METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ (HPLC) HPLC este cea mai extinsă metodă cromatografică utilizată pentru

analiza analiţilor compuşi biologic activi, fiecare clasă a acestora fiind testată separat. Spre deosebire de tehnica LC-MS, nu oferă o certitudine 100% cu privire la identificarea analiţilor. Principiul cromatografiei lichide Spre deosebire de cromatografia de gaze în care faza mobilă joacă doar rolul de “cărăuş” în transportul componenţilor prin coloană, în cazul cromatografiei de lichide, faza mobilă participă alături de faza staţionară la procesul de separare prin interacţiuni selective mult mai complexe (Gocan, 2002). Cromatografia lichidă se subclasifică după tipul suportului, în cromatografie cu fază normală (NP-HPLC) şi inversă (RP-HPLC). Sistemele NP-HPLC utilizează o fază staţionară polară (silicagel, alumină, celuloză, Ca(OH)2, MgCO3 ), o fază mobilă nepolară (eter de petrol, hexan puri sau în amestec cu acetonă 1-15%), separarea având la bază adsorbţia diferită a componentelor amestecului pe faza staţionară. Se adresează probelor preponderent nepolare, ordinea de eluţie (caracterizată de timpul de retenţie, tR, al probei pe coloană, exprimat în minute) a componentelor amestecului fiind : tR componente nepolare < tR componente polare În sistemele RP-HPLC, faza staţionară devine nepolară prin legare chimică de octadecilsilan (C18) sau octasilan (C8), ca fază mobilă se folosesc amestecuri de solvenţi polari (acetonitril, metanol, acetat de etil, apă), iar procesul de separare are la bază repartiţia componentelor amestecului între faza staţionară şi eluent. Este indicat în cazul probelor preponderent polare, ordinea de eluţie fiind: tR componente polare < tR componente nepolare (Socaciu, 1997). În prezent, peste 60% din totalul separărilor se realizează prin cromatografia cu fază inversă. Popularitatea acestei tehnici rezidă în faptul că prezintă o universalitate în separarea unor compuşi nepolari, polari şi ionici, incluzând un larg domeniu de mase moleculare şi faptul că optimizarea separărilor se realizează relativ uşor (Gocan, 2002).

După mecanismul de separare, cromatografia poate fi: de absorbţie, de repartiţie lichid-lichid, de schimb ionic, de excluziune sterică (gel-cromatografia) sau de afinitate (interacţiuni hidrofobe, separări chirale). Principalele tipuri de tehnici cromatografice, în funcţie de mecanism, fază staţionară şi mobilă sunt redate în tabelul 1. Tabel 1 Principalele tipuri de tehnici cromatografice
Mecanism 1. Adsorbţie* (CA) 2.Repartiţie LL (CR) 3.Schimb ionic (CSI) 4. Excluziune sterică *** 5.Afinitate** şi Cromatografia gazoasă Interacţiuni hidrofobe 1. Adsorbţie 2. Repartiţie
*** **

Faza staţionară S1, NP-HPLC Si-C8,Si-C18,RPHPLC Schimbători de ioni2 Geluri3(CES) Geluri şi

Faza mobilă Solvenţi preponderent nepolari Solvenţi preponderent polari Soluţii acizi-baze Soluţii tampon4 Soluţii tampon4

Cromatografia de lichide

Hidroxilapatită Oţel sau răşini (GSC) Ar, He, N2 + H2 Uleiuri(GLC) Ar, He, N2 + H2

* Efectuată pe hârtie (CH), strat subţire (CSS), coloană deschisă (CC) şi coloană închisă (HPLC) ** Efectuată pe strat subţire (CSS) sau pe coloană deschisă (CC) şi închisă de oţel (HPLC) *** Efectuată pe coloană deschisă sau închisă de sticlă la presiuni joase (LPLC- Low pressure liquid chromatography)
1 2 3

Vezi faze staţionare răşini schimbătoare de ioni de tip Amberlit, Doriex geluri de tip Sephadex (G50, G100, G200), Sephacryl, cu pori controlaţi

Sursa: Socaciu, 1997 Părţile componente ale unui cromatograf de lichide de înaltă performanţă sunt: pompele ataşate la un rezervor de unde preiau eluentul (faza mobilă), un injector manual sau un autosampler, cuptorul termostatat în interiorul căruia se află coloana cromatografică de separare, degazorul, controller-ul, detectorul şi instrumentul de înregistrare a semnalului furnizat de detector (fig.1).

2). Eluentul. 1. Are loc migrarea. Aria corespunzătoare unui semnal cromatografic este proporţională cu concentraţia substanţei pe care acesta o determină şi această arie se poate măsura cu un integrator. împreună cu substanţa lichidă de analizat este pompat în coloana ce conţine faza staţionară. a componenţilor amestecului de separat de-a lungul coloanei. . deoarece aici este sediul procesului de separare. detectorul preia continuu fluxul de solvent conţinând componentele separate şi transformă semnalul chimic în semnal electric. sau cu un computer. cu viteze diferite. înregistrat sub forma unei cromatograme (fig. La ieşirea din coloană. Schema generală a unui HPLC Coloana cromatografică este componenta cea mai importantă a cromatografului.Fig. 1997). Maximele înregistrate deasupra liniei de bază în cromatogramă poartă numele de picuri şi au forma distribuţiei normale Gauss (Socaciu.

separarea în condiţii izocratice. urmată de analiza propriu-zisă. Cromatograma unui amestec de compuşi analizaţi prin tehnica HPLC În cazul unor amestecuri complexe. 2. Tehnici de extracţie Tehnica HPLC presupune o etapă de prelucrare a probei în care se realizează extracţia şi curăţarea matricei. care implică o singură fază mobilă. este imposibilă. trei sau chiar patru solvenţi. Acest lucru se realizează prin amestecarea a doi. pentru a obţine un gradient de un anumit profil (Gocan. . cât mai ales ca proprietăţi diferite ale acestora. atât ca număr de componenţi. În aceste situaţii se apelează la eluţia cu gradient. în care se modifică faza mobilă în timp. în care analitii vor fi separaţi şi cuantificaţi. Pentru extracţia analiţilor de interes din matrice se folosesc tehnicile LLE (extracţie lichid-lichid).Absorbanta/Absorbance (mAU) 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 10 15 20 25 30 Timp de retentie/Retention time (min) Fig. 2002). după un anumit program. SPE (extracţie în fază solidă) sau SFE (extracţie cu fluide supercritice).

utilizând un solvent care va distruge interacţiunile analit-pat adsorbant. Există patru mecanisme generale de extracţie întâlnite în tehnica SPE: .coloanele schimbătoare de ioni se împart în coloane schimbătoare de anioni şi cationi. Utilizarea cartuşelor SPE implică patru paşi: condiţionarea umpluturii cartuşului.polar . Procedeul se repetă de regulă de 2-3 ori. În acest sens. aplicarea probei prin care analiţii de interes vor fi reţinuţi selectiv pe cartuş. se obţin extracte mai curate şi necesită cantităţi de solvenţi mai reduse.grupările funcţionale utilizate sunt C18.Primele două sunt cel mai frecvent folosite. mai reproductibilă. Metodologia LLE constă în amestecarea a două faze nemiscibile (de obicei una organică şi una apoasă). ciclohexil şi copolimerul stiren-divinilbenzen . calităţi donoare sau acceptoare de H+. C8. fenil. C2. Comparativ cu LLE. în timp ce restul compuşilor vor fi îndepărtaţi. Alternanţa pH-ului are un efect dramatic asupra solubilităţii compuşilor ionizabili. nu şi-a găsit aplicaţii foarte largi. 1998). extracţia în fază solidă SPE are unele avantaje: este mai rapidă. pentru a asigura o extracţie completă. interacţiuni dipol-dipol. O importanţă deosebită prezintă alegerea solventului utilizat în extracţia analitului.schimbător de ioni . în urma căreia analitul de interes este separat de ceilalţi componenţi ai matricei din prima fază şi extras în cea de-a doua fază lichidă.nepolar .grupările funcţionale utilizate sunt: cianopropil. diol şi aminopropil . spălarea cartuşului cu solvenţi care să îndepărteze compuşii nedoriţi adsorbiţi la încărcarea probei. Întrucât SFE necesită echipament specializat. Grupările schimbătoare de anioni pot fi deasemenea puternic schimbătoare (aminele cuaternare) sau slab schimbătoare (aminele primare. . secundare şi terţiare). se va ţine seama de proprietăţile termodinamice ale solventului şi solvatului: polaritate. precum şi de observaţiile analistului din practica experimentală. Grupările schimbătoare de cationi pot fi puternic schimbătoare (derivaţii acidului sulfonic) sau slab schimbătoare (derivaţii acidului carboxilic). eluarea compuşilor reţinuţi pe cartuş. Se ştie că compuşii ionizaţi sunt mult mai solubili in solvenţi polari (în special soluţii apoase) decât compuşii neionizaţi (Fedeniuk şi Shand.

.interacţiunile de tip covalent depind de structura chimică a analitului. Utilizarea mai multor cartuşe SPE cu structuri ale umpluturii diferite a fost aplicată cu succes în pregătirea probei. Acestea. dar timpul de analiză a fost mult mai mare. Cartuşele SPE cu o singură grupare funcţională prezintă dezavantajul că nu pot fi folosite pentru analiza multireziduală. De aceea. s-a încercat folosirea unor cartuşe SPE cu amestec de faze. Dar. Un exemplu ar fi utilizarea derivaţilor boratului pentru extracţia compuşilor cu două grupări vecine hidroxil. principala problemă era aceea că adsorbţia compuşilor era foarte puternică. în unele cazuri ireversibilă. Deşi erau multifuncţionale.-covalent . În acest caz. prezentau avantajul utilizării unui singur cartuş pentru mai mulţi analiţi cu proprietăţi chimice diferite. Principiul extracţiei SPE se bazează pe teoria cromatografiei. 1987). S-a încercat deasemenea crearea unui tip de cartuş SPE care utiliza carbonul grafitic poros (PGC). având capacitatea de a reţine atât analiţi polari cât şi nepolari. particulele umpluturii nefiind distribuite omogen. datorită faptului că extracţiile nu erau reproductibile. dar capacitatea lor de adsorbţie era mai redusă. care combinau grupările nepolare cu cele schimbătoare de ioni (Oka şi col. structura chimică a analiţilor fiind diferită. Alegerea variantei de extracţie a analiţilor se va face ţinând cont de natura şi particularităţile matricei. s-a revenit la cartuşele SPE cu o singură fază. particulele PGC se caracterizau printr-o distribuţie omogenă. .

în schimb detectorii din cromatografia lichidă acoperă un număr mult mai mare de substanţe. 2002).Detectori utilizaţi în cromatografía lichidă Pentru cromatografia de lichide au fost create două tipuri de detectori care sunt astăzi folosiţi în mod curent:  Detectorii bazaţi pe proprietatea componentului sunt sensibili la unele proprietăţi chimice ori fizice. Sunt foarte sensibili la variaţii de temperatură şi nu sunt recomandaţi pentru eluţia cu gradient (Gocan. electrochimici şi spectrometrul de masă. Există posibilitatea creşterii selectivităţii şi sensibilităţii detecţiei prin tehnicile de derivatizare pre. debit. temperatură • sensibilitate mare • selectivitate • răspuns rapid • zgomot de fond scăzut • non-destructiv pentru probă • domeniu dinamic liniar mare . Se pot atinge sensibilităţi remarcabile. aşa cum este de exemplu detectorul de ionizare cu flacără (FID) din cadrul cromatografiei gazoase.şi post-coloană. Astfel de detectori se bazează pe măsurarea indicelui de refracţie. Detectorii sunt selectivi. Din această categorie fac parte detectorii spectrofotometrici de absorbţie UV-Vis. Caracteristicile detectorului cromatografic ideal: • răspuns independent de compoziţia fazei mobile. selectivitate bună şi permit eluţia cu gradient. de fluorescenţă. ci numai la anumite molecule sau clase de compuşi.  Detectorii bazaţi pe proprietatea de volum funcţionează prin măsurarea unor proprietăţi fizice ale componentului în efluent în comparaţie cu eluentul. a constantei dielectrice şi a conductivităţii. În cromatografia lichidă nu există un detector universal şi de înaltă sensibilitate. ei nu răspund la toate moleculele existente într-un amestec.

fapt ce conduce la erori de interpretare datorită suprapunerii semnalelor. având o energie înaltă de emisie la 254nm. este universal recunoscut că cea mai bună metodă de identificare şi caracterizare a fiecărui component separat prin cromatografie constă în înregistrarea spectrului său de masă. . • spectrometre cu lungime de undă variabilă. putând fi selectată continuu. iar eluentul să fie transparent în domeniul spectral respectiv (Gocan. Spectrometrul de masă (MS) este detectorul care permite identificarea prin compararea electronică a spectrului oricărei specii moleculare cu spectrele etalon din biblioteca de spectre. Acest tip de detector poate fi utilizat şi ca un spectrofotometru pentru înregistrarea spectrului unui anumit component ce urmează a fi identificat prin compararea acestui spectru cu cel din biblioteca de date. • detectori cu serie de fotodiode. din întreg domeniul UV. poate fi aleasă absorbanţa cea mai bună în raport cu eluentul sau cu compuşii care interferă. care au sursă spectrală continuă de înaltă energie stabilă reprezentată de lampa cu deuteriu (190-400nm). dar componentul trebuie să aibă o absorbanţă acceptabilă la această lungime de undă. Prezintă avantajele: poate fi aleasă lungimea de undă optimă (adică corespunzătoare absorbanţei maxime). care prezintă facilitatea că întreg domeniul spectral este înregistrat continuu. fără a fi necesară repetarea separării. Unele substanţe organice au timpi de retenţie identici. Exista mai multe tipuri de detectori UV-Vis şi-anume: • detectori cu o singură lungime de undă. iar datele stocate pot fi folosite în diferite moduri şi la date ulterioare. la intervale de timp de microsecunde. 2002).• stabilitate într-un timp îndelungat de operare Detectorii ce au la bază absorbţia în ultraviolet (UV)-vizibil (Vis) sunt cei mai populari detectori utilizaţi în cromatografia de lichide şi sunt practic insensibili la variaţii de debit şi temperatură. Pentru domeniul vizibil (350-800nm) s-a introdus lampa de tungsten. Astfel. Pentru a se utiliza un asemenea detector. care folosesc ca sursă de lumină UV o lampă de mercur la presiune joasă. Prezintă un zgomot de fond redus. este necesar ca componentele de analizat să manifeste absorbanţe suficient de mari în domeniul spectral la care funcţionează detectorul. Există situaţii în care amestecul de separat este complicat şi timpul de retenţie nu este suficient pentru a caracteriza fiecare component.

vor fi deviaţi mai mult sau mai puţin în funcţie de masa şi sarcina lor (Oprean. fiind locul unde se petrece transformarea moleculelor neutre în ioni pozitivi (alături de alte particule negative sau neutre). Ionii cu aceeaşi valoare m/z formează în colector un curent slab care este trimis spre amplificator şi apoi înregistrat (Oprean. 1974). Schema de principiu a unui spectrometru de masă Spectrometrele de masă sunt alcătuite din trei componente de bază: sursa de ioni sau camera de ionizare analizatorul de ioni detectorul sau colectorul de ioni. În figura 3 este redată schema de principiu a unui spectrometru de masă.Spectrometrul de masă se bazează pe principiul că ionii de diferite greutăţi (indiferent de modul lor de formare) după accelerarea într-un câmp electric. . Fig. 3. Analizatorul de ioni separă ionii proveniţi din camera de ionizare în funcţie de raportul dintre masa şi sarcina acestora (m/z). 1974). Sursa de ioni constituie partea cea mai importantă a unui spectrometru de masă. la care se adaugă sistemul de introducere a probei şi înregistratorul. supuşi acţiunii unui câmp magnetic perpendicular pe direcţia lor de deplasare.

majoritatea analiţilor separaţi prin HPLC sunt nevolatili şi/sau nestabili termic şi prin urmare nu pot fi supuşi ionizării electronice sau chimice. Astfel. Pe parcursul anilor. 2003).wikipedia.METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE CUPLATE CU SPECTROMETRIE DE MASĂ (LC-MS) LC-MS este o tehnică cu multe aplicaţii datorită sensitivităţii şi specificităţii sale foarte ridicate. care este pompat prin coloană cu un debit de ordinul ml/min. determinarea compoziţiei izotopice moleculare. farmaceutică. având utilizări atât calitative cât şi cantitative: identificarea compuşilor necunoscuţi. . Pentru utilizarea spectrometrului de masă ca detector în cromatografia de lichide. să identifice şi să cuantifice componenţii din cele mai complexe probe. Principalele interfeţe utilizate în cuplarea unui LC cu un MS sunt:  cu introducerea directă a efluentului  curgere continuă cu bombardament atomic rapid . Interfaţa asigură trecerea analiţilor din soluţie în stare de vapori. problema principală este realizarea unei interfeţe eficiente care să soluţioneze două incompatibilităţi majore: . pornind de la analize simple ca un înlocuitor al tradiţionalului UV şi ajungând la analize calitative şi cantitative foarte exacte. A fost necesară dezvoltarea unor metode alternative de ionizare (Ardrey. sistemele LC-MS au suferit transformări semnificative.org/wiki/Shimadzu_Scientific). în timp ce spectrometrul de masa operează sub un vid de 10-6 torr. determinarea structurii în funcţie de fragmentare şi cuantificarea compuşilor din diferite probe (http://en. este imposibilă trecerea directă a eluentului din coloana HPLC în sursa spectrometrului şi rolul interfeţei este de a îndepărta faza mobilă. a mediului şi în criminalistică. Prin cuplarea cromatografului de lichide cu spectrometrul de masă s-a obţinut un instrument de analiză performant capabil să separe. Aceste sisteme şi-au găsit largi aplicaţii în analiza alimentară.faza mobilă este un lichid. adesea conţinând proporţii semnificative de apă.

sunt de preferat metodele care implică utilizarea tampoanelor volatile. cu bandă transportoare  cu pulverizare la temperatură (thermospray)  cu electropulverizare (electrospray)  cu pulverizarea efluentului într-un curent de gaz la cald combinată cu o ionizare chimică la presiunea atmosferică (APCI) sau cu fotoionizare la presiunea atmosferică (APPI) (Gocan. proba de analizat este preluată din dispozitivul de introducere a probei de către faza mobilă şi introdusă în coloana cromatografică ce conţine faza staţionară. nevolatile cum ar fi fosfatul de potasiu sau sodiu. lucru ce duce la depunerea nedorită a moleculelor de tampon în interfaţă şi sursa ionică a spectrometrului. Consecinţa este reducerea performanţei detectorului. 2003). Drept urmare. Unul dintre rolurile interfeţei LC-MS este acela de a îndepărta faza mobilă. Solvenţii trebuie să fie de puritate înaltă. tensiune superficială. De mare importanţă este degazeificarea fazei mobile pentru a preveni formarea de bule în cadrul interfeţei LC-MS. ei sunt trecuţi în spectrometrul de masă. Aici are loc separarea componenţilor care. pentru a nu da naştere la un fond spectral semnificativ ce ar putea îngreuna interpretarea datelor (Ardrey. conductivitate) pot afecta funcţionarea diferitelor interfeţe. Alegerea fazei mobile are o mare importanţă în obţinerea unor bune separări. Compoziţia şi parametrii fazei mobile (punct de fierbere. Principiul cromatografiei lichide cuplate cu spectrometrie de masă După extracţie şi purificare. Cele mai des utilizate sunt cele anorganice. vor migra cu viteze diferite de-a lungul coloanei. cum ar fi acetatul de amoniu. . Tampoanele sunt folosite în cromatografia lichidă pentru a controla gradul de ionizare al analitului şi implicit simetria semnalului şi reproductibilitatea retenţiei. 2002). datorită distribuţiei diferenţiate între cele două faze. Pe măsură ce componenţii amestecului sunt eluaţi din coloană.

În cazul când schimbarea configuraţiei electronice are lor prin emisie de electroni. Pentru a împiedica ciocnirile între particulele pozitive pe de o parte. separarea acestora în funcţie de raportul dintre masă şi sarcină (m/z) precum şi înregistrarea lor. După detectareamplificare.→ MProcesul de formare al ionilor moleculari pozitivi este de aproximativ 104 ori mai probabil. Radicalii şi moleculele neutre formate sub impactul electronic sunt evacuaţi de către pompele de vid.Spectrometria de masă este o metodă ce permite obţinerea ionilor. Fasciculul molecular gazos este trimis în camera de ionizare. care furnizează astfel spectrul de masă (Oprean. 1974). se realizează treptat condiţiile ca ionii de toate mărimile m/z să focalizeze şi să ajungă la detector. iar ionii pozitivi sunt acceleraţi de-a lungul tubului analizorului de ioni aflat în câmp magnetic. molecula se fragmentează în ioni pozitivi. În spectrometria de masă pot fi studiate numai particule gazoase. negativi. se formează ioni moleculari pozitivi (M+). M .e. a sistemului de separare şi a colectorului e menţinută sub un vid de 10-6 torr. În urma ciocnirii moleculelor cu electronii. sau între acestea şi moleculele neionizate pe de altă parte. fie a potenţialului accelerator. Moleculele pot ceda surplusul de energie fie prin schimbarea configuraţiei lor electronice. Prin varierea continuă fie a câmpului magnetic. radicali şi molecule neutre simple. curentul de ioni este înregistrat de către înregistrator. întreaga incintă a camerei de ionizare. se formează specii moleculare cu energie mărită. . în timp ce schimbarea configuraţiei prin câştig de electroni duce la formarea de ioni moleculari negativi (M-). unde va fi bombardat de un flux de electroni a căror energie e cuprinsă între 10-100 eV. Dacă energia fluxului de electroni depăşeşte cu mult energia necesară ionizării (potenţialul de ionizare). Ionii descriu o traiectorie circulară a cărei rază e proporţională cu masa lor.→ M+ M +e. fie prin radiaţie.

Acesta poate fi identic cu picul molecular sau poate fi un pic generat prin fragmentarea ionului molecular. Intensitatea procentuală relativă se consideră de 100% pentru picul de bază. Majoritatea atomilor au mai mulţi izotopi. adică semnalul generat de ion apare sub forma unei linii numite şi pic. 4. iar intensităţile relative a celorlalte picuri se determină în raport cu picul de bază. Cel mai înalt pic din spectrul de masă se numeşte pic de bază (linie de bază) şi corespunde ionilor cu viaţă lungă. Tipuri de linii în spectrul de masă al unui compus organic Dacă o moleculă conţine doar atomi formaţi dintr-un singur izotop de abundenţă naturală de 100%. Cunoaşterea intensităţii procentuale relative permite cunoaşterea abundenţei procentuale relative pentru fiecare specie de ioni din spectrul de masă. .Spectrele de masă sunt spectre de linii. care ajung la detector în cea mai mare cantitate. ceea ce determină apariţia de linii la valori mai mari decât cea corespunzătoare ionului molecular. linia de la valoarea m/z cea mai mare corespunde ionului molecular. Aceste linii se numesc linii izotopice sau picuri izotopice. În figura 4 sunt ilustrate tipurile de linii din spectrul de masă al unui compus organic. Fig.

când se realizează dezvoltarea unei metode în laborator. spectrul de masă mai conţine şi alte linii datorate ionilor (cationi sau radicali cationici) de fragmentare. Cromatograful de lichide poate fi deasemenea cuplat cu două sau multiple stadii de analiză de masă (LC-MS/MS respectiv LC-(MS)n ). este indicat să se efectueze mai întâi analiza în modul “scan” pentru a determina timpii de retenţie şi amprentele spectrale ale analiţilor de interes.Pe lângă linia ionului molecular şi a liniilor izotopice. Tehnica are sensibilitate redusă şi se foloseşte la determinarea compuşilor necunoscuţi a unei probe. din acest motiv fiind nevoie de o a doua etapă de analiză MS (Gocan. Tehnici de ionizare Producerea ionilor în spectrometrul de masă se poate realiza în mai multe moduri (Gocan. Acest spectru este sărac în informaţii.  modul “sim” (monitorizarea ionului selectat). 2002):  Ionizare electronică (electron ionization. în care se monitorizează toţi ionii dintr-un anumit interval al fragmentelor de masă. Avantajele modului “sim” sunt: limita de detecţie e mai joasă. 2002). interferenţele matriceale sunt mai mici şi poate confirma identificarea unui compus dacă raţia ionilor obţinută este comparabilă cu cea dată de standardele de referinţă. Fragmentarea ionului molecular în spectrul de masă se face după anumite reguli specifice fiecărei clase de compuşi. Acest mod de operare poate fi foarte folositor la identificarea unor substanţe necunoscute şi anume în cazul în care s-a utilizat o ionizare blândă. se vor produce predominant ionii [M+H] + . CI) . Deasemenea. Spectrometrul de masă poate fi utilizat în două moduri:  modul “scan” (scanare completă). EI)  Ionizare chimică (chemical ionization. în care se introduc în metodă numai fragmentele de masă ale compuşilor urmăriţi şi numai acele fragmente sunt detectate de MS.

ro/intranet/Prezentari/HPLC_MSD. fără a afecta integritatea probelor. producând aducţi protonaţi (M+1)+ prin procedeul cu ion pozitiv şi (M-1).doc). producând un jet supersonic de vapori încărcaţi. înalt încărcate electric şi odată cu evaporarea solventului. încărcarea electrică este transferată moleculei de analizat. polimerilor şi proteinelor. În cazul interfeţei care utilizează pulverizarea termică. Soluţia este transformată în picături foarte fine (spray). Temperatura joacă un rol .icmpp. FAB)  Ionizare prin desorbţie asistată laser din matrice (matrix assisted laser desorption ionization. Ionizarea ESI este o metodă blândă de producere a ionilor. Ionizarea thermospray se produce când un component într-o soluţie salină este vaporizat. În urma ionizării. Aceşti ioni moleculari sunt formaţi prin ataşamentul unor ioni mic moleculari la macromoleculele studiate ori prin sustragerea unui ion (http://www. Pe măsură ce solventul se evaporă şi raza picăturii se micşorează. sunt produşi ioni moleculari cvasistabili care nu sunt fragmentaţi în timpul analizei. Spectrele de masă obţinute prin ionizare TSP sunt simple. De aceea.prin procedeul cu ion negativ. Cromatografia de lichide este folosită la analiza unor compuşi polari şi nevolatili şi prin urmare necesită alte moduri de ionizare. ESI)  Pulverizare termică (thermospray. Prin pulverizarea termică. tot eluentul este introdus prin intermediul acesteia în masa spectrometrului. Ionizarea electrospray constă în trecerea la presiunea atmosferică şi debit foarte mic a unei soluţii a compusului de analizat printr-o capilară expusă unui câmp electric foarte puternic (3-6 kV). suprafaţa câmpului pe o picătură creşte până are loc evaporarea finală a unui ion. Pulverizare electronică (electrospray ionization. Tehnica se aplică moleculelor foarte polare. aceste tehnici de ionizare sunt utilizate cu precădere în cromatografia de gaze. Ionizarea electronică şi chimică poate fi aplicată numai probelor în fază gazoasă. APCI)  Ionizare prin bombardament cu atomi rapizi (fast atom bombardment. MALDI). ionizarea probei poate fi obţinută fără a se recurge la folosirea unui filament. TSP)  Ionizare chimică la presiune atmosferică (atmospheric-pressure chemical ionization.

de preferinţă post-coloană. METODA CROMATOGRAFIEI GAZOASE CUPLATE CU SPECTROMETRIE DE MASĂ (GC-MS) . datorită energiei termice mari utilizată la generarea de ioni. cu un domeniu al maselor moleculare de la 100 la 2000 dalton (Gocan. Spre deosebire de pulverizarea electronică. În tehnica de ionizare FAB. Mecanismul de formare al ionilor implică un transfer de sarcină speciilor între un ion reactiv şi o moleculă ţintă. Ionizarea MALDI se realizează prin impactul fotonilor de energie ridicată asupra probei plasate într-o matrice organică solidă. Totuşi. nestabile termic. Ionizarea are loc la impactul atomilor cu matricea din care sunt expulzaţi ionii compusului de analizat. proba dizolvată într-o matrice lichidă (glicerina) este bombardată cu un fascicul de atomi (Xe) de energie foarte înaltă. pentru a produce un ion ţintă care poate fi transmis către analizorul de masă. Matricea se adaugă la eluentul HPLC. în timp ce prin metoda ioni negativi sunt produşi ionii [M-H] -. Pentru a nu se diminua performanţa tehnicii FAB. cu mase de până la 500000 dalton (Ardrey.important şi de aceea trebuie riguros controlată şi menţinută la parametri optimi de funcţionare a interfeţei (Gocan. Ionizarea APCI este o tehnică în care fluxul de eluent provenit din coloana cromatografică este dispersat în picături mici datorită temperaturii şi a unui gaz nebulizator. 2003). Se aplică moleculelor polare. APCI nu produce ioni cu sarcini multiple şi nu este potrivită pentru analiza compuşilor cu mase moleculare mari cum ar fi proteinele. 2002). Spectrele obţinute prin APCI sunt similare cu cele obţinute prin pulverizarea electronică prin metoda ioni pozitivi când rezultă ionii [M+H]+. 2002). fapt ce ar conduce la creşterea fundalului spectral (Ardrey. pentru a nu influenţa procesul de separare. 2003). APCI poate ioniza compuşi relativ nepolari. conţinutul matricei din faza mobilă nu trebuie să depăşească procentul de 5%.

prevede Decizia Comisiei Europene 2002/657/CE (Gentili şi col. În funcţie de natura fazei staţionare. cât şi pentru soluţii lichide şi solide volatile. nevolatil la temperatura de lucru. Tehnica cromatografiei gazoase cuplată cu spectrometria de masă se bazează pe natura şi distribuţia fragmentelor moleculare rezultate prin bombardarea componenţilor probei cu electroni de o anumită energie. studiile ulterioare au revoluţionat chimia separărilor. gaz cromatografia se poate diviza în cromatografie gaz-solid (GSC) şi cromatografie gaz-lichid (LGC). fiecare component al amestecului va fi transportat diferenţiat de gaz. iar în al doilea caz suportul este legat chimic de o peliculă de lichid nepolar cu tensiune de vapori mică. 2005). 2004). cromatografia gazoasă realizează separarea substanţelor volatile pe baza adsorbţiei sau repartiţiei lor într-o fază staţionară (solidă sau lichidă) şi o fază mobilă gazoasă ( un gaz sau un amestec de gaze). GC poate fi utilizată atât pentru probe gazoase. Principiul cromatografiei gazoase Ca principiu de funcţionare. Spectrometria de masă este cea mai performantă şi sigură tehnică de identificare a compuşilor. He. din librăria de spectre. În prezent. Dintr-un amestec de substanţe. Datorită acestui fapt. Faza mobilă se deplasează de-a lungul coloanei prin porii fazei staţionare. Dacă la capătul superior al coloanei se introduce amestecul de separat în stare de vapori. În primul caz. Faza mobilă este constituită din gaze inerte (H 2 . Dacă proba analizată este nevolatilă. CO 2 ) care nu sunt reţinute de faza staţionară. fiecare component va fi separat la .Dacă gaz cromatografia era la început aplicată doar analizelor compuşilor volatili. toate metodele bazate pe cromatografie fără utilizarea MS. întrucât face posibilă compararea numerelor de masă obţinute cu numerele de masă a unor compuşi cunoscuţi. se pot folosi tehnicile de derivatizare sau piroliză GC (Grob şi Barry. faza staţionară introdusă în coloana cromatografică este adsorbant sau suport polar activ. N 2 . Ar. trebuie confirmate prin spectrometrie de masă. menţinându-se un echilibru între cantitatea reţinută în faza staţionară şi cantitatea din faza mobilă..

Separarea compuşilor este realizată atât de stratul activ al coloanei.timpi de retenţie (t R ) diferiţi. injectorul. de obicei temperatura coloanei sau debitul gazului purtător). coloana de separare situată într-un cuptor termostatat. 5. Efluentul care părăseşte coloana este analizat de un detector care permite trasarea cromatogramei: variaţia concentraţiei fiecărui component eliminat din coloană în funcţie de timpul de retenţie pe coloană sau variaţia concentraţiei în funcţie de volumul efluentului. diametre. Separarea se poate face în sistem izoterm şi izobar (temperatura. detectorul şi înregistratorul. factorul de separare şi volumul de retenţie a componentelor (Socaciu. Un cromatograf de gaze conţine următoarele componente principale: butelia cu gazul transportor. În figura 5 este redată schema de principiu a unui gaz cromatograf. compoziţii diferite. debitul fazei mobile şi presiunea în coloană sunt constante) sau în sistem de gradient (variază unul sau doi dintre parametri. Se disting două tipuri de coloane: coloane cu umplutură ce conţin suporturi solide şi care pot fi . cât şi de programarea temperaturii (separarea compuşilor condensaţi în capul coloanei pe baza punctelor de fierbere). Între factorii care pot influenţa capacitatea separării se numără: numărul de talere teoretice din stratul cromatografic. Schema de principiu a unui gaz cromatograf Coloanele cromatografice sunt foarte diverse. 2000). Fig. cu lungimi. în funcţie de natura componenţilor de separat.

astfel în GSC se folosesc faze staţionare active: cărbune activ. Faza staţionară astfel constituită este repartizată uniform ca peliculă subţire pe pereţii coloanei. Diametrul interior al coloanelor este de 2-500mm pentru coloanele clasice şi <1mm pentru coloanele capilare. iar suporturile mai puţin poroase sunt: bile de sticlă. β’. Pentru a elimina proprietăţile absorbante ale suportului se pot face tratamente chimice cu dimetildiclorsilan sau acoperirea suportului cu polivinilpirolidonă (PVP). Umplutura coloanelor clasice depinde de tipul cromatografiei. de interacţiunile chimice posibile cu faza staţionară sau faza mobilă. analiza se realizează la temperaturi mai mari decât în GLC.analitice sau preparative în funcţie de lungime şi coloane capilare construite dintrun tub de oţel moale sau Cu. pământul de diatomee. Diametrul interior influenţează viteza optimă a gazului transportor. alumină. Înălţimea unui taler teoretic este proporţională cu diametrul particulelor. deci pentru separări optime se folosesc coloane lungi. ca fază staţionară sau pot fi tapetaţi cu o fază staţionară. larga lor utilizare datorându-se eficienţei ridicate de separare a acestora. . pentru a opune rezistenţă cât mai mică amestecului de separat. Este important ca particulele să aibă dimensiuni apropiate. în care pereţii interiori pot fi folosiţi ca atare. Suportul impregnat cu lichid este încălzit într-un curent de gaz inert la o temperatură apropiată de cea de separare. polietilenă microporoasă. Suporturile poroase folosite sunt: Chromosorb W sau P. produsele Brique C 22 . Coloanele capilare sunt net superioare celor cu umplutură. Cu cât diametrul coloanei este mai mic. etc. silicat de Mg. pudra de teflon. zeoliţi. legături de hidrogen. Faza staţionară în GLC este constituită dintr-un suport inactiv. celita. cu teflon sau argintare. sticlă.). separarea este mai performantă. poros (suprafaţa specifică de 1-10 m 2 /g) impregnat 5-20% cu un lichid. grafit. Al. În alegerea fazei staţionare trebuie să se ţină seama de tipul substanţelor de separat (polaritate. site moleculare. capacitatea de lucru a coloanei şi cantitatea maximă de material separat. Întrucât energiile de absorbţie sunt mai mari decât energiile de disociere. Numărul de talere teoretice este proporţional cu lungimea coloanei.dioxipropionitril (cel mai polar). S-a făcut o scală de selectivitate a lichidelor staţionare care începe cu squalenul (nepolar) şi se încheie cu β. silicagel. de capacitatea de adsorbţie pe suport. sticlă poroasă.

Când coloanele sunt supraîncărcate. Coloanele capilare pot fi constituite din tuburi goale în care faza staţionară nu este fixată pe suport. În calculul concentraţiilor componenţilor determinaţi se va ţine seama de raportul de splitare.Umplerea coloanei se face sub vid. Analiza unei probe implică etapele de pregătire a probei. trebuie determinată concentraţia totală a substanţelor în amestec şi apoi pe baza procentelor deduse din cromatograme se calculează concentraţia fiecărei componente (Socaciu. fiind repartizată uniform pe pereţii interiori ai coloanei. În cel de-al doilea caz. permiţând evaporarea probei. exprimate ca procent din totalul picurilor.25-0. Această cameră are o temperatură mai mare decât coloana. Practic se realizează o peliculă foarte subţire prin evaporarea fazei staţionare lichide. 2000). Analiza calitativă presupune identificarea fiecărui pic din cromatogramă. creşte înălţimea unui taler şi picurile devin asimetrice şi cu lăţime mare. Pentru a exprima în valori absolute cantitatea fiecărei componente din amestec. iar condiţionarea ei constă în încălzire sub curent de gaz purtător la temperatură înaltă pentru a îndepărta impurităţile volatile. toată cantitatea injectată intră în coloana cromatografică.5mm. Proba nu se introduce direct în coloană. de separare a componenţilor şi de evaluare calitativă şi cantitativă a componenţilor separaţi. iar lungimea de 20-50m. Analiza cantitativă se face prin integrarea picurilor şi calculul ariilor acestora. ci printr-o cameră de injectare a cărei formă şi volum influenţează mult separarea. Diametrul interior este de 0. . o parte va fi direcţionată în exteriorul cromatografului. care are practic semnificaţia unei diluţii. se reduce numărul de talere teoretice. Injectarea probei poate fi făcută cu sau fără splitare. Volumul probei trebuie să fie cât mai mic. realizânduse aproximativ 10000 talere teoretice. Pentru compuşii mai volatili decât solventul este obligatoriu să se lucreze cu splitare: o parte din extractul de injectat va intra în coloană. Acest procent este proporţional cu ponderea fiecărei componente în amestec.

2. Creând un câmp electric între duză şi un electrod colector aşezat deasupra flăcării. Caracteristicile detectorului: • sensibilitate cât mai mare pentru a putea detecta chiar şi urmele de componenţi şi pentru a nu fi necesară încărcarea coloanei cu cantităţi mult prea mari de probă • viteză de răspuns cât mai mare • liniaritate: sensibilitatea detectorului să rămână constantă într-un domeniu larg de concentraţii • limită de sensibilitate ( concentraţia minimă de substanţă în eluent pentru care se obţine un pic) cât mai joasă • stabilitate: linia de fond şi reproductibilitatea să fie cât mai puţin afectate de condiţiile de lucru (temperatură. sub forma unor semnale electrice care pot fi înregistrate. Apariţia în flacără a unui compus organic măreşte intensitatea . Cele mai importante tipuri de detectori sunt: 1. Se mai numeşte şi catarometru. Principiul de funcţionare se bazează pe diferenţa de conductibilitate termică dintre component şi eluent. Detectorul trebuie să deosebească o proprietate oarecare a componentului de analizat faţă de gazul purtător.. etc) (Liteanu şi col. La ieşirea din coloană. Detectorul de conductibilitate termică (DCT) a fost primul care a apărut.Detectori utilizaţi în cromatografía gazoasă Detectorul pune în evidenţă componentele separate pe coloana cromatografică. Există detectori universali. sensibili numai la anumiţi componenţi (la anumite grupări funcţionale sau legături chimice). 1981). făcând parte din categoria detectorilor universali. presiune. sensibili la un număr mare de componenţi şi specifici. eluentul este amestecat cu un curent de hidrogen şi este aprins la capătul unei duze din oţel inoxidabil. debit. Detectorul cu flacără de ionizare (FID) este tipul de detector cel mai mult folosit în GC. Principiul de funcţionare constă în măsurarea conductibilităţii electrice a unei flăcări de hidrogen în prezenţa unui compus organic. se stabileşte un curent slab (10-14 A) între cei doi electrozi prin flacără. putând fi utilizat şi în cromatografia preparativă. este nedestructiv.

Prin aplicarea unui câmp electric între electrozii camerei de ionizare. Azotul se utilizează ca gaz purtător şi produce prin iradiere electroni şi ioni pozitivi: N2 →N2 + +eDatorită mobilităţii ridicate a electronilor liberi. Reprezentarea abundenţei lor (concentraţiei relative) în funcţie de masă constituie spectrul de masă. Ionii formaţi sunt separaţi în funcţie de masa lor în analizorul de masă şi apoi sunt detectaţi şi înregistraţi. simplitate în operare şi întreţinere.→[component]Ionii negativi se recombină cu ionii pozitivi mult mai uşor decât electronii liberi: N2 + + [component]. Detectorul FID are o sensibilitate înaltă.→[moleculă neutră] Detectorul ECD are avantajul selectivităţii şi sensibilităţii foarte ridicate.curentului datorită ionizării acestuia în funcţie de natura şi concentraţia componentului respectiv. nu are loc recombinarea lor cu ionii pozitivi. 5. cu mase diferite. Acest curent va fi amplificat şi apoi înregistrat. Detectorul cu captură de electroni (ECD) prezintă o mare sensibilitate pentru compuşii capabili de captură de electroni. 4. Sursa de ionizare constă din tritiu sau Ni63 radiocactiv. ionii formaţi prin iradiere vor fi colectaţi. . răspuns al semnalului rapid. Spectrometrul de masă (MS): în urma ionizării în vid a moleculelor substanţei de analizat. Detectorul cu fotoionizare (DFI) are la bază ionizarea fotonică a moleculelor probei şi măsurarea curentului format cu ajutorul electrodului colector cuplat cu un electrometru. cum ar fi compuşii conţinând halogeni. Mulţi compuşi de interes biologic prezintă proprietatea de a capta electroni sau posilitatea de a fi derivatizaţi cu compuşi care au această proprietate. Ionizarea moleculelor poate avea loc în două modalităţi: prin impact electronic (EI) şi ionizare chimică (CI). 3. stabilitate pe termen lung. are loc fragmentarea acestora cu formarea unui grup de ioni caracteristici. Procesele se desfăşoară în sursa de ionizare a spectrometrului. Prezenţa unor molecule cu afinitate ridicată pentru captarea electronilor liberi favorizează formarea ionilor negativi: [component] + e.

prin fragmentare se vor forma toţi ionii posibili. Electronii proveniţi de la un filament încălzit sunt focalizaţi în timp ce străbat camera şi colectaţi de un electrod având un potenţial de 70V. Dacă în camera de ionizare se introduce o substanţă într-o cantitate suficientă ca presiunea să crească la 10-5torr. ciocnirile dintre electroni şi moleculele compusului respectiv determină fragmentarea acestora. În consecinţă. Gazul reactiv poate să înlocuiască gazul purtător în GC-MS şi poate fi introdus direct în sursă. Acesta îi conferă fiecărui electron o energie de 70eV. ci numai cu pereţii camerei. Din păcate însă. prin care să se obţină informaţii despre masa moleculară. Fragmentele de molecule neutre şi de ioni formaţi nu se vor ciocni între ei. Întrucât electronii la 70eV au energie suficientă pentru a rupe orice legatură din moleculă. a devenit necesară utilizarea unei tehnici de ionizare mai blânde. stabilitatea ionului molecular este aşa de redusă (el se va fragmenta mai departe) încât. Primul ion care se formează în urma impactului este aşa-numitul ion molecular. Spectrele de masă cu ionizare chimică sunt produse prin reacţii ionmoleculare între moleculele neutre ale componentului (10-5 torr) şi o presiune ridicată (0. Spectrul de masă obţinut în asemenea condiţii va fi reproductibil şi caracteristic pentru compusul respectiv. Ionizarea EI duce la fragmentarea moleculei şi la obţinerea unui amestec complex de ioni a căror masă si abundenţă relativă se poate utiliza pentru identificarea calitativă a compuşilor respectivi. Din cauza presiunii scăzute din camera de ionizare.2-2 torr) a plasmei de ioni a gazului reactiv (de obicei metan sau izobutan). Această tehnică este ionizarea chimică. cu puţine efecte asupra rezoluţiei cromatografice. introdusă în anul 1966. care are mare importanţă în identificarea substanţei deoarece are aceeaşi masă cu masa moleculară a compusului respectiv. abundenţa sa relativă va fi foarte mică şi identificarea de cele mai multe ori imposibilă. de 10-8 torr. numai o moleculă din aproximativ 10 6 va realiza ciocnirea şi ionizarea.Ionizarea prin impact electronic În camera de ionizare se realizează un vid înaintat. fiind posibilă aşadar îndepărtarea lor din camera de ionizare şi colectarea ionilor de mase diferite în detector. Întrucât concentraţia gazului reactiv este cu câteva ordine de mărime peste concentraţia .

http://www.3. realizându-se ionizarea probei. tipurile cele mai uzuale fiind cele magnetice şi cu cuadrupol descrise în capitolul 3. reacţiile ion-molecule sunt favorizate. dar în practică se utilizează reprezentarea fiecărui pic sub forma unei linii. Ciucanu. 1998. Deoarece sursa este operată la presiune înaltă comparativ cu sursa EI. Separarea ionilor formaţi are loc în analizorul de masă. iar restul sunt exprimate ca procente faţă de aceasta. Majoritatea tehnicilor de ionizare chimică lucrează cu ioni pozitivi. fasciculul de electroni ionizează gazul reactiv cu puţine molecule ale probei ionizate direct. obţinându-se concentraţia diverselor fragmente ionice ca valori de abundenţă relativă (Gocan. . Spectrele de masă pot fi înregistrate sub formă de picuri cu maxime (forma originală a spectrului).3.probei. abundenţa ionului molecular faţă de alte fragmente rezultate va fi mare şi mecanismul de fragmentare va fi mult mai simplu. Celei mai înalte linii din spectru i se atribuie arbitrar valoarea 100. Aceste reacţii au loc cu energie mică în comparaţie cu impactul direct cu electroni. dar s-au dezvoltat şi cele cu ioni negativi bazate pe captura unor electroni cu energie mai mică. Comparativ cu ionizarea prin EI. ionizarea chimică prezintă dezavantajul că oferă rezultate mai puţin reproductibile şi nu este posibilă alcătuirea unei librării de spectre care să fie folosită în scopuri de identificare. 1990.php).scritube.com/stiinta/chimie/Cromatografia-de-gaze41182.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful