Acción de la enterotoxina citotóxica en la patogénesis

REPORTE
de Aeromonas hydrophila
# Rosabel Falcón1, Hernándes F Carvalho2, Paulo Pinto2,
Maria S V Gatti2, Tomasa Yano2
1
Departamento de Bacteriología-Micología, Microbiología,
Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”
Autopista Novia del Mediodía Km 61/2, PO 601, Marianao, Ciudad de La Habana, Cuba
E-mail: rosabel@ipk.sld.cu; Fax: (53 7) 24 6051
2
Departamentos de Biología Celular, Histología y Embriología, Microbiología e Inmunología,
Instituto de Biología, Universidad Estatal de Campinas, Sao Pablo, Brasil
RESUMEN
La enterotoxina citotóxica (Ent-ctx) de Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) se caracteriza por sus múltiples
actividades biológicas, entre las que se destacan su capacidad hemolítica, citotóxica y enterotóxica. Catalogada
como el principal factor de virulencia asociado con la enteropatogénesis de Aeromonas, poco se conoce sobre los
mecanismos de acción de esta toxina que desencadena enfermedades gastrointestinales asociadas con esta
especie. En el presente estudio se pretende profundizar en la caracterización de las alteraciones morfológicas e
intracelulares causadas por la Ent-ctx de A. hydrophila en las células epiteliales intestinales humanas, así como
verificar las vías activadas por esta toxina para la inducción del efecto citotóxico. Los ensayos de la actividad
citotóxica de la Ent-ctx mostraron una rápida cinética de actuación sobre las células HT29 y Caco-2. Las alteraciones
morfológicas intracelulares fueron drásticas e irreversibles; la dosis letal citotóxica es 5 µg/mL. Los análisis
microscópicos revelaron una intensa vacuolización citoplasmática, condensación cromatínica y nuclear, así como
la formación de fragmentos con contenido citoplasmático y nuclear. La fragmentación del ácido desoxirribonucleico
(ADN) se confirmó mediante técnicas electroforéticas (gel de agarosa al 2%) e inmunocitoquímicas (TUNEL). Por
medio de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) se confirmó que no existe ninguna asociación
entre los genes responsables de la enteropatogénesis en la Escherichia coli y la muestra de A. hydrophila
productora de la Ent-ctx. La interpretación de los resultados permitió afirmar que la enterotoxina induce apoptosis
en las células epiteliales intestinales humanas. Este análisis contribuye de manera significativa a la comprensión
de los mecanismos intracelulares posiblemente activados por esta toxina, que causan la muerte celular.

Introducción
La Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) se considera
entre los principales agentes enteríticos. Ampliamente
distribuida en la naturaleza, esta especie es capaz de
producir infecciones en peces y anfibios de interés
comercial, lo cual causa importantes pérdidas en la
esfera económica [1]. Se estima que la A. hydrophila
es uno de los más frecuentes microorganismos causales
de trastornos intestinales, como cuadros clínicos
diarreicos en los seres humanos a partir de intoxica-
ciones por alimentos y/o ingestión de aguas
contaminadas [2, 3]. Este microorganismo puede
trasmitirse, además, a través de heridas abiertas, y
actuar como oportunista, principalmente en hospede-
ros inmunológicamente debilitados [4].
La enterotoxina citotóxica (Ent-ctx) sintetizada
por esta especie, posee la capacidad de lisar
eritrocitos, provocar daños irreversibles en diversas
líneas celulares, inducir acumulación de fluidos en el
intestino de diferentes modelos animales y llegar a
ser letal cuando se inocula por vía intravenosa.
Reconocida como el principal factor de virulencia
asociado con la entero-patogénesis de la Aeromonas
[5, 6], poco se conoce acerca de los mecanismos por
los cuales esta toxina actúa en los enterocitos y
desencadena las enfermedades gastrointestinales
asociadas con esta especie.
Con el objetivo de ofrecer evidencias actualizadas
al respecto, este trabajo pretende profundizar en el
estudio y caracterización de los mecanismos de acción
de la Ent-ctx de la A. hydrophila en las células
epiteliales intestinales humanas.
Materiales y métodos
Para la obtención y purificación de la Ent-ctx, se utilizó
una cepa de A. hydrophila (AH191) aislada de leche
contaminada, proveniente de la Fundación André
Tosello, Campinas, SP, Brasil [2]. La caracterización
del efecto citopático inducido por la toxina purificada
se realizó en las líneas celulares de origen epitelial
intestinal, HT29 y Caco-2. Para evaluar las dimen-
siones de este efecto, se hicieron análisis microscópicos
y diferentes ensayos biológicos que comprendieron la
determinación de la dosis letal citotóxica [7], el estudio
de la cinética del efecto citopático y la comprobación
de la inducción de apoptosis, con el empleo de técnicas
electroforéticas e inmunocitoquímicas [8]. La presencia
de genes responsables de la enteropatogenicidad en
Escherichia coli (ST, LT, VT) en la muestra productora
de la enterotoxina de A. hydrophila, se investigó por
medio de técnicas de reacción en cadena de la
polimerasa (RCP) [9].
Resultados y discusión
Muchos estudios han demostrado que la enteroto-
xina citotóxica de la A. hydrophila provoca daños en
las células de los mamíferos [6, 10, 4]. Estas
alteraciones pueden causar la pérdida de iones y
pequeñas moléculas y ocasionar afectaciones en el
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525-31.

# Autor de correspondencia
253
Reportes Reports

metabolismo celular [11, 12]. Los resultados de este 40

trabajo demostraron que la enterotoxina citotóxica de
A. hydrophila causó alteraciones morfológicas en las
35
células epiteliales intestinales humanas. Los análisis
microscópicos revelaron una intensa vacuolización
citoplasmática, así como la perdida de la junción 30

Muerte celular por apoptosis (%)

celular, una condensación cromatínica y nuclear, así
como la formación de fragmentos con contenido 25
citoplasmático y nuclear. Similares alteraciones
morfológicas se observaron al ensayar esta toxina en
fibroblastos de pulmón [10]. En nuestros experi- 20
mentos además se observó que la Ent-ctx causa intensa
picnosis, fragmentación nuclear e internucleotídica de 15
ADN [8]. El porcentaje de células apoptóticas
presentes en las células epiteliales intestinales
tratadas con la Ent-ctx fue seis veces mayor que en 10
las células controles (ver tabla). Los ensayos de
actividad citotóxica mostraron una rápida cinética de 5
actuación (1 h) de esta toxina sobre las diferentes
líneas celulares evaluadas, por lo que causa un efecto
drástico e irreversible (ver figura). La dosis letal
citotóxica obtenida fue de 5 µg/mL. Los aspectos 0 01 02 03 04 05 06
morfológicos observados y la confirmación de la
Tiempo (h)
fragmentación nuclear permitieron afirmar que la
enterotoxina citotóxica de A. hydrophila induce
Figura. Cinética de la muerte celular (%) mediante apoptosis inducida por la enterotoxina citotóxica de
apoptosis en las células epiteliales intestinales Aeromonas hydrophila. La cuantificación se realizó con el empleo del ensayo inmunocitoquímico de TUNEL.
humanas. Estos resultados confirman que la Ent-ctx,
al igual que otras toxinas bacterianas (“Shiga-toxin”,
La realización de este trabajo permitió describir
verotoxina de E. coli) son inductoras de procesos
detalladamente aspectos relacionados con las alteraciones
apoptóticos que provocan la muerte celular, lo cual
morfológicas e intracelulares provocadas por la Ent-ctx
pudiera interpretarse como un posible mecanismo de
de A. hydrophila en células epiteliales humanas, lo cual
defensa del microorganismo bacteriano o una vía de
demuestra que esta toxina, además de sus propiedades
acceso para la invasión y posterior replicación [13,
biológicas, es capaz de inducir la muerte celular mediante
14]. No obstante, la técnica de RCP no reveló ninguna
apoptosis. La interpretación de estos resultados
asociación entre los genes responsables por la
contribuirá a enriquecer los conocimientos acerca de los
enteropatogénesis en E. coli y la muestra de A.
mecanismos de acción de las toxinas formadoras de
hydrophila utilizada en estos experimentos.
poros, que causan efectos citotóxicos irreversibles en
diferentes líneas celulares. También se podrá dilucidar
Table. Porcentaje de células apoptóticas en células la posible función de la Ent-ctx en las enfermedades
epiteliales intestinales cuantificadas con el empleo de
gastrointestinales asociadas con esta entidad bacteriana.
la técnica de Feulgen.
Células HT29
Células
apoptóticas (%)
Desviación
estándar
Agradecimientos
Control celular A Ana Stella Menegon y a Ana Lúcia Rodrigues por la
2.197 1.21
(sin tratamiento) asistencia técnica brindada y a la Fundación de Amparo
Células tratadas
19.565 5.12
a Investigaciones, del Estado de Sao Paulo (SP, Brasil),
con la Ent-ctx por el financiamiento para la realización de este trabajo.

9. Blanco M, Blanco JE, González EA, Mora A,
Jansen W, Gómez T, Zerbini LF, Yano T, Pestana
de Castro AF, Blanco J. Genes encoding for
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flexeri in vitro undergo a rapid cytolytic event
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259 Biotecnología Aplicada 2004; Vol.21, No.4