You are on page 1of 65

DISTANČNÍ OPORY PRO KOMBINOVANÉ STUDIUM BIOLOGIE

MOLEKULÁRNÍ A BUNĚČNÁ BIOLOGIE
Jan Malý

UNIVERZITA JANA EVANGELISTY PURKYNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA
katedra biologie

Ústí nad Labem 2006

Anotace opory Molekulární biologie je povinným kurzem studijního oboru učitelství pro střední školy a nově připraveného distančního bakalářského studia jednooborové biologie na katedře biologie přírodovědecké fakulty UJEP. Cílem tohoto kurzu je především poskytnout základní, ucelené informace o principech života na molekulární úrovni. Smyslem této dvoudílné opory bylo především ujednotit a vymezit základní obsah kurzu, tj. vyčlenit nejdůležitější pojmy a stručně je charakterizovat. V tomto pojetí tedy nelze text chápat jako skripta, či učebnici do podrobností objasňující všechny detaily. Text je spíše určitým vodítkem k dalšímu samostudiu z doporučené odborné literatury a popř. vlastních přednášek. Jako doplněk textu jsou uvedeny číslované odkazy na obrázky, které každý student obdrží na samostatném CD disku. Tyto obrázky slouží k snažšímu pochopení složitých molekulárně-biologických dějů a efektivnímu samostudiu.

OBSAH
STRUKTURA A FUNKCE PROTEINŮ 1.1. Obecné vlastnosti aminokyselin 1.2. Peptidická vazba 1.3. Klasifikace a charakteristika vlastností aminokyselin 1.4. Nestandardní aminokyseliny 1.5. Specializované funkce aminokyselin 1.6. Sekundární struktura proteinů 1.7. Fibrilární proteiny 1.8. Globulární proteiny 1.9. Stabilita proteinů 1.10. Denaturace proteinů 1.11. Kvarterní struktura proteinů 2. STRUKTURA A FUNKCE NUKLEOVÝCH KYSELIN 2.1. Vlastnosti nukleotidů 2.2. Struktura DNA s nadšroubovicovým vinutím 2.3. Denaturace a renaturace nukleových kyselin 3. REPLIKACE DNA 3.1. Obecný princip replikace 3.2. Replikační enzymy 3.3. Replikace prokaryot a bakteriofágů 3.4. Replikace eukaryotního chromozómu 4. REPARACE DNA 4.1. Přímá oprava poškození nukleotidů 4.2. Excisní reparace 4.3. Mismatch reparace 4.4. SOS odpověď 4.5. Reparace dvojřetězcových zlomů 4.6. Identifikace karcinogenních látek 5. TRANSKRIPCE 5.1. Role RNA v syntéze proteinů 5.2. RNA polymeráza 5.3. Vazba templátu 5.4. Iniciace transkripce 5.5. Elongace 5.6. Terminace transkripce 5.7. Eukaryotní RNA polymerázy 5.8. Struktura promotorových sekvencí eukaryot 6. REGULACE EXPRESE GENŮ NA ÚROVNI TRANSKRIPCE U PROKARYOT 6.1 Regulace transkripčními faktory 6.2 Regulace katabolickou represí 6.3 Regulace sekvenčně specifickými protein-DNA interakcemi 6.4 Regulace araBAD operonu 6.5 Regulace tryptofanového (trp) operonu atenuací 6.6 Regulace syntézy rRNA za přísných podmínek (stringent response) 7. POSTRANSKRIPČNÍ ÚPRAVY PRIMÁRNÍHO TRANSKRIPTU 7.1 Úpravy mRNA čepičkou a polyA koncem 7.2 Molekulární sestřih mRNA (splicing) 1. …. 3

…. 15

…. 22

…. 35

…. 40

…. 50

…. 57

Strana 4 . Proteiny jsou molekuly.5).5.2. tzn. aa) jsou základními stavebními kameny proteinů. Typický protein se skládá z polypeptidu o 40-33. Tzv. Vzhledem k obrovskému množství kombinací. 1. oligopeptidy (do 10 aa) a polypeptidy. Analýzou obrovského množství proteinů bylo prokázáno. Peptidická vazba (voda). tj. 1. je zřejmé. že jsou vždy tvořeny 20 základními aminokyselinami (Obr 1 a 2). tj. Tyto molekuly jsou označovány jako tzv. primární struktura proteinu je determinována pořadím aminokyselin v řetězci. Jelikož hodnoty pK α-aminoskupiny a αkarboxyskupiny aminokyselin leží v rozsahu pH 8. jejich molekulová váha se pohybuje v rozpětí 4-3600 kD.0-9. Toto pořadí určuje výsledné vlastnosti proteinů. Tato vlastnost výrazně zvyšuje teplotu tání (300°C) a způsobuje velmi dobrou rozpustnost v polárních rozpouštědlech rozpouštědlech.4 respektive pH 2.27×10130 kombinací).2 – 3. tj.1. tripeptidy (3 aa). STRUKTURA A FUNKCE PROTEINŮ Obecné vlastnosti aminokyselin Aminokyseliny (amino acids. jsou tvořeny primární aminoskupinou a karboxyskupinou navázanou na stejném. centrálním atomu uhlíku (s vyjímkou prolinu) (Obr. Tento fakt je důležitým faktorem který umožňuje přenos strukturální informace z pořadí lineárně uspořádaných nukleotidů v DNA do jednoznačného pořadí aminokyselin v řetězci polypeptidu.:Molekulární biologie 1. α-aminokyseliny.4).000 aminokyselin. Polypeptidy jsou lineární polymery. Z tohoto důvodu jsou aminokyseliny amfolyty. Dle počtu zpolymerovaných jednotek aminokyselin rozeznáváme dipeptidy (2 aa). tj. při fyziologickém pH jsou obě skupiny kompletně ionizovány (Obr. Především z tohoto důvodu se při evolučním vývoji proteiny uplatnily jako základní stavební a funkční jednotky garantující základní životní funkce organismů. které se skládají z jednoho či více polypeptidů. které je z 20 aminokyselin možné při typické velikosti proteinů vytvořit (pro protein o pouhých 100 jednotkách je to 20×10100. peptidické vazby CO-NH a uvolnění molekuly vody (1902 Emil Fisher a Franz Hofmeister) (Obr. jsou současnými nositely kladného a záporného náboje. že existují téměř nevyčerpatelné možnosti generování výsledných vlastností.3).Studijní opory biologie Malý J. 1. Aminokyseliny jsou rovněž zwitteriony. Aminokyseliny jsou většinou nerozpustné v nepolárních α-aminokyseliny mohou polymerizovat kovaletní vazbou mezi amino a karboxy skupinou za vzniku tzv. chovají se současně jako báze i kyselina.

při kterém je výsledný náboj aminokyseliny nulový (součet všech nábojů) se označuje jako izoelektrický bod (pI). phenylalanin. tj. leucin. Výsledná hodnota pI je výrazně ovlivněná nabitými skupinami v postranních řetězcích. prolin.7). svázaných skrze disulfidický můstek (S-S). Tato vlastnost je způsobena existencí chirálního atomu uhlíku (α-uhlík). Ve starší literatuře se někdy tento dimer označuje pojmem cystin. asparagin. Aminokyselina cystein je charakteristická tvorbou dimerů. Malý J. Aminokyseliny s nenabitými postranními skupinami obsahují hydroxylovou. Z Handerson-Hasselbalch vztahu plyne. převládající v oxidačních podmínkách prostředí (Obr. prostorové konfiguraci vznikajícího peptidického řetězce. Jejich výsledný tvar je dán součtem křivek jednotlivých aminokyselin zapojených v řetězci a je výrazně ovlivněn prostorovou konfigurací proteinu. thiolovým éterem. Histidin jako jedinná aminokyselina je při pH ≈ 6 neutrální. Z tohoto důvodu je histidin často přítomen v aktivních místech enzymů. threonin. Titrační křivky aminokyselin jsou obecně komplikované. Ta do značné míry rozhoduje o celkových vlastnostech. Aminokyseliny s nabitými –R řetězci mohou nést kladný či záporný náboj. tryptofan. tj. Aminokyseliny jsou ve vodném prostředí vždy nositely náboje. Negativně nabité jsou –R zbytky kyseliny asparagové (aspartátu) a glutamové (aspartátu). kde se podílí na přenosu náboje. amidovou či thiolovou skupinu v –R řetězci (serin. Aminokyseliny vyjma glycinu jsou opticky aktivní. Postranní řetězec jev tomto případě tvořen alifatickými uhlovodíkovými řetězci.Studijní opory biologie 1. tj. glutamin. cystein) (Obr. v důsledku existence dvou a více nabitých funkčních skupin (Obr.6) Tato vazba je důležitým předpokladem ustavení správné prostorové konformace řady proteinů a její rozštěpení zpravidla vede k jejich denaturaci. Obecnou vlastností těchto typů molekul je existence dvou Strana 5 . Asparagin a glutamin jsou amidy těchto dvou kyselin. Obecně je tedy možné vyčlenit s určitým zjednodušením aminokyseliny s (i) nepolárními postranními řetězci (ii) nenabitými postranními řetězci a (iii) polárními postranními řetězci.2. obsahem solí v roztoku atp.1). stáčí rovinu polarizovaného světla.5(pKi + pKj) kde Ki a Kj značí disociační konstanty nabitých párů. že: pI = 0. Mezi aminokyseliny s nepolárními postranními řetězci patří alanin. isoleucin. tyrosin.1). které se účastní vzájemné eliminace náboje v izoelektrickém bodě. Za běžných fyziologických podmínek jsou –R řetězce lysinu a argininu protonovány a jsou tedy nositely bazických vlastností.:Molekulární biologie Klasifikace a charakteristika vlastností aminokyselin Klasifikace aminokyselin je zpravidla založená na polaritě jejich postraních řetězců (-R). methionin. pH. valin. Proteiny vykazují velmi komplexní titrační křivky. glycin. phenylovou a indolovou aromatickou strukturou (Obr. uhlíku se čtyřmi odlišnými substituenty.

produkovaných opět bakteriemi. D-aminokyseliny jsou součástí některých krátkých polypeptidů.3.Studijní opory biologie Malý J.10). tak po stránce chemické od L a D-formy. L-α-aminokyseliny (dle Fischerovy konvence. jsou L formy enantiomerů. Řada z nich není součástí proteinů. 4-hydroxyprolin a 5hydroxylysin jsou důležitými konstituenty fibrilárního proteinu kolagenu. jako např. které se vyskytují zejména u bakterií. 1. „nestandardních“ (Obr. celkem 4 možné stereoizomery. acetylace. která se vyskytuje vždy při zahájení translace u prokaryotních organismů na N-konci vznikajícího polypeptidového řetězce. Jedinečnost života spočívá v syntéze pouze jedné L-formy. fosforylace aminokyselin). Ve všech případech (až na jednu vyjímku) se jedná o modifikované aminokyseliny. přesto však často hrají velmi důležitou roli v metabolismu. Nestandardní aminokyseliny V biologických systémech se přirozeně nevyskytuje pouze výše zmíněných 20 základních aminokyselin. přičemž jejich vznik není kódován genetickým kódem.:Molekulární biologie zrcadlově symetrických. Tyto dvě formy jsou zpravidla chemicky či fyzikálně neodlišitelné. které se vyskytují v proteinech. znaménko -) z pohledu pozorovatele (Obr. které jsou součástí komplexů s nukleovými kyselinami. tj. prostorových konfigurací – enantiomerů (stereoizomerů). N-formylmethionin je typickou aminokyselinou. histony (metylace. Tyto dvě formy jsou odlišné jak po stránce fyzikální. Např. zbývající dvě formy se nazývají diastereomery (L-allo a D-allo formy). D-forma není běžnou součástí proteinů. Všechny α-aminokyseliny. znaménko +) či proti směru hodinových ručiček (levotočivost. proč se evoluce života vydala tímto směrem a ne opačným (D-formou) není dosud uspokojivě objasněna.8). Přirozeně se opět vyskytují L-formy (zrcadlem je D-forma). Tyto aminokyseliny často vznikají dodatečnou enzymaticky katalizovanou modifikací –R zbytků polypeptidů. Liší se pouze směrem stáčení roviny polarizovaného světla – stáčí buď ve směru hodinových ručiček (pravotočivost.9). Strana 6 . ale i řada aminokyselin tzv. Tyto polypeptidy jsou však syntetizovány enzymatickou cestou a nejsou kódovány v DNA. která je složena ze směsi stereoizomerů. gramicidin A a aktinomycin D. D-aminokyseliny jsou součástí peptidických antibiotik jako je valinomycin. forma shodná s uspořádáním L-glyceradehydu) (Obr. Důvod a příčiny. tj. racemické směsi. Běžná chemická syntéza aminokyselin vede ke vzniku tzv. Některé aminokyseliny (threonin a isoleucin) mají dva chirální uhlíky. Velmi často jsou modifikovány proteiny. Jsou součástí buněčných stěn bakterií a zvyšují jejich odolnost vůči přirozeně se vyskytujícím proteázám (součást obranných mechanismů hostitele). které mají schopnost štěpit přednostně L-formu aminokyselin.

N. Studiem konformace peptidické vazby se zabýval ve 40 letech minulého století fyzik Linus Pauling a Robert Corey. Sekundární struktura proteinů Vlastnosti proteinů jsou dány jejich třídimenzionální prostorovou strukturou v nativním (tj. ale mohou nabývat vždy pouze určitých hodnot. Unikátní prostorová struktura jednotlivých typů proteinů je přitom založena na jejich primární struktuře. Tyto sekundární struktury jsou determinovány geometrickými vlastnostmi peptidické skupiny v řetězci. Vyjádřil informaci o možných kombinaci obou uhlů do konformační mapy.:Molekulární biologie Role aminokyselin v organismu není jen role konstituční.13). biologicky významné funkce (Obr. tj. V naprosté většině případů jsu peptidické skupiny uspořádány v trans konformaci. Tento fakt vysvětluje. Specializované funkce aminokyselin Malý J. které by v této (cis) konformaci musely být přiloženy k sobě (Obr. vzdálenost libovolných vzájemně kovalentně nevázaných atomů nepřekračuje tzv. tzv. 1.11). planární struktury (Obr. Rentgenovou analýzou aminokyselin a krátkých peptidů odvodili. že peptidická skupina je rigidní. Např. torzních úhlů (tyto úhly se značí jako φ pro případ vazby Cα-N a ψ pro vazbu Cα-C) (Obr. tzv.Ramachandran. tj. pak kostra polypeptidu je tvořena peptidickými vazbami orientované v jedné rovině. které jsou energeticky přípustné. histamin je významným lokálním zprostředkovatelem alergických reakcí. citrulin a ornitin (biosyntéza močoviny).14). Ramachandranova diagramu (Obr. fyziologicky relevantním) stavu. na pořadí aminokyselin v polypeptidickém řetězci.15). objemnosti –R řetězců. thyroxin je živočišný hormon. Celkový počet dosud zdokumentovaných aminokyselin nalezených ve všech organismech se blíží číslu 700.16). které je spojují (Obr.5.12). tj. tzn. Sekundární struktura proteinů je definována jako lokální prostorové uspořádání polypeptidického řetězce.4.Studijní opory biologie 1. van der Strana 7 . které jsou uskutečnitelné. tj. které mohou nabývat různých konformací v důsledku vzájemného natočení. homocystein (syntéza aminokyselin) a Sadenosylmethionin (metylace molekul). Studiem možných konformací (natočení vazeb) v polypeptidech se zabýval G. 2 Cα uhlíky navázané na peptidickou skupinu jsou orientovány planárně na obrácené straně peptidických vazeb. Aminokyseliny často zastupují i jiné. Například γaminomáselná kyselina (GABA) a dopamin jsou důležité neurotransmitery. Tyto úhly (natočení) však nemohou být libovolné. výstavba proteinů. V tomoto diagramu jsou zobrazeny pouze ty kombinace úhlů. Tato konformace je stabilnější oproti cis konformaci především ze sterických důvodů. např. Některé z aminokyselin jsou významné intermediáty v metabolických procesech. proč je polypeptid tvořen pospojovanými sekvencemi planárních peptidických skupin. pokud oba úhly jsou rovné 180°C. tj.

Studijní opory biologie Malý J. cca 3 otáčky). α-helix je běžnou sekundární strukturou u fibrilárních a globulárních proteinů. Paulingem v roce 1951 se pokládá za jeden z mezníků dalšího výzkumu v oblasti strukturální biochemie. Zpravidla jsou spojky mezi jednotlivými β-listy tvořeny helixy. Zřídka jsou pozorovány u nativních i umělých polypeptidů další možné varianty helixů.22). β-listy jsou také ve většině případů mírně pravotočivě zakřivené. které jsou stabilizované vodíkovými můstky.6 (3. U globulárních proteinů je typicky tvořen z 2-15 řetězců. π helix a polyproline II helix (Obr. Mezi tyto helixy patří např. Postranní –R zbytky aminokyselin jsou lokalizovány vně helixu a nejsou ted překážkou ke stabilizaci polymeru. který značí. že pouze tři oblasti kombinací jsou z hlediska reálných konformací pravděpodobné a skutečně byly potvrzeny rentgenovou analýzou některých proteinů (Obr. tzv. což je jednou z důležitých vlastností zaručující specifické funkce zejména v aktivních centrech některých enzymů (Obr. α-helix.:Molekulární biologie Waalsovu vzdálenost. tzv. Strana 8 .21). β-listy jsou obvyklým stukturálním motivem v řadě proteinů.19). že skládaný list je tvořen mezi dvěma navzájem sousedícími polypeptidovými řetězci. Pouze jedna z možných konformací (kombinací n a p) je umožňuje vznik helixu a jeho stabilizaci pomocí vodíkových můstků – tzv. které odděluje jedna celá otočka (Obr. tj. Z tohoto důvodu se glycin často vyskytuje v oblastech. Objev této struktury L. Ve stejném roce jako byl navržena struktura α-helixu. 310 helix.4Å (Obr. u která je volnost natočení vazeb vysoká. navrhli Pauling a Corey další možnou sekundární strukturu – tzv. kde dochází k ostrému zatočení polypeptidického řetězce.20). popř. Helix může být v principu pravotočivý či levotočivý. Helikální sekundární struktura je jednou z nejběžnějších sekundárních struktur proteinů.6 aminokyseliny na 1 otáčku) a d = 5.23).18). ale které se liší hodnotou indexů n a p. kolik aminokyselin v řetězci se nachází na jednu celou otočku helixu a indexem p – prostorovou vzdáleností mezi aminokyselinami. Topologie (konektivita) β-listů je poměrně komplexní s řadou možností. Často dochází k vzájemné kombinaci paralelních a antiparalelních β-listů. Namísto ψ a φ úhlů se v tomto případě vyjadřuje míra natočení indexem n. s průměrnou délkou helixu 18Å (12 aminokyselin. Zásadní rozdíl mezi α-helixem a strukturu skládaného listu je v tom. Helix vzniká tehdy. I zde vycházeli z konformace s opakujícími se úhly ψ a φ. Z tohoto diagramu vyplývá. strukturu skládaného listu (β-sheet). které spadají do povolených oblastí Ramanchandranova diagramu. s průměrnou šířkou plochy cca 25Å a délkou okolo 21Å (15 aminokyselin) (Obr. α-helix je pravotočivá šroubovice s n=3. Určitou vyjímkou je nejjednoduší aminokyselina glycin. když řetězec je na Cα vždy natočen o stejný úhel.17). Ty mohou být uspořádány paralelně a antiparalelně (dle směru od N k C konci polypeptidu) (Obr.

typu I (kyselé vlastnosti) a typu II (zásadité vlastnosti). Vlas je tvořen z mrtvých buněk s makrofibrilami.Studijní opory biologie Malý J. Je součástí zrohovatělé pokožky (epidermis). smyček úseků s nepravidelně uspořádánými úhly φ a ψ. kosti atd. jejichž sekundární struktura se vymyká běžným strukturálním motivům a je pro ně typická. které vytváří lidský vlas. Jelikož fibrilární proteiny je velmi obtížné připravit ve formě krystalů. Tzv. nehtů. které mohou mít povahu pravotočivého či levotočivého helixu (Obr. 1.26).27). Molekuly α-keratinu jsou tvořeny dimery dvou polypeptidů. Řada větších globulárních proteinů obsahuje zvláštní struktury.25). Ω-smyčky (Obr. chlupů a peří přičemž tvoří až 85% buněčných proteinů. Z tohoto důvodu je struktura fibrilárních proteinů dosud málo prozkoumána. Nejedná se však v žádném případě o náhodnou a neuspořádanou sturukturu. která se sdružují do tzv. obsahující α-keratin a amorfní proteinovou matrix s vysokým obsahem síry (Obr. protofilament. svaly.).24). protofibril a ty tvoří vlastní mikrofibrily (Obr. Redukční činidla. Výsledný dimer je združen do vláken tzv. které se skládají z tzv. tzv. které se vyskytují u plazů a ptáků. Ostatní část existuje ve formě tzv. jsou hiearchicky uspořádány. které neposkytují definovanou strukturu. Keratin je mechanicky odolný a chemicky nereaktivní protein. který se nachází u všech vyšších obratlovců. Jedná se pouze o těžko popsatelnou nerepetetivní strukturu. jako jsou Strana 9 .6. Tato struktura je tvořena jedním vláknem tzv. které vytvářejí β-listy – tyto úseky se téměř vždy nalézají na povrchu proteinu a ovlivňují tak jeho vlastnosti. které se navzájem obtáčí a vytváří strukturu podobnou α-helixu. Díky vysokému obsahu cysteinu a tím i disulfidových můstků ve vláknech je α-keratin odolný proti tahu. Řada fibrilárních proteinů se nachází v tkáních s mechanickou či pohybovou funkcí (kůže.:Molekulární biologie vlásenkami (uplatňují se zejména u antiparalelních β-listů). které se vyskytují výhradně na povrchu proteinu a hrají důležitou roli při biologických rekogničních procesech. Fibrilární proteiny Fibrilární proteiny jsou dlouhé polypeptidy. propojují jednotlivé úseky polypeptidu. α-keratiny. Sekundární stuktury ve formě α-helixu a β-listu zpravidla tvoří až 50% polypeptidického řetězce globulárních proteinů. jakou je možné popsat např. obrácené smyčky např. které se vyskytují u savců a β-keratiny. mikrofibril. která však zásadním způsobem ovlivňuje konečnou třidimenzionální strukturu proteinu. nelze v protikladu s globulárními proteiny provádět rentgenovou strukturní analýzu. vlasů. u denaturovaných proteinů. Keratiny. Keratiny jsou dále členěny na tzv.

Ten je Strana 10 . Naprostá většina poznatků o tercierní struktuře proteinů byla získána jejich studiem využitím rengenové strukturní analýzy a nukleární magnetické resonance (NMR). Rich. synchrotron) a vzniklý difrakční obrazec zviditelněn na fotografické desce. která se blíží vzdálenosti kovalentní vazby v molekulách. 1.29). fibril. která podává informace o struktuře molekul na atomární úrovni. Jedná se o paralelní trojřetězcovou strukturu navzájem se pravotočivě ovíjejících vláken kolagenu (Obr. ztrátu integrity kůže.Studijní opory biologie Malý J. Globulární proteiny Globulární proteiny tvoří velmi různorodou skupinu proteinů. které jsou v mikroskopickém pohledu příčně pruhované (Obr. Většina globulárních proteinů vytváří enzymy.:Molekulární biologie merkaptany mohou redukovat disulfidické vazby a tím i zvláčnit vlas. Je součástí pojivových tkání. např. Struktura je jako celek stabilizována vodíkovými můstky. Tyto fibrily se skládají ze symetricky uspořádaných šestic kolagenních vláken. ligamenty atd. chrupavka. Vlákna kolagenu jsou uspořádána do tzv. Kolagenní vlákna jsou jak intramolekulárně. Defekty ve struktuře keratinu mohou způsobit závažná onemocnění. Jedná se o extracelulární protein existující ve formě nerozpustných vláken s vysokou odolností v tahu. U savců je známo až 20 odlišných forem kolagenů přítomných v rámci různých tkání u jednoho jedince (Obr. který se skládá z opakujících se sekvencí Gly-Pro-Hyp.31). Crick a A.28).5Å). vzájemného přiložení vláken v řadě. Rengenové záření je podmínkou k získání této informace vzhledem k velmi malé vlnové délce (λ ≈ 1.7. pro které je typická jejich existence v kompaktním sférickém nativním tvaru. tak intermolekulárně zesítěná kovalentní vazbou mezi aminokyselinami Lys a His činností enzymu lysyl oxidázy (Obr. jako je kost. Rentgenová strukturní analýza je metodikou. zub. Podélné napětí v tahu je přenášeno do kompresního působení jednotlivých řetězců kolmo na osu vlákna. tj. Toto uspořádání vláken je zodpovědné za charakteristickou odolnost vlákna v tahu. Prostorovou strukturu kolagenu navrhl již v roce 1955 F. transportní a receptorové proteiny. Kolagen je přítomen u všech živočichů a je jeden z nejvíce rozšířených proteinů mezi obratlovci. odhalujících každých 400Å tmavší strukturu tvořenou v místě „děr“.30). Nejznámější struktura kolagenu je struktura popsaná pro bovinní kolagen α1(I). Kolagen má velmi specifické složení aminokyselin – více jak z 30% je tvořen glycinem a dalších 15-30% je tvořeno prolinem a 4hydroxyprolylem (Hyp) (Obr. Defekty ve struktuře kolagenu jsou příčinou řady lidských onemocnění. Oxidační činidla naopak vlas ztuží vznikem disulfidických můstků. Vzorek ve formě krystalu je osvícen zářením z zdroje rengenového záření (např.30).

β-listů a smyček (Obr. spíše poskytuje určité množství možných řešení. tato metodika je využívána ke studiu sbalování proteinů (protein folding) a jejich dynamiky. Do dnešní doby je známa 3D Strana 11 .32). jako je tomu u běžných krystalů. Jiná zobrazení využívají vyobrazení typických sekundárních struktur. V důsledku velmi komplikovaných struktur je prakticky nemožné zobrazit protein se všemi atomy. což je v některých případech velmi obtížné. Z tohoto důvodu není prakticky možné získat rozlišení jejich struktury pod 1. neboť NMR analýzu je možné provádět v širokém časovém rozmezí. které se účastní jeho stavby.5Å.35). přičemž se zobrazují pouze některé hlavní řetězce (Obr.33). která je nutná pro udržení správné prostorové konformace. Difrakční obrazec je ve své podstatě obraz prostorově rozložené elektronové hustoty molekul. Tyto určené vzdálenosti jsou využity k výpočtům 3D struktury proteinů kombinací znalostí o chiralitě. Třídimenzionální strukturu proteinů v nativním stavu ve vodném roztoku je možné získat metodou dvourozměrné (2D) a nověji i 3 a 4D NMR spektroskopie. Tento fakt je podpořen řadou argumentů. skupinové planaritě atd.34). jako je jejich nativní struktura.37). Tato metodika dovoluje stanovit meziatomovou vzdálenost díky přítomnosti specifických protonů.:Molekulární biologie podkladem k matematické rekonstrukci třídimenzionální struktury molekul (Obr. které poskytují informace v zjednodušených. ale i komplikovaných 3D projekcích. van der Waalsově vzdálenosti. Navíc. Zejména v důsledku vysoké míry hydratace polypeptidických řetězců. tj. Výhodou NMR oproti rengenové strukturní analýze je možnost stanovit strukturu bez nutnosti získání krystalu proteinu.38). především αhelixů. V současné době existuje řada počítačových programů. jejich aktivní místa nejsou uspořádáním v mřížce krystalu nijak ovlivněna. Přesnější představu o architektuře proteinu je zpravidla možné získat pouze kombinací znalostí primární struktury polypeptidu a výsledku strukturní analýzy. byl myoglobin (Obr. V dnešní době lze snadno vytvářet pomocí počítačové rekonstrukce 3D obrazy elektronových hustot proteinů (Obr. Z tohoto důvodu se zpravidla využívá zobrazení pouze polypeptidické uhlíkové kostry.Studijní opory biologie Malý J. Získání dostatečně čistého a uspořádaného krystalu proteinů je v řadě případů hlavní překážkou ke strukturální analýze s vysokým rozlišením (Obr. Pvním globulárním proteinem. Struktura proteinů získaná analýzou krystalů je zpravidla vždy stejná.36). např. u kterého byla zjištěna 3D struktura rengenovou krystalografií. Terciární struktura proteinů značí skutečné prostorové uspořádání sekundárních struktur polypeptidického řetězce. Tato metodika nedovoluje určit jednoznačnou strukturu proteinu. Krystaly proteinů jsou zpravidla méně uspořádané a rigidní struktury než krystaly anorganických látek. některé enzymy přetrvávají v aktivním stavu i ve formě krystalu. která jsou si vzájemně velmi blízká (Obr. které jsou u známých polypeptidových sekvencí vzdálené méně jak 5Å.

tvořený těsně nahloučenými nepolárními skupinami je téměř bezvodý a připomíná tak uspořádání podobné molekulárnímu krystalu. Typickým příkladem je struktura cytochromu c (Obr. Asp a Glu jsou lokalizovány především na povrchu proteinů. tj. Leu. domén. Vnitřek proteinů. Příkladem je doména imunoglobulinů (Obr.:Molekulární biologie struktura přibližně 18. proteinové motivy (supersekundární struktury). Domény jsou strukturálně nezávislé jednotky. βαβ motiv. Pro ilustraci lze uvést např. mimo kontakt s vodným prostředím obklopující protein. Lys. tvořících sendvičové uspořádání. V řadě i strukturálně nepříbuzných proteinů se vyskytují tzv. Příkladem je NAD+ vazebná doména glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy. Ta však nutně nemusí ovlivnit konformaci a funkci propojených domén. kde dochází k enzymatické proteolýze proteinu. β domény se skládají z 4 až 10 převážně antiparalelních β-listů ve dvou rovinách.43) a retinol-vázajícího proteinu (Obr.42). Tyto struktury jsou často součástí aktivních center enzymů a jsou evolučně příbuzné i u funkčně vzdálených enzymů. Ačkoliv jsou tyto dosud charakterizované struktury unikátní. že vznikly z jedné původní domény divergenční evolucí. 4-helixový svazek u cytochromu b562 a lidský růstový hormon (Obr. αα motiv a motiv řeckého klíče (Greek key motif) (Obr. Tyr a Trp jsou běžně orientovány na povrchu i ve vnitřku proteinů. Doménové struktury jsou zpravidla členěny na tzv. specifická uskupení sekundárních stuktur. V řadě globulárních proteinů jsou přítomny jak α-helixy tak β-listy (v průměru 31% a 28%). tzv.40). jako je tomu u fibrilárních proteinů. jsou nositely některých společných znaků a vlastností. jsou velmi často lokalizovány dovnitř proteinu. α /β domény jsou tvořeny centrálním paralelním uspořádáním β-listů pospojovaných α-helixy (Obr. Met a Phe. Thr. složení enzymu glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy (Obr.45).000 proteinů. His. Je tedy pravděpodobné. Nepolární skupiny aminokyselin jako je Ser. Reprezentativním příkladem α domény je globinová doména. Asn. Gln.39). které mají každá o sobě charakter malého globulárního proteinů.41). Polypeptidické spojky mezi doménami jsou často místem. Proteiny. které jsou delší jak ≈ 200 aminokyselin zpravidla vytváří dva nebo více vzájemně propojených globulárních shluků. Tyto skupiny velmi často váží enzymové kofaktory a učastní se katalytické funkce enzymu. β-vlásenkový motiv. Ile. Nepolární rezidua aminokyselin. Nabité polární skupiny aminokyselin jako je Arg. obrácené do vodného prostředí. jako jsou Val. téměř vždy jsou svázány vodíkovými můstky s jinými fukčními skupinami. α domény jsou nedílnou součástí transmembránových proteinů.44). Každá doména se skládá vždy z několika vrstev sekundárních struktur a má specifickou funkci. α a β domény a α /β domény. Naproti Strana 12 .Studijní opory biologie Malý J. Globulární struktury velmi zřídka obsahují periodické motivy v primární struktuře. Nejznámější je tzv. Skupiny proteinových motivů vytváří strukturu jednotlivých domén.

plyne. nukleovými kyselinami a substrátem. Existuje řada počítačových programů. V protikladu k tomu je např. Do dnešní doby je v této databázi shromážděno až 20 tis.rutgers. Databáze nukleových kyselin (Nucleic Acid Database. tj. výpočty prostorového rozložení povrchového náboje proteinů.:Molekulární biologie tomu. neboť je garantována pouze slabými interakcemi.). Ze srovnání např.mol-1. tj. který se zabývá využitím moderních výpočetních postupů v analýze sekvencí proteinů a nukleových kyselin stejně jako způsoby. Bioinformatika je vědní obor. Iontové páry (solné můstky) přispívají ke stabilizaci proteinů pouze malou měrou. strukturální bioinformatiky. PDB. že typický protein o 100 aminokyselinách je držen ve správné konformaci energií cca 40 kJ. Elektrostatické síly. výrazně přispívají zejména k mezimolekulárním vazbám mezi proteiny. které umožňují třídimenzionální zobrazení prostorových struktur proteinů (např.edu/NDB/ndb. proteinové bance (Protein Data Bank. coulombovské interakce. programy umožňující provádět klasifikaci či srovnávací analýzy 3D struktur proteinů (např. VRML atd. Např. v důsledku jejich superpozice a zesílení hrají velmi důležitou roli při stabilizaci proteinů. jejich správná prostorová konformace je ve fyziologických podmínkách velmi křehká. Daleko větší měrou se uplatňují tzv.47).org/pdp/). 1. Získávání. Znalosti o atomární struktuře proteinů jsou shromažďovány v tzv. SCOP atd. NDP. Současné počítačové postupy dovolují realizovat např.8. van der Waalsovy síly.46). jakými mohou být zobrazovány a srovnávány makromolekulární struktury jako jsou proteiny. Stabilita proteinů Z termodynamických měření vyplývá. Přestože jejich energie je vzhledem k iontovým interakcím slabá.mol-1. zpracování a uchování informací o struktuře proteinů je v současné době neodmyslitelně spjato s rozvojem tzv. http://ndbserver. http//www. Londonovy disperzní síly. popř. energie potřebná k rozštěpení vodíkové vazby rovna cca 20 kJ. zejména díky jejich solvataci. jejich optimální uspořádání v aktivním centru enzymu mohlo vést i ke konvergentní evoluci z původně nepříbuzných struktur. CE. kategorizace CATH.rcsb. biomolekulárních struktur získaných NMR a rentgenovou strukturní analýzou. že nativní proteiny.). které do značné míry ovlivňují mechanismus enzymové aktivity (Obr. které mají svůj původ v elektronových Strana 13 .Studijní opory biologie Malý J. RasMol.thml) poskytuje informace o struktuře biomolekul obsahující nukleové kyseliny. karbonylová a amidová skupina peptidické vazby mají formu permanentních dipólů. Denaturaci proteinu je tedy zabráněno pouze velmi citlivě balancovanými vnitřními a vnějšími silami působícími na protein ve fyziologickém prostředí. které mají svůj původ v dipól-dipólových interakcích (ať již permanentních či dočasných dipólů) (Obr.

změnou pH. proteiny mohou podléhat ztrátě konformace např. Kvarterní struktura proteinů Díky existenci prostorových povrchových nábojů proteinů je obecnou vlastností jejich vazba na jakékoliv jiné molekuly. V případě. 1. Jelikož proteiny jsou do určité míry podobné micelárním strukturám (hydrofobní zbytky aminokyselin lokalizovány do jádra proteinu). ClO4-. ve které dosáhnou maximální počet intermolekulárních vodíkových můstků. alifatických alkoholů). teplota tání proteinu (Tm) je obdoba veličiny. Hydrofobní síly jsou síly. U naprosté většiny proteinů je Tm menší jak 100°C (Obr. Denaturace proteinů Povaha slabých stabilizačních sil. Tzv. Toto však neplatí o jiných proteinech. která charakterizuje tepotu tání pevných látek. které zaručují správnou konformaci proteinů je příčinou snadné denaturace proteinů v podmínkách. UV absorpce. Disulfidové můstky vznikající spojením dvou cysteinových zbytků jsou výrazným stabilizátorem tercierní struktury proteinů. Relativně redoxní povaha cytoplasmy řady buněk však snižuje stabilitu disulfidických můstků v nativních podmínkách. jako je aktivita a konformačně závislé charakteristiky. SCN-. Strana 14 . chaotropní činidla jsou soli.10. Tato změna vyvolá kolaps struktury do náhodného klubka polypeptidu. Správně zbalené proteiny nabírají takové konformace.:Molekulární biologie fluktuacích jinak nepolárních molekul. Nezbalené proteiny vytvářejí vodíkové můstky s molekulami rozpouštědla. kdy tyto vazby jsou narušeny. denaturovaného proteinu. částečná ztráta struktury navozuje rychlou destabilizaci proteinu jako celku. že ztráta konformace probíhá kooperačním způsobem. ve vodě rozpustných látek (např. jsou stabilizační silou zejména v těsně nahloučených vnitřních prostorách globulárních proteinů. vznik micelárních struktur. Mimo teplotní denaturace. Tzv. 1. viskozita atd. které spoluvytvářejí funkční celek – kvarterní strukturu proteinů. Výrazným způsobem stabilizují protein vodíkové můstky. Vyjímku tvoří polypeptidy.Studijní opory biologie Malý J. které vedou k minimalizaci kontaktu nepolárních molekul s vodou či amfipatickými molekulami. Zde je tato vazba pro funkčnost nežádoucí a proto byla evolucí u funkčně nesourodých proteinů vyloučena. tj. Důležitými stabilizačními silami jsou hydrofóbní síly. že je protein postupně zahříván. je jisté. že podíl těchto sil na stabilizaci proteinu je významný. dochází k skokovým změnám jeho vlastností.48).9. Li+). působením detergentů či vysokou koncentrací organických. Rychlost těchto změn napovídá. Tato vazba je zasílena při exkreci proteinů do extracelulárních prostor. I-. tj. jejichž výsledkem je např. kde převažují oxidační podmínky. které ve zvýšené koncentraci mohou navodit denaturaci proteinů (např.

Nejjednoduším typem rotační symetrie je symetrie cyklická (Cn. se nazývají oligomery. V převážné většině oligomerních proteinů jsou protomery symetricky uspořádané. které mohou být v případě potřeby vyměněny za jiné. Existuje několik důvodů pro tento fakt. které se skládají ze stejných. Místo vzniku. Tyto struktury jsou dále charakterizovány rotační symetrií. které jsou charakterizovány tzv. s dvou. lze nalézt osu rotace. Dihedrální symetrie (Dn) je více komplikovaná symetrie. Příkladem je aktin a tubulin.49). dvěma navzájem kolmo orientovanými osami.Studijní opory biologie Malý J. Z tohoto důvodu vznikají prostorově ohraničené definované struktury. V tomto pohledu je např. kubickou či oktahedrickou (O) symetrii. Protomer se pak muže skládat buď z jednoho polypeptidického řetězce nebo z více. Příkladem je hemoglobin.a vícesymetrickými. které tuto strukturu vytvářejí se nazvývají proteinové podjednotky. helikální symetrie (Obr. která je tvořena pouze jednou osou symetrie. často mnohokrát opakovaných podjednotek. Multikomponentní stavba umožňuje snažší regulaci funkce proteinů atd. úprav a konečného složení funčního celku může být lokalizováno v různých částech buňky. U řady komplikovaných enzymů vzniká aktivní místo na pomezí jeho podjednotek. nachází se v pravidelné geometrické pozici v rámci oligomeru.51). Naprostá většina funkčních proteinů je složena z několika podjednotek. U řady strukturně i funkčně složitých proteinů je snažší vytvářet vyšší celky samovolným skládáním menších podjednotek (self-assembling process). hemoglobin dimer složený z protomeru α a β (Obr. Jednotlivé podjednotky tohoto typu se pak nazývají protomery.50). Složitější útvary mohou nabývat tetrahedrickou (T). Některé oligomerní proteiny nabývají tzv. vzájemně odlišných řetězců. kde n značí počet protomerů). tj. Proteiny. podle které je tvar proteinu symetrický (Obr. Strana 15 .:Molekulární biologie Jednotlivé polypeptidy. bodovou symetrií. tj.

Fosfátové zbytky těchto polynukleotidů jsou za fyziologických podmínek kyselé. je vázána na C3´uhlík pentózy a vytváří tak 3´-nukleotid. Nejdůležitější purinovou bází je adenin a guanin. v případě pyrimidinových bazí se jedná o cytozin. pyrimidinové báze skrze N1 atom.54). jako je nikotinamid adenin dinukleotid (NAD či NADP). popř.55). Fosfátový zbytek je za fyziologických podmínek dvakrát ionizován. flavin adenin dinukleotid (FAD) nebo coenzym A (CoA) jsou přímími účastníky řady enzymatických reakcí. aromatické a heterocyklické molekuly. uracil a thymin (5-methyluracil) (Obr. Řada metabolických pochodů je regulována přítomností/nepřítomností dostatečného množství ATP. jsou tvořeny 2´-deoxy-Dribózou. jako vazba mezi C4´a C5´uhlíkem pentózy (β-konfigurace). některé NTP se účastní přenosu informací v buňce. kdežto deoxyribonukleotidy. které participují takřka ve všech biochemických procesech. které vznikají spojení skrze fosfátové skupiny na 3´a 5´atomu uhlíku po sobě jdoucích pentóz (Obr. ve kterých je dusíková báze vázána v poloze C1´ na cukerném zbytku (Obr. tzn. Ve všech známých přirozeně se vyskytujících nukleotidech je dusíkatá báze vázána na C1´uhlíku s kovalentní vazbou (glykosidickou vazbou) orientovanou do stejné roviny. 2. STRUKTURA A FUNKCE NUKLEOVÝCH KYSELIN Vlastnosti nukleotidů Nukleotidy a jejich deriváty jsou biologicky nazastupitelné molekuly. ribozymů. Některé nukleotidové deriváty. které jsou monomery ribonukleových kyselin (RNA) jsou tvořeny pentózou D-ribózou. Fosfátová skupina je navázaná buď na C5´uhlík pentózy a vytváří tak 5´-nukleotid. Strana 16 . Nukleotidy jsou fosfátovými estery pětiuhlíkatých cukrů. že nukleové kyseliny jsou polyanionty.Studijní opory biologie Malý J. Pokud není fosfát na pentóze navázán vůbec. Dusíkaté báze jsou planární. Nukleové kyseliny jsou lineární polymery nukleotidů. nukleových kyselin s enzymatickou aktivitou. součást deoxyribonukleových kyselin (DNA).52). Nukleosid-trifosfáty (NTP) jsou energeticky bohaté molekuly. které jsou v zásadě odvozeny od struktury purinu a pyrimidinu (Obr. Purinové báze se váží na pentózu skrze jejich N9 atom. tj. Nukleové kyseliny jsou směrově orientovatelné.53). ribonukleotidy. které se účastní většiny metabolických pochodů v buňce jako zásobárna okamžitě využitelné energie. molekula se nazývá nukleosid. každá má 3´konec (C3´atom není spojen s dalším nukleotidem) a 5´konec (C5´atom není spojen s dalším nukleotidem). Je tedy možné 5´-nukleotid označit také za nukleosid-5´-fosfát. Vyvářejí monomerní jednotky nukleových kyselin a sehrávají tak centrální roli při uschování a expresi genetické informace. zejména pokud jsou součástí tzv. Tzv. Některé nukleotidy mají katalytickou aktivitu.1. tj.:Molekulární biologie 2. má poměrně silné kyselé vlastnosti.

Skládá se ze dvou řetězců polynukleotidů. tj. B-DNA (Obr. Struktura nativní DNA byla stanovena v roce 1953 Watsonem a Crickem.58). (iii) informace o helikální struktuře DNA získaná rentgenovou difrakcí (R. navzájem komplementárních řetězců nukleových kyselin (ssDNA – single stranded DNA). párování A-G. Tyto páry jsou vzájemně zaměnitelné. které by výrazným způsobem deformovalo cukerný řetězec polynukleotidu a narušovalo uspořádanost struktury DNA. Jejímu objevu napomohlo několik v té době známých faktů o povaze a vlastnostech DNA: (i) Chargaffovy pravidla. Podstatou tohoto jevu je existence genomové DNA ve formě dvoušroubovice (dsDNA – double stranded DNA). popsaná Watsonem a Crickem je považována za nativní (biologicky aktivní) konformaci DNA. tj. párování bazí). stabilizovaných vodíkovými můstky mezi páry A-T a G-C.úzkým (minor groove) a širokým žlábkem Strana 17 . Tyto řetězce jsou navzájem antiparalelní. spektroskopickou a rentgenovou strukturální analýzou. jen místo párování A-T je párování A-U. Na základě těchto faktů navrhl Watson a Crick strukturu dvouřetězcové šroubovice. nezáleží. Franklin) (Obr. na kterém vlákně DNA se daný člen dvojice nachází. které se navzájem obtáčí do pravotočivé dvoušroubovice s průměrem ≈ 20Å. Roviny bazí jsou téměř kolmé na osu šroubovice. st. Obsah GC je velmi proměnlivý z hlediska organismů (od 25-75%). Tzv. Tato struktura je popsána několika následujícími charakteristickými znaky. Watson-Crickova struktura DNA patří k základním pilířům a mezníkům rozvoje molekulární biologie. přičemž báze jsou směřovány dovnitř šroubovice. v rámci příbuzných skupin je však poměrně ustálený (např. přičemž délka vlákna na 1 otočku je 34Å.57). složené ze dvou. existence tzv. která se velmi rychle ujala mezi vědeckou veřejností zejména díky jednoduchosti a jasné interpretaci z ní vyplývajících biologických principů. savci mají rozsah GC obsahu v rozpětí 39-46%). díky rozvoji kvantitativních metod separace a analýzy hydrolyzované DNA. U některých virů.:Molekulární biologie DNA má vždy stejný počet adeninu a thyminu (A = T) a guaninu a cytosinu (G =C).) by došlo k párování. Toto tzv. A-C atd. žlábky . (ii) znalost správných tautomerních forem dusíkatých basí potvrzených jejich NMR. RNA se vyskytuje v převážné většině v jednořetězcové (ssRNA – single stranded RNA) formě. Watson-Crickových párů bazí (Obr. Každá z bazí je svázána vodíkovými můstky s protilehlou komplementární bazí (tzv.56). Chargaffovo pravidlo bylo objeveno ve 40. letech 20. ve kterých je přítomna dvouřetězcová forma RNA (dsRNA – double stranded RNA) podléhá Chargaffovým pravidlům. Jejich objev byl později oceněn Nobelovou cenou. Naopak v případě nekomplementárních bazí (např.Studijní opory biologie Malý J. Jednou z důležitých vlastností B-DNA je vzájemné párování pouze adeninu s thyminem a guaninu s cytosinem. Ideální B-DNA je tvořena 10 páry bází (bp – base pair) na 1 otočku helixu. BDNA je tvořena dvěma externími tzv.

Široký žlábek je hluboce zaříznutý do helixu.60). V okamžiku.63). tj. nemohou vytvářet strukturu obdobnou B-DNA v důsledku sterických zábran 2´-OH skupin. V tomto případě je tato struktura (RNA) substrátem pro RnasuH. Strana 18 . kde jejich existence zaručuje odolnost spór proti UV záření. In vivo existence Z-DNA byla prokázána teprve nedávno.62). tj. Skutečná struktura B-DNA se od teoretické v několika aspektech liší. že B-DNA není jedinou konformací dvouřetězcových nukleových kyselin. Např. jako tzv. A-DNA strukturu (Obr. 20 let po objevu B-DNA byla popsána velmi neobvyklá struktura levotočivého dvojřetězcového helixu (Wang a Rich) u syntetického oligonukleotidu d(CGCGCG) a označena jako Z-DNA (Obr. Existuje celá řada konformací. která specificky hydrolyzuje RNA hybridního helixu. v aktivním vazném místě DNA-polymerázy (≈ 3bp segment) a u bakteriálních spór.59. s 11. V nativních podmínkách byla tato struktura popsána např. tj. Helix je tvořen 12 bp na 1 otáčku s délkou 44Å. které jsou běžné u některých virů. kdy je vlhkost prostředí snížena z 90 na 75%. v závislosti na přítomnosti iontů kovů či vlhkosti prostředí. Tato struktura má 11bp na 1 otočku. neboť jsou principiálně součástí hybridní DNA-RNA vznikající při transkripci a při iniciaci (primerování) replikace. které zesilují či zeslabují vazbu obou řetězců. dsRNA či DNA-RNA hybridní molekuly. Zα-protein vázající doména lokalizovaná ve specifických nukleotidových sekvencích na řetězci B-DNA (Obr. je známo. které mohou zaujímat dsDNA. které zpracovávají genetickou informaci. že Z-DNA vzniká především na segmentech s alternujícími purinovými a pyrimidinovými bázemi v přítomnosti vysokých koncentrací solí. Hybridní dvouřetězcové komplexy. dlouhou 30. že skutečná struktura je sekvenčně závislá.Studijní opory biologie Malý J. úzký žlábek je velmi mělký. pro sekvenčně specifické interakce DNA s proteiny.:Molekulární biologie (major groove). komplexy DNARNA nabývají opět struktury podobné A-RNA (Obr. přechází B-DNA struktura samovolně na tzv. Ve většině případů nabývají konformace blízké A-DNA. Tyto struktury jsou in vivo běžné. Zejména v souvislosti s rozvoje umělých syntéz oligonukleotidů a jejich rentgenovou difrakční analýzou bylo zjištěno. Tyto sekvence jsou důležité např. Je pro něj charakteristický velmi hluboký úzký žlábek a zanedbatelný široký žlábek. Rovina bazí je pootočena vzhledem k ose šroubovice asi o cca 20°. určité kombinace sekvencí (pořadí nukleotidů v řetězci) vnáší do B-DNA deformace. které se označují jako A-RNA či RNA-11.6 bp na 1 otáčku a délkou 34Å s centrální dutinou.9Å. Charakteristiky dvou typických konformací – A-DNA a Z-DNA jsou uvedeny na Obr. avšak podstatně širší. Opět se jedná o dvouřetězcovou pravotočivou šroubovici. thyminových dimerů). Studiem syntetických oligonukleotidů bylo zjištěno. Dvouřetězcové dsRNA. vzniku kovalentní vazby mezi dvěma sousedními thyminy (tzv.61).

2. Tento fakt je způsoben podstatně menší diverzitou nukleotidů ve srovnání s aminokyselinami. či nadšroubovicové vinutí. V důsledku polyiontové povahy nukleových kyselin (negativně nabité fosfáty nukleotidů) se stabilizace účastní rovněž i iontové síly. Struktura DNA s nadšroubovicovým vinutím Genetické analýzy prokazují. Tato topologická struktura se občas označuje i za tercierní strukturu DNA a má pro tyto organismy důležitou roli v řadě životních projevů. která může nabývat pouze několik stabilních prostorových uspořádání a párování Watson-Crickových bazí obou protichůdných řetězců. Tyto interakce jsou ve vodném prostředí nejčastěji způsobeny hydrofobními silami působícími mezi bázemi nukleotidů. i zde se uplatňují stabilizační síly různé povahy. existuje pouze limitovaný počet možných konformací. Vzhledem k velmi nízké stabilitě se v rámci dsDNA nevyskytují párování bazí jiného než komplementárního typu. snadnější denaturací DNA v nevodném rozpouštědle (např.64). Z analýzy krystalů DNA je známo. ve kterých je tato struktura stabilní. že naprostá většina bakterií a virů obsahuje genomovou DNA ve formě uzavřených kruhových DNA. kde L značí tzv. Schematický diagram základní struktury cirkulární DNA je znázorněn na Obr. Matematicky se dá vyjádřit tento fakt vztahem: L = T + W.:Molekulární biologie Dvouřetězcová DNA je ve srovnání s terciérní strukturou proteinů daleko méně komplexní.Studijní opory biologie Malý J. že jsou zodpovědné za párování komplementárních bazí. např. elektronovou mikroskopií (Obr. Po denaturaci jsou báze stabilizovány vodíkovými můstky s molekulami vody. van der Waalsovy interakce planárních paralelních molekul purinových a pyrimidinových basí v řetězci nukleové kyseliny (Obr. tak např. tj.66. base stacking. Vodíkové vazby přispívají ke stabilizaci dsDNA pouze omezeně a to i přes to. Stejně jako v případě proteinů. spojovací číslo označující počet otáček jednoho vlákna kolem vlákna druhého. který zeslabuje vodíkové můstky a snižuje tak teplotu tání (Tm) dsDNA. ethanolu). Mg+2) stabilizuje dsDNA (zvyšuje Tm). Základem stabilizace dvou řetězců nukleové kyseliny je poměrně omezená konformační volnost cukerné kostry nukleové kyseliny. Přítomnost kationtů v roztoku (zejména divalentních. že důležitou stabilizační silou dsDNA je tzv.2. kterými se obě vlákna DNA vzájemně obtáčí. který se nazývá superhelikální. T číslo celkových otáček DNA kolem osy vlákna v dané konformaci a W je počet otáček duplexu DNA kolem osy dvojšroubovice.65). Tato skutečnost byla prokázána jak molekulárněbiologickými přístupy. Řada těchto kruhových DNA se nachází ve stočeném stavu. Výsledné geometrické uspořádání této struktury je závislé na počtu otáček. Lze se o tom přesvědčit např. tj. než přestřihnutím a provlečením jednoho z vláken okolo vlákna druhého. Změnu v počtu otáček není možné provést jiným způsobem. W je Strana 19 .

67. superhelikálních DNA v elektickém poli a polymerním sítu agarózového gelu. Topologii. Správná biologická funkce cirkulrání DNA je zaručena pouze v případě správné topologie. Jinou metodikou.:Molekulární biologie měřítkem nadšroubovicového vinutí (superhelicity) DNA. která má schopnost se vmezeřit mezi vlákna duplexu (Obr. Rozdíl mezi T a W je prezentován na Obr. v případě stočeného helixu se duplex stáčí okolo sebe. že tyto enzymy pouze mění topologii DNA. V procesech transkripce a translace vyžadují enzymy jako je RNA polymeráza či DNA polymeráza lokální rozpletení duplexu DNA a odhalení sekvence bazí. nestejně rychlé migraci. Dojde k protočení jednoho vlákna okolo druhého a uvolnění nahromaděného napětí. topoisomerázy typu I se subtypy IA a IB (na základě jejich primární struktury a reakčního mechanismu) a topoisomerázy typu II (způsobující dvouřetězcové zlomy DNA). jako je ethidium bromid (EtBr) (Obr.70). prostorovém uspořádání helixu.71) a přitom mění stupeň pootočení vláken (≈ 26°) a tím i superhelicitu duplexu. cirkulární formy s W=0 pomocí štěpení jednoho řetězce v duplexu pankreatickou DNasou I (endonukleáza. tj. které se nazývají topoisomerázy. příklad zavedení nadšroubovicového vinutí do cirkulární DNA na Obr. přes relaxovanou kruhovou DNA až po pozitivní superhelicitu (W > 0) (Obr. V toroidním helixu je osa duplexu omotána ve formě cylindru. I zde dochází k separaci. Superhelikální DNA může být převedena in vitro do relaxované podoby. tj. Jejich název je odvozen z faktu.68. štěpící v určité sekvenci pouze 1 vlákno duplexu). Hodnota superhelicity (W) je pak vyhodnocena odlišnou sedimentační rychlostí jednotlivých typů duplexů. Strana 20 . tj. tzv. Superhelikální DNA s negativním W může existovat ve dvou odlišných formách – tzv. Pokud je DNA relaxována. Dosud pozorované nativní formy těchto duplexů byly případem stočeného helixu. Postupným zvyšováním koncentrace EtBr je možné dosáhnout postupnou změnu superhelicity od negativní superhelicity (W < 0).72). Superhelicita je kontrolována početnou skupinou enzymů. EtBr je planární molekula. toroidním helixu a v stočeném helixu (Obr. prostorové uspořádání cirkulární DNA se superhelicitou lze laboratorně studovat a měřit. tj. Topoisomerázy se člení na 2 skupiny. schopnou odlišit navzájem odlišné struktury s různou superhelicitou je agarózová elektroforéza (Obr.Studijní opory biologie Malý J.73).69). či neprobíhají vůbec.. Negativní superhelicita cirkulární DNA napomáhá odtrhnutí obou vláken duplexu v určitých sekvencích a sestavení funkčních polymeráz. pak výše zmíněné procesy buď probíhají velmi pomalu. Tento jev byl mnohokrát potvrzen využitím interkalárních molekul. avšak nikoliv její kovalentní strukturu.

Typ IB pracuje na základě kontroly rotace duplexu.Coli (Obr.82).81). v důsledku navození relaxace DNA (nečinnost gyráz). Je známa řada látek. I zde dochází k rozštěpení jednoho řetězce duplexu DNA a jeho vazbě na tyrozin. který se skládá z podjednotek GyrA a GyrB.78). Gyráza může rozpojovat a spojovat jeden i oba řetězce duplexu DNA. Následuje relaxace duplexu.:Molekulární biologie Typ I topoisomeráz katalyzují úplnou relaxaci superhelikální DNA změnou jejich počtu otáček (L) v jednootáčkovém krokování. Typ IA se nachází ve všech typech buněk a provádí relaxaci pouze u negativní superhelikální DNA. jako je např. neboť jeho rotace je způsobena uvolněním negativního napětí v duplexu (Obr. kontrolovanou rotací přestřiženého vlákna DNA kolem zafixovaného komplementárního řetezce.75). Příkladem je činnost topoisomerázy I a III bakterie E. tj. Funkce gyrázy spočívá v přestřižení obou vláken duplexu. Typ II topoisomeráz prokaryot se označují jako enzym gyráza. která je však prováděna odlišným mechanismem od typu IA. Dobře prostudovanou topoisomerázou typu II je enzym izolovaný z kvasinek (Saccharomyces cerevisiae. Na závěr dochází k opětovnému spojení vlákna a uvolnění duplexu DNA. Po rozstřižení jednoho řetězce v duplexu je 5´-konec zachycen kovalentní vazbou na tyrozinu a následně je mezi vzniklým zlomem provlečeno celistvé vlákno (Obr. Tyto enzymy mají schopnost restrikce v určitých specifických sekvencích duplexu DNA za současného navázání rozštěpených konců řetězce pomocí tzv. protlačení vlákna duplexu přes dvojřetězcový zlom a jeho opětovné spojení (Obr. typ IB se nachází jak u prokaryot tak i eukaryot a provádí relaxaci negativní i pozitivní superhelikální DNA. novobicin. antibiotika izolovaného z streptomycet (patří ke kumarinovým typům antibiotik) či ciprofloxacin (obchodní značka Cipro) pařící k chinolinovým typům antibiotik (Obr. které inhibují činnost eukaryotních topoisomeráz typu II a jsou hojně Strana 21 . avšak skrze 3´-fosfotyrozinovou vazbu. jeho akivní provlečení (spotřeba energie) okolo druhého řetězce a opětovného spojení (strand passage mechanism) (Obr. avšak opět za spotřeby ATP. Pravděpodobný proces a jeho jednotlivé fáze jsou prezentovány na Obr. Příkladem je lidská topoisomeráza I (topo I) (Obr.80). Tyto enzymy pracují mechanismem obdobným strand passage mechanismu topoisomeráz IA.76). 5´-fosfotyrozinové vazby na aktivní tyrozin enzymu (Obr. DNA gyrázy mohou být inhibovány řadou látek.77). topoII) (Obr.77.74). Tento enzym katalyzuje krokové zvyšování negativní superhelicity duplexu DNA za současné hydrolýzy ATP. Tyto antibiotika inhibují procesy replikace a transkripce v bakteriích.Studijní opory biologie Malý J. Podstatou funkce typu IA je rozštěpení jednoho řetězce duplexu DNA.79). Ostatní topoisomerázy typu II prokaryot a eukaryot (vyjma gyrázy) naopak provádí relaxaci DNA. Gyráza je A2B2 heterotetramer. Tento proces nevyžaduje dodání další energie enzymem.

Strana 22 .:Molekulární biologie využívána v nádorových chemoterapiích.Studijní opory biologie Malý J. terrmální energie je stále dostatečná k tomu. jako monitorovat denaturaci DNA. tyto molekuly zvyšují rychlost štěpení duplexů. je možné pozorovat např. 2. dochází ke kolapsu nativní dvojřetězcové struktury. Za těchto podmínek je možné kompletně renaturovat DNA v původní formě. popř. Obecně platí pravidlo. aby se vlákna DNA navzájem pohybovala a reorganizovala s cílem nalézt komplementární oblasti. je sledování změn absorpce v UV oblasti. než je struktura definitivně „zmražena“. Denaturace je doprovázena změnou fyzikálně-chemických vlastností roztoku DNA. Během procesu denaturace dochází k ≈ 40% nárůstu absorpce v důsledku uvolnění aromatických bazí. že vyšší obsah GC zvyšuje Tm v důsledku existence tří vodíkových můstků mezi komplementárními bazemi. který se nazývá hybridizace. pH. výsledná DNA bude pouze částěčně spárovaná (Obr. sekvenční komplexita genomu (obsah GC). kdežto vyšší obsah AT naopak snižuje Tm (2 vodíkové můstky). Pokud je však teplota roztoku ponechána po určitou dobu ≈ 25°C pod Tm. Příkladem je doxorubicin a etoposid (Obr. neboť oba řetězce nemají dostatek času k nalezení komplementárních sekvencí před tím. oddělení komplementárních řetězců DNA a jejich sbalení do náhodného uspořádání. PCR). který se nazývá hyperchromní efekt. Získaná závislost se nazývá křivka tání a její střední hodnota odpovídá teplotě tání Tm (melting point). Nejspolehlivější metodou. jak se dá odhadout tzv. nádorových buněk.3. Ta je základem moderních metod v molekulární biologii a genovém inženýrství (např. Obdobně lze například získat i dvouřetězcovou hybridní DNA-RNA molekulu procesem. V kontrastu s inhibitory gyráz.84). Tento jev.85). při konstantní vlnové délce λ = 260nm jako závislost na teplotě roztoku (Obr. Teplota tání duplexu je závislá na celé řadě faktorů. nebo inhibují religační schopnost. kde jsou lokalizována charakteristická absorpční maxima. concentrace a typ přítomných iontů.83). Stanovení Tm u genomové DNA je jednou z metod. Dochází tak k masivnímu nárůstu jedno a dvou-řetězcových zlomů DNA v buňce a následní zánik především rychle se replikujících. Pokud je roztok obsahující denaturovanou DNA rychle schlazen pod hodnotu Tm. Denaturace a renaturace nukleových kyselin Pokud je roztok duplexu DNA zahříván na určitu teplotu. obsah GC a AT párů. zejména viskozity či absorpčního spektra (Obr. polymerázová řetězová reakce. jako je povaha solventu.87). které jsou odpovědné za absorpci v UV oblasti. Tento proces se nazývá denaturace (Obr.86).

Důvodem byl především fakt.st. které realizují genetickou informaci uloženou v DNA v daném konkrétním organismu. Vzniká tak tzv. Replikační očko může obsahovat jednu či dvě replikační vidličky.:Molekulární biologie 3. v závislosti na počtu DNAP. Téměř všechny známé DNAP jsou schopny připojit nový nukleotid do vznikajícího řetězce na volnou 3´-OH skupinu syntetizovaného vlákna. překlad) genetické informace do pořadí aminokyselin v proteinech (Obr. REPLIKACE DNA Obecný princip replikace V roce 1958 nastínil Crick schéma přenosu a realizace genetické informace v organismech. zatímco její transkripce (tj. tj. přepis) poskytuje RNA. který se nazývá DNA polymeráza (DNAP). se nazývá Strana 23 .let min. aby nedocházelo k vzniku chybného párování.89). Místo. centrální dogma molekulární biologie. Cairnem jako replikace cirkulárního chromozómu a vzniklé struktury označeny řeckým písmenem theta (θ) a nazvány jako tzv. že replikace se vždy účastní pouze několik málo kopií enzymů v jedné buňce. replikační očko (Obr. které se později označilo za tzv. které bylo nutné izolovat a popsat.92). Tyto enzymy využívají jednořetezcový templát DNA k syntéze komplementárního vlákna z příslušných s templátem párujících se nukleotidů (Obr. tj. ve kterém je syntetizována dceřiná dsDNA se nazývá replikační vidlička (Obr. každé vzniklé vlákno dsDNA obsahuje jedno vlákno z původní dsDNA a druhé nově nasyntetizované. DNA specifická DNAP (označující typ nukleové kyseliny. Dovouřetězcová DNA je kopírována tím způsobem. která probíhá vždy jen ve směru 5´-3´vznikajícího vlákna DNA. semikonzervativní dceřiná kopie dsDNA (Obr. Část replikačního očka. stolení. Replikace přitom zajišťuje kontinuitu existence genové informace v čase a prostoru. popř. že dochází k postupujícímu rozštepění dsDNA vlákna v určitém místě (sekvenci) a odhalení volných bazí nukleotidů. která je podkladem pro translaci (tj.Studijní opory biologie Malý J. Důsledkem je směrovost syntézy (replikace). Poprvé byl tento proces pozorovnán J. Přestože role a existence replikačního mechanismu byla známa již v koncem 50. Jednotlivé nukleotidy komplementárního řetězce jsou přísně kontrolovány tak.88).1. který replikuje). 90). 3. které se replikace účastní (jednosměrná či dvousměrná replikace). kde na vlákně dsDNA je zahájena replikace. DNA je replikována pomocí enzymu. její detailní popis se podařilo uskutečnit až mnohem později. v průběhu 70. které slouží jako templát k syntéze komplementárního řetězce kopie DNA. komplementární vlákno. Vzniká tak dsDNA s typickou helikální strukturou.let 20.91). zaručuje její mezigenerační přenos. DNA řídí vlastní replikaci (zdvojení obsahu DNA). Transkripce a translace jsou nástrojem.

tvorbou Okazakiho fragmentů. že nutně musí existovat nejaký specifický mechanismus zahájení replikace.Studijní opory biologie Malý J. Tyto fragmenty jsou dlouhé 1-2 tisíce nukleotidů. eukaryotní chromozóm obsahuje zpravidla více replikačních počátků. Okazakiho. jak je možné tímto způsobem replikovat i druhé templátové vlákno původního řetězce. V přirozené formě je bakteriální chromozóm cirkulární s negativní superhelicitou. že jejich 5´-konce jsou tvořeny krátkými úseky RNA. který popsal tvorbu krátkých nukleotidových polymerů. tj. U prokaryot je tato topologie udržována aktivitou topoisomeráz II. že DNAP. Okazakiho fragmenty jsou pospojovány až následně činností enzymu DNA ligázy. ve směru pohybu DNAP po 3´-5´ templátovém řetězci. koplementárními k templátové DNA. Naproti tomu tzv. tj. které vzniklé napětí v cirkulární DNA uvolňují. vedoucí řetězec (leading strand) je templátový řetězec orientovaný ve směru 3´-5´. akumulaci (tj. topoisomeráz. které je ve vidličce přítomná popojíždí jedním směrem a syntetizuje semikonzervativní kopie dsDNA. Jejich existence umožnila formulovat tzv.:Molekulární biologie replikační počátek. Požadavek na rozpletení DNA v místě replikačního počátku přináší poměrně závažný topologický problém. popř. hrnutí) otáček ve směru replikace. dnes nazývaných jako Okazakiho fragmenty (Obr. Například chromozóm bakterie E. Tzv. semidiskontinuální replikační model. vyvstává otázka.94). Již z faktu. které je orientováno opačně. Analýzou Okazakiho fragmentů bylo prokázáno. Ze struktury replikační vidličky vyplývá. ve kterém jsou oba mateřské řetězce DNA replikovány odlišným způsobem. tj. ve směru 5´-3´.93). jsou komplementární k druhému rodičovskému řetězci DNA. Jelikož však všechny známé kopie DNAP mohou polymerizovat komplementární vlákno pouze ve směru 5´-3´vznikajícího řetězce. že DNAP je shopná pouze připojit nový nukleotid k 3´-OH skupině předchozího nukleotidu v řetězci vyplývá. který napomáhá rozvinutí duplexu DNA. Prokaryotní a bakteriofágová DNA je charakterizovaná pouze jedním replikačním počátkem. U replikačních oček se dvěma replikačními vidličkami jsou navíc Okazakiho fragmenty syntetizovány na protilehlých řetězcích v jednotlivých vidličkách (tj. Tyto úseky Strana 24 . že rozpletení šroubovice by bylo spojené s jejím točením kolem osy s rychlostí cca 100 otáček za 1s. který je orientován ve směru 5´-3´. Coli je replikován rychlostí ≈ 1000 nukleotidů za 1s. tj. Existence diskontinuálního procesu syntézy DNA je mimo jiné potvrzena elektronovou mikroskopií existencí jednořetězcových úseků DNA v replikační vidličce (Obr. tzv. ale diskontinuálně. syntéza komplementárního řetězce probíhá v souladu se směrem pohybu DNAP. Z různých důvodů tento proces není možný a je ošetřen enzymatickou aktivitou např. zpožďující se řetězec (lagging strand) je také syntetizován ve směru 5´-3´ narůstajícího komplementárního řetězce. mění se poloha lagging a leading řetězce). Tato problematika byla objasněna v roce 1968 výzkumem R.

V souhrnu lze jmenovat následující: (i) DNA topoisomerázy. je pochopitelné. inkorporací molekul mimikujících elektronovou strukturu bazí. že rifampicin inhibuje pouze syntézu vedoucího řetězce (a tedy jeho primerování je zaručeno RNAP) dokazuje. 3.difluorotoulen) (Obr. RNA polymeráza (RNAP) a tzv. které mají schopnost syntetizovat RNA primery – tzv. 2. který kovalentně spojuje Okazakiho fragmenty. odštěpovat nukleotidy od narůstajícího řetězce. Např.96). Pol I může za určitých okolností pracovat i obráceným směrem. Mimo schopnosti polymerizace. že nutně vyžaduje přítomnost správně spárované komplementární báze s templátovou DNA. (v) DNA polymeráza. Coli syntetizoval DNA. které syntetizují RNA primery. než RNAP. tj.:Molekulární biologie se nazývají RNA primery. které separují jednotlivé řetězce dsDNA v replikační vidličce. která je podstatně menším enzymem. Reakce je doprovázena uvolněním dvou fosfátů (PPi) a jejich následným rozštěpením pyrofosfatázou. Pol I Strana 25 . tj. Požadavek na polymeraci Watson-Crickovy báze spočívá spíše než v schopnosti rozpoznání příslušné báze v požadavku na jejím dokonalém zpárování s templátem. DNA polymeráza I (DNAP I nebo Pol I) byla objevena v roce 1957 A. Reakce se velmi podobá aktivitě RNAP. v bakterii E. který v buněčném extraktu bakterie E. které zabraňují jejich zpětnému spárování dle komplementárních bazí.Studijní opory biologie Malý J. Tento proces však není přirozený a nemá závažný fyziologický význam. Pol I je pracuje tzv. DNAP I tak pracuje s velmi vysokou přesností. (vi) enzym. Kornbergem jako enzym.2. Replikační enzymy DNA replikace je složitým procesem zahrnující celou řadu enzymů. Primáza není citlivá k inhibitoru RNAP rifampicinu. který odstraňuje RNA primery. Fakt. (vii) enzym.95). Dalším výzkumem bylo zjištěno. helikázy. Jelikož zralá dsDNA neobsahuje RNA. ale neposkytujících vodíkovou vazbu (např. enzymy. že v určité fázi musí docházet k odstranění primerů a jejich nahrazení komplementární DNA (o mechanismu viz dále). primáza. (ii) tzv. avšak s tím zásadním rozdílem. V následujícím textu jsou podány informace o struktuře a funkci jednotlivých proteinů. do vznikajícího dsDNA je chybně inkorporována pouze 1 nukleotid na každých 10 milionů zpolymerovaných nukleotidů. processingem.4. že primáza se účastí zahájení (iniciace) tvorby Okazakiho fragmentů (Obr. tj. provádí série polymerizačních kroků (typicky 20 a více). že Pol I spojuje deoxynukleosid trifosfáty nasedlé na DNA templátu mechanismem nukleofilního ataku 3´-OH skupin narůstajícího řetězce α-fosforylovou skupinou připojovaného nukleosid trifosfátu. (iii) proteiny. Coli existují dva enzymy. aniž by opustila templát. Tento fakt byl potrzen např. tj. (iv) enzym.

97). Pol I je tvořena tzv. kdy se do řetězce vznikající DNA začlení špatná (nespárovaná) báze. Praktické využití této aktivity Pol I je např. že správný nukleotid je rozpoznán ne základě sekvenčně nezávislé interakce s přiházejícím dNTP. editační aktivita. Tento enzym byl krystalizován a jeho struktura společně s krátkými oligonukleotidovými řetězci duplexu B-DNA charakterizována rentgenovou krystalografickou analýzou (Obr. Cena za tuto aktivitu je určitá ztráta energie. zpravidla Mg2+ . Pol I se výraznou měrou podílí na reparačních procesech poškozené DNA (např. přičemž polymerázová aktivita vyplňuje vznikající mezery. Tato aktivita umožňuje efektivně eliminovat chyby při čtení a replikaci templátu. popř. Ta v tomto místě nejen odstraní několik nukleotidů.Studijní opory biologie Malý J. neboť takto je vytřiženo cca 3% všech inkorporovaných nukleotidů. Pol III). Podrobně prostudovanou DNAP I je polymeráza izolovaná z termofilní bakterie Thermus aquaticus (Taq). pak je řetězec v tomto místě rozštěpen endonukleázou a stává se přístupným k 5´-3´exonukleázové aktivitě Pol I. Aktivita těchto polymeráz je ve srovnání s Pol I nízká (cca 5% Strana 26 . Mimo DNAP I byly objeveny další typy polymeráz. nick translation) a nahrazen značenými nukleotidy (Obr. které jsou přítomné v aktivním místu (Obr. strukturální částí. které se z hlediska morfologie a struktury liší od DNAP I.100). označovaná jako Klentaq1. která je zodpovědná za 3´5´exonukleázovou aktivitu a polymerázovou aktivitu a zbylou částí. resp. kde Pol I odštepuje jednu či několik málo bazí od 5´konce nezávisle na typu přítomné báze.99). vlastní 3´-5´a 5´-3´ exonukleázovou aktivitu. Srovnání vlastností jednotlivých polymeráz je provedeno na Obr. chemickými mutageny). Jsou jimi především DNA polymeráza II (DNAP II. V tomto případě převládne exonukleázová aktivita a špatně spárovaná báze je zpět odštěpena a její místo může obsadit báze komplementární. modifikovaná báze). Pol II) a DNA polymeráza III (DNAP III. tj. kdy 5´-úsek vlákna v uměle navozeném jednořetězcovém zlomu je v přítomnosti Pol I a radioaktivně značených nukleotidů odstraněn (tzv. Nukleotidylový transfer (spojení nukleotidů) je umožněn přítomností dvou iontů kovů.101. Klentaq 1 je funkčně i strukturálně podobný Klenowovu fragmentu Pol I bakterie E. zodpovědnou za 5´3´exonukleázovou aktivitu (Obr. Pol I 5´-3´ exonukleázová aktivita se projevuje především v jednořetězcovém zlomu DNA. Aktivní místo této polymerázy naznačuje. Klenowovým fragmentem. ale zárověn syntetizuje vlákno nové a tím opravuje poškozenou dsDNA.98).:Molekulární biologie má schopnost odštěpovat nukleotidy z řetězce. 5´-3´exonukleázová aktivita Pol I se uplatňuje in vivo také v případě odstranění RNA primerů na 5´-konci nově syntetizovaného vlákna ds DNA. při syntéze radioaktivně značených dsDNA. tj. Tato aktivita Pol I se nazývá proofreading nebo také tzv. 3´-5´exonukleázová aktivita se projeví v okamžiku. Pokud se vyskytne poškozená DNA (např. přičemž aktivní místo mimikuje komplementární tvar správné báze. Coli.

Jak již bylo popsáno.104). Pokud by rozvinuté ssDNA vlákna v replikační vidličce byla ponechána bez další ochrany. SOS odezvu. Pol III holoenzym bakterie E. Helikázy jsou velmi širokou a početnou skupinou enzymů. Před replikací Pol III holoenzymem však musí být rychle odstraněny. Struktura SSB homotetrameru z E. která je schopna „popojíždět“ po templátovém vlákně DNA.:Molekulární biologie v normální buňce).102). β odjednotka vytváří prstenec. Rep helikáza a tzv. Jiným příkladem je helikáza-primáza bakteriofága T7 (produkt genu 4) napadající E.105.Studijní opory biologie Malý J. dimer) či směru rozplétání (ve směru 3´-5´ či 5´-3´vázaného vlákna). které společnou činností za spotřeby energie ve formě hydrolýzy ATP rozplétají dsDNA v replikační vidličce a připravují ji tak na replikaci. Helikázy se zpravidla člení na několik typů např. Charakteristické vlastnosti těchto proteinů jsou popsány na Obr. Jednotlivé SSB proteiny jsou na vlákně ssDNA nahloučeny jako korálky. došlo by k jejich zpětnému a rychlému spojení do dsDNA.struktura známá jako pohyblivá β-svorka (Obr.107 a 108). podle morfologie (hexamer.DnaB protein ( produkt dnaB genu).110. Rep helikáza nebo PriA protein jiných bakteriofágů napadajících rovněž E. Tuto roli přebírají u této bakterie tři speciální proteiny . které poskytují přístup dsDNA k procesům replikace. SSB protein (single-strand binding protein). popř. Coli je známo celkem 12 různých helikáz. β a λ podjednotka s vysoce organizovaným procesem sestavení na primerovaném templátu DNA (viz dále). Význam této funkce bude objasněn v dalším textu. Pol II jádra (Obr. kterým prochází vlákno DNA . Skládá se z tzv. které je funčně velmi podobné Pol I (s vyjímkou např. Enzymy. jako např. Helikázy pracují většinou tak. Tomuto procesu zabraňují SSB proteiny. transkripce atd. coli (Obr.106). že postupují navázané na jednom vlákně DNA a před sebou rozplétají dsDNA za spotřeby NTP. coli nemá schopnost rozvinout dsDNA. Rovněž zabraňují tvorbě nejrůznějších náhodných intramolekulárních sekundárních struktur ssDNA a chrání ji proti nukleázám. Pol III je DNA replikáza v bakterii E. Coli. Podobnou funkci mají i nedávno objevené DNAP IV (Pol IV) a DNAP V (Pol V).109). DnaB protein E. Pol I. DNAP II se uplatňuje především při reparačních procesech ds DNA skrze tzv. skládajícího se nejméně z 10 podjednotek (Obr. nick translace) a které je v nativní podobě součástí komplikované struktury Pol III holoenzymu. Nejvýznamější součástí je tzv. pohybující se po zpožďujícím se řetězci ve směru 5´-3´ za současné hydrolýzy ATP (Obr.103). Pol I odstraňuje primery Okazakiho fragmentů a syntetizuje komplementární DNA procesem tzv. nick translace. v E. coli je známa a je zobrazena na Obr.coli (Obr. např. rozvolněním jejich struktury na dva ssDNA řetězce se obecně nazývají helikázy. Vznikají tak jednořetězcové niky Strana 27 . coli patří mezi hexamerní helikázy.

stejně jako nick na vedoucím řetězci po ukončení replikace cirkulární DNA. Bakteriofág M13 je tvořen 6408-bp cirkulární virovou (+) ssDNA (zanaménko plus značí. která je transformována do RF I činností gyrázy a DNA ligázy. relativní jednoduchost) jejich replikace tento fakt do značné míry odráží. replikativní forma (RF). Primer je odstraněn činností Pol I. je stabilizována pomocí SSB proteinů vyjma krátké sekvence 57 nukleotidů. Nejvíce prostudovaným zástupcem replikace prokaryot je pak samotná bakterie E. aby byla schopná syntetizovat RNA primer pro Okazakiho fragment ve směru 5´-3´vznikajícího RNA primeru. tj. DNA ligázou za využití energie ve formě ATP a NAD+ (Obr. Vzniká RF II.coli). Jakmile M13 (+) ssDNA pronikne do bakterie. tzv.Studijní opory biologie Malý J. dojde k sysntéze komplementárního (-) vlákna DNA a vytváří se cirkulární duplex. 3. která může být jak přerušena nickem (relaxována) (RF II) či se nachází v nadšroubovicové formě (RF I). tj. In vivo konverze tohoto bakteriofága je však daleko komplikovanější než v případě M13. Např.111). že DNA je zároveň templátem pro transkripci). musí se tato primáza pohybovat dočasně opačným směrem. které jsou pospojovány tzv.112). Struktura DnaG primázy byla získána teprve nedávno (Obr. RNA primáza syntetizuje RNA primer 6 nukleotidů před počátkem vlásenky a vzniká DNA-RNA heterodimer procházející dalších 20 až 30 nukleotidů do samotné vlásenky. Jelikož tato helikáza se pohybuje po zpožďujícím řetězci ve směru 5´-3´. Bakteriofág φX174 je tvořen obdobně jako M13 jednořetězcovou cirkulární DNA. která je v nativním stavu asociována s helikázou DnaB. v in vivo procesu se jedná pouze o 11 nukleotidů. Jakmile dojde k infekci E.coli disponuje tzv. které vytváří vlásenku na základě intermolekulární komplementarity. Strana 28 .:Molekulární biologie (nespojitosti) mezi Okazakiho fragmenty. DNA ligáza spojuje sousední nukleotidy vytvořením fosfodiesterové vazby mezi jejich 3´-OH a 5´-P volnými skupinami a za současného uvolnění AMP. Nejběžněji studovanými fágy jsou kolifág M13 a φX174 (bakteriofág napadající bakterii E. Primázy bakterií a některých bakteriofágů sledují pohyb replikační vidličky v asociaci s některými proteiny DNA helikázy. coli. DnaG primázou (produkt genu dna G). nick translací. Pol III holoenzym pak syntetizuje (-) DNA. palindromatických sekvencí (Obr.3. bakterie E. coli. Řada poznatků o principech replikace byla získána studiem bakteriofágů. Replikace prokaryot a bakteriofágů Bakteriofágy jsou jedny z nejjednodušších nebuněčných organismů a způsob (tj.113). kdy vzhledem k rychlosti replikace dochází k syntéze cca 1 primeru za 1s. Ačkoliv in vitro je DnaG primáza schopna syntetizovat primery až ze 60 nukleotidů.

coli replikuje svůj chromozóm pomocí dvousměrného theta θ intermediátu.114). (4) Po ukončení jednoho cyklu je (+) řetězec uvolněn a celý cyklus se může opakovat. tzv. (1) Reakce začíná obdobně jako u M13. Většina modelů popisujících replikaci této bakterie byla vytvořena na základě jednodušších modelů. (+) ssDNA vlákno je po infekci obaleno SSB proteiny. (5) Pol III holoenzym prodlužuje primery do formy Okazakiho fragmentů. mimo 44 bp vlásenku. (3) V průběhu syntézy narůstá (+) řetězec loop (smyčka) procesem. místo pas (primosome assembly site). Pozitivní (+) ssDNA bakteriofága φX174 je kopírováno modifikací tohoto mechanismu. Tento proces se vyskytuje v pozdních stádiích infekce. Bakterie E. kde vznikající (+) vlákna jsou zabalena do fágových hlav. Schéma replikace je na Obr. Celý proces se dá popsat 4 kroky.Studijní opory biologie Malý J. Vytěsněný (+) řetězec je dále obalen SSB proteiny a stabilizován. jako jsou kolifágy M13 a φX174. tj. valivé kružnice (nebo tzv. PriB a PriC. přičemž druhý konec je neustále spojen s proteinem genu A. loop mechanismem (loop mód valivé kružnice) z RF I templátu (Obr. preprimosom. Sekvence vlásenky je známa jako tzv. tzv. (3) Primosom se pohybuje ve směru 5´-3´ (+) řetězce a vytěsňuje SSB proteiny za spotřeby ATP (obrácený směr pohybu než směr čtení templátu). které je rozpoznáno podjednotkami primosomu PriA. Syntéza (+) ssDNA vlákna slouží jako model pro replikaci vedoucího řetězce (leading strand). který specificky rozštěpí (+) vlákno a kovalentně se naváže na 5´-P skupinu DNA řetězce.:Molekulární biologie především účastí proteinu tzv. Primosom nadále zůstává spojen s dsDNA a podílý se na syntéze nových (+) ssDNA (replikaci viru). Fragmenty jsou pospojovány pomocí DNA ligázy a činností DNA gyrázy je na něj zavedená superhelicita.118.115). v důsledku podobnosti replikační struktury řeckému písmenu sigma) (Obr. (4) V náhodných místech dojde k zpětnému pohybu primosomu po (+) vlákně.117). (6) Pol I vyštěpí primery a nahradí je DNA.116). (2) Na sestavené proteiny v míst pas se váží proteiny DnaB a DnaC s pomocí proteinu DnaT přičemž po spotřebě ATP a uvolnění DnaC vzniká tzv. Pol III holoenzym syntetizuje (+) řetězec dle (-) templátu. (1) (+) dsDNA vlákno s navázaným primosomem je svázáno s proteinem genu A. replikačním počátku. (2) Rep helikáza se přiloží k (-) řetězci v místě navázaného proteinu genu A s pomocí stále navázaného primosomu rozplétá dsDNA od 5´-konce (+) řetězce. DnaB helikáza rozplétá Strana 29 . Ten váže primázu a vzniká vlastní primosom. přičemž primáza syntetizuje RNA primer. primosomu (Obr. Syntéza komplementárního (-) řetězce probíhá celkem v 6 fázích a je modelem pro objasnění syntézy zpožďujícího se řetězce (lagging strand) (Obr. Jedno vlákno cirkulární dsDNA může být kopírováno systémem tzv. který vzniká v jednom místě na chromozómu. σ-replikace.

DNA gyrázy a DnaB helikázy dochází k dalšímu rozšiřování preprimerového komplexu tak. Replikace chromozómu E. oriC místo (lokus). Primery Okazakiho fragmentů jsou nahrazeny DNA pomocí Pol I katalyzované nick translace a následně jsou jednotlivé fragmenty spojeny DNA ligázou. Tento ohyb dsDNA je zesílen vazbou DNA vázajících proteinů – tzv. tzn. Přednostně se na membránu vážou tzv. Stejná primáza syntetizuje i RNA primery Okazakiho fragmentů. že tento proces musí být striktně kontrolován. Jakmile je dokončena syntéza jednoho Okazakiho fragmentu. Porovnání rychlosti replikace (1000 n/s) a velikosti genomu bakterie (4. Chromozomy jsou separovány do dceřinných buněk vazbou na membránu bakterie. coli se vyskytuje vždy jen jednou na jedno dělení buňky. Proces iniciace je zahájen vazbou DnaA proteinů. složitým komplexem skládajícím se z podjednotek – dvou jader Pol III (podjednotky αεθ).coli tvoří unikátní 245-bp segment. coli je v závislosti na vnějších podmínkách od 20 min do 10 hodin (37°C. které zaručují vznik nové kopie chromozómu vždy těsně před následujícím buněčným dělením (Obr. preprimerový komplex. Vazbou DnaB proteinů na odhalené ssDNA vzniká tzv.120). že se umožní vznik replikačních vidliček se sestavenou primázou a RNA polymerázou. Tento ohyb způsobí rozštěpení dsDNA v místě specifické 13-bp sekvence oriC. holoenzym Pol III zpožďujícího se řetězce se přesouvá do místa v replikační vidličce. Syntéza vedoucího i váznoucího řetězce je zajištena tzv.:Molekulární biologie dsDNA. které jsou spojené skrze podjednotky τ. Tato sekvence je velmi konzervativní mezi gram-negativními bakteriemi.119). DnaA boxy (obsahují vysoce konservovanou sekvenci 5´TTATCCACA-3´) přičemž jejich vazbou vzniká negativní závit na oriC a stočení dsDNA kolem přítomných pěti DnaA proteinů (Obr. přičemž primer je syntetizován primázou primosomu. hemimethylované Strana 30 . doba zdvojení chromozómu) ≈ 40 min. známý jako tzv. tzv. Výsledkem je chromozóm s více replikačními vidličkami.6 × 106 bp) poskytuje replikační čas (tj. Z porovnání doby zdvojení a replikačního času plyne logický závěr. která je bohatá na AT. tj.Studijní opory biologie Malý J. HU proteinu a IHF (integration host factor). přesto v rámci jedné generace buňky dochází k zahájení vždy jen jedné replikace. které rozpoznají specifické sekvence na oriC. Syntéza vedoucího řetězce je zajištěna Pol III holoenzymem. dostatek substrátu). Ačkoliv každý chromozóm tak obsahuje více oriC počátků. že buňka musí zahájit replikaci jěště před ukončením předchozího cyklu dělení. V přítomnosti SSB proteinů. replisomem. kde vznikl nový primer pro následující Okazakiho fragment. přčemž vznikající ssDNA řetězce jsou ihned obaleny SSB proteiny. Zpožďující řetězec tedy vytváří smyčku. Replikační počátek chromozómu E. Doba zdvojení E.

Cykliny jsou vždy tvořeny v průběhu jedné fáze buněčného cyklu ale kompletně degradovány v následující fázi. Replikace je ukončena v místě. Tento systém zaručuje setkání obou replikačních vidliček v jednom místě na chromozómu. která methyluje A v této sekvenci. Jedná se o nepalindromické 23-bp sekvence. (2) G1 fáze (gap phase) patří mezi nejdelší fáze buněčného cyklu. popř. Ve zdravé buňce je přechod buňky mezi jednotlivými fázemi je regulován proteiny. v nativních podmínkách v rozsahu cca 8h až více jak 100 dní. která je poměrně krátká a charakterizuje přípravu buňky k mitóze. 3. kde dochází k syntéze (replikaci) DNA. cykliny a cyklin-dependentními protein kinázami (Cdks). (4) G2 fáze. na TerD a TerE (nejspíše zálohují TerA).121). Dam methyltransferázu. Přesto existují zásadní rozdíly.4. Buněčný cyklus buněk v in vitro kulturách se pohybuje okolo 24 h na 1 dělení. hemimethylované. který zabraňuje DnaB helikáze rozplétat vlákno dsDNA. Vazba chromozómu na membránu je zprotředkována proteinem SeqA.122).:Molekulární biologie oriC. terminus. Druhá replikační vidlička se naopak zastavuje na TerC. U čerstvě zreplikovaných dsDNA je jeden A v sekvenci GATC v oriC nemetylován.Studijní opory biologie Malý J. TerD a TerA na jedné straně a TerG. tj. které se označuje jako tzv. Replikační vidlička směřující proti směru hodinových ručiček a vznikající v oriC na opačném pólu chromozómu se zastavuje přednostně na TerA. Právě vazba těchto hemimethylovaných oriC na membránu zabraňuje iniciaci další replikace a zároveň garantuje rozchod čerstvě zreplikovaných chromozómů do dceřinných bakterií. Buněčný cyklus eukaryotní buňky je členěn na čtyři odlišné fáze (Obr. Zastavení vidličky v místě terminus je umožněné díky speciálnímu proteinu Tus (produkt genu tus). Rozhodnutí buňky k dělení je učiněno v G1 fázi v důsledku řady faktorů. které aktivují cílové proteiny jejich fosforylací. tzv. které jsou podmíněny zejména vysokou komplexitou eukaryot v porovnání s prokaryoty. popř. TerF. vlákno je tzv. (3) S fáze (synthesis) je jedinnou fází. Jedná se o hlavní období buněčného růstu. seqA genu. produktem tzv. (1) mitóza a dělení buňky se objevují v relativně krátké M fázi. Ter B a TerC (Obr. ravinové bujení). OriC přitom obsahuje methylační sekvence GATC přístupné pro tzv. Tyto Strana 31 . neurony) se nedělí vůbec a zůstavají tak v tzv G0 fázi. Replikace eukaryotního chromozómu Replikace eukaryotního chromozómu je v řadě aspektů velmi podobná relikaci prokaryot. Například eukaryotní chromozóm je složitý organizovaný komplex dsDNA a proteinů. Cykliny aktivují příslušné Cdks (vážou se na ně). a replikační mechanismy musí tedy být s těmito komplexy synchronizovány. včetně patogenních (karcinogenní látky či nádorové viry navozující nekontrolovatelné dělení. na TerB. Některé buňky (např. které se označují jako TerE.

který se nazývá proliferační buněčný nukleární antigen (PCNA). Jedná se o polymerázy označené jako (Pol) α. jako POL A. rodina B (příbuzná Pol II). okolo 50 nukleotidů za 1s (oproto 1000 nukleotidů u bakterií). Pol α se nachází v jádře buňky a podílí se na replikaci chromozomální DNA. nazvaný pol α/primáza. replikace chromozómu by trvala řadu týdnů. se nazývá replikon. rodina C (příbuzná Pol III) a rodiny D. které se však účastní spíše reparačních mechanismů (POL B. Pokud by tedy byl přítomen pouze 1 replikační počátek. Naprostá většina poznatků o eukaryontní DNA replikaci byla získána studiem kvasinek (Saccharomyces cerevisiae). které se účastí replikace. Eukaryotní buňky obsahují celou řadu DNA polymeráz. které mohou být rozděleny do 6 rodin na základě jejich fylogenetické příbuznosti: rodina A (příbuzná Pol I). buňka setrvává v jedné fázi.:Molekulární biologie proteiny zaručují nezbytné funkce buňky v daném fázi buněčného cyklu. Pol ε je velmi podobná Pol δ. POL H.). coli (Obr. Mimo tyto základní typy DNAP existují další. POL I atd. že eukaryotní chromozóm obsahuje celou řadu replikačních počátků.125).Studijní opory biologie Malý J. avšak je charakterizována velkou procesivitou i bez navázaného proteinu PCNA. POL D1. Pol γ se nachází výhradně v mitochodriích a replikuje tedy mitochondriální DNA. Pol δ je opět jaderná DNAP. Aby bylo možné přejít z jedné fáze do druhé. pokud je v komplexu s proteinem. vznik mitotického vřeténka musí předcházet mitóze atd. Pokud tyto body nejsou splněny. Tato DNAP je schopná replikovat templát jakékoliv délky. Proto se tyto počátky vyskytují hojně na přibližně každých 300 kb úseku dsDNA. Obdobná DNAP je přítomná i v chloroplastech.126).123). Eukaryotní a prokaryotní DNA replikační systémy se liší především ve faktu. Ten funguje pravděpodobně stejně jako tzv. Úsek DNA. a Y. který obsahuje pouze jeden (Obr. která se replikuje z jednoho počátku. avšak je velmi těsně asociován s primázou a vytváří tak protein. δ a ε popř. Buňky živočichů obsahují 4 DNAP. Obdobně jako jiné DNAP i tato syntetizuje nové vlákno DNA dle ssDNA templátu ve směru 5´-3´ templátu. Struktura tohoto typu DNAP byla získána studiem DNAP bakteriofága RB69 (Obr. která však nemá primázovou aktivitu a projevuje korekturní 3´-5´ exonukleázovou aktivitu. POL E (Obr. tj. musí buňka splnit určité kontrolní body (např. Replikace eukarytního chromozómu je také daleko pomalejší. nebo se přechod do další fáze výrazně zpožďuje. Zpravidla dochází k aktivaci a současné Strana 32 . β-svorka u DNAP E. γ. na rozdíl od bakteriálního chromozómu.122).X. viru SV40 a metazoí jako je Drosophila a Xenopus laevis.).124). Nemá exonukleázovu aktivitu. Lze ji specificky inhibovat aphidicolinem (Obr. Replikace se tak zkrátí na potřebnou hodnotu do několika málo hodin. POL G.

coli) a několika dalších proteinových podjednotek.coli a ve spolupráci s dalšími proteiny (Cdc6-18) umožňuje vazbu tzv.128). Výzkum licenčního procesu je teprve v počátcích. D-smyčka je přechodná trojřetězcová struktura DNA. pol ε. Z tohoto důvodu nejsou schopny sestavit pre-RC komplex. který zakončuje vznik licencovaného preRC komplexu. Jedná se o tzv. kterým se zabraňuje dvojí replikaci téhož replikonu v jednom buněčném cyklu je aktivita cyklin dependentních kináz (Cdks). origin recognition complex) (Obr. pre-replikativního komplexu (pre-RC) v každém replikačním počátku v průběhu G1 fáze. setrvávají v tzv. Tímto způsobem je vyloučena další iniciace replikace na nově vzniklém dsDNA vlákně v S-fázi a tím i jedna kopie každého replikonu v jednom buněčném cyklu. Nově nasyntetizovaná DNA je buňkou rozpoznána a není tedy možné provést v jednom buněčném cyklu více replikací stejného replikonu.Studijní opory biologie Malý J. replikačního proteinu A (obdoba SSB proteinů E. neboť pouze v této fázi cyklu může pre-RC komplex vzniknout. princip této regulace však ještě není dostatečně znám. Dalším ze způsobů. musí být tento komplex aktivován v S fázi buněčného cyklu. komplexu rozpoznávající replikační počátek (ORC. Nádorové buňky.127). V první fázi dochází k sestavení tzv.:Molekulární biologie syntéze klastrů až 80 replikonů v S fázi. která ponechává pouze 5´ribonukleotid – ten je následně odstraněn tzv. Go fázi cyklu nemají aktivní Cdk a neobsahují MCM komplex. D-loop mechanismu (D-loop displacement mechanism) (Obr. RNA primery eukaryotních Okazakiho fragmentů jsou odstraněny enzymem RNázou H1. tj. které se nedělí. která se Strana 33 . V S-fázi dochází ke konverzi pre-RC licencovaného komplexu na iniciační replikační komplex vazbou pol α/primázy. licenční proces. K tomu aby došlo k replikaci. Sestavení pre-RC komplexu je zahájeno v pozdní M či na počátku G1 fáze cyklu vazbou tzv. které jsou charakterizované rychlým a nekotrolovatelným dělením buněk obsahují velké množství MCM komplexu. flap endonukleázou-1 (FEN1). hexameru který se skládá z podjednotek Orc1-Orc6 do počátku replikace. Vznik pre-RC komplexu je nutnou podmínkou k replikaci replikonu. Z toho důvodu je tedy MCM komplex důležitým potenciálním diagnostickým markerem nádorového onemocnění. ORC je funkční analog DnaA proteinu E. avšak nikoliv podmínkou postačující. MCM komplex je ATP helikázou obdobnou DnaB helikáze E. Mitochondriální DNA je replikována pomocí tzv. MCM komplexu. Po zahájení replikace dochází k syntéze nových dsDNA v replikačních vidličkách (dvě na jedno replikační očko) dokud se replikační vidličky sousedních replikonů na chromozómu nesetkají. Vedoucí řetězec vytěsňuje v průběhu syntézy váznoucí řetězec formou tzv. Buňky. D-smyčky. coli. Sestavení replikačního komplexu na replikačním počátku chromozómu eukaryot se odehrává ve dvou fázích. Eukaryota neobsahují terminační místa replikace jako bakteriální chromozóm.

neboť je schopná transkribovat mRNA izolované z organismu do komplementární DNA (tzv. Tento enzym byl objeven v roce 1970 H. telomery replikovány. Baltimorem a popsán jako enzym.131). Jedná se o dimerní protein skládající se z podjednotek p66 a p51 (dle velikosti v kD). k sekvencování jejich struktury. Jakmile dosáhne přibližně dvou třetin délky obvodu kruhu chromozómu. který se vyskytuje u lineárních řetězců dsDNA a tedy i u chromozómů eukaryot je především nebezpečí zkracování konců jako důsledek replikace.129). původce HIV. který mi jsou konce lineárních chromozómů eukaryot. (2) RNA vlákno hybridu RNA-DNA je odstraněno pomocí aktivity enzymu RNázy H. Templátem ale není DNA. Reverzní transkriptáza přepisuje RNA genom retroviru do dsDNA v několika fázích (Obr. že RNA primer na 5´-konci templátové DNA váznoucího řetězce nemůže být nahrazen DNA (primer na dosyntetizování tohoto konce by se neměl na čem uchytit). resp. Z tohoto důvodu existuje speciální mechanismus. tzv. V průběhu replikace se tato smyčka prodlužuje. copy DNA. nýbrž RNA. human immunodeficiency virus) obsahují speciální DNAP. cDNA). které jsou využity k léčbě AIDS (Obr.:Molekulární biologie v mitochondriálním cirkulárním chromozómu vyskytuje jako nestálý. tj. Retroviry. DNA syntéze je primerována tRNA hostující buňky. Tento problém je způsoben faktem. které patří mezi RNA eukaryotní viry a jsou často odpovědné za virově aktivované nádorové změny buněk či za onemocnění. Následně je dsDNA integrována do hostujícího genomu. RT). který syntetizuje DNA ve směru 5´-3´ primerovaného templátu. v okamžiku. (1) Retrovirová RNA slouží jako templát pro syntézu komplementárního vlákna DNA (pomocí RT) za vzniku RNA-DNA hybridního helixu. Telomery DNA mají neobvyklé sekvence. popř. Váznoucí řetězec je tedy nasyntetizován pouze z jedné třetiny. Struktura modelové RT. reprezentované HIV1 reverzní transkriptázou byla stanovena teprve nedávno (Obr. odhalí se replikační počátek pro váznoucí řetězec a je započatá syntéza jeho komplementárního vlákna.Studijní opory biologie Malý J. jakým je syndrom získaného selhání imunity (onemocnění AIDS. (3) vzniklé ssDNA vlákno je templátem pro syntézu komplementárního vlákna DNA a vzniku dsDNA. Problémem.130). Ta se skládá z mnohatisíců tandemových opakování jednoduché. Vzniklou genomovou knihovnu (soubor cDNA) je možné využít např. jejím částečně rozpleteným 3´-koncem. na G bohaté a druhově odlišné sekvence Strana 34 . Na základě znalosti prostorového uspořádání těchto podjednotek byly připraveny inhibitory HIV-1 RT. 500-600 nukleotidů dlouhý úsek. avšak v obráceném směru. RNA dependentní DNA polymerázu (nebo také reverzní transkriptázu.Teminem a D. kdy syntéza vedoucího řetězce je ukončena. tj. k identifikaci genu zodpovědného za kódování příslušné mRNA. RT je využívána v genovém inženýrství.

dosyntetizováním telomér ve formě ssDNA (Obr. Ze studií telomér savců byla potvrzena existence tzv. TRF1 a TRF2 savců (telomere repeat binding factor). ztráty kontroly nad činností telomerázy a tím i zajištění podmínky nekontrolovaného dělení.133). čepičky (Obr. Aby ted tento mechanismus splňoval svou funkci. telomerázy. Tato sekvence tedy působí jako templát pro syntézu telomér principem reverzní transkripce. Čepička je tvořena telomerní DNA ve vazbě na speciální proteiny. Navíc. ztrátě funkce telomerázy dochází po několika generacích dělení buněk k jejich smrti v důsledku postupné eliminace telomeráz. které vytváří čepičku. tzv. G-kvartet. Smrtelnost běžných buněk je způsobena neaktivní telomerázou. tzv. Např. tj. Telomerázy mohou vytvářet cyklický tetramer. výrazně se zvyšuje riziko jejich maligní transformace. Strana 35 . ukončující každý 3´-konec chromozómu. která nezávisle na povaze templátu neustále přidávají tandemové sekvence na 3´-konec telomerního oligonukleotidu.:Molekulární biologie nukleotidů (obratlovci TTAGGG). Jedním z důvodů stárnutí buněk (zkracovní telomér) může být ochrana organismu před nádorovným bujením. Tato syntéza je umožněna faktem. Pokud by telomeráza zůstávala aktivní i u somatických buněk. volné 3´-konce ve formě ssDNA by mohly být přístupné k exonukleázám a mohly by být jednoduše degradovány. Z tohoto důvodu se jako potenciální protinádorové léky mohou uplatnit inhibitory telomeráz. somatické buňky izolované z mnohobuněčných organismů zpravidla neobsahují aktivní telomerázu a v in vitro kulturách přežívají pouze 20-60 dělení.134). T-smyček (T-loops) – dimerních forem telomér s navázaným proteinem TRF2 (Obr. jako je např. Na tuto strukturu se váží proteiny. Telomery jsou syntetizovány jiným mechanismem. Rakovinové buňky jsou charakteristické nekontrolovatelným dělením a ve své podstatě neomezeným počtem buněčných generací. Vztah mezi délkou telomér a počtem dělení buněk v těchto kulturách byl jednoznačně potvrzen. které obsahují ve své RNA složce komponenty s komplementárními úseky k opakující se telomerické sekvenci. tj.Studijní opory biologie Malý J. že telomerázy jsou ribonukleoproteiny. Bez existence telomeráz by docházelo ke zkrácení 3´-konců chromozómu o 50-100 bazí na jeden replikační cyklus. než zbylá dsDNA. popř. V případě neexistence čepičky. Za syntézu jsou odpovědné speciální enzymy. Telomerázy se tedy podílí na procesech stárnutí buňky a mnohobuněčných organismů. musí být telomery chráněny před jejich aktivitou pomocí tzv.132).

Reparace pyrimidinových dimerů je umožněna existencí enzymů. fotoreaktivačních enzymů. tzv. jako je DNA fotolyáza (přítomná jak v prokaryotech tak i eukarytech). neboť vnášejí při replikaci do vznikajícího řetězce špatné báze v důsledku nesprávného párování (např. vznik tzv. Důležitost reparace DNA je potvrzena existencí více jako 300 genů. který umí odstranit tyto alkylované báze je vzniku O6alkylguanin-DNA-alkyltransferáza.138) mají schopnost alkylovat (přenášet alkylovou skupinu) dusíkaté báze (např. MTHF nebo 5-deazaflavin (Obr.Coli nazývá Ada protein. tj.135). Strana 36 .136) absorbuje v oblasti 300-500 nm a přenáší excitační energii na FADH-. Chemické látky. Tato oprava je možná z toho důvodu. Tyto chemické změny jsou velmi mutagenní.137). které mohou vést k jejímu poškození jako je např. mezi dvěma cytosiny. 4. REPARACE DNA DNA v organismu není neměná. že informace o pořadí nukleotidů je kódována dvěma rětězci dsDNA. Tyto pyrimidinové dimery způsobují lokální deformaci dsDNA.139).:Molekulární biologie 4. která je však po této reakci sama zničena a není tedy klasickým enzymem. Chromofore. thyminových dimerů (Obr. guanin za vzniku O6alkylguaninu). rigidní struktura. může být informace obnovena na základě řetězce komplementárního.coli.Studijní opory biologie Malý J. která zabraňuje replikaci a transkripci řetězce DNA. pokud dojde k porušení jednoho z řetězců. v lidské buňce dojde denně k ≈ 10 tis. V prostředí buňky musí čelit řadě negativních vlivů (chemické látky. který redukuje thyminový dimer a způsobí jeho reparaci na dva nesvázané thyminy (Obr. záření. Tento enzym se váže ve tmě ve formě dimeru (55 a 65 kD) na pyrimidinový dimer. Podstata těctho podchodů je přitom velmi podobná s pochody. tzv. které jsou zdokumentovány pro bakterii E. Struktura Ada proteinu byla analyzována s atomárním rozlišením (Obr. tzv. Tento protein se v případě bakterie E. thymin místo cytozinu). kódující v lidském genomu proteiny účatnící se reparačních pochodů. tj. Přímá oprava poškození nukleotidů UV záření o vlnové délce v rozsahu 200-300 nm způsobuje kovalentní vazbu mezi dvěma v řetězci sousedícími thyminy. NMNG – viz Obr. Příkladem enzymu. působení enzymů).1. alkylační činidla (např. přerušení glykosidických vazeb v DNA) Tyto poškození musí být opraveny (reparovány). tak aby genetická informace zanesená v genomu nebyla poškozena a byla tak zajištena její neměnnost (integrita). nejčastěji tzv. pořípadě přerušení řetězce (např. Obdobně mohou vznikat i vazby mezi thyminem-cytosinem popř. chemická modifikace bazí či cukerné kostry.

3-methyladenin atd. nadměrnému UV ozáření a toxickému působení cigaretového kouře. excisní reparace bazí (BER). DNA glykosiláz. U E.2. které probíhají za normálních fyziologických podmínek.141). AP-site) odstraněno naštěpením AP endonukleázou a nahrazeno pomocí DNAP a DNA ligázy správným nukleotidem. charakterizovaná extrémní citlivostí na světelné záření a brzkým vývoje rozsáhlé rakoviny pokožky. 7-methylguanin. jak dochází k boji proti karcinogenům.:Molekulární biologie 4. které eliminují poškození dsDNA vystřižením celých poškozených úseků (oligonukleotidů) a následným nahrazením novou DNA. které mají schopnost rozpoznat specificky modifikovanou bázi a rozštěpit glykosidickou vazbu bezi bazí a cukrem a ponechat tak pouze cukernou část nukleotidu v řetězci DNA (Obr. Báze nukleových kyselin jsou často modifikovány reakcemi. nebyl tento fakt dlouhou dobu uspokojivě objasněn. U člověka je tento způsob reparace hlavním mechanismem. Celý tento systém se nazývá UvrABC endonukleáza. Teprve s výzkumem reparací bylo zjištěno. kdy dochází k porušení struktury helixu v důsledku přítomnosti nesprávných či modifikovaných nukleotidů (bazí) (Obr. 3 u prokaryot a 6 u eukaryot). že tento fakt je esenciální pro správné uchování genetické informace. Ionizující záření může způsobit otevření heterocyklů bazí. V následném kroku je tzv. Cockayneův syndrom (CS). který se nachází u všech organismů. Tyto změny mohou způsobit změnu párování bazí.140). a 7. Geneticky kódovaná porucha obdobného reparačního systému u člověka způsobuje velmi závažné onemocnění. Excisní reparace Existují dva typy této reparace: (1) tzv. NER systémy prokaryot a eukaryot si jsou velmi podobné (až na počet podjednotek enzymu tj. ale i skrze nejrůznější toxické působení polutantů. která reparuje poměrně větší poškození DNA a (2) tzv. Tento systém je zpravidla aktivován v místě. BER mechanismus napomáhá tyto pozměněné báze odstranit. Vznikají tak modifikované báze jako je např.Studijní opory biologie Malý J. avšak pravděpodobně vznikly konvergentní evolucí. I přes znalost faktu. UvrB a UvrC. že uracil zastupuje v RNA thymin. bezbázové místo (apurinic nebo apyrimidinic site. reparující malá poškození včetně jednoduchých bazí. nazývané xeroderma pigmentosum. Ta štěpí 4. fosfodiesterovou vazbu na 5´a 3´konci od místa poškození DNA. Buňky obsahují řadu tzv. které však nezpůsobuje rakovinové bujení je tzv. nukleotidová excizní reparace (NER). NER je typ reparace. Obdobné onemocnění.coli se jedná o ATP dependentní proces. Do vzniklé ssDNA je navázána UvrD známá také jako tzv helikáza II a komplementární vlákno je nasyntetizováno činností enzymu Pol I a spojeno DNA ligázou. V normálních fyziologických podmínkách může Strana 37 . na němž se podílí podjednotky UvrA.

chyba replikace Pol I a Pol III u E. Za pomocí MutH je rozpoznáno nemethylované vlákno DNA a rozstřiženo endonukleázou na 5´konci nemetylované sekvence GATC. nebylo by možné rozhodnout. 4. pak nutně vznikl deaminací cytosinu a musí být odstraněn. Navíc. MMR systém eukaryot je mnohem komplikovanější než popsaný systém. Strana 38 . Vlákno. MutS-DNA komplex váže homodimer MutL. 4. Tuto funkci zastávají enzymy. MutS-MutL komplex vytváří na dsDNA smyčku za spotřeby ATP. které z vláken dsDNA je správné. zda daný uracil je správný.3. mismatch reparace (MMR – mismatch repair). Odstraněné vlákno je znovu syntetizováno dle templátové methylované DNA Pol III a spojeno pomocí DNA ligázy. Tyto enzymy pracují mechanismem BER. tedy obdobně. DAM methylázou. způsobují v buňkách bakterie E. který určí správné. Aby MMR systém mohl rozlišit. především tzv. aby byly odhaleny nespárované úseky a opraveny MMR systémem. u E. či vznikl z cytozinu touto reakcí.coli (Obr. které se nazývají uracil-DNA glykosylázy (UDG). editační aktivitou DNAP) může být opravena pomocí mechaismu tzv. že defekt v lidském MMR systému způsobuje vyskou incidenci rakovin. MMR systém byl nejlépe prostudován opět na bakterii E. Pokud by uracil byl normální součástí DNA. především z ohledu na počet zůčastněných proteinů. SOS odpověď Fyzikálně-chemické vlivy (alkylační činidla. Např. Tato sekvence může být až 1000 bazí vzdálená od místa nespárovaných bazí. nespárované úseky až 4 nukleotidů. Důležitost tohoto reparačního mechanismu vyplývá i z faktu. která není opravena v průběhu replikace (tj. tedy templátové vlákno. sklouznutím DNAP (slippage mechanismus). které v buňkách vyvolávají modifikace DNA. které je dceřiné zůstává tedy po určitou dobu nemethylováno. musí existovat systém. MMR systém umí opravit úseky. Protein MutS se váže ve formě homodimeru na nespárovanou bázi. které mohou vznikat tzv.Studijní opory biologie Malý J.coli je tento systém tvořen tzv. tj. Např. Tato doba je dostatečná k tomu.142). kdy báze cytosin je konvertována na uracil. Pokud se tedy U vyskytne v DNA. Po vzniku nicku (nastřižení) odstraní exonukleáza ve spojení s proteinem UvrD (helikáza) nastřižené vlákno až po 3´-konec nespárovné sekvence. zesíťovací činidla atd).:Molekulární biologie totiž docházet k deaminačnímu procesu. která methyluje sekvenci GATC u nově vzniklých vláken avšak s určitou časovou prodlevou. coli se pohybuje v rozsahu 10-7 do 10-6 na jednu bázi.coli řadu procesů. Nutně by to znamenalo postupnou ztrátu informace uložené v DNA. Mismatch reparace Jakákoliv chyba párování. UV záření. jako bylo zmíněno výše. dědičné nonpolypózní kolorektální rakoviny (HNPCC).4.

proteinu RecA.:Molekulární biologie které jsou známy jako tzv. ve kterém musí být nejdříve konce přerušené DNA nalezeny. aby byly nalezeny komplementární sekvence a následně musí dojít k ligaci (Obr. rekombinační reparace a tzv. ten nasedne a blokuje SOS box a celý proces se může opakovat. U eukaryot je celý proces zahájen pomocí proteinu Ku. Navíc. který se nachází v buňce v hojném množství a má schopnost vazby do místa DSB na poškozené DNA (Obr. jejich konce nastaveny do správné. dojde k vyvázání a aktivaci proteinu RecA. či zanořeny do sebe tak. V případě NHEJ mechanismu se jedná o způsob ligace DSB.155). Všechty tyto geny obsahují tzv. která funguje jako operátor (tj. Neopravené DSB mohou být pro buňku letální.5. DSB repair) Dvojřetezcové zlomy DNA (DSB) vznikají expozicí DNA ionizujícímu záření a volnými radikály.143). Komplex Ku-DNA má schopnost Strana 39 . či mohou způsobovat vznik rakoviny. Buňky mají ve své podstatě dvě odlišné strategie/mechanismy reparace DSB. V případě zvýšené dávky výše zmíněných stresorů. Tzv. který aktivuje rozštěpení a tím i deaktivaci proteinu LexA. který se za normálních podmínkách podílí na procesech rekombinace DNA. které kódují proteiny důležité pro reparační mechanismy DNA a kontrolují dělení buňky. Jakmile se však v buňce objeví ssDNA zlomy. způsobuje tento protein rozštěpení specifické sekvence proteinu LexA. Tento krok je zahájen vazbou RecA na ssDNA. váže represor a blokuje/zahajuje transkripci) (Obr. Homologní rekombinace je diskutována v samostatné kapitole.Studijní opory biologie Malý J. Podstatou této reakce buněk je dána funkcí tzv. 20 nukleotidovou sekvenci bazí. které vznikají jako vedlejší produkt metabolismu buňky. Reparace dvojřetězcových zlomů (double strand breaks repair. SOS box. Dodjde tak k uvolnění operátorů a zahájení transkripce SOS genů. LexA je represorem 43 genů. komplementární polohy. SOS odpověď. 4. Z tohoto důvodu jsou opravné mechanismy DSB esenciální pro život buňky. LexA tedy za normálních okolností inhibuje expresi SOS genů vazbou na SOS box a inhibicí činnosti RNAP.144). které modifikují či poškozují DNA. non-homologní rekombinace konců (NHEJ – nonhomologous end-joining repair). která se v případě poškození DNA může v buňce objevit. Po reparaci poškozené DNA činností SOS proteinů RecA přestane navozovat lýzy LexA. jako je meióza a tzv. tj. V tomto stavu se bakterie přestane dělit a spustí se řada reparačních mechanismů. která napomáhá vytvářet rozsáhlou diverzitu antigenvázajících míst protilátek a receptorů T-buněk. V(D)J rekombinace v lymfatických buňkách. DSB jsou normálními intermediáty DNA v přirozených procesech.

Řada látek. his-. u kterých byla pomocí Amesova testu identifikována vysoká mutageneze.6. tj. Jelikož není technicky možné toto množství látek prozkoumat na mutagenní a karcinogenní účinky standardními metodikami. nemá schopnost syntézy histidinu a nemůže tedy růst na médiu bez přítomnosti histidinu. které se využívají v průmyslu. aflatoxin a celá řada dalších mykotoxinů (Obr. Existuje řada důkazů.:Molekulární biologie dimerizace. Toto spojení poskytuje možnost opětovného spojení řetězců díky činnosti DNA ligázy IV a proteinu Xrcc4. tj.155). V současnosti je známo více jak 60 tisíc chemických látek. které se u dané látky mohou objevit. která je známa pod názvem karcinogeny. že přibližně 80% forem lidské rakoviny je způsobeno právě těmito látkami. která je tzv. Amesův test. tj. byla později ověřena i pro vysoké karcinogenní účinky na testech se zvířaty. Patří sem nejen látky. Odhaduje se. množství narostlých kolonií na petriho misce v porovnání s množstvím spontánních revertantů poskytuje informaci o míře mutagenicity stanovené látky (Obr. využívají se často testy na mutagenní účinky pomocí jednodušších organismů. Z míry mutagenních účinků je pak odhadnuta i míra potenciálních karcinogenních účinků. Identifikace karcinogenních látek Řada forem rakoviny je způsobena expozicí organismů skupině látek. Nejběžnejší je tzv. Pokud daná látka projevuje mutagenní účinky.Studijní opory biologie Malý J. kdy tato bakterie. spojení obou konců DSB. Množství revertantů. jako je bakterie Salmonella typhimurium. jako je např. je kultivována v přítomnosti potenciálního mutagenu. 4.na his+ a tím i schopnosti těchto buněk růst na médiu bez dodaného histidinu. ale i řada velmi nebezpečných přírodních látek. U bakterií tyto látky velmi často způsobují navození SOS reakce a vznik mutací. dochází k změně bakterií z his. testování na zvířatech. jako je např. Strana 40 .166). že primárním účinkem těchto látek je poškození DNA. které jsou synteticky připravené. Existuje velmi úzká souvislost mezi mutagenezí a karcinogenezí.

tj.coli je schopná syntetizovat okolo 4300 různých polypeptidů v obrovském počtu kopií (např. Bakterie E. TRANSKRIPCE Exsitují tři druhy RNA.ribozómy při překladu informace v proteosyntéze byla navržena již ve 30. pokuď tento substrát je přítomen v médiu. či adaptabilní enzymy. popř. tzv. dle aktuální potřeby buňky. J. coli syntetizují enzym pro příjem substrátů pouze tehdy. Jiné proteiny. obsahuje pouze minimální (< 5) těchto přenašečů v membráně.Studijní opory biologie Malý J. Následuje návrat hodnot počtu a aktivit těchto Strana 41 . i méně jak 10 kopií na 1 buňku). se nazávají inducibilní. Např. Tzv. V následujícím textu jsou shrnuty některé klasické experimenty. enzym rozštěpí tento disacharid na dva monosacharidy. konstitutivní proteiny jsou syntetizovány neustále ve stejném množství.1. Na těchto pokusech bylo ukázáno. které jsou syntetizovány v proměnlivém množství.177). tj. Centrální role RNA ve spojení s nukleo-proteinovými komplexy . Všechny tyto RNA jsou syntetizovány na základě DNA templátu procesem transkripce (přepisu). neboť zajišťují základní životní funkce buňky. „housekeeping genes“. Pokud se tak stane. transferová RNA (tRNA) a mediátorová RNA (mRNA). Ribozomální RNA (rRNA). které vedly k objevu mRNA. laktóza). která roste bez laktózy v médiu. 5. během několika málo minut dojde k obrovskému nárůstu syntézy těchto proteinů (až 1000krát) a udržuje tento stav dokud není laktóza z média vyčerpána. kopiích v 1 buňce). E. enzym β-galaktozidáza je syntetizován pouze v případě. i ve velmi malém počtu kopií (regulační proteiny.st. centrálního dogmatu molekulární biologie F. která se specificky váží na templátovou DNA. patří mezi skupinu tzv. Tato hypotéza byla stvrzena formulací tzv. že indukce tvorby proteinů je důsledkem regulace syntézy mRNA pomocí proteinů. Bakterie jako E. galaktózu a glukózu (Obr. Naproti tomu enzymy. že v kultivačním médiu se nachází substrát tohoto enzymu. Jakmile však je do média laktóza přidána. disacharid (např. coli. ribozomální proteiny i v 10tis.:Molekulární biologie 5. Crickem v roce 1958. Brachetem. Role RNA v syntéze proteinů Role mRNA v proteosyntéze byla navržena na základě studia indukce exprese proteinů u jednoduchých organismů – bakterií. ve které je mRNA kódována. které se účastní translace. Ty jsou syntetizovány pouze za určitých okolností. galaktosid permeáza (nebo také laktóza premeáza) transportuje laktózu do buňky.letech 20.

Závěr z tohoto experimentu byl takový.179).v nepřítomnosti induktoru pro βgalaktozidázu.buňky. Tyto geny. společně s kontrolními elementy P a O vytváří genetickou jednotku. začne ihned syntetizovat β-galaktozidázu v konstitutivním množství.178). V tomto experimentu byly Hfr bakterie s genotypem I+Z+ skříženy s F.Studijní opory biologie Malý J. Jacob a J. Pardee. isopropylthiogalaktosid (IPTG). že I+ je zodpovědný za syntézu difuzibilního produktu. tj. galaktóza permeázy a thiogalaktosid transacetylázy (další protein.kmenem s genotypem I-Z. který provedl A. došlo k inhibici tvorby β-galaktozidázy v F. Induktory jako je IPTG dočasně inaktivují lac represor. kdy I+ pocházející z F+ buňky měl dostatek času pro svou expresi. označovanou jako operon. který má schopnost kontrolovat expresi Z genu na jenom chromozómu. Tato obecná vlastnost bakterií – schopnost syntetizovat enzymy a proteiny ke zpracování substrátu jen v jeho přítomnosti – jsou důležitou adaptací bakterií na velmi proměnlivé podmínky jejich životního prostředí. který se dostane do I. Strana 42 . 1. bakteriální konjugace (vysvětlení pojmu viz Maly J.6-allolaktóza. že Z+ gen. bazální hladinu (úroveň) (Obr. V umělých podmínkách se jako induktor využívá především syntetický analog laktózy. Umožňuje jim provádět syntézu jen skutečně potřebných enzymů a proteinů v daném místě a čase. PaJaMo experimentem (Obr. tzv. Povaha tohoto úseku byla objasněna tzv. Obdobně jako byl objeven lac represor. který není metabolizován βgalaktozidázou.kmenu zaznamenat vysoké množství aktivní β-galaktozidázy. Teprve po určité době. Přirozený induktor laktózového systému je laktózový izomer. konkrétně lac operon (Obr. lac represor (v tomto případě se jedná o protein). Důležitými experimenty. Monod v roce 1959 a který využil jevu tzv. Y+ a A+. avšak minimálním množství.181). Tento typ molekul se také nazývá induktor.180). konstitutivní mutací. Ibuňky využité v experimentu produkovaly konstitutivně β-galaktozidázu. která se vždy vyskytuje v roztoku laktózy v určitém.buňkách. která je lokalizovaná blízko lac enzymových kódujícícho oblastí na DNA. coli byly provedeny tzv. neboť neobsahovaly represor. Tento jev lze vysvětlit tak. Do 1 hodiny po zkřížení bakterií bylo možné v F. jehož funkce však není známa) se označují jako Z+. Tato mutace mutace je provedena v úseku I. které vedly k objasnění struktury a funkce lac operonu E. Geny zodpovědné za kódování a regulaci produkce β-galaktozidázy. O gen. přestože nebyl přítomen induktor. Tato mutace způsobuje nadměrnou syntézu lac proteinů bez přítomnosti induktoru. F. Laktóza tedy musí nějakým mechanismem indukovat syntézu příslušných enzymů.: Opory studia mikrobiologie) (Obr. byl objeven i tzv. inhibuje tvorbu β-galaktozidázy (a tedy transkripci lac operonu). který funguje jako tzv.:Molekulární biologie enzymů na tzv.

na které se nachází. elongaci a terminaci. sigma (σ) faktor oddisociuje od jádra enzymu. Holoenzym se na DNA váže v několika fázích. iniciaci transkripce. Geny jako gen I. templátem je DNA). Mnoho bakteriofágů kóduje specifické RNA polymerázy. GTP a UTP na podkladě DNA templátu v reakci. že strukturální geny DNA jsou transkribovány do komplementárních řetězců mRNA. Jakmile dojde k iniciaci transkripce. zvané promotor. které syntetizují rozdílné skupiny RNA. RNA polymeráza RNA polymeráza (RNAP) je enzym zodpovědný za DNA-dependentní syntézu RNA (tj.:Molekulární biologie Popsané experimenty vedly k vytvoření hypotézy. vzniká tzv. 5. jako je např. -35). Promotor se nachází nalevo od +1 sekvence a je značen indexem se záporným znaménkem. RNAP bakterie E. která obsahuje všechny transribované lac geny (cistron je zastaralé označení genu). Vazba templátu Syntéza RNA je zahájena vždy jen na specifickém místě DNA. Tyto hypotézy vysvětlovaly působení induktoru a represoru lac systému. že se jedná o přibližně 40-bp úseky lokalizované na 5´. 5. Ten je rozpoznán specifickým sigma faktorem. polycistronická mRNA. holoenzymem. V bakterií jeden typ RNAP syntetizuje všechny RNA (vyjma RNA primerů pro replikaci DNA).3. Existence promotorů byla objevena studiem sekvencí v okolí některých genů (např. že nukleotid. sigma (σ) podjednotka. Tento typ sekvencí se nazývá cis-působící elementy. Hurwitzem.2. pro lac enzymy). kterým je α2ββ´ω a které je zodpovědné za samotnou polymeraci. mohou kontrolovat pouze geny na téže DNA. Koordinovaná (simultánní) syntéza všech lac enzymů spočívá ve faktu. tedy pohybu RNAP. přičemž znaménko plus označuje směr transkripce.coli je tvořena tzv.182). CTP. se nazávají trans-působící faktory. Holoenzym vytváří Strana 43 . Eukarytní buňky obsahují 4-5 RNAP.konci od startu transkripce (konvencí bylo dohodnuto. že jsou kontrolovány jedním operátorem. Kontrolní sekvence. které produkují difusibilní regulační produkty a které mohu ovlivňovat i různé vlákna DNA. tj.Studijní opory biologie Malý J. které zahrnují vazbu templátu. např. Všechny buňky obsahují RNAP. od kterého začíná transkripce se označuje indexem +1. Ta je pak v součinnosti s ribosomy odpovědná za syntézu polypeptidických řetězců. Enzym navzájem spojuje ribonukleosid trifosfáty ATP. která se také označuje jako tzv. O gen. Genetické mapování těchto sekvencí ukazuje. který byl nezávisle objeven v roce 1960 S. přičemž mutace v těchto sekvencích ovlivňuje úroveň transkripce enzymů. které jsou fágově specifické. Weissem aj. skládajícím se z podjednotek α2ββ´ωσ (Obr. která je poháněna energií uvolněnou při hydrolýze PPi.

Sekvence mezi -10 a -35 není důležitá z hlediska sklatby. Dále bylo prokázáno. Obtížnost s rozštěpením dsDNA vlákna holoenzymem povrzuje fakt. Na rozdíl od DNA replikace tedy iniciace nevyžaduje přítomnost primeru.:Molekulární biologie velmi pevné komplexy s promotory (disociační konstanta K ≈ 10-14 M) přibližně v oblasti od -20 do +20.Studijní opory biologie Malý J. že velmi často se po 212 nasyntetizovaných nukleotidech jejich další syntéza přeruší a z enzymu odchází krátké oligonukleotidy. Další oblast s konservovanými sekvencemi je tzv. Sigma faktor tak napomáhá RNAP nalézt správný promotor popojížděním holoenzymu po dsDNA a jeho zastavením na správném místě. Vazbou holoenzymu na promotor a alkylací nevázané DNA (metoda DMS footprinting) bylo možné odhalit sekvence promotoru.4. přičemž nejčastěji jde o A (následuje v četnosti G). opakující se u různých promotorů) sekvence se nachází v oblasti -10 nukleotidu ve formě hexameru. Holoenzym se však neodpoutá od komplexu s promotorem a znovu se Strana 44 . Mutace. Sekvenací promotorů v těchto oblastech byly získány tzv. které RNAP překrývá. Tento element se nachází nejčastěji v blízkosti genů pro ribozomální RNA. Ve většině případů se jedná o -10 a -35 sekvenci na stejné straně B-DNA. Bakteriální RNA tedy obsahují na 5´. který váže C-terminální doménu α-podjednotky RNAP. sestavení holoenzymu) způsobí snížení této nespecifické vazby (K ≈ 10-7 M) a zvýšení specifické vazby k promotoru. Jedná se o sekvenci TATAAT. tzn. Teprve navázání příslušného sigma-faktoru (tj. -35 oblast.coli (Obr. že činností holoenzymu dochází k rozštěpení dsDNA vlákna v 14 bp sekvenci se symetrií kolem -10 sekvence. Jádro RNAP váže nespecificky velmi silně dsDNA nezávisle na sekvenci (K = 5 × 10-7 M). Iniciace transkripce 5´-konec prokaryotní RNA je téměř vždy tvořen purinem. s přesahem do transkribované oblasti. Míra (rychlost) s jakou je transripce prováděna je závislá na stabilitě komplexu RNAP holoenzymu a promotoru.konci trifosfátovou skupinu. tzv. Nejvíce konzervované (tj. že holoenzym váže DNA z jedné strany.183). ale kritická je její délka (16-19 bp). jádro nabude opět silné nespecifické vazby na dsDNA a tím dojde ke stabilizaci RNAP na transkribované DNA. kde jej brání působení DNázy I. 5. Pribnowův box (D. Iniciace transkripce je vpodstatě založena na spojení dvou nukleosid trifosfátů fosfodiesterovou vazbou. tj. konsensus sekvence E. Jakmile je sigma faktor po zahájení transkripce uvolněn. upstream promotorový element (UP) v oblasti -40 až -60. které způsobí změny v síle této vazby se nazývají jako „up“ a „down“ mutace. V určitých případech je iniciační nukleotid v +1 místě tvořen A nebo G. Pribnow 1975). U některých promotorů je navíc přítomný tzv. která je charakterizovaná sekvencí TTGACA.

že RNAP se obtáčí souhlasně s templátovým vláknem. jako v případě replikace DNA. RNAP je velmi komplexní struktury.:Molekulární biologie pokouší o iniciaci. Navázaná RNAP na promotoru brání ostatním RNAP zahájení transkripce a tím dochází k poškození funkce buňky. aby dsDNA řetězec byl rozevřen z důvodu odhalení bazí templátové DNA pro syntézu komplementární RNA. Mechnismus inhibice je znám. Elongace RNA vyžaduje.187). analog adenosinu postrádající 3´-OH skupinu inhibuje RNA syntézu.Studijní opory biologie Malý J. 5. Tento jev se nazývá abortivní transkripce. které se účastní několik podjednotek holoenzymu za aktivní účasti iontů Mg2+ a Zn2+ (Obr. Krystalografické studie však byly provedeny v jiném případě – na holoenzymu a jádře RNAP Thermus aquaticus (Taq) (Obr.5. tj. V průběhu elongace je tak tvořen na přechodnou dobu heteroduplex RNA-DNA v tzv. Pokud je tato molekula začleněna do řetězce (v případě syntézy ve směru 5´-3´) je zamezena další elongace RNA v důsledku nemožnosti napojení dalšího nukleotidu. obdobně. V tomto okamžiku oddisocijuje σ faktor z holoenzymu a může vytvořit nový iniciační komplex s dalším jádrem RNAP. Toto zjištění bylo dále potvrzeno faktem. že směr syntézy RNA je orientován ve směru 5´-3´ vznikajícího řetězce. což vysvětluje specifitu inhibice. Elongace Studie s přídavky radioaktivně značených nukleotidů a sledování jejich fixace v narůstajících řetězcích RNA potvrdila. která vzniká v průběhu iniciace v holoenzymu RNAP. je posouvána ve směru pohybu současně s RNAP (Obr. Antibiotikum navázané do podjednotky β ze sterických důvodů zabraňuje elongaci – prodlužování syntetizované RNA. shodně s orientací helixu. je zahájena kontinuální (procesivní) transkripce.coli dosud nebyla definitivně určena. Antibiotikum rifamycin B produkovaný Streptomyces mediterranei a syntetický derivát rifampicin specificky inhibují prokaryotní RNAP (ale nikoliv eukaryotní RNAP). Teoreticky se toto může uskutečnit dvěma možnými způsoby.184). tj. Místo jeho účinku je sekvenčně odlišné od stejných podjednotek na RNAP eukaryot. U E. V prvním případě dochází k pohybu RNAP po vlákně dsDNA tak. Tato antibiotika jsou velmi účinná a využívají se k léčbě infekcí gram-pozitivními bakteriemi a tuberkulózy. že antibiotikum cordycepin.185 a 186). Vzniklá RNA se obtáčí kolem dsDNA a Strana 45 . která vede k prodlužování vlákna RNA. transkripční bublině. příčemž brání přechodu RNAP z fáze iniciace do elongace. Rentgenová krystalografie komplexu DNA-RNAP ukazují složitý mechanismus vazby nukleové kyseliny. Pokud se rozštěpení dsDNA podaří. Rifamycin se váže do podjednotky β. Tato struktura.

velká část eukaryotních RNA je po transkripci vystřižena (úprava primárního traskriptu.6. Jakmile je zahájena elongace transkripce a promotor je tedy uvolněn. Transkripční terminační sekvence genů E. tj. Je pochopitelné. V případě selhání funkce těchto enzymů dochází k zastavení transkripce nahromaděním otáček dsDNA. kde je transkripce terminována. které vytváří přílišné negativní napětí na vlákně DNA zamezující postupu transkripční bubliny a zastavení transkripce. dojde inhed k sestavení nové RNAP a proces iniciace a elongace se může opakovat. Transkribovaná RNA tak může na svém konci vytvořit vlásenkovitou strukturu zakončenou krátkou sekvencí několika U (Obr. Terminace transkripce DNA obsahuje specifická místa. Tento fakt je příčinou daleko vyššího počtu chyb vnášených do RNA – přibližně 1 špatně vložená báze na ≈ 104 transkribovaných bazí.:Molekulární biologie na templátové DNA nedochází k vzniku superhelicity. tzv. Rychlost transkripce in vivo je přibližně 20 až 50 nukleotidů za sekundu při 37°C u bakteri E. RNAP na rozdíl od DNAP nemá korekturní aktivitu.coli. Obsahují 4-10 sekvencí AT na templátovém řetězci. že namísto skutečné rotace v in vivo je navozená superhelicita relaxována pomocí topoisomeráz a gyráz. Tento model je nepravděpodobný. nemá schopnost štěpit nasyntetizované vlákno RNA v případě vazby nesprávného nukleotidu do řetězce exonukleázovou aktivitou. dochází k opakované iniciaci přibližně jedenkrát za sekundu (Obr. který způsobuje ukončení (terminaci) transkripce. Vytvoření vlásenky na RNA způsobí krátké zastavení (několik sekund) RNAP na terminačním místě. V případě RNA. RNAP svým dopředným pohybem před sebou hrne otáčky DNA. kdy RNAP se neotáčí kolem dsDNA. 5. která rotuje. RNA je terminována na této sekvenci nebo těsně za ní. neboť vzniklá RNA by se nemohla od dsDNA samovolně oddělit. Tento okamžik Strana 46 .188). které je třeba syntetizovat ve velkém množství. Druhá možnost spočívá v principu. jako např. Stabilita této vlásenky na syntetizované RNA a velmi slabá vazba sekvence uracilů k templátové AT sekvenci je pravděpodobně velmi důležitým faktorem. coli jsou typické mnoha společnými rysy. splicing). záměna jedné aminokyseliny se na funkci proteinu většinou neprojeví.Studijní opory biologie Malý J. Rotaci se podařilo experimentálně povrdit v umělých podmínkách. Zvýšení chyb se z hlediska funkce buňky zpravidla vůbec neprojeví v důsledku několika faktů – každý gen je opakovaně transkribován. ale naopak.189). genetický kód obsahuje řadu synonymních kodonů (kodony kódující stejnou aminokyselinu). Za AT sekvencí proti směru transkripce se nachází palindromická (dvoustranně souměrná) GC sekvence. rRNA. RNA je v tomto případě elongována volně do prostoru a není navinuta na dsDNA.

RNA polymeráza II (RNAP II. Trankripce je tedy ukončena. migruje po RNA ve směru 5´-3´. Ve skutečnosti pouze přibližně polovina terminačních mít kóduje vlásenku a oligo (U) řetězce. které jsou nutné k Rho dependetní terminaci. RNA polymeráza I (RNAP I. Výše zmíněné způsoby terminace jsou spontánní a závislé na existenci terminačních sekvencí. Rho faktor. V těchto případech je k terminaci vyžadována aktivita tzv. Tyto RNAP jsou velmi jednoduché a podobají se RNAP některých bakteriofágů. která obsahuje ribozomální geny) a syntetizuje většinu prekurzorů ribozomálních RNA (rRNA). které téměř vždy vedou k neschopnosti ukončit trankripci na terminační sekvenci templátové DNA. hexamerní protein se známou strukturou (Obr. Eukaryotní RNAP jsou daleko komplexnější než polymerázy prokaryot.:Molekulární biologie zřejmně napomůže vytlačení RNA vázané oligo(U) koncem na templátové DNA pomocí komplementární DNA v transkripční bublině a tím terminaci. tRNA. Eukaryotní RNA polymerázy Jádro eukaryotní buňky obsahuje tři různé typy RNA polymeráz. Jiný model předpokládá. RNA polymeráza III (RNAP III. Rho protein je ve své podstatě helikáza.190). směrem k RNAP. dokud RNAP nedostihne v okamžiku.Studijní opory biologie Malý J. kdy transkripční komplex je zastaven na terminačním místě. Rho faktor se tedy pravděpodobně váže na nascentní (právě vznikající) RNA v místě rozpoznávací sekvence. RNAP C) se rovněž nachází v nukleoplazmě a syntetizuje prekurzory 5S ribozomální RNA. či krátkého oligo(U) řetězce. že terminace je umožněna především povahou interakce RNARNAP. RNAP B) se nachází v nukleoplazmě a syntetizuje mRNA. o čemž svědčí i vysoká variabilita a počet Strana 47 . tj. což v důsledku znamená odpojení RNA od templátové DNA a terminaci. Genetické studie ukázaly nutnost existence speciálních rozpoznávacích sekvencí (80-100 nukleotidů. řadu malých jaderných RNA (snRNA) a cytozolických RNA. které se liší způsobem. 5. jakým syntetizují RNA. Rho protein následně rozvine RNA-DNA duplex v transkripční bublině RNAP a uvolní RNA transkript.7. nízký G) na RNA před terminačním místem. RNAP A) se nachází v jadérku (hustá struktura v buněčném jádře. schopná oddělovat helixy RNA-DNA a RNA-RNA za spotřeby ATP. vysoký obsah C. Mimo klasické jaderné RNAP se v eukarytní buňce nachází RNAP i v mitochodriích a chloroplastech (u rostlinných buněk). RNA je pravděpodobně svázána s RNAP ve dvou místech a právě vytvoření terminační vlásenky jednu z těchto vazeb porušuje. Tuto hypotézu potvrzují výsledky studia bodových mutací v sekvencích vlásenky. proteinu Rho (Rho faktor). zvyšuje efektivitu spontánní terminace a zároveň je zodpovědný za terminaci transkriptů bez terminační vlásenky.

Malý J. Povrch RNAP II je negativně nabit. které řídí sestavení RNAP na promotoru transkribovaného genu. Nejběžnější z nich. obdobně jako u DNAP. Struktura promotorových sekvencí eukaryot Strana 48 . avšak k nim se přidávají další.Studijní opory biologie funkčních pojednotek (Obr. tj. CTD doména). Aktivaci RNAP II (tj. který váže dva Mg2+ ionty v aktivním místě.191). Krystalografická studie eukaryotní RNAP izolované z kvasinek a provedená R. tj RNAP III a RNAP III je skupina toxinů. vyjma pozitivně nabitého žlábku. Na rozdíl od RNAP holoenzymů prokaryot. kudy se do aktivního místa dostávají NTP k syntéze RNA. CTD může být reverzibilně fosforylována/defosforylována pomocí CTD kináz/fosfatáz. části RNAP. zpomalení nebo zastavení translokace a nikoliv ve snížení průchodnosti či změnou afinity pro NTP. V místě stočení dochází ke vzniku RNADNA duplexu a syntéze RNA řetězce v aktivním místě s Mg2+. tj. Mechanismus translokace RNA-DNA duplexu v průběhu elongace je zobrazen na Obr. Inhibiční účinek však pravděpodobně spočívá v inhibici konformačních změn „můstku“. které se nazývají amatoxiny (na ostatní RNAP nepůsobí). a ω prokaryotní RNAP. Tyto toxiny jsou přítomné v jedovaté houbě Amanita phalloides (5-6 mg amanitinu je letální dávka pro člověka). která vytváří „můstek“ nespecificky interagující s templátovou DNA. „trychtýři“.:Molekulární biologie Některé z těchto podjednotek jsou homologické k podjednotkám α. Kornbergem potvrdila vysokou míru podobnosti s již zmíněnou Taq RNAP.8. sekvence těchto 10 podjednotek je vysoce kozervována od kvasinek až po člověka (Obr.192). Tato vazba je jim propůjčena až po utvoření mediátorového komplexu s transkripčními faktory. Známým inhibitorem transkripce. které jsou pravděpodobně zodpovědné za katalýzu elongace RNA vlákna. přechodu z iniciace do elongace) předchází fosforylace C-terminální domény podjednotky β´ (tzv. do kterého se váže DNA. Z celkem 12 podjednotek RNAP II je 10 sekvenčně velmi podobných podjednotkám RNAP I a III a navíc. Krystalografickou analýzou bylo identifikováno místo vazby α-amanitinu v tzv. RNAP eukaryot nejsou samy o sobě vázány těsně na dsDNA. RNAP II je o trochu větší komplex z více podjednotek. dsDNA je vnořena do RNAP tunelem mezi tzv. tzv α-amanitin má schopnost mnohotisíckrát zpomalovat transkripci vazbou a inhibicí RNAP (transkripce pouze jednotky nukleotidů za minutu). Translokace (posun řetězce dsDNA o 1 nukleotid k umožnění čtení následujícího nukleotidu) je pravděpodobně způsobena pravidelnými konformačními změnami helixu podjednotky Rpb1.193 a 194. „můstkem“ a „svorkou“ a unvitř se stáčí v 90° úhlu.β. 5. a vychází místem „exit“. u prokaryot chybějící proteiny.

které nemají fixovanou pozici vzhledem k počátku transkripce a vyskytují se na řetězci poměrně v náhodné poloze. které kódují tzv. RNAP I rozpoznává pouze jeden promotor. které jsou exprimovány ve všech typech buněk v organismu a které jsou zodpovědné za udržení základních životních funkcí buňky. že tyto genetické elementy jsou rozpoznávány řadou transkripčních faktorů. tento enzym rozpoznává pouze tento jeden specifický promotor a z tohoto důvodu není RNAP I schopná provádět transkripci jiných něž rRNA. lokalizované před +1 nukleotidem. nikoliv k úplnému zastavení transkripce genu (Obr. jejichž vazba stimuluje sestavení funkční RNAP II na příslušném promotoru. CCAAT box. Je evidentní. ale nezastaví ji úplně. k zvýšení úrovně transkripce je vyžadována sekvence (horní kontrolní sekvence) bohatá na G a C lokalizována daleko před vlastním promotorem (-187 až -107) (upstream promotor element). v oblasti vymezené -70 a -90 nukleotidem a dále další horní kontrolní sekvenci – CACCC box lokalizovanou ještě před ní. Role TATA boxu však na rozdíl od prokaryot není naprosto esenciální pro zahájení transkripce. který se nachází mezi -31 až +6 nukleotidem. Mutační analýzou bylo zjištěno. Naproti tomu strukturální geny. který dirigují sestavení funkční RNAP I na promotoru. tzv. že tyto GC boxy fungují obdobně jako prokaryotní promotory. jejich struktura ještě nebyla detailně popsána.:Molekulární biologie Jelikož valná většina sekvencí rRNA v eukaryotním chromozómu si je velmi podobná. Tyto elementy nejsou nezbytné pro vlastní transkripci – jejich delece sice ovlivní míru činnosti RNAP. jeho delece vede k zpomalení. housekeeping genes. 193). které jsou syntetizovány pouze za určitých okolností (pouze u určitých typů buněk) obsahují spíše AT bohaté sekvence lokalizované 25 až 30 bp před +1 nukleotidem. často velmi vzdálené od +1 (i několik tisíc bp). Například globinové geny obsahují konsensus sekvenci. že pro vazbu RNAP I do promotorů genu pr rRNA je nezbytně nutná existence tzv. než v případě prokaryot. Promotory RNAP II jsou mnohem delší a více diverzifikované. Je prokázáno. tj. Z tohoto důvodu se tyto genové elementy nazávají enhancery (zesilovače). tentokráte v oblasti -50 až -110. Strukturální geny. Navíc. Mimo TATA box se na těchto typech promotorů vyskytují i další regulační sekvence. Tento tzv. Tato funkce je zajištěna vytvářením smyček dsDNA mezi promotorem a enhancerem. mají vždy jednu nebo více kopií GGGCGG sekvence (GC box). TATA box je velmi podobný -10 sekvenci prokaryot (TATAAT). že tyto sekvence se výraznou měrou podílejí na sestavení funkční RNAP II.Studijní opory biologie Malý J. Mutační studie (studium vlivu mutací v promotoru) ukázaly. jaderného promotorového elementu. Tyto sekvence jsou místem vazby traksripčních faktorů. tj. Jedním ze zajímavých a dosud neobjasněných faktů je existence kontrolních elementů. Tyto zesilovače jsou nezbytné pro zajištění maximální aktivity příslušných promotorů. geny. Navíc. přičemž Strana 49 .

Studijní opory biologie

Malý J.:Molekulární biologie

jejich vazba a fixace se vznikající RNAP II je zprostředkována pomocí transkripčních faktorů. Enhancery tedy do značné míry ovlivňují selektivní expresi genů v eukaryotních organismech.

Strana 50

Studijní opory biologie

Malý J.:Molekulární biologie

6.

REGULACE EXPRESE GENŮ NA ÚROVNI TRANSKRIPCE U PROKARYOT

Prokaryta musí být schopny rychle reagovat na skokové změny vnějšího prostředí, jako je například tok živin, rychlou syntézou příslušných přenašečových proteinů a enzymů. Tento proces přitom trvá pouze několik málo minut, neboť proces transkripce a translace je velmi těsně spjat (Obr.194). Ribozómy začíjí translatovat vznikající mRNA od 5´-konce v okamžiku, jakmile je tento konec vlákna uvolněn z RNAP. Navíc, většina mRNA prokaryt je velmi rychle (do 1-3 min. po syntéze) degradována nukleázami, aby nedocházelo k tvorbě nepotřebných proteinů a zbytečné spotřebě energie. 5´-konec mRNA je tak často degradován dříve, než dojde k dosyntetizování 3´-konce řetězce. V kontrastu s prokaryoty, eukaryotní buňky syntetizují nové proteiny velmi pomalu (hodiny až dny), zejména v důsledku odděleného místa transkripce (jádro) a translace (cytoplasma), kdy vznikající mRNA musí být dopravena skrze jaderné póry do místa translace. Navíc, eukaryotní buňky většiny mnohobuněčných organismů jsou obklopeny stabilním prostředím a nejbouřlivější transkripce probíhá v průběhu dělení buňky či její diferenciace. Regulace genové exprese se může odehrávat na několika úrovních, z nichž regulace na úrovni transkripce je nejefektivnější. Jelikož je tato regulace u eukaryot velmi složitá, v následujícím textu je věnována pozornost pouze prokarytní regulaci. Regulace exprese u eukaryot bude součástí samostatné kapitoly.

6.1.

Regulace transkripčními faktory

V přítomnosti vysoké koncentrace induktoru, dochází k rychlé transkripci lac operonu (viz předchozí kap.). Lac represor, produkc lac I genu E.coli, je v konstrastu syntetizován ve velmi malém množství, nepřevyšující 10 jednotek na 1 buňku. Příčinou tohoto stavu je velmi málo efektivní (slabý) promotor genu lac I. Naproti tomu geny, které jsou transkribovány ve velkém množství (intezitě) mají silný promotor a obsahují konsensus sekvence. Regulace exprese u prokaryot je dobře prostudována v differenčních pochodech. V průběhu differeciace buňky dochází k řízené změně exprese genů, která je kontrolována pomocí speciálních proteinů, tzv. sigma faktorů (součást RNAP holoenzymu). Jedním z modelových systémů je model bakteriofág-bakterie. Fág obsahuje soubor genů, které se mohou dělit na tzv. ranné, střední a pozdní geny. Tzv. ranné geny se dostanou do bakterií inhed na počátku infekce. Ty navodí v buňce řadu změn, které dále podpoří expresi středních genů fága. V nich jsou kódovány proteiny, které umožňují expresi pozdních genů. Sekvenční exprese těchto genů je umožněna pomocí syntézy tzv. kaskády sigma faktorů. Např. po

Strana 51

Studijní opory biologie

Malý J.:Molekulární biologie

infekce bakterie Bacillus subtilis bakteriofágem SP01 dojde nejdříve k transkripci ranných genů bakteriofága pomocí RNAP holoenzymu bakterie. Mezi proteiny těchto ranný genů je i gen 28, která dává vznik sigma faktoru, označeného jako σgp28. Ten nahradí σ faktor bakterie, který je přítomný v RNAP holoenzymu a zvyšuje tak afinitu RNAP k promotoru středních genů bakteriofága. Obdobně, genový produkt středních genů, sigma faktor 33/34 (σgp33/34) způsobuje po vazbě na RNAP transkripci pozdních genů bakteriofága. Bakterie B. subtilis obsahuje mimo obvyklý sigma faktor σ70 i jiné sigma faktory, které jsou zodpovědné za proces sporulace. V případě navození sporulace tak dochází v důsledku sekvenčních změn v expresi navozených působením kaskádou příslušných sigma faktorů k přestavbě metabolismu bakterie a vzniku spóry. Ta se jak morfologicky, tak z hlediska metabolismu liší od normální vegetativní buňky. Lac represor je tetramerní protein s vysokou afinitiou k IPTG (K = 10-6M). V nepřítomnosti induktoru projevuje nejen nespecifickou afinitu k dsDNA, ale především mnohem silnější specificku vazbu k lac operátoru. Je velmi pravděpodobné, že represor hledá operátor popojížděním po dsDNA, na kterou se nespecificky váže. V případě, že narazí na operátor, dojde k jeho zastavení a blokaci promotoru. Lac operátor je tvořen palidnromatickou sekvencí 26 nukleotidů, který je společným znakem pro vazebné interakce řady proteinů s dsDNA (Obr.195). Operátor se nachází mezi -7 a +28 sekvencí lac operonu. Jelikož RNAP iniciační komplex je pevně vázán mezi -20 až +20 sekvencí, dochází k překryvu vazebného místa s represorem. Navázaný represor způsobuje zvýšení kinetické bariéry pro přechod RNAP z abortivní transkripce do procesivní transkripce (elongace).

6.2.

Regulace katabolickou represí

Glukóza je jedním z nejdůležitějších substrátů bakterie E.coli. Její dostatek v médiu zamezuje (inhibuje) expresi více jak 100 genů, které jsou zodpovědné za fermentaci mnoha látek, jako je laktóza, arabinóza, galaktóza atd. Tento jev, kdy přítomnost jednoho substrátu navozuje inhibici příjmu jiného substrátu se nazývá katabolická represe. Princip tohoto jevu byl studován na souvislosti mezi hladinou cAMP v buňce E.coli a přídavky glukózy do média (Obr.196). Zvýšení koncentrace glukózy má za následek pokles vnitrobuněčné koncentrace cAMP, který je znám jako tzv. druhý posel v přenosu informace v živočišných buňkách. U mutatntních buněk, postrádajících tento typ odezvy na přídavek glukózy, není přítomen tzv. genový aktivační protein (CAP), který má schopnost vazby an cAMP za vzniku komplexu CAP-cAMP. Jak bylo později prokázáno, komplex CAP-cAMP se váže na lac operon a

Strana 52

tj. jejich rozpoznávací schopnost musí být determinována pouze těmi funkčními skupinami bazí. Vazba HTH motivu na dsDNA a způsob rozeznání sekvence je velmi komplexního charakteru. při které se uplatňuje řada strukturálních interakcí různé povahy. Neexistují jednotná pravidla. Třída III promotorů vyžaduje spolupůsobení více aktivátorů současně k maximální stimulaci transkripce. které vyžadují pouze vazbu CAP-cAMP k aktivaci transkripce. Jelikož tyto proteiny zpravidla nemají schopnost rozštěpit dsDNA.197). Třída I promotorů. Třída II promotorů. Ze sterických důvodů se však uplatňuje především široký žlábek.3. Jedná se o cca 20 aminokyselinový polypeptid ve formě dvou α-helixů. Struktura a funkce vazby CAP-cAMP na operon byla objasněna na molekulární úrovni (Obr. Všechny tyto typy HTH motivů jsou evolučně spjaté a váží dsDNA podobným způsobem. lac operon. který se nazývá rozpoznávací helix. α-CTD podjednotka se nespecificky váže na dsDNA. cI represor a Cro proteiny bakteriofága λ. zejména v oblastech se zvýšenou přítomností AT sekvencí. Tato vazba stimuluje zahájení iniciace RNAP na nejbližším promotoru. CAP interaguje přímo s RNAP skrze C-koncovou sekvenci tzv. CAP dimer je tvořen dvěma symetricky uspořádánými helixy. neboť úzký žlábek je těžko přístupný pro sekundární strukturu proteinů. v protikladu k negativní regulaci navozenou lac represorem. je velká pozornost věnována otázce.198. vážící CAP-cAMP komplex mohou být děleny do tří skupin. které vycházejí z proteinu a jsou vsazeny do dsDNA v místě širokého žlábku. který je konformačně blízký jiným HTH motivům přítomným v bakteriálních represorů. které jsou zkřížené ve 120° úhlu. Tyto dva helixy CAP proteinu vytváří tzv. trp represor. která by ovlivňovala způsob interakce jednotlivých Strana 53 . jako je lac represor.Studijní opory biologie Malý J.:Molekulární biologie stimuluje transkripci v nepřítomnosti lac represoru. 6. Navíc. 199). CAP je tedy příkladem pozitivní regulace laktózového operonu. helix-turn-helix motiv (HTH motiv). solné můstky a van der Waalsovy interakce (Obr. především pak vodíkové můstky. Promotory. jak tyto proteiny rozpoznávají jejich cílovou sekvenci na DNA. které rovněž vyžadují pouze přítomnost CAP-cAMP. tj. α-CTD podjednotky. které přečnívají do úzkého či širokého žlábku helixu dsDNA. Interakce mezi HTH a dsDNA je zprostředkována pomocí postraních helixů vycházejících z druhého helixu HTH motivu. překryvem s vazbým místem pro RNAP (u přechozí třídy je místo vazby různé). jakým ja např. Regulace sekvenčně specifickými protein-DNA interakcemi Jelikož genová exprese je regulována proteiny jako je CAP nebo lac represor. v oblasti -35 promotoru. Na rozdíl od předchozí třídy však je jednoznačně definována poloha vazby CAP.

coli má schopnost metabolizovat pentózový cukr L-arabinózu. Naproti tomu eukaryotní stukturální motivy jsou daleko více variabilní a řada z nich neobsahuje prvky symetrie. zodpovědných za syntézu methioninu a SAM. zatímco araBAD operon je transkribován pouze na bazální (konstitutivní) úrovni. který podléhá katabolické represi. V nepřítomnosti AraC. Tento operon obsahuje v horních sekvencích od +1 nukleotidu kontrolní místa.200). V případě přítomnosti arabinózy v médiu. že dsDNA mezi nimi je vazbou proteinu AraC ohnutá do smyčky. které jsou vloženy do širokých žlábků rozpoznávané dsDNA. Transkripce araBAD operonu je regulována jak systémem CAP-cAMP. AraO2 je lokalizována v nekódující oblasti -270. dojde k vazbě proteinu AraC na sekvenci araO2 a araI1 a zamezení transkripce araBAD operonu (negativní kontrola). což je pravděpodobně příčinou zamezení transkripce. tzv. Tři z pěti enzymů. araI1 a araI2. RNAP provádí transkripci genu araC. Zvyšuje se tak afinita AraC k místu araI2. které se podílí na vzájemné vysoké vazebné afinitě HTH motivu a DNA. dojde k eliminaci vazby AraC na araI1 za současného zachování vazby na araO2. jako prokaryotních motivů. Jiným příkladem protein-DNA interakce je tzv. Tento fakt dovolí rozvolnit smyčku a je zahájena transkripce araBAD operonu (pozitivní kontrola). V případě nízkého obsahu glukózy v substrátu (velké množsví CAP-cAMP). Bakterie E. dojde k k vazbě CAP-cAMP na sekvenci mezi araO2 a araI1 a tím i snadnějšímu rozpletení smyčky. Velká většina prokaryotních transkripčních regulátorů obsahuje stuktury obdobné HTH motivu či podobné β-listu MetJ represoru. Regulace araBAD operonu probíhá v několika stupních (Obr. Krystalizací komplexu MetJ-SAM s dsDNA bylo zjištěno. Jakmile je přítomný AraC (ale zároveň je nepřítomná arabinóza a CAP-cAMP). araI. Regulace araBAD operonu 6. Vzdálenost obou regulačních sekvencí napovídá. tak i tzv. proteinem vázajícím arabinózu. Obdobně i araO1 je složeno ze dvou sekvecí L a R. Rekognice sekvence DNA je tedy dána souhrnem faktorů a interakcí.Studijní opory biologie Malý J. AraC. Tyto motivy budou diskutovány v kapitole věnující se regulaci transkripce u eukaryot.:Molekulární biologie aminokyselinových zbytků a bazí. který po vytvoření komplexu s S-adenosylmethioninem (SAM) reprimuje tvorbu sebe sama a genů. Vazba AraC-arabinóza komplexu do místa araO1 Strana 54 . araC genu. které jsou lokalizovány v blízkosti -35 regulační sekvence promotoru. že tento represor se váže na palindromatickou sekvenci DNA pomocí symetricky uspořádaných dvouřetězcových antiparalelních β-listů.201). které jsou využitelné k jejímu metabolickému zpracování jsou produkty operonu araBAD.4. araO1 a araO2 (Obr. AraI (místo pro vazbu induktoru) se skládá ze dvou 17 bp míst. met represor (MetJ). v blízkosti tzv.

dochází k represi tvorby AraC. ihned dochází k sestaven ribozomu na jejím 5´-konci a zahájení translace. Ze sekvenčních analýz vyplývá. je i dostatek tryptofanyl-tRNATrp (transferová RNA pro tryptofan s navázaným Trp reziduem) a ribosom pokračuje v syntéze na segmentu 2. prvnímu z genů v operonu. Regulace tryptofanového (trp) operonu atenuací Atenuace je způsob regulace exprese na úrovni transkripce. trpR operon a aroH operon. coli. které neobsahují geny pro translaci enzymů. který ji způsobuje atenuátor. Pozice těchto dvou aminokyselin ve vzniklém řetězci je důležitým faktorem v mechanismu atenuace (Obr. že množství tryptofanu je v buňce malé.204). Přesto je část segmentu 1 translatována za vzniku krátkého. který využívají některé bakterie k regulaci operonů. tj. zúčastňujících se biosyntézy aminokyselin. Trp operon kóduje pět polypeptidů. že trpE. označovaná jako trpL. které mohou vytvářet dva typy odlišných vlásenek (Obr.:Molekulární biologie v nadbytku arabinózy blokuje přístup RNAP do do promotoru araC. rho-nezávislý (viz rho závislá terminace terminace transkripce) transkripční terminátor.5. předchází 162 nukleotidová sekvence. jeho nadbytek jako koněčný produkt biosyntézy negativně reguluje jeho vlastní syntézu. Jakmile dojde k syntéze tohoto krátkého řetězce mRNA. Přesto ale dochází k neustálé produkci sekvence obsahující trpL. Tomuto způsobu kontroly transkripce se říká atenuace a kontrolnímu elementu. které se účastní syntézy tryptofanu. přičemž vzniká komplex. Tzv. korepresor.Studijní opory biologie Malý J. vedoucí sekvence (leader). tzv. Transkripce pokračuje velmi zřídka i za tuto terminační vlásenku. Nedochází tedy k naprostému zamezení transkripce. segmenty 3 a 4 vytváří společně normální. ale k vytváření a terminaci nehotových transkriptů. který se specificky váže na trp operátor (trpO) a snižuje tak míru transkripce až o 70 krát. V případě. Ten je započat RNAP. dimerickým proteinem genového produktu trpR (Obr.202). Trp represor navíc reguluje další dva operony. blízko RNAP přičemž blokuje vznik 2-3 antiterminační vlásenky a způsobuje vznik 3-4 terminační Strana 55 . S nárůstem koncentrace tryptofanu je transkripce trp operonu postupně inhibiována pomocí trp represoru-korepresoru. tj. Působení trp represoru není jediným regulačním mechanismem transkripce tryptofanového operonu. která syntetizuje trpL mRNA. V případě. z 14 aminokyselin tvořeného polypeptidu. Transkript atenuátoru obsahuje čtyři komplemenární segmenty. tj. Tryptofan tedy funguje jako tzv. který obsahuje dva za sebou jdoucí tryptofany. Trp represor váže L-tryptofan. Tento způsob byl popsán na příkladu tryptofanového operonu bakterie E. že v buňce je dostatek tryptofanu.203). Tyto geny jsou kontrolovány trp represorem. dochází k syntéze polycistronické mRNA včetně trypL sekvence. 6.

Následuje odpověď buňky. regulace za přísných podmínek (stringent response). Syntéza pppGpp spočívá v enzymaticky řízené rekaci ATP a GTP za vzniku nukleosid pentafosfátu a AMP. jako je ppGpp a pppGpp (dohromady pojmenované jako (p)ppGpp (guanosin pentafosfát) a jejich rychlé degradaci v okamžiku dostatku všech aminokyselin. Buňky mají schopnost koordinovat míru translace potřebný proteinů s počtem ribozómů. RNAP je schopná zahájit transkripci ribozomální rRNA nejrychleji jednou za 1 s. ribozom se zastaví na kodonu UGG pro tryptofan a umožní vznik antiterminační vlásenky 2-3. ilv operonu v bakterii E. (p)ppGpp vzniká v okamžiku. Mechanismus atenuace je tedy velmi podobný (Obr. která by buňkám odebírala zbytečnou energii. nebyla by schopna nasyntetizovat více jak 1200 kopíí jednoho typu. Navíc. Mechanismus této regulace spočívá v akumulaci neobvyklých nukleotidů.205). Mimo tryptofanu se podobným způsobem reguluje i syntéza histidinu. přičemž každý obsahuje po jedné kopii všech rRNA. leucinu a valinu pomocí tzv.:Molekulární biologie vlásenky. his operonu a syntéza isoleucinu. Zamezuje se tak nadbytečné a neefektivní syntéze. Tyto nukleotidy mají schopnost měnit afinitu RNAP k promotorům a snižují rychlost elongace transkripce určitých genů. které jsou kódovány v leaderových sekvencích peptidu. Nedostatek některé z aminokyselin. „nenabité“ příslušné tRNA pro tuto aminokyselinu. Oba tyto případy obsahují sekvence bohaté na regulované aminokyseliny. takže ve výsledku jsou schopny dosáhnout požadované rychlosti syntézy ribozomů a potažmo i proteinů důležitých pro buněčné dělení.coli se za optimálních podmínek dělí každých 20min. 6. coli. katalyzované enzymem ReIA (stringent factor). tedy všech genů nutných pro syntézu tryptofanu. který se může objevit za nedostatečné míry její syntézy.Studijní opory biologie Malý J. se projeví vznikem tzv. Regulace syntézy rRNA za přísných podmínek (stringent response) Buňky bakterie E. Buňka se tak připravuje na hladovění za nedostatku živin. zodpovědných za tvorbu aminokyselin. což mimo jiné znamená. Jedním ze způsobů. v tzv.6. kdy se v ribozómu na patřičném kodonu pro Strana 56 . Z tohoto důvodu obsahuje genom batekterie sedm samostatně lokalizovaných operonů pro rRNA. která ukončí transkripci. rychle se dělící bakterie obsahují více částečných kopií chromozómu. RNAP tak není zastavena a pokračuje dále v transkripci trp operonu. že musí být schopna nasyntetizovat až 35 000 ribozomů na jeden buněčný cyklus. kdy dochází k potlačení celé řady syntetických pochodů na úkor zvýšení syntézy enzymů. Pokud by tak buňky obsahovala pouze jednu kopii genu pro každou s ribozomálních RNA. Jakmile však není v buňce dostatek tryptofanu a tedy ani tryptofanyl-tRNATrp. syntézy proteinů. Míra syntézy rRNA je tak srovnatelná s mírou translace. tj. jak se tato kontrola realizuje je tzv.

Studijní opory biologie Malý J. Tím je odhalen nedostatek aminokyseliny v buňce a vznikající (p)ppGpp působí jako difuzibilní efektor. navozující následné změny ve transkripci příslušných genů regulací pomocí stringent mechanismu. Opětovná degradace (p)ppGpp je navozena genovým produktem spoT.:Molekulární biologie chybějící aminokyselinu vyskytne neobsazené místo (v důsledku absence příslušné tRNA). Strana 57 .

u savců vždy tvořeny 3´-polyA koncem o délce až 250 nukleotidů.206). Výsledkem tohoto faktu je heterogenita 3´-konců primárních transkriptů eukaryot. Úpravy mRNA čepičkou a polyA koncem V prokaryotních buňkách je většina syntetizované mRNA translatována bez jakýchkoliv úprav. zralé mRNA. primární transkript. Eukaryotní mRNA je opatřena enzymaticky syntetizovanou tzv. Tyto konce jsou např. U eukaryt je ale RNA syntetizována v jádře a translatována v cytozolu. exonukleázové či endonukleázové odštěpení polynukleotidových segmentů. Naproti tomu. (3) metylace guaninu guanin-7metyltransferázou (metyl dodává S-adenosylmethionin.:Molekulární biologie 7. např. tzv. S cílem nabýt konečné. cap-1 čepičce (typická pro mnohobuněčné organismy). je metylován v poloze N6. memusí být nutně konečnou funkční RNA. Eukaryotní mRNA v konstrastu s prokaryotní mRNA jsou téměř vždy monocistronické. jakou je např. PolyA konce jsou enzymaticky připojeny k primárnímu transkriptu Strana 58 . Z tohoto důvodu nebyly u těchto organismů identifikovány terminační sekvence. který vede k tzv. zejména z důvodu potřeby jejich rychlé translace ribozómy.1. která je tvořena 7-methylguanosinem navázaným na původní 5´nukleosid 5´-5´ trifosfátovým můstkem (Obr. O2´-methylace prvního nukleosidu. postranskripčními úpravami. jakmile je odhaleno prvních 30 nukleotidů a definuje startovní místo eukaryotní translace. ani na jednom (cap-0) z nukleosidů. durhého nukleosidu 2´-O-metyltransferázou. Dle může být tento typ methylace proveden i na druhém (cap-2) popř.Studijní opory biologie Malý J. čepičkou. rRNA a tRNA. Čepička je navázána na nascentní mRNA. Pokudje prvním nukleosidem adenosin. (4) O2´metylace prvního popř. Těmto úpravám podléhají zejména mRNA. biologicky aktivní konformace musí řada těchto primárních transkriptů projít následnými. připojení specifických nukleotidových sekvencí na 3´a 5´konec RNA a modifikace specifických nukleosidů. která vzniká ihned po syntéze RNAP. 7. vzniklé úpravou těchto primárních traskriptů mají vždy velmi dobře definované 3´-konce. POSTRANSKRIPČNÍ ÚPRAVY PRIMÁRNÍHO TRANSKRIPTU Ribonukleová kyselina. tzv. SAM). Eukarytní mRNA tedy provází řada postranskripčních úprav a to ještě před opuštěním samotného jádra buňky. (2) guanylace mRNA čepičku tvořícím enzymem za vzniku 5´-5´ trifosfátového můstku. Vytvoření čepičky je provedeno několika postupnými kroky s účastí několika enzymů: (1) odstranění 5´terminální trifosfátové skupiny RNA trifosfatázou. Mimo základní úpravu koncového nukleotidu mohou být provedeny i úpravy další.

že hnRNA podléhá ještě v jádře výrazným změnám. tzv. Tento fakt je potvrzen dlouhou dobou existence polyA modifikovaných mRNA v cytoplasmě (hodiny) oproti mRNA bez polyA konce (např. CPSF faktor) rozpoznává sekvenci AAUAAA a na jejím podkladě zahajuje syntézu polyA konce. které jsou z hlediska délky velmi variabilní a které nic nekódují (jsou vystřiženy) a kódujících úseků. heterogenní nukleární RNA (hnRNA) byla jen na výjímky jejích 5´. Exony jsou zpravidla podstatně kratší s průměrnou délkou nepřesahující 300 nukleotidů. PolyA konec nemá kostitutivní funkci. Problém heterogenních konců primárních transkriptů je tak vyřešen. které nic nekódují.:Molekulární biologie ve dvoustupňové reakci katalyzované komplexem z přibližně 6 proteinů. Jeho funkce spočívá v protekci 3´-konce mRNA před působením exonukleáz. přičemž charakteristická délka je ≈ 3500 nukleotidů. PAP je RNAP. Ten s pomocí dalšího faktoru (tzv.Studijní opory biologie Malý J. nazývaných exony (Obr. Vysvětlení tohoto jevu přinesly výzkumy P. PolyA konec je v nativních podmínkách v cytoplazmě kompletován s tzv. které vedou k vystřižení dlouhých úseků a spojení zbylých úseků. v druhém jmenovaném případě je gen tvořen kodujícími sekvencemi. Její struktura byla popsána rentgenovou analýzou (Obr. hnRNA je tedy složena z úseků.208). Robertse. Jeho přítomnost na polA reguluje činost PAP. že původně indentifikovaná RNA v jádře.207). Molekulární sestřih mRNA (splicing) Jedním z největších rozdílů mezi strukturálními geny prokaryot a eukaryot je že. která je vysoce konzervovaná u všech eukaryot (vyjma kvasinek). Délka polyA konce je rozpoznávána a regulována prostřednictvím vazby proteinu poly(A) – vázajícího proteinu (PAB II) na vznikající polyA konec. Po nasyntetizování čepičky jsou introny Strana 59 . kteří dokázali.2. intronů. restrikční faktor I a II (CFI a CFII). Objev tohoto typu kódování souvisel s faktem. 30 minut) a postupnému zkracování 3´-konců mRNA s polyA koncem v průběhu jejich přítomnosti v cytoplasmě. 7. Průměrný počet intronů na jeden gen je ≈ 8.Sharpa a R. tj. poly(A) vazebným proteinem (PABP). Na štěpení RNA se podílí tzv. kde dochází k translaci. včetně intronů. V druhém kroku je syntetizován polyA konec z ATP činností enzymu poly(A) polymerázy (PAP). kteráje nezávislá na existenci templátu a prodlužuje mRNA primer od 3´-OH konce. které jsou přerušeny sekvencemi. V prvním kroku dochází k odštěpení 3´-konce primárního transkriptu ve specifické sekvenci zhruba 20 nukleotidů vzdálené od sekvence AAUAAA. tzv. Na počátku je vždy syntetizována mRNA jako ucelená kopie jaderného genu. RNA pro histony. Jejich sekvence je v každém intronu téměř unikátní a nahodilá. není translatován. který se výraznou měrou podílý na prodloužení doby života mRNA. přítomných v cytoplazmě.a 3´konců pozorována v cytozolu.

Studie provedené A. selfsplicingu (samosestřih) (Obr. Na 5´ konci intronu se vždy nachází invariantní sekvence GU a na 3´konci itronu sekvence AG. Nedochází ani ke změně pořadí exonů – ve zralé mRNA zcela kopírují jejich polohu na templátové DNA.Studijní opory biologie Malý J. Každý špatný sestřih. Vzniká tak spojení dvou exonů.209). neboť se jedná o transesterifikaci. Dochází tak Strana 60 . která je nepostradatelná pro proces splicingu (Obr. avšak čepičkou opatřené mRNA v jádře. přičemž vystřižený intron linearizuje a je rychle degradován. Adenosinový zbytek intronu se nachází přibližně 50 bází od 3´-konce štěpeného intronu a často je obklopen konzervovanou sekvencí UACUAAC. Maniatisem objasnily mechanismus ekcise (vystřižení) intronu. Cecha k velmi důležitému objevu tzv. že tyto spoje projevují vysokou míru homologie. michondriích a chloroplastech široké skupiny eukaryot. Introny jsou rozděleny dle stuktury a mechanismu do osmi rozdílných skupin. Srovnávací studie sekvencí v oblasti uzlu mezi exony a introny ukazují. který byl inkubován s guanosinem nebo s GMP. nebo také splicing (genový splicing).210). z nichž sedm se vyskytuje u eukaryot (Obr. Intron tak utvoří novou lasovitou strukturu. na 5´konci situovaný) exon. Tento proces je charakteristický vysokou přesností. byť by znamenal jen posunutí jednoho nukleotidu. Studium těchto typů intronů na prvoku Tetrahymena thermophila vedla T. 3´-OH skupina uvolněného levého exonu vytváří fosfodiesterovou vazbu s 5´-terminálním fosfátem pravého (ted na 3´ konci RNA orientovaného) exonu.5´-fosfodiesterové vazby mezi adenosinem intronu a jeho 5´-koncové fosfátové skupiny (intronu) za současného uvolnění 3´-OH skupiny exonu. jedna vazba zaniká ale místo ní vzniká vazba nová. Celý proces splicingu nevyžaduje dodání volné energie. který probíhá pomocí transesterifikačních reakcí a je obecné povahy u organismů (Obr.Efstradiadisem a T. Excise je započatá vytvořením 2´. že za určitých okolností se RNA může chovat jako enzym a katalyzovat nejrůznější reakce.211). U izolovaného primárního transkriptu rRNA.213). GTP došlo v nepřítomnosti proteinů k samovolnému vystřižení intronu a s spojení příslušných exonů do jednoho řetězce. GDP popř. Skupina I intronů se vyskytuje v jádře. tj. Tento proces probíhá ve třech krocích (Obr.212). by poskytl zcela jiný protein po translaci.:Molekulární biologie vyštěpeny a exony po stranách vystřiženého intronu navzájem spojeny (Obr. Tento objev potvrdil. 3´-OH skupina volného guanosinu vytváří fosfodiesterovou vazbu s 5´-koncem intronu a uvolňuje levý (tj. V následujícím kroku vytváří volná 3-OH skupina uvolněného exonu fosfodiesterovou vazbu s 5´-terminální fosfátem následujícího exonu.214). Tato struktura začátku a konce intronu je nepostradatelná pro vytvoření struktury. vyjma obratlovců. prozatím vázaného s intronem s lasovitou strukturou. Tento proces se nazývá molekulární sestřih. který se často provádí kotranslačně. ještě na nehotové. tzn.

tzv. Tyto introny tak procházejí splicingem.216). že spliceosom není nic jiného. Ty byly demonstrovány na jeho schopnosti štěpit in vitro poly(C) s urychlením jeho hydrolýzy na C s faktorem 1010. při které je rozštěpena 3´. připomínající kladivo. tj. který je velmi podobný sestřihu jaderné mRNA. Tento ribozym se skládá z devíti dvojřetězcových segmentů.:Molekulární biologie ke spojení levého a pravého exonu do jednoho vlákna RNA a uvolnění intronu. Podobné úvahy platí i o struktuře a funkci ribozómu. než původní self-splicing RNA doplněná o proteiny. ještě v před vznikem buňky.215). Na rozdíl od předchozí skupiny však splicing probíhá přes lasovitou strukturu (viz výše) a nevyžaduje dodání externího nukleotidu. Tyto RNA tvoří komplexy s proteiny. Proteiny byly jako stavební kameny a katalyzátory organismů uplatněny až v pozdějších fázích evoluce makromolekul a života jako takového. který je ribonukleotidovou částicí. kinetika této katalyzované reakce podléhala závislostem Michaelise-Mentenové. spliceosom. vyskytující se u některých rostlinných virů. které se nazývají malé jaderné RNA (snRNA. Název spočívá v charakteristickém uspořádání trojrozměrné struktury.5´-fosfodiesterová vazba mezi nukleotidy C a A. Jinými typy ribozymů. že původním biologicky aktivním katalyzátorem na počátku evoluce života. Tento self-splicing je opět tvořen sledem transesterifikačních reakcí a nevyžaduje dodání volné energie. Všechny tyto poznatky vedou k hypotéze. Skupina II intronů se nachází zejména v mitochondriích hub a rostlin a zahrnuje většinu intronů v chloroplastech. které jsou dobře popsány jsou ribozymy s kladivovou strukturou (hammerhead ribozymes). Ribozymů bylo do dnešní doby nalezeno a po strukturní stránce charakterizováno několik typů.3´-fosfodisterové vazby (Obr. které její funkci a strukturu upevňují. Další studium vlastností intronu potvrdilo jeho katalytické schopnosti. za vzniku cyklické intramolekulární 2´. Podobné RNA enzymy se dnes označují jako ribozymy. ale molekuly RNA. U1-snRNA (patří do skupiny snRNA s vysokým obsahem U) je částečně komplementární ke konsensus Strana 61 . Příkladem je již výše zmíněný ribozymu ve formě intronu skupiny I (Obr. Tyto ribozymy katalyzují transesterifikační reakci. katalyzující sestřih. V případě mRNA v jádře je však k sestřihu využit tzv. small nuclear ribonucleoproteins). Navíc. small nuclear RNA). Jádro eukaryotních buněk obsahuje řadu kopií několika vysoce konzervovaných 60300 nukleotidových RNA. přičemž aktivní místo vzniká protkáním několika řetězců v centrální oblasti. Dojde tak k vyštěpení krátkého lineárního vlákna a cyklizaci velké části intronu. 5´-konec jedné z těchto RNA.Studijní opory biologie Malý J. Podobnost mechanismu sestřihu se skupinou II intronů vede k teorii. I tento typ intronů projevuje self-splicing. 3´-OH skupina intronu vytváří fosfodiesterovou vazbu s fosfátem nukleotidu na 15 pozici intronu od jeho 5´-konce. které se nazývají malé jaderné ribonukleoproteiny (snRNP. nebyly proteiny.

avšak na procesu splicingu se nepřímo podílí. která se vyskytuje i u tzv.217). Funkce spliceosomu je poměrně komplikovaná (Obr.Studijní opory biologie Malý J. Vznik lasovité struktury transesterifikací v prvním stupni reakce je doprovázen změnou prostorové struktury spliceosomu. který je součástí imunosystému). Spliceosom se pravděpodobně sestavuje již jako funkční molekula ještě než nasedne na mRNA. která probíhá v šesti stupních. Jedna z teorií. LDL receptor v plazmatické membráně. které kódují specifické funkční domény proteinu. jsou přítomné pouze v nevýrazném množství u taxonomicky nižších eukaryot avšak velmi hojné u vyšších eukaryot (vyjímkou jsou geny pro histony a interferony u obratlovců). že molekulární sestřih RNA přináší buňce některé podstatné výhody. jejíž činností ke splicingu dochází. která se k existenci intronů váže. K obdobně rozsáhlým strukturálním změnám spliceosomu dochází i při druhé transesterifikaci a regeneraci spliceosomu. junk = odpad). čtyřech snRNP a nedefinovaného počtu mRNA-vázajících proteinů (dohromady cca 65 proteinů (Obr. Např. Tyto mechanismy jsou diskutovány v následujících odstavcích. splicing faktory patří např. low-density lipoprotein) a umožňuje jejich transport do buňky endocytózou. obsahují nekódující oblasti ve formě intronů. splicing faktor 1 (SF1. Gen pro tento receptor se skládá z 18 exonů. komplementu C9 (protein. Druhou výhodou je tzv. Z tohoto důvodu je až 80% typického genu obratlovců tvořeno oblastmi. Analýzou genomu řady organismů bylo zdokumentováno. Tato teorie se však zdá být nepravděpodobná. že intron je ve své podstatě „molekulárním parazitem“ (tzv. neboť bylo prokázáno. 5 z těchto exonů kódují sekvenci. alternativní splicing. Obdobné vlastnosti projevují i U2-snRNP. Oba tyto proteiny napomáhají nalézt hranici intronu. nebo také BBP) nebo tzv. které nejsou přímou součástí spliceosomu. Existuje řada proteinů. 13 těchto exonů je navíc podobných polypeptidickým segmentům jiných proteinů. Všechny tyto ribonukleoproteiny se tedy účastní samotného splicingu mRNA v jádře eukaryot a jsou součástí tzv.:Molekulární biologie sekvenci mezi intronem a exonem na 5´-konci vlákna mRNA. Spliceosom je ≈ 45 S velká částice. U4-U6-snRNP (U4 a U6-snRNA jsou spárovány komlementárními bázemi) a U5snRNP. Splicing je například významným mechanismem pro rychlou evoluci proteinů (viz dále). tedy struktury. tj. které se neexprimují. že introny se takřka nevyskytují u prokaryotní DNA. Mezi tyto tzv. junk DNA. které se nachází i v jiných proteinech. spliceosomu. který umožňuje kódování funkčně i morfologicky zcela odlišných proteinů jedním genem. který váže lipoproteiny s nízkou hustotou (LDL. říká. Tři exony jsou podobné exonům Strana 62 . Mnoho eukaryotních proteinů se skládá z modulů. U2-snRNP přídavný faktor (U2AF).218). Její štěpení je doprovázeno spotřebou ATP. která se skládá z primárního mRNA transkriptu. Příkladem může být tzv.

který poskytuje 7 rozdílných tkáňově-specifických variant skrze alternativní splicing pre-mRNA (Obr. optimalizací jejich primární struktury. V případě využití tzv. Jelikož je typ splicingu tkáňově či orgánově specifický. Obdobný mechanismus alternativního splicingu je typický pro všechny mnohobuněčné organismy. které se vyskytují i v jiných typech proteinů. Výsledkem těchto rozmanitých změn splicingu může být ovlivnění takových vlastností proteinu. V prvním případě obsahuje primární transkript proteinu tra (transformer) dvě alternativní místa splicingu na 3´-konci exonu 2. ke změně místa splicingu bodovou mutací. že geny. vložení stop kodonu a předčasnou terminaci translace. Je tedy pravděpodobné. genů) se ukázaly být nepravdivé. Mechanismus alternativního splicingu je velmi rozmanitý. do jakého místa v buňce bude protein lokalizován. jednotlivých aminokyselin. jako je jeho rozpustnost v cytoplazmě či naopak vazba v membráně. v případě Strana 63 . Podobné uspořádání je typické pro celou řadu dalších eukaryotních proteinů. že LDL receptor se skládá modulárně uspořádaných exonů. musí existovat dokonalá regulace. tj.:Molekulární biologie v genu pro epidermální růstový faktor (EGF) atd.Studijní opory biologie Malý J. který je blíže 5´-konci exonu 1 dojde ke determinaci samčího pohlaví. Klasickým příkladem je krysí gen pro svalový protein α-tropomyosin. Dobře zdokumentované změny splicingu jsou i v případě růstu rakovinového nádoru. Jedná se o dva samostatné mechanismy. Rozdíl je dán mechanismem alternativního splicingu. jaká bude afinita receptoru ke specifickému ligandu atd. Určitý typ exonu v jedné diferencované buňce tak může být součástí intronu v buňce jiné. Pokud dojde např. Např. zda bude vázat určitý typ alosterického faktoru. obzvláště pro obratlovce.219). které kódují tyto modulární proteiny. Častá geneticky kódovaná onemocnění člověka (≈ 15%) jsou způsobena změnou splicingu pre-mRNA v dané tkáni. odhalí se jiné místo splicingu. Tento způsob vytváření nových proteinů přináší velkou výhodu v kombinaci evolučně osvědčených modulů. byly vytvořeny postupnou kombinací z různých exonů rekombinací mezi jejich sousedními introny. Exprese řady buněčných genů je modulována selekcí alternativních míst či způsobů splicingu. těchto genů. Evoluce nových proteinů tak nutně nemusí začínat „de novo“. Může se jednat o vložení či naopak vystřižení celých funkčních domén. původní odhady počtu strukturálních genů pro člověka (50-140 tis. které poskytne funkčně a morfologicky odlišný protein.220). zda bude podléhat fosforylaci specifickou kinázou či nikoliv. nebo např. neboť sekvenací bylo zjištěno „pouze“ 30 tis. který je prováděn odhadem až v 60% všech lidských strukturálních genů. proximálního místa splicingu. Mechanismus alternativního splicingu je dobře popsán pro případ proteinů ovlivňujících pohlaví mušky octomilky (Drosophila) (Obr. ale skládáním funkčních částí v nový celek. Je tedy evidentní.

Vzniká tak funkční protein tra. Dalšími možnými úpravami. Protein tra tak nevzniká. který zaručuje aktivaci alternativního místa splicingu a ponechání tohoto exonu v translatovaném řetezci mRNA. U za C). přičemž dojde k předčasné terminaci nefunkčního proteinu. avšak jejich funkce (transport lipidů a lipoproteinů) a místo tvorby je však zcela jiné. zahrnuje např. neboť samotná (SL)RNA obsahuje na 5´a 3´-konci konsensus sekvence obdobné těm. Příkladem je lidský protein apolipoprotein B (apoB):apoB-48 a apoB-100. Obdobný mechanismus se pravděpodobně vyskytuje u nematod a některých zástupců vyšších eukaryot.:Molekulární biologie využití druhého místa splicingu. vč. výměnu jednoho typu báze za jiný typ (např. který blokuje vazbu U2AF. sex-lethal genu sxl. jednalo se o tzv. který mi může RNA procházet. doublesex (dsx) pre-mRNA. trans-splicingem. Důvodem je odlišnost jednotlivých mRNA v záměně C za U a vznik nového stop kodonou Strana 64 . Tento způsob je doložen u trypanozóm (zástupce protozoí. První tři exony jsou vždy konstitutivně tvořeny nezávisle na pohlaví. který se nazývá editování RNA (RNA editing). U samiček však dochází v přítomnosti funkčního proteinu tra (viz předchozí regulační mechanismus) k jeho vazbě do specifických míst v exonu 4. které se nachází na koncích intronu a jsou nezbytné pro vazbu spliceosomu. způsobují spavou nemoc) (Obr. Ten tato místa rozpozná a váže tak vlákno (SL)RNA na pre-mRNA příslušného genu. Dosud popsané mechanismy splicingu se týkaly úprav jednoho vlákna pre-mRNA. U) a inzerci opakujících se G a C zbytků. Obdobné mechanismy alternativního splicingu byly popsány i v případě obratlovců. Oba proteiny jsou kódovány stejným genem. který je funkční jen u samiček). cis-splicing.Studijní opory biologie Malý J. V případě samiček je však první místo splicingu blokováno vazbou tzv. Princip odlišného štěpení spočívá v existenci stop kodonu UAG mezi těmito dvěma místy splicingu. SXL proteinu (produkt tzv. Naproti tomu existuje způsob splicingu. Vzniká tak DSX-F protein (female specific DSX protein). Všechny mRNA tohoto organismu obsahují tzv. které je blíže k 3-konci exonu 2 je determinováno samičí pohlaví octomilky. Ten funguje jako represor specifických samčích genů. který probíhá mezi odlišnými vlákny pre-mRNA za účasti spliceosomu tzv. U samečků však dochází k vystřižení exonu 4 a vzniká tak tzv. Ten se váže do druhého místa splicingu a zamezuje tak čtení výše zmíněného stop kodonu. deleci báze (např.221). která však v genech pro tyto mRNA chybí. Tento proces. C za U. tj. DSX-M protein (male specific DSX protein). (SL)RNA je kódována v samostatném genu a k mRNA každého genu připojena mechanismem trans-splicingu. obratlovců. Tento mechanismus je velmi podobný cis-splicingu. leaderovou sekvenci (SL)RNA. je záměna nebo vymazání některých bazí v řetězci. V druhém případě se jedná o regulaci splicingu tzv. V případě samečka dojde k vazbě splicingového faktoru U2AF a odhalení stop kodonu.

Editační aktivita je zaručena specifickou aktivitou enzymu citidin deaminázy. Tyto enzymy se váží pouze do specifických míst. viz. pro glutamátový receptor v nervové tkáni (záměna A na I deaminací . Strana 65 . transformující C na U deaminací. Tento způsob editace výrazně zvyšuje variabilitu proteinů a napomáhá existenci řady izoforem stejného proteinu. Obdobný mechanismus je zdokumentován např. které provádějí tuto substituci se nazývají ADAR1 a 2 (adenosine deaminases acting on RNA). další kap.. Tento způsob editace se nazývá substituční.222). I je modifikovaná báze inosin. Enzymy.:Molekulární biologie UAA na apoB-100 mRNA a tím odlišného produktu. které jsou tvořeny dsRNA vznikající mezi komplementárními sekvencemi exonu a intronu (Obr. která je překládána jako G).Studijní opory biologie Malý J.