gel y esta difunde y se nos pierde en el buffer de corrida. Acido acético glacial 57. También llamado "loading buffer" y es lo que agregamos a al muestra para poder sembrarla en el gel. Cosas a tener en cuenta: • No se puede hacer una medición del tamaño de moléculas en la forma superenrollada. El glicerol le da densidad a la muestra.1%. Es el líquido que va encima del gel. mayor será esta resistencia (útil si queremos analizar moléculas pequeñas). Buffer de siembra 3X (Xilene-cianol 0. y mientras más concentrada esté. en primer lugar. Este compuesto fluoresce en el naranja al ser irradiado con luz UV. basados en una curva de calibración realizada a partir del marcador de PM.SOLUCIONES UTILIZADAS: 1) Solución de agarosa (Agarosa 0. Buffer de corrida (TAE 50 X) (Tris base 242g. necesitamos mantener un pH básico para asegurarnos de que ningún protón nos neutralice la carga del DNA. es preciso. ¿Para qué? Bueno. El TAE es simplemente un buffer.1 ml. Pero más importante aún es que necesitamos que haya sales disueltas (o sea. secuestrando cationes divalentes. partículas cargadas). ya que el agua pura NO CONDUCE LA ELECTRICIDAD! El EDTA colabora. Nos sirven para darnos cuenta de cuándo detener la corrida (tengamos en cuenta que mientras hacemos la corrida no vemos el DNA. ¿Por qué utilizamos un buffer en lugar de agua? Bueno. Los primeros dos compuestos forman el buffer. al graficar log(PM) en función de la distancia recorrida. por lo que estos colorantes son nuestra única referencia. vemos que se empiezan a separar cada vez más de la linea de tendencia. ya que moléculas de DNA del mismo tamaño pueden estar enrolladas de distinta manera y correr a distintas velocidades • El método para calcular los tamaños. en mantener este pH.

pero tinen una explicación bastante resumida en la guía por las dudas. Transformación: Las bacterias competentes logran obtener moléculas de DNA desnudo del medio extracelular. McLeod y Mc Carty descubrieron que esa transformación se debía al DNA y no a proteínas. Con respecto a la 5ta pregunta. Lo que nos preguntan luego es qué pasaría si tratamos a la muestra con una enzima de restricción con un solo sitio de corte por molécula de plásmido. ya que pueden haber distintas secciones con tamaños iguales (o lo suficientemente similares como para que no detectemos la diferencia). se lo queda en gran parte el RNA) CUESTIONARIO: La primera pregunta ya fue explicada. La tercera y la cuerta pregunta también fueron respondidas. etc. muchas de estas cargas se neutralizarían y la molécula no correría en la electroforesis. EN EL LABORATORIO: . Si utilizáramos un buffer de pH 3. --------------------------------------------------------------------------------- TP 3: Transformación bacteriana Lo más importante: Las bacterias tienen 3 formas de intercambio de información genética. La segunda nos pregunta si sl pH del buffer es importante. Este DNA puede ser degradado. Si no sabemos cómo es el plásmido. y no sabemos el tamaño. nos piden que expliquemos qué pasa si dañamos mecánicamente a las moléculas. y también se explicó que la poca concentración de H+hace que las moléculas de DNA mantengan su carga negativa. y nos da una banda correspondiente al plásmido en la forma lineal. Esta capacidad es transitoria y asociado a crecimiento rápido y falta de nutrientes. Esto es simplemente porque la cantidad de RNA que tenemos en la muestra es muy grande y el bromuro de etidio "no alcanza" para todas las moléculas (o sea. hidratos de carbono. que quien descubrió la transformación bacteriana fue Griffith y luego Avery. por las dudas. La última pregunta tiene una parte que es importantísima. es imposible determinar si el mismo tenía solo dos sitios de corte para esa enzima. mantenido como episoma (elemento replicativo autónomo). lo cual es excesivamente poco probable. Recuerden.• En las muestras que fueron tratadas con RNasas. simplemente porque tendríamos que hacer un corte en cada hebra EXACTAMENTE EN EL MISMO LUGAR.. Simplemente lo que pasaría es que tendríamos una banda más gruesa correspondiente a la forma CA del plásmido (por ruptura mecánica es muy difícil que se produzcan plásmidos de la forma lineal. o incorporado al DNA genómico ¿A qué me refiero cuando digo "competentes"? A que tienen la capacidad de transformarse. la banda correspondiente a la forma CCC se ve menos definida y la lineal en muchos casos ni se ve. y es en realidad lo que hizimos con EcoR1. Las otras dos (conjugación y transducción) no creo que sean demasiado importantes para este parcial. que es donde dice "del cual no conoce el mapa".

ese antibiótico no podría utilizarse como presión de selección para quedarme solo con las bacterias transformadas. Recuperación con LB sin antibiótico. se utilizó agua estéril.) Bcto-triptona (puede ser también Caseina) es la fuente de nitrógeno para las bacterias. El CaCL2 además altera la pared celular. Esto es simplemente para que las bacterias que hayan adquirido el plásmido empiecen a expresar el gen de resistencia a la ampicilina (sino se mueren todas al plaquear con ese antibiótico). Esto lo hicieron previamente los docentes. El NaCl no tengo ni idea de para qué lo pusimos. pero se le agregan 15g de bacto-agar por litro de LB y se vuelve a pero supongo que será también como nutriente . Este control lo hicieron algunos grupos. CONTROLES: • Control de viabilidad: Se plaquea a las bacterias en LB sin antibiótico para comprobar que realmente en la muestra inicial teníamos bacterias capaces de duplicarse y formar colonias. mediante el método de Hanahan. Con esto logramos que el Ca2+ disminuya la repulsión de los fosfolípidos de la membrana de las bacterias. para las bacterias. • Control Positivo: Se transformó a las bacterias con una masa conocida de una muestra conocida del plásmido. NaCl 5g.. Con esto más la presencia de Ca2+ se forman poros en la membrana y por estos poros entra el plásmido a la bacteria. es la que utilizamos para luego calcular al eficiencia de transformación. Además. para ver lo que tiene que suceder "si todo va bien". LB sólido: Lo mismo que el anterior. Extracto de levadura 5g. Si esto fuese así. MEDIOS DE CULTIVO: LB (Bacto-triptona 10g. El Extracto de levaduras son básicamente levaduras machacadas que aportan el resto de los nutrientes que va a necesitar la bacteria para crecer y duplicarse. • • Shock térmico a 42ºC por 1 min y medio. ¿Cómo transformamos a las bacterias? En resumen: • Enfriamos a las bacterias en presencia del DNA y de CaCL2... y que el frio disminuya la fluidez de la misma. ya que confiamos en esa muestra de plásmido (o al menos en quien lo preparó para nosotros ). llevado a un litro con H2O y esterilizado por autoclavado x 20 min. • Control negativo: En lugr de transformar a las bacterias con DNA plasmídico.Lo primero fue hacer competentes a las bacterias. Con esto nos aseguramos de que las bacterias no fuesen naturalmente resistentes a la ampicilina. Con esta muestra lo que tenemos es un experimento de referencia..

en presencia de iodo. con el cual vamos a obtener la cantidad de DNA plasmídico que teníamos originalmente. ya podemos calcular la eficiencia. Avery. 1. elimina esta propiedad de la amilosa y deja de presentar esta coloración. Estando en la dilución óptima. CUESTIONARIO: Pregunta 1: Tubos. y para eso necesitamos que estén quietitas mientras se duplican. Pregunta 5: ¿Por qué no un medio líquido? Simple. Pregunta 6: A ver. que es más soluble porque está cargado. Con respecto a la pregunta 4. . Cuando la &alpha -amilasa degrada el almidón.autoclavar por 20 min. Listo. El principio principal (jeh) del experimento que realizamos es el hecho de que. nos dan 1. McLeod y McCarty trataron al producto de lisado de los pneumococos de la cepa S (letales para el ratón) con enzimas que degradan lípidos. proteínas. usando la fórmula EF = UFC / &mu g DNA. --------------------------------------------------------------------------------- TP 4: Actividad de la &alpha -amilasa Resumencito: La &alpha -amilasa es una enzima que degrada el almidón en dextrinas lineales (producto de la ruptura de amilosas) y ramificadas (producto de la ruptura de amilopectinas). polisacáridos.5 x 10-3 &mu g = 133333 UFC / &mu g DNA.5 x 10-3 &mu g.5 ng de plásmido. RNA y DNA y vieron que las únicas que no transformaron a las bacterias de la cepa R de la forma que vió Griffith eran las tratadas con DNasas. obteniéndose I3-. porque necesitamos poder contar las colonias formadas. Primero hay que pasar los ng a &mu g. A esto se lo llama "solución de Lugol" A tener en cuenta: La dilución óptima es aquella que nos permite tener tiempos medibles que se puedan usar como referencia a la hora de medir la actividad enzimática luego de distintos tratamientos o pretratamientos. teniendo en cuenta que el I2 es poco soluble en agua. se lo mezcla con el anión ioduro (I-). Si tenemos 200 colonias. la eficiencia de transformación es: EF = 200 UFC / 1. el almidón presenta una coloración azulada por la interacción entre el iodo y las moléculas de amilosa.5 ng son 1. el segundo es el control positivo y el tercero es el de nuestro plásmido. El 1ro es el control negativo. Para agregar el iodo a la solución. el tiempo de referencia debe ser de 3 a 8 minutos. Las preguntas 2 y 3 ya fueron respondidas.

A temperatura ambiente.. Esto significa que. o bien la enzima es una proteína. • Presencia de NaCl: Se ve que en presencia de iones Cl.. esta enzima ya debería estar desnaturalizada y no podría cumplir su función. pero más cercana a la temperatura óptima.la enzima tiene una actividad mayor. no sabemos si la enzima actúa en condiciones normales --------------------------------------------------------------------------------- TP 5: Inducción enzimática . o a pH muy bajo. A 0 ºC la energía cinética de las moléculas es. pero el problema es que ahora se empieza a desnaturalizar la enzima. aún es poca la energía cinética del medio. Lo que se mide en este experimento es la desaparición de sustrato. lo que indica que el ion Cl-favorece a la reacción de la &alpha -amilasa. el balance de cargas en el medio está modficado. por lo que las diferencias de cargas entre los restos de los aminoácidos de la proteína cambian y. A 70%. esta proteína cambia su conformación 3D. por ende. por lo que tampoco se ve mucha actividad. se somete a la enzima a temperaturas diferentes a su temperatura óptima. baja. uno de los grupos que hizo este experimento midió un tiempo mayor a 5 minutos para la reacción. • Incubación a 0ºC. como ya vimos. que pregunta a qué temperatura y pH esperaríamos que la &alpha -amilasa tuviera su actividad óptima. ya que más alla de que las condiciones normales de la saliva son 37 ºC y ph 7 (o cercano al neutro). a temperatura ambiente y a 70ºC: En este caso. a excepción de la 3ra. Resultados obtenidos y explicación: • Pre-tratamiento con proteinasa K: Sin actividad. Es por esto que se encontraron tiempos de reacción muy altos (o no se encontró reacción) para pH 2 y pH 12. o bien que depende de la presencia de una proteína que la active. las moléculas tienen más energía de la necesaria. • Pre-tratamiento de la enzima con calor (100ºC): Se espera que no haya actividad (de todas maneras.Diferencia entre tratamientos y pre-tratamientos: los pre-tratamientos los hacíamos ANTES de comenzar a medir la actividad enzimática y los tratamientos los hacíamos MIENTRAS medíamos esta actividad. • Efecto del pH: A pH muy alto. La respuesta real es que no se pueda estimar esto . en promedio. ) Esto es porque a 100º. por lo que son poco frecuentes los "choques" entre la enzima y el sustrato con la energía suficiente para realizar la reacción. CUESTIONARIO: Todas las preguntas fueron respondidas.

• 7) Cultivo + Solución fisiológica + Lactosa + Glucosa + AMPc En este caso. eso espero). que da como producto un compuesto de color amarillo. El funcionamiento teórico ya lo sabemos (o al menos. • 2) Cultivo + Solución fisiológica + IPTG El IPTG es un análogo estructural de la lactosa que funciona como inductor gratuito. porque si no ponemos ningún inductor del sistema. salvo en uno de los tubos. En este tubo hemos visto mucha actividad enzimática. la proteína CRP. por lo cual el resultado obtenido (menos reacción que en el tubo anterior) era también el esperado. por lo cual podemos sospechar que el AMPc no ingresó a la célula (habría que medir la cantidad de AMPc dentro de las bacterias para comprobarlo). no hay transcripción. lo cual demuestra que la &beta -gal permanece dentro de la célula y que el ONPG no ingresa a la misma. Esta parte es el experimento y lo que sigue es el revelado. o que la cantidad de AMPc no fue la suficiente (para coprobarlo habría que repetir el experimento con mayor concentración de AMPc) o simplemente la muestra de la cual disponíamos no contenía AMPc funcional.. vemos que no hubo reacción enzimática en este tubo. pero de manera indirecta viendo su actividad al degradar al ONPG. lo cual es esperable por lo que acabamos de ver. La glucosa inhibe a la enzima adenilato ciclasa. induce al sistema. que funciona induciendo al sistema. Sin embargo. pero en la medida que se sintetiza &beta -gal. es decir. esta va consumiendo a la lactosa. • 6) Cultivo + Solución fisiológica + Glucosa. por ende. al no haber AMPc disponible. y es lo que esperábamos. el agregado de AMPc debería compensar lo visto en el tubo Nº 6. lisamos las bacterias y exponemos su contenido. De esta manera.. . por lo que más allá de que la lactosa induce al sistema. no debe haber reacción enzimática. El hecho de que no hayamos detectado actividad de la &beta -gal nos indica que efectivamente el sistema debe ser inducido. ya que la proteína no está presente en la célula antes del agregado de lactosa. no se debe producir &beta -galactosidasa y. • 3) Cultivo + Solución fisiológica + lactosa Esta vez utilizamos lactosa.Bueno. pero de todas maneras lo vamos a ir viendo en el experimento. responsable de transformar el ATP en AMPc. no logra facilitar la unión entre la RNA pol y el DNA. pero no es degradado por la &beta -galactosidasa. • 4) Cultivo + Solución fisiológica + lactosa (pero no lisamos a las bacterias) No vimos reacción enzimática. básicamente el Operón Lac es un ejemplo de cómo funciona la regulación de la transcripción en bacterias. TUBOS PREPARADOS: • 1) Cultivo bacteriano + Solución fisiológica No pasa nada. ¿Qué medimos en el revelado? la producción de &beta -galactosidasa. Lo que hacemos es manipular al sistema (el operón lac) y luego de esto. • 5) Cultivo + Solución fisiológica + Lactosa + Cloranfenicol El Cloranfenicol es un antibiótico que inhibe la síntesis protéica.

Pregunta 2: Hacemos un experimento con un tubo. Veríamos actividad enzimática normal en una bacteria Cya. en este caso deberíamos ver actividad enzimática. etc. espontáneamente.. Me olvidaba!!! Tengan en cuenta la diferencia entre Síntesis de escape y Expresión basal!!! La síntesis de escape es la que se da en los instantes en los que. ahora alimentada por lactosa. La expresión basal es la síntesis que se produzca aún sin que se unan el CRP + AMPc al promotor (esto se da porque la RNA pol tiene poca afinidad. El gráfico de actividad de la &beta -gal se mantiene cerca del 0 mientras hay glucosa y luego comienza a crecer sin detenerse hasta que el sustrato limite la reacción (no se frena en una meseta como el anterior). el gráfico de población bacteriana vs. ya que no esperamos que haya reacción en absoluto. pero no es nula). Solución fisiológica. se logra que se exprese un gen y se produzca de novo una proteína. pongamos o no AMPc. en lugar de activar una proteína ya presente en la bacteria. y luego comoienza a crecer nuevamente la colonia. uno induce al sistema y el otro lo usamos para el revelado del experimento. el represor se despega del operador y la RNA pol puede transcribir. se empieza a producir AMPc.• 8) Solución fisiológica + lactosa Es nuestro blanco de reacción.. se me va a complicar el tema del gráfico. es que por medio de la inducción. como referencia de lo mínimo de coloración obtenible... pero básicamente. SOLUCIONES UTILIZADAS: Buffer Z. jamás nos explicaron para qué sirve cada cosa. se empieza a producir &beta -gal.y en la Wild Type también veríamos actividad. tiempo (gráfico de crecimiento) es la curva diauxia que vimos que crece un poco. Pregunta 4:El IPTG y el ONPG ya fueron explicados. El primer crecimiento corresopnde a las bacterias alimentándose con glucosa. luego se forma una meseta y luego vuelve a crecer. la proteína ya está presente en la célula y esta es activada (valga la redundancia ). Si las bacterias son Crp. . Pregunta 3:Bueno.solamente veríamos actividad basal. • 9) Cultivo + Solución fisiológica + lactosa (pero la lactosa la agregamos luego de lisar las bacterias) Si la &beta -gal existiese de antemano en la bacteria y la lactosa simplemente activara a esta enzima. Lo utilizamos entonces. la meseta al momento en el que no hay glucosa. Cl3CH (cloroformo): junto con el SDS son utilizados para lisar las bacterias. al cual le agregamos bacterias. ONPG y AMPc. El resultado negativo de este experimento confirma que la lactosa induce al sistema. IPTG. mientras que en la activación. CUESTIONARIO: Pregunta 1: La diferencia entre la inducción y la activación.

El control positivo es el que ejerce el AMPc junto con la proteína CRP para favorecer la transcripción.Tengan en cuenta que el Operón Lac tiene dos controles. El control negativo es el que ejerce el represor para evitar la transcripción. .