TÉCNICA DE ELISA PARA ANAPLASMA MARGINALE

MATERIAL:

Placa de fondo plano de 96 pozos (Costar No. de Cat. 3590). Viales de 1.5 ml Micropipetas de una punta para 20, 200, y 1000 microlitros Micropipetas de ocho o doce puntas para 200 microlitros

Reactivos: Antígeno.- El actual es: Am 040595 (Mex 3109601) c 20 Sueros problema y sueros testigo (positivos y negativos) Conjugado anti IgG bovina Chemicon Ap 102 A Gt X Bov IgG Alk phos en dilución 1:10000 (normalmente marca SIGMA) Substrato para fosfatasa alcalina. No de Cat. 10440T, Sigma 104® phosphatase substrate. (buscar en congelador y dejar que tome la temperatura ambiente antes de manipular)

PROCEDIMIENTO 1. SENSIBILIZACIÓN DE PLACA El antígeno se usa a una dilución final de 1:200 11.1 1.2 1.3 Mezclar volúmenes iguales de antígeno y SDS o LLS1 al 0.1%. Para una placa se mezclan 110μl de Ag + 110 μl SDS (0.1%) = 220μl. Incubar la mezcla por 30 minutos a temperatura ambiente (TA). Diluir la mezcla Ag-SDS 1:200 en solución amortiguadora de carbonatos pH 9.6 30 mM. Para una placa se agregan a los 220 μl de la mezcla AgSDS, 21.78 ml del regulador de carbonatos, esto da una dilución final de 1:200 Homogenizar Depositar 200 μl de esta mezcla a cada pozo de la placa. Incubar toda la noche en refrigeración (a 4ºC) Lavar 3 veces la placa (200μl por pozo) con solución salina reguladora de fosfatos pH 7.2 (SSAF)-Tween 20 al 0.05%. Cada lavado consiste en eliminar el contenido de la placa mediante una fuerte sacudida arrojando el contenido hacia la tarja, secado de los residuos que quedan sobre la placa con toalla de papel y llenando los posos con la solución de lavado dejando la placa con dicha solución por el tiempo requerido, en este caso 5 min.

1.4 1.5 1.6 1.7

1

Para la preparación de las soluciones usadas en esta técnica, ver el apéndice anexo.

7) Lavar 3 veces la placa con solución salina reguladora de fosfatos pH 7. 4.075% en solución reguladora de Tris 100mM. Substrato: 3. 5.1 Diluir 1:100 en SSAF/Tween 20 todas las muestras de suero. se depositan en el/los pozos que serán usados como blanco. a 37º Lavar (Repetir el paso 1. • Para tres repeticiones marcar la placa de tal manera que las replicas queden en las columnas 1.2. 200μl de SSAF/Tween 20 en lugar del suero diluido.1 2.1. En viales de 1500 µl se depositan 990 µl de SSAF/Tween 20 y 10 µl de suero. 8 y 11 -. pH 9.2.1.2 Agregar 200 µl del conjugado diluido por pozo.4 Realizar 3 lavados como se describió en el punto 1.1.6. pH 9. 5 y 9.2 3.05%.1 Depositar 200μl por pozo del Substrato (una solución previamente elaborada de p-nitrofenilfosfato al 0. Este es uno o varios pozos que se utilizan para calibrar el lector de ELISA.4 Realizar 2 lavados con SSAF/Tween 20 y un lavado final con Solución Tris 100mM.3.5.3 Incubar la placa a 37ºC por 60 min. 6 y 10) etc. Para este propósito.(1:5000 .1 Diluir apropiadamente el conjugado (anti IgG bovina.7. (200μl por pozo) 3 REACCION Ag-Ac 3. negativos y problema.3 Depositar en cada pozo 200μl de leche descremada en polvo (“Svelty”. ej: la muestra que se deposita en el pozo A1 se repite en el pozo A7. 7 y 10 (2. 3. (2.5) (15 mg en 20 ml) 3. se repite en A8 y así sucesivamente. 3. la muestra del pozo A2. Y con cuatro repeticiones serían 1. 2 3. en SSAF/Tween 20 Para este propósito el conjugado deberá ser titulado previamente y en cada lote se debe definir la dilución de uso. Incubar por 30 min. BLOQUEO 2.2.2 Depositar por triplicado 200 μl de cada dilución por pozo. 3.3. incluyendo controles positivos.8 y 12). Conjugado: 3.3 Incubar la placa a 37ºC por 60 min.1.3 Ver diagrama anexo Para dos repeticiones la placa se divide en cuadrantes repitiendo las muestras en cada uno de las mitades.2 (SSAF)-Tween 20 al 0.2.1 Sueros: 3. Nestle) al 5% en SSAF/Tween 20. 3. Tomando en cuenta los controles positivo y negativo y el Blanco.2 2. • 2 .1:10000) 3.2.

1. Este valor debe ser substraído de los valores de todas las demás lecturas si es que no es substraído automáticamente por el lector de ELISA. se debe también estimar el error “E” que se calcula determinando el porcentaje que representa la desviación estándar de cualquier suero problema contra su media. .3. 4 REGISTRO DE VALORES: La reacción se registra mediante un Espectrofotómetro específico para leer placas de ELISA.3.9%.4 El promedio de los valores positivos con sus respectivas desviaciones estándar.1. esto representa probabilidad de que cualquier valor que esté por arriba de este valor determinado sea superior al 99.1. 5 ANÁLISIS DE RESULTADOS: Para el análisis de los resultados se deberán tomar en cuenta los siguientes parámetros.1.5 Para efecto de valoración de la consistencia del operador de la prueba. 5. 5.2 El promedio de los valores negativos con sus respectivas desviaciones estándar. programado para la lectura de absorbancia a 405 nm.1. 5.3 La línea de corte se establece tomando el valor del negativo +3 veces la desviación estándar del negativo.2 Incubar Las placas por 30 min a 37ºC. 5.1 El valor del/los pozos blanco. 5.

137. si es necesario se calienta para disolver los cristales. Aforar a 1000 ml con agua destilada. Solución concentrada de fosfatos 0.62 g Fosfato de Sodio Dibásico. se titula el pH A 9. Solución amortiguadora de carbonatos (SAC) pH 9.1 m (SAF 10X). NaHCO3. Anhidro Na2HPO4.SOLUCIONES 1. Hay que tomar en cuenta que dada la naturaleza de los carbonatos. H2NaO4P.H2O.50 g Agua destilada 1000 ml Disolver las sales en 800 ml de agua destilada.6 Carbonato de Sodio. Solución de lauril sulfato de sodio (LSS) 0.01 (70 mMoles) 5.18 g Bicarbonato de Sodio.6 con Hidróxido de Sodio o ácido clorhídrico según sea el caso y se afora a 1000 ml.99 (19 mM) 2. 3.1%.88 g Agua destilada 1000. P.M. 84. P. Na2CO3. SDS Agua destilada 0. PM. Almacenar a 4ºC. ml Disolver las sales en 800 ml de agua destilada. Los residuos de cada vial abierto se deben descartar. .M.1g 100 ml Diluir el g de lauril sulfato de sodio en los 100 ml de agua destilada ( Almacenar a temperatura ambiente 2. 142 (81mMoles) 11. Fosfato de Sodio monobásico monohidratado. PM. 106 (30mMoles) 3. esta solución se debe mantener herméticamente sellada o su fuerza iónica se pierde con el tiempo. Distribuir en volúmenes de 25 ml y almacenar 4ºC.

PM 95.Disolver (la sal) NaCl PM. Solución amortiguadora Tris pH 9.107 moles) 10.875%. leche descremada 5% Leche descremada (Svelty. Solución de Bloqueo..1(0. Nota: En el caso de que los reactivos que se describen en esta técnica no se encuentren disponibles y se encuentren reactivos con mayor o menor número de moléculas de agua. 58.05%. una vez que este reactivo este disuelto se agrega el NaCl y finalmente el Trizma. Nestle) SSAF 1X Tween 20. aforar a 1000 ml con agua destilada. 58. 121. ajustar a pH 9.4. Tween 20 0.. H2NaO4P.920 g Agua destilada 1000 ml Disolver en 800 ml de agua destilada el cloruro de magnesio. 58. ya que si se trata de disolver en un pH alcalino el magnesio precipita.Aforar a 1000 ml.. se convierte el peso especificado para el reactivo en cuestión y se convierte a moles.5. . Esta cantidad es suficiente para una placa.05% NaCl PM.165 g NaCl P.Agregar 500μl de Tween 20 5. 4.5.21 (0.M.1 moles) 12..2. antes que los demás componentes.110 g Cloruro de Magnesio Anhidro MgCl2.75 g (0. La solución se prepara el día en que se usa y se desecha el sobrante.2 NaCl 0. pH 7. C4H11NO3 PM. almacenar a 4ºC. 5. Solución salina amortiguadora de fosfatos (SSAF) 1X/tween 20 0. 6.44 en 700 ml de agua destilada 2.H2O/Na2HPO4 10 mM. homogeneizar y almacenar a 4ºC.875 %) 100 ml (solución 3) 1000 ml 1. Trizma Base (hydroxymethyl)aminomethane)..44 SAF 10 X Agua destilada 8.Ajustar el ph a 7.Agregar 100 ml de solucion SAF 10X 3. una vez tomado ese dato se toma su equivalencia en moles del reactivo con mayor o menor número de moléculas de H2O.44 2. 1g 20 ml Disolver la leche en la SSAF 1X Tween 20.

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