LABORATORIO I

MICROSCOPIA

LISSET LORENA PICON FLOREZ

COD: 1090416160

UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
FACULTAD DE SALUD
TERAPIA OCUPACIONAL
2010
 LABORATORIO I
MICROSCOPIA

LISSET LORENA PICON FLOREZ

COD: 1090416160

DOCENTE
CLAUDIA LEIVA

UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
FACULTAD DE SALUD
TERAPIA OCUPACIONAL
2010
 TALLER DE LABORATORIO DE BIOLOGIA

Cuales serán los poderes de resolución de los objetivos 4X y 10X

R= 640 R= 32
--------------- ___________
2 x 0.10 2x

R = 32 R=

UNIDADES DE MEMDIDAS UTILIZADAS EN MICROSCOPIA SIMPLE

De acuerdo con el poder de aumento y la resolución que posee su microscopio,

las unidades de medida que se utilizaran normalmente son el milímetro (mm) y
el micrómetro (µm).

EQUIVALENCIAS
1 mm = 1.000 µm
1 µm = 0.001 mm
1 mm = 1 000 000 nm
RESPONDA:
RESPONDA:

¿Cuantos µm caben en 20 mm? 20000 µm_______

1 ----------- 1000 µm
20mm ----- X

1000 x 20
------------- = 200000 µm
1
¿Cuantas veces es menor 1 µm que 1 mm? Es 1000 veces menor

¿Cuantas veces es mayor 0.674 mm que 1 µm? Se divide 0.674 mm por la

equivalencia de 1 µm que es igual a = 0.001 mm

¿Si se supone que el diámetro de 1 grano de polen es de 0.05 mm; cuantos

cabrán en 2600 µm y en 10 mm? En 2600 µm caben 52 veces En 10 mm,
caben 200 veces.

PROCEDIMIENTO:
2600 µm x 0.001 mm 1 0.005 mm 2.6mm
= 2.6 mm x 2.6 mm = 52
0.005 mm
1 0.005 mm 10 mm
x 10 mm = 200
0.005 mm

Ordene los microorganismos A, B, C en orden ascendente según su tamaño:

A: 130 µm; B: 0.006 mm; C: 54.000

Para facilitar el cálculo, convierta todos los varones a una misma unidad y
luego ordenes. B, A , C.

A: 130 µm 130 µm x 0.001 mm = 0.013 mm

B: =0.006 mm
C: 54.000 mm su equivalencia en mm es = 0.054 mm
 LABORATORIO I
MICROSCOPIA

LIZETH JOHANA VILLAFAÑE HENANDEZ

COD:1090408364
LISSET LORENA PICON FLOREZ
COD:1090416160

UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
FACULTAD DE SALUD
TERAPIA OCUPACIONAL
2008
 LABORATORIO I
MICROSCOPIA

LIZETH JOHANA VILLAFAÑE HENANDEZ

COD:1090408364
LISSET LORENA PICON FLOREZ
COD:1090416160

DOCENTE
CLAUDIA LEIVA

UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
FACULTAD DE SALUD
TERAPIA OCUPACIONAL
2008
 PRINCIPIOS FISICOS DE MICROSCOPIA DE LUZ

Microscopio Óptico(MO)

El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que se sirve de la

luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico
más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas
lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan
microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se
consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar
un objeto por encima de las 2.000 veces

El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el

ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está
compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto
examinado. Las lentes de los microscopios están dispuestas de forma que el
objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a través del
ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real. El aumento total
del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de
lentes.

El equipamiento adicional de un microscopio consta de un armazón con un

soporte que sostiene el material examinado y de un mecanismo que permite
acercar y alejar el tubo para enfocar la muestra. Los especimenes o muestras
que se examinan con un microscopio son transparentes y se observan con una
luz que los atraviesa, y se suelen colocar sobre un rectángulo fino de vidrio. El
soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se encuentra un
espejo que refleja la luz para que atraviese el espécimen. El microscopio puede
contar con una fuente de luz eléctrica que dirige la luz a través de la muestra.
Los MO actuales tiene un poder resolutivo de 0,2 µm, unas mil veces la del ojo
humano.

Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado): El material a

observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el
contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera

Célula de Pisum, Traqueidas del leño de Pinus

coloración: safranina-fast-green Coloración: safranina

Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La luz

pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente
coloreados

El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un

cono hueco concentrado sobre el espécimen. El campo de visión del objetivo
se encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz que se
refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espécimen aparecen como
un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen
como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza para
analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con
iluminación normal.
Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el
contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear.
Es ideal para especimenes delgados, o células aisladas. El
microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz,
como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el
microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el
campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de
anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase
de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca
variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen
transparente, haciéndolo visible. Este tipo de microscopio es muy útil a
la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia
en biología y medicina

Nomarski, microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC).

Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como
si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue diseñado para
observar relieves de especimenes muy difíciles de manejar, es muy utilizado en
los tratamientos de fertilización in-vitro actuales. DIC se usa cuando el
espécimen es muy grueso para usar contraste de fases

Células epiteliales 200X

Microscopía de fluorescencia: una sustancia natural en las células o un
colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz,
emitiendo parte de la energía absorbida como rayos luminosos: esto se conoce
como fluorescencia. La luz fluorescente de mayor longitud de onda se observa
como si viniera directamente del colorante.

Células epiteliales , triple coloración: núcleo (azul), microtubulos (verdes),

actina (rejo). 200X (izq.) y 1000X (der.).
 TIPOS DE MICROSCOPIA

Un microscopio es, básicamente, un sistema óptico que transforma un objeto

en una imagen, la cual amplifica (magnifica) detalles característicos del objeto.

Con el microscopio de luz se resuelven detalles del orden del micrón, mientras
que con el microscopio electrónico se alcanzan a resolver objetos del orden de
los angstrom.

En el microscopio electrónico, un haz de electrones incide sobre una muestra y

de la interacción de estos electrones con los átomos de la misma, surgen
señales que son captadas por algún detector o bien, proyectadas directamente
sobre una pantalla.

Dentro de la familia de microscopios electrónicos, se encuentran el microscopio

electrónico de transmisión (TEM) y el microscopio electrónico de barrido (SEM).
Cada uno de ellos, permite el estudio de diferentes características de una
muestra. El SEM provee información sobre morfología y características de la
superficie, mientras que con el TEM podemos observar la estructura interna y
detalles ultraestructurales.

Un gran avance se ha alcanzado con la incorporación de técnicas de

procesamiento de imágenes para revelar detalles específicos de interés,
algunos de ellos ligados a la ultraestructura de la muestra.

COMPARACION ENTRE MICROSCOPIOS DE LUZ Y ELECTRONICO

Los microscopios de luz y electrónico son esencialmente, idénticos. Tanto uno

como otro nos permiten amplificar aquellos objetos que son indistinguibles a
nuestro ojo. La diferencia fundamental entre los dos es la fuente de
iluminación. Mientras el microscopio de luz utiliza un haz de luz en el rango de
las longitudes de onda del visible, el microscopio electrónico emplea un haz de
electrones de muy corta longitud de onda que permite obtener una mayor
resolución.

Una tabla comparativa, entre ambos microscopios se muestra a continuación.

Cabe destacar que la misma, involucra características generales de los
microscopios electrónicos y no considera las diferencias particulares entre TEM
y SEM.
 MICROSCOPIO MICROSCOPIO
DE LUZ ELECTRONICO
Iluminación Haz de luz Haz de electrones
Longitud de 2000 Å - 7500 Å 0.037 Å - 0.086 Å
onda
Lentes Vidrio Electromagnéticas
Medio Atmósfera Vacío
Resolución 2000 Å 3Å
Magnificación 10 x - 2000 x 100 x - 450000 x
Focalización Mecánica Eléctrica
Contraste Absorción - Reflexión Scattering

RESOLUCION

El concepto de resolución está relacionado con la capacidad de distinguir

detalles finos en una imagen. En otras palabras, es la distancia mínima r 1 a la
cual podemos distinguir, claramente, dos puntos como entidades separadas.

La resolución teórica del microscopio electrónico es:

Para valores de  = 0.037 Å y  = 0.1 radianes, la resolución nominal es 0.2 Å.

NATURALEZA DE LAS ONDAS DE ELECTRONES

De Broglie mostró que una partícula moviéndose a una velocidad cercana a la

de la luz tenía una forma de radiación asociada con ella. Esta relación está
expresada por:

donde  es la longitud de onda, h la constante de Plank, m la masa de la

partícula y v su velocidad.

Si la partícula es un electrón y su velocidad 1/3 de la velocidad de la luz, =

0.05 A. que es 100.000 veces más corta que la luz verde. Por lo tanto, la
resolución de un microscopio que emplee este tipo de radiación será mucho
mejor que la de un microscopio de luz.
La naturaleza precisa de estas ondas de electrones es difícil de entender en
términos de la física clásica y su descripción se hace mediante la mecánica
cuántica.

Las ondas de electrones se pueden pensar como un quantum o paquete de

radiación que acompaña a cada electrón en su trayectoria, es parte de él y
permanece con él. Las características de estas ondas dependen de la posición
exacta de un dado electrón en el espacio y en el tiempo; puede expresarse
como la probabilidad de encontrar al electrón en esa posición.

Las ondas de electrones no deben confundirse con radiación electromagnética,

como la que se produce cuando un haz electrónico interactúa con la materia,
pierde energía y produce una radiación cuya longitud de onda pertenece al
espectro electromagnético.

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION

EL INSTRUMENTO

El sistema óptico-electrónico del microscopio electrónico de transmisión está

constituido por las siguientes partes:

1. Cañón de electrones
2. Sistema de lentes
3. Pantalla fluorescente

Estos componentes están ensamblados en una columna vertical la cual se

encuentra en alto vacío.

El cañón de electrones, es la fuente emisora del haz de electrones. Se

encuentra ubicado en la parte superior de la columna. Está constituido por un
filamento (cátodo), un cilindro con una apertura central, llamado cilindro de
Wehnelt que rodea al filamento y tiene un potencial ligeramente más negativo
que éste. El ánodo se encuentra por debajo del cilindro de Wehnelt.

El filamento es calentado por el pasaje de corriente (alrededor de 2800 K). Los

electrones emitidos termoiónicamente por el cátodo son acelerados hacia el
ánodo, pasan por la apertura circular central de éste y un haz de alta energía
es emitido hacia la columna del microscopio.

El sistema de lentes está formado por lentes condensadores objetivos,

intermedios y proyectores. Las lentes condensadoras, en los microscopios,
más modernos son dos. La primera, proyecta la imagen punto de
entrecruzamiento demagnificada (spot size), mientras que la segunda controla
su diámetro y el ángulo de convergencia en que incide sobre la muestra. limita
al haz que incide sobre la muestra.
La lente objetivo forma la primera imagen, localizada debajo del especímen. Es
considerada el componente más importante del microscopio electrónico.
Cualquier defecto en ésta, será magnificado y transmitido al resto del sistema
óptico. Por lo tanto, de ella dependen, en gran medida, la resolución final y la
corrección de las aberraciones.

Las lentes intermedia y proyectora son las encargadas de amplificar la imagen

dada por la lente objetivo y proyectarla sobre la pantalla fluorescente.

La pantalla del microscopio electrónico de transmisión está recubierta por una

pintura de fluoruros de Zn y Cd, que fluoresce cuando es bombardeada por
electrones, generando una imagen en el rango de las longitudes de onda del
visible.

Mediante el microscopio electrónico de transmisión podemos estudiar la

ultraestructura de un material orgánico oinorgánico. Para esto, existen
diferentes formas de operación que posibilitan el estudio de una característica
en particular. Entre las aplicaciones del TEM para el estudio de materiales no-
biológicos y biológicos podemos nombrar :

1. Determinación de estructura cristalina en minerales,

metales, etc.
2. Estudio de catalizadores.
3. Determinación de impurezas, precipitados,etc.
4. Identificación de bordes de grano e interfaces en metales.
5. Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.
6. Determinación de tamaño de partícula en catalizadores,
minerales,etc.
7. Identificación de planos cristalinos.
8. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes
tratamientos térmicos.
9. Realización de estudios de histoquímica para identificar
compuestos específicos.
10. Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales.
11. Reconocimiento de virus.
12. Estudios de citoquímica.
 13. Estudios de estructuras moleculares.

MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO (SEM).

El microscopio electrónico de barrido (SEM) es similar al microscopio

electrónico de transmisión. Ambos tienen ciertas características comunes tales
como un cañón de electrones donde se genera el haz de electrones, lentes
condensadoras y objetivo, sistema de vacío. La diferencia principal entre ellos
es la manera en que forman y magnifican la imagen. Esto hace que la
información que se obtenga de cada uno sea distinta. Mientras el TEM permite
el estudio de la ultraestructura de muestras delgadas, el SEM posibilita conocer
la morfología superficial.

En el microscopio electrónico de barrido, el haz electrónico, atraviesa la

columna y llega a la muestra. Un generador de barrido es el responsable de
producir el movimiento del haz , de manera que barra la muestra punto a punto.
De la interacción entre los electrones incidentes con los átomos que componen
la muestra se generan señales, las cuales pueden ser captadas con detectores
adecuados para cada una de ellas. El detector capta una señal y las convierte
en una señal electrónica que es proyectada en un tubo de rayos catódicos
(CRT).

El barrido del haz está sincronizado con el barrido del CRT y produce una
relación uno a uno entre puntos de la muestra y puntos en el CRT.

Un esquema del SEM se muestra en la siguiente figura.

Mediante el SEM se estudian:

1. Morfología superficial de minerales, catalizadores, etc.

2. Electrodepósitos
3. Adherencia fibra-matríz en polímeros.
4. Cambios morfológicos de materiales sometidos a tratamientos químicos.
5. Formas de cristalización de minerales.
6. Control de calidad de catalizadores industriales.
7. Morfología superficial interna de partículas poliméricas.
8. Morfología de tejidos u órganos animales y vegetales.
 9. Estudio de moléculas
10. Reconocimiento de fósiles.

INTERACCION HAZ INCIDENTE - MUESTRA EN EL SEM.

Naturaleza de la interacción: Cuando el haz de electrones choca contra la

muestra, ocurren interacciones entre dichos electrones y los átomos que
componen la muestra. De allí surgen señales tales como: electrones
secundarios, electrones retrodifundidos, rayos x característicos, electrones
Auger, catodoluminiscencia. Todas estas señales se producen
simultáneamente pero cada una de ellas es captada por detectores diferentes.

Uno de los detectores más comunes es el de electrones secundarios. Los

mismos son emitidos desde la muestra como consecuencia de las
ionizaciones surgidas de las interacciones inelásticas. Por esta razón, poseen
baja energía (50 ev). Ellos brindan una imagen de la morfología superficial de
la muestra.

UNIDADES DE MEDIDA EN MICROSCOPIA

La unidad que se usa en microscopía de luz es el micrón (µ) que es la milésima

parte del milímetro.

En microscopía electrónica la unidad más conocida es el angstrom (Å), definido

como la diez millonésima parte del milímetro. También se emplea el
manómetro (nm), que es la millonésima parte del micrón.

1 mm = 103 µ = 106 nm = 107 Å

Así, por ejemplo, la resolución de un microscopio de luz es 0.25 µ ó 2500 Å ; y

la de un microscopio electrónico de 2.5 Å

PEQUEÑA GALERÍA DE IMÁGENES DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Vista general de un piojo

(20X).(1cm=300 micras)
 Detalle de ala de
mariposa (220X).
(1cm=30 micras)

Detalle de bacterias
(bacilos) a 10000X.
Las bacterias miden
aproximadamente una
micra.

Detalle de fibras de
algodón (600X). (1cm= 10
micras)

Detalle de epidermis de Micrografía electrónica de

semilla de justicia. Transmisión de un
Fotografía tomada con el polímero. (1cm=0.2 micras)
microscopio electrónico
de barrido. (1cm=10
micras)
 BIBLIOGRAFIA

• www.itg.uiuc.edu/technology/atlas/microscopy/images/20x_dic.tif
• www.itg.uiuc.edu/technology/atlas/microscopy/images/100x_fluor.tif
• http://www.biologia.edu.ar/microscopia/microscopia1.htm
 INTRODUCCION

En este trabajo, se pretende ampliar el conocimiento el conocimiento de la

microscopia;, por medio de revisión bibliografía, relacionada con los
principios físicos de microscopia de luz y otros tipos de microscopia que me
permitan mas conocimiento y cumplir con los objetivos de la materia.
 CONCLUSION

Gracias a las revisiones bibliográficas, se pudo obtener información de los

principios físicos de la microscopía y otros tipos de la microscopía de luz.