Ingeniería Genética I 2010

Ingeniería Genética
• ¿Qué significa “clonar” un gen y obtener DNA  “recombinante” en comparación con clonar por ej. una planta y la recombinación homóloga? • Diferencias entre recombinación homóloga y  recombinación ilegítima • Herramientas originales: endonucleasas de  restricción (+ ligasas) y retrotranscriptasas; luego  PCR

Hay 4 clases de recombinación
Recombinación homóloga: intercambio de material genético entre dos moléculas de ADN que comparten una alta identidad entre sí. Es lo que ocurre durante la meiosis (crossing-over), la recombinación entre fagos o la conjugación bacteriana por ejemplo (¿lo recuerdan?) Recombinación sitio específica: implica el intercambio de material genético en sitios muy específicos (con una secuencia determinada); son ejemplos la integración del fago Lambda para generar el profago y los rearreglos cromosomales que general la diversidad de anticuerpos. Transposición: Lo veremos en una clase dedicada Recombinación ilegítima: un número importante de casos de intercambio de ADN que no pueden incluirse en alguna de las categorías anteriores.

Plásmidos

a) Sin plásmido

Dilución y selección Dilució selecció b) plásmidos en = célula plá cé La proporción de proporció bacterias que incorporan un plásmido es baja plá Hay incompatibilidad

Se producirían 4 tipos de células que tenemos que diferenciar: a)Sin plásmido b)Varios plásmidos en = célula c)Recombinantes (distintas) d)No recombinantes

c) Muchos recombinantes distintos

b) plásmidos en = célula vs colonias superpuestas

d) ¿Cómo eliminar los plásmidos vacíos (no recombinantes)? Vectores plasmídicos Antiguos (pBR322) Vectores  plasmídicos modernos d) ¿Cómo eliminar los plásmidos vacíos (no recombinantes)? Clonar un gen significa aislarlo y amplificarlo .

análisis de funciones génicas Ligación Transformación. etc Representación en una genoteca Q = (1 – 1/n)N P=1–Q P = 1 – (1 – 1/n)N Q: probabilidad de que un clon no esté representado P: probabilidad de incluir una dada secuencia N: número de clones analizados (screened) n: relación entre el tamaño del genoma y el del clon promedio “Genomic Libraries” Genotecas N = ln (1-P) / ln (1-1/n) P: probabilidad de incluir una dada secuencia N: número de clones analizados (screened) n: relación entre el tamaño del genoma y el del clon promedio (Número total de clones necesarios para cubrir el genoma sin superposición ) “cDNA Libraries” clonotecas N = ln (1 – P) / ln (1 – m/T) P: probabilidad de que cada ARN esté representado N: número de clones independientes analizados m: número de moléculas de un ARNm raro en una célula T: número total de moléculas de ARNm por célula (1 – 1/n)N = 1 – P ln (1 – 1/n)N = ln (1 – P) N = ln (1-P) / ln (1-1/n) .) ADN (genoteca) Restricción Completa o parcial Vectores (cDNA: plásmidos. empacado in vitro. estudios sobre promotores. etc “screening” de las colonias buscadas Amplificación y conservación a largo plazo •usos: análisis genómico. postivos indep. PAC. cósmido.Células/tejido ARNm (clonoteca) cDNA(metilación. TAC) “Genomic Libraries” Genotecas •Se parte de ADN genómico •frec. BAC. clonado posicional. fago λ Genómico: fago λ. YAC. expresión •puede contener promotores e intrones •problema para expresar en sistemas heterólogos “cDNA Libraries” clonotecas •Retrotranscripción del ARN •Dependiente •sin promotores o intrones Fraccionamiento Restricción ? •posible expresar si se coloca promotor adecuado •usos: estudios de regiones codificantes. etc. adición de linkers.

origen de replicación que funciona durante la replicación del ADN Fue una importante herramienta para mapear genomas complejos Bacteriofago P1 PAC (P1derived artificial chromosome) TAC (Transformable artificial chromosome) Máximo cerca de 100 kb Similar al BAC Problemas: quimeras. coli) y origen Ri (copia única en Agrobacterium tumefaciens) Elementos esenciales: centrómero. más estable Plásmidos bacterianos Vectores para clonotecas Vector Tamaño inserto comentarios Capacidad máxima no limita a ARNm (8kb) empaquetamiento eficiente Bueno para estudiar genes individuales En general se usa el vector de inserción Más representativo que clonotecas de plásmidos Subclonados y pasos siguientes más complicados que con clonotecas de plásmidos Fago lambda Hasta 20-30 kb Fago lambda 20-30 kb (reemplazo) 10-15 kb (inserción) Cósmido 35-45 kb 10-15kb Fósmido Similar al cósmido Fácil de transformar E coli.Vectores para genotecas Vector YAC (yeast artificial chromosome) Vectores para genotecas Vector BAC (bacterial artificial chromosome) Tamaño inserto 230 . Bajo nro de copia. pero no tan eficiente como lambda a gran escala Menos representativo que clonotecas de fagos Subclonados y pasos siguientes se simplifican .1700 kb (largo de un cromosoma de levadura) Promedio: 400-700 kb comentarios Se propaga en Saccharomyces cerevisiae Tamaño inserto Hasta 300 kb Promedio:100 kb comentarios Plásmido conteniendo el origen de replicación del F. PAC. Útil para subclonar insertos de YAC. usa el empaquetamiento de éste Se propaga en E. puede llevar 78105% del genoma del fago En general se usa el vector de reemplazo Brazos predigeridos se pueden comprar Bueno para estudiar genes individuales Plásmido contiene sitio cos del λ. para transformar plantas Vectores para genotecas Vector Tamaño inserto comentarios Genoma del fago ~ 48kb empaquetamiento eficiente. etc. coli como un plásmido. Una copia por bacteria Versión reducida de genoma de fago genoma de P1 de 110 kb empaquetamiento eficiente sitio PAC de reconocimiento y clivaje replicón de P1 y replicón lítico inducible sitio loxP para Cre Combinación de características de BAC y PAC Con origen P1 (copia única en E. telómeros que marcan el final del cromosoma. inestabilidad (rearreglos) Similar al P1 Con los bordes del T-DNA. Contiene sitio cos del λ y el origen de replicación del plásmido F. BAC.

. el receptor del fago f1. esta cepa es supresora de forma tal que los fagos helper f1 que llevan una mutación ambar pueden empaquetar DNA •El λ ZAP contiene las señales de iniciación y terminación para el empaquetamiento por el f1 flanqueando al pBluescript •Segundo huésped: SOLR. fago f1 no se propaga. cepa resistente al fago λ previene la propagación del mismo. cepa no supresora.λZAP Library (Stratagene) Escisión del plásmido pBluescript • Primer huésped: cepa XL1-Blue MRF’: plásmido F’ provee el pili del F.

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Cósmidos BACmidos o BAC El fago P1 como vector .

Cromosomas  artificiales de  levaduras  (YAC) Aislamiento y Amplificación in vivo (clonando) e in  vitro (PCR) Conozco los vectores ¿Qué hay de los insertos? Puedo preparar insertos específicos utilizando PCR y “primers” cuando la secuencia es conocida o utilizar regiones conservadas y “primers degenerados”. Ventajas? Desventajas/cuidados? . Puedo agregarle sitios de restricción a los “primers” o emplear vectores T.

jpg 05_02_2.05_02. dATP.jpg RNAm Construcción de Clonotecas Síntesis de la primer cadena AAAAAAAA TTTTTTTTGAGCTC CH3 CH3 Primer cadena de cDNA + Linker-primer. dGTP. dTTP CH3 • linker-primer: transcripción reversa. transcriptasa reversa + 5-methyl dCTP. sitio de restricción (XhoI) • 5-methyl dCTP: proteje sitios internos .jpg 05_02_3.

. dNTPs RNase H: remueve mRNA en híbridos DNA-RNA DNA Polymerase I: sintetiza 2da cadena Al degradar el ARN.. esta parte. la RNAsa H deja residuos de ARN que funcionan como primers para iniciar la síntesis de ADN DNA Polymerase 1 rellena los gaps por nick translation CH3 +XhoI AATTC. se hace por PCR ...... G.G TTTTTTTTGAGCTC... CH3 CH3 CH3 AAAAAAAAC TTTTTTTTGAGCT Adaptador EcoRI y linker XhoI: clonado direccional También puedo combinar cDNA y PCR 3) Diseño de iniciadores (primers) específicos PCR Hoy en día.. G. CH3 CH3 CH3 AAAAAAAACTCGAT..Síntesis de la segunda cadena Segunda cadena de cDNA Agregamos adaptadores AATTC..CTTA AAAAAAAACTCGAT TTTTTTTTGAGCTC CH3 CH3 Primer cadena de cDNA + RNase H + DNA polymerase I.

Construcción de genotecas de insertos grandes en vectores lambda Vector Charon 40 (capacidad: 9 . vectores de expresión.23 kb) cos “Screening” de los clones de interés ¿Cómo clonar una aguja en un pajar (un gen entre 30. Coli K802 (rec A-) •Microinjección Screening por complementación funcional en levaduras Screening por complementación funcional en levaduras Mutante de levadura deficiente en una función de interés Saccharomyces cerevisiae es un sistema eucariota simple Fácil de cultivar y manipular genéticamente Contamos con mutantes. hybrid cells: J640-51) J640Isolate chromosomes by flow-sorting flowPurify chromosomes using described protocol Partial digest with MboI / dephosphorylate BamHI (1) Nae 1 (2) PEG precipitation (3) Phenol.g. Por hibridización si contamos con fragmentos del gen o de los homólogos Por ensayos funcionales: •Complementación funcional en levaduras cos L arm Polystuffer R arm cos BamHI BamHI Plaqueo y screening defagos conteniendo fragmentos de interés Ligar Ba Ba Empacar y amplificar en E. inducible .000 o 103 nucleótidos entre 109) ? L arm BamHI Polystuffer BamHI R arm cos SOURCE DNA FOR CLONING Grow cell (e. o hay genes homólogos o tenemos información sobre la secuencia proteica. etc Una clonoteca del organismo de interés en un vector apto para levaduras cDNA se expresa por un promotor de levaduras. protocolos de transformación. chloroform extraction (4) Ethanol precipitation (5) BamHI Por abundancia relativa Por su producto de expresión: clonotecas de cDNA de expresión Por PCR o hibridización si hay información sobre la secuencia del gen blanco.

Screening por complementación funcional en levaduras Necesitamos de un vector apropiado El mutante se complementa cuando el gen se expresa Ejemplo: clonado de un canal de potasio Mutante transformante Medio no inductor Medio inductor Medio rico en potasio Medio pobre en potasio ¿Cómo  clonaron el  centrómero? .

Identificación: Hibridación diferencial Por su producto de expresión: clonotecas de cDNA de expresión Si se dispone de anticuerpos: El producto de expresión se identifica por reconocimiento antígeno-anticuerpo Tambien podríamos producir proteína recombinante. aunque probablemente necesite ser optimizado para máxima producción .

Screening con sondas marcadas .

El resultado de un screening secundario Técnicas de reemplazo alélico = Knock out ¿Cómo llego del cDNA al clon genómico? Marco el cDNA .

Gen X Inserción al azar es más frecuente que reemplazo alélico por recombinación homóloga neoR resistencia a geneticina (G418) tk del virus herpes simplex convierte el análogo de T ganciclovir en un inhibidor de la replicación del ADN Selecc + Selecc - Técnicas de evaluación funcional = knock down .

Herramienta ¿Dónde están? PCR con AttB AttB Seleccionar recombinantes Reemplazo alélico por integrasa/clonasa® reemplaza las ER en los clonados modernos .

Like the quinolones.CcdA and CcdB. the CcdB protein is a poison of the DNA-topoisomerase II complexes. while CcdA acts as an antidote against CcdB . which contribute to the plasmid's high stability by postsegregational killing of plasmid-free bacteria.

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