In the last few years a general model of cell cycle control has been established for all eukaryotic

cells. Experiments from a variety of organisms and from a variety of experimental approaches have identified a protein kinase and its unstable regulatory subunit as the activator of mitosis; related molecules seem to be involved in the activation of chromosome replication. The identification of the biochemical components of these important regulatory pathways is providing several new insights into homeostatic and developmental control mechanisms in higher organisms.
AS THE PIONEERS of molecular biology reach retirement, they have begun to rhapsodize about the simplicity and singleness of purpose that characterized their era. In contrast to the previous era, where generality in biology seemed to emerge from a study of its diversity, molecular biology emphasized the value of concentrating on a few model systems, such as E. coli and phage. In the past few years the pendulum has begun to swing back to a strategy of reconstructing general truths from the myriad of special cases that biology affords. This revisionist strategy has flourished during the period covered by the last 100 issues of TIBS and nowhere so clearly as in research on the cell cycle. Here the forbidden bastion of cell cycle control was breached, not by a concerted frontal attack on one model system or by one overpowering technique, but by the stealth, indirection and serendipity that could only be found in diverse organisms and diverse approaches.

Early ideas, assembling the cast

In 1980 I attended my first cell cycle symposium. Most of the talks in that session were unlike any I had previously encountered; they were mostly about theory and measurement. The field of the cell cycle at that time was concerned with somatic cells or single-celled organisms and was filled with arcane concepts, such as limit oscillators and transition probabilities. The message of my brief talk, by contrast, was very unsophisticated. I showed a movie of frog eggs, brutalized in various ways (enucleated, ecentriolated, emicro-tubuleated). When viewed in time lapse, the eggs popped up and down with the same regular cadence as the cleavage of their pristine siblings (Fig. 1). The conclusion was obvious: there must be a biochemical oscillator in the cytoplasm that regulated the cell cycle. It was a clock that happily ticked on even without its hands1. Since then I learned that a movie makes for a very popular seminar but I lost whatever illusions I had about my own popularity, when instead of receiving seminar invitations, I began to receive invitations to just send my movie. By 1984 real progress had been made on the components of the cell cycle. Lee Hartwell had worked for years defining genes that could be involved in the cell cycle in Saccharomyces cerevisiae, but in the pre-cloning and pre-geneknockout era the cell cycle (cdc) mutants were just numbers to me. His picture of the cell cycle in yeast did not look at all like the bouncing frog eggs; rather, it was an assembly line. Whenever Lee and I met, we would have interesting conversations and I could not help being impressed by the depth of his thinking and the cleverness of his approaches. I think both of us walked away believing that the cell cycle disappointingly was not very general. Yet, generality in components, if not in overall physiology, was just around the corner. Paul Nurse, taking a similar genetic approach in the more obscure fission yeast Schizosaccharomyces pombe, had identified a gene, cdc2, that seemed to control entry into mitosis. In 1982 he and David Beach showed that this gene was homologous to the S. cerevisiae gene, CDC28 (discovered by Hartwell2), which also regulated the cell cycle, and that the S. cerevisiae gene could substitute for the cdc2 gene3. Despite the evolutionary divergence of these two species of yeast, it was not clear how relevant their cell cycle was to that of metazoan organisms. For several years after I returned from my sabbatical, I was interested in finding the biochemical mechanism underlying the master oscillator in the frog. With John Gerhart and Michael Wu in Berkeley we carefully measured the activity of maturation promoting factor (MPF) in the non-dividing eggs and in oocytes 4. This intracellular factor causing oocyte maturation was discovered by Yoshio Masui and by Dennis Smith in the early 1970s and by that time was known to be found in a wide variety of eukaryotic cells5 6. Its discovery in somatic cells portended its fundamental role in cell cycle transitions. We found that MPF oscillated in the bouncing eggs as well as in normally dividing eggs and, except for the first meiotic division, these oscillations required protein synthesis. This was the first biochemical marker for the autonomous oscillator, but this experiment did not distinguish whether MPF drove the cell cycle or merely responded to it. At about the same time Ryn Miake-Lye in my laboratory and Fred Lohka in Masui's laboratory showed that partially purified MPF could induce mitotic events in vitro and with John Newport we showed that merely adding and subtracting MPF could drive the complete mitotic cycle including DNA replication 7-9. MPF became the holy grail of cell cycle control in frog eggs, just as cdc2 became the holy grail in yeast. Could anyone doubt that the two quests would lead to the same end? The last major ingredient in the cell cycle was found quite by accident by Tim Hunt and his students in the Physiology Course at Woods Hole. Tim was not looking for a new regulator of the cell cycle, but was just looking for a simple experiment for students with sea urchin eggs. Their experiment of labeling eggs continuously with 35S-methionine showed that one protein, which they named cyclin, oscillated in abundance in each cell cycle during the early synchronous cleavage stages in sea urchins 10. Tim Hunt recognized that a protein that accumulated during interphase and was degraded during mitosis was a perfect candidate for a cell cycle activator. For a while it appeared that nothing could be done but speculate about any relationship between the oscillating protein and the regulation of the cell cycle, and about cyclin, cdc2 and MPF.

Towards a general mechanism, assembling the scene

Even if cyclin had some role in the cell cycle, there was no indication that it was a central regulator. There were, in fact, reasons for believing that cyclin could not be MPF, since protein synthesis was not required to activate the first meiotic division in frogs. (We now know that in the frog oocyte cyclin has already been synthesized and MPF is held in an inactive state by a posttrans-lational block.) Yet, significantly in both frogs' and other eggs, there was a universal requirement for protein synthesis for each mitotic division. A requirement for protein synthesis may seem unremarkable to anyone studying growth and division in somatic cells; after all, each cell must duplicate its entire contents before each division. Eggs, however, seem to have stored most of the materials needed for many rapid cell divisions, such as histones, deoxyribonucleotides and tubulin. In retrospect, the requirement for protein synthesis was very significant and proved to be an intimate part of cell cycle regulation. The unraveling of the basic cell cycle mechanisms came quickly in the past eight years, particularly in the last four. There were several high moments of drama. First came the creeping'sense of the generality of the mechanisms, followed by an appreciation of why the frog and yeast cells, which originally appeared so different, were fundamentally the same. At the risk of offending some, I will list the high points for me. (1) The complementation of yeast cdc2 by a homologous human gene by Lee and Nurse removed any doubt about evolutionary conservation of the cell cycle11. (2) The activation of frog oocyte maturation by clam cyclin RNA by Swenson and Ruderman was a puzzling result in some ways, since the first meiotic division required no new protein synthesis, but it gave the first indication that cyclins might have a regulatory activity12. (3) The development of concentrated extracts that responded to MPF by Manfred Lohka and Yoshio Masui and by John Newport and Ryn Miake-Lye in my laboratory showed that addition and removal of MPF could drive the entire cell cycle; hence protein synthesis and presumably cyclin synthesis was required only to activate MPF7"9. (4) The development of an extract that generated active MPF in the absence of protein synthesis by Martha Cyert in my laboratory stimulated a search for regulatory post-trans-lational modifications in the activation of MPF13. The linkage of MPF to cdc2 and ultimately to cyclin came from many directions. Affinity chromatography by Dunphy, Beach and Newport suggested that cdc2 was in frog MPF14. The long arduous task of purifying MPF was finally accomplished by Lohka and Mailer, who with Jean Gautier confirmed the connection between cdc2 and MPF by immunoblotting with anti-cdc2 antibodies obtained from Nurse 15. The identification of an oscillating HI kinase activity that contained cdc2 in human cells by Beach's group 16 and in starfish eggs by Doree17 further supported and generalized the identification of cdc2 with MPF. But if MPF oscillated as an activity, so should cdc2. Yet in every system cdc2 did not seem to vary during the cell cycle. Something else must be responsible. The best candidate was cyclin, but the evidence was purely circumstantial. Exasperatingly, at that time there was no known mutant for cyclin and hence no genetic test for its role. Reconstitution in vitro is a goal of all biochemical research. Reconstitution of complex processes, such as the cell cycle or mitosis, may have seemed impossibly difficult to some but for me it always seemed like a rather small step from injecting an egg and using it as an in vivo test tube to squeezing the egg into a real test tube and using it as an in vitro biochemical system. The frog egg has several unequaled advantages for such an approach. It is essentially pure cytoplasm, containing stockpiles of cellular components. It is arrested at a single state of the cell cycle, and it can be made to go from one state to the other by addition of purified molecules. In the years since 1984, several complicated reactions have been reconstituted from the nearly purified cytoplasm obtainable from frog eggs. Nuclei have been reconstituted 18 as well as mitotic spindles19, initiation of DNA replication20, nuclear transport21 and centrosome duplication (S. Doxsey and M. Kirschner, unpublished). In 1989 the apotheosis of all in vitro systems was the reconstitution of the entire pathway of cell cycle progression by Andrew Murray in my laboratory22. Using concentrated frog egg cytoplasm depleted of endogenous transcripts, he demonstrated that cyclin fulfilled the entire protein synthesis requirement for the cell cycle, as measured by the cyclic appearance and disappearance of MPF, the breakdown and reformation of the nuclear membrane, the assembly and disassembly of the mitotic spindle and DNA replication. The long-sought protein synthesis requirement for cell cycle progression was shown to be cyclin. Coupled with results from Tim Hunt's laboratory showing a cyclin requirement for cell cycle progression23, biochemical evidence demonstrating the association of cyclins with cdc2 24,25 and the identification of one of the yeast cell cycle genes as cyclin 26"28, the basic and universal paradigm of the cell cycle was established (Fig. 2). The cell cycle field has not paused to consolidate the gains made since 1989. It has moved in six major directions at once, buoyed by the apparent conservation of the basic reactions and by the ease of moving from higher to lower eukary-otes and from genetics to biochemistry.

The cyclin-cdc2 complex and mitosis

Can the orchestrated sequence of events in mitosis be ascribed to the activation of a single kinase at a single place and at a single time? Almost every component of the cell is drastically remodeled at mitosis. Does this mean that each is a substrate for cdc2-cyclin or does it mean that this kinase sits at the node of a regulatory network of kinases or other enzymes that carry out the mitotic process? There will be no complete answer to this question until each subprocess of mitosis is examined. The breakdown of the nuclear membrane has been the clearest biochemical target of MPF. The nuclear lamin protein is a member of the class of very durable intermediate filament proteins. Its phosphorylation causes its complete solubilization; its dephos-phorylation causes reassembly. In the last couple of

years work of Gary Ward in my laboratory and Mattheus Peter in Erich Nigg's laboratory has shown that in vitro MPF phosphorylates a specific serine residue in the lamin proteins29,30. In addition, other sites on lamins are also phosphorylated by kinases whose activity is activated by MPF. Thus cdc2, the monarch of all kinases, is not too proud to act directly on the common mitotic substrates; however, it also acts through intermediaries. The complex temporal control in mitosis is undoubtedly an interplay of these intermediaries, which in turn may respond to the state of completion of specific events. Thus, even if MPF is an on-off switch that signals the onset of mitosis, the individual downstream events may occur in a temporal order due to an imposed substrate-product sequence. Lamin disassembly is just one process of mitosis; each of the other processes, such as spindle formation or the reconstitution of the endoplasmic reticulum and Golgi, although dependent ultimately on cyclin and cdc2, will have its own story of regulation.

Activation of cdc2 by cyclin

The combination of cyclin with cdc2 does not immediately activate kinase activity. Genetic studies in 5. pombe had at first identified a negative regulator, weel, which proved to be a specific tyrosine kinase31 and a positive regulator, cdc25, which after considerable biochemical effort proved to be a member of a new class of tyrosine phosphatases32,33; both acted in an antagonistic manner to control the final activity of the cyclin-cdc2 complex at a single tyrosine on cdc2 identified by Kathy Gould and Paul Nurse 34. Biochemical experiments in frog cell extracts identified two other activities, a kinase responsible for the activation of cdc2 and a phosphatase responsible for its inactivation 35. These reactions, which are responsible for the activation of cdc2 by cyclin, have been studied in in vitro extracts with the addition of purified components by Mark Solomon in my laboratory25. Together, these reactions constitute the highly cooperative transition into mitosis that shows a threshold in cyclin concentration and a lag after addition of cyclin. Some of these kinases and phosphatases can serve as rate-limiting activities in mitotic induction at certain stages of development. In Drosophila, despite the usual cyclin requirement for entry into mitosis, the activity of cdc25 (the tyrosine phosphatase) is rate limiting and hence the major controlling element 36. These reactions are also entry points for regulation by checkpoint controls described below.

Cyclin degradation
In 1970 while I was still a graduate student, I read a memorable review by Bob Schimke on protein degradation that argued that for non-dividing cells, protein turnover could play as significant a role in controlling enzyme activity as transcription and translation37. The intervening years have not been kind to this opinion, as transcription and RNA processing have shown incredible complexity and capacity for control, while protein degradation has been relegated to the role of a waste disposal system. However, during this time experiments of cell cycle physiologists like Arthur Pardee kept alive the notion that the accumulation of unstable proteins could regulate transitions in the cell cycle38. The cell cycle field has revived interest in the regulatory potential of protein degradation. The most unusual reaction that has been identified in the cell cycle is the highly regulated destruction of cyclin. Cyclin accumulates as a stable protein 9A in interphase and is rapidly degraded at anaphase". Experiments by Michael Glotzer and Andrew Murray in my laboratory have shown that cyclin stability is controlled by a specific recognition sequence near the amino terminus of the molecule39. Proteins artificially fused to this sequence are degraded by the ubiquitin pathway during mitosis but not in interphase. Mutants in this sequence cause a failure to be ubiquitin-ated and a failure to be degraded, which leads to a dominant metaphase arrest. How this system is regulated is the terra incognita of cell cycle research.

Cyclin, cdc2 and the Gl/S transition

The G2/M paradigm has served as a good model for the Gl/S transitions and perhaps other transitions in the cell cycle. Genetic experiments in yeast had shown that cdc2 was required twice, once as part of what we now know as MPF, and another as a requirement before DNA replication, a time loosely called the Gl/S boundary40. Yet despite these clues, the discovery of the cyclin-cdc2 transition in Gl did not come from looking at cdc2 but instead came through separate genetic experiments directed at genes that controlled the sensitivity to a-factor arrest or cell size control 41,42. These genes identified Gl regulator proteins with some, albeit weak homology to the mitotic cyclins. Subsequently it was shown by Steve Reed's laboratory that a redundant set of Gl cyclins cooperate to drive the yeast cell into S phase43. Genetic complementation of cyclin-deficient yeast mutants with human DNA as well as other physiological properties have allowed the cloning of human Gl cyclins 4445. There is now further evidence for their episodic expression in Gl or S and their combination with cdc2 or a closely related protein called CDK246. It is important to stress how little we know about the 'Gl' cyclins, since we do not know of any analogous transition to the G2/M transition, nor do we know of any phosphorylated targets, nor do we know whether like the G2/M phase there is a specific requirement for cyclin degradation. Yet the Gl/S transition is closest to the hearts of biologists interested in growth control, since most cells arrest at that stage of the cell cycle.

The targets of exogenous cell cycle regulators

The regulation of cell division in yeast in response to mating pheromones is probably the best-understood pathway for cell differentiation and cell growth. The yeast cell uses standard means of cell communication to transduce the mating signal to specific downstream targets, through a cascade of kinases to activate specific genes. Ira Herskowitz has been particularly interested in those activated genes that inhibit cell cycle progression, and with Fred Chang found that one of them, FAR1, interacts directly with one of the Gl cyclins, CLN2 47. In principle, the entire regulatory pathway of one Gl cyclin can now be traced back to an initial extracellular signal. With great rapidity new Gl and G2 cyclins have been identified in yeast. Each has its own story of transcriptional and trans-lational control and each serves to

clarify the physiological and homeostatic mechanisms that integrate growth, cell cycle decisions, and developmental decisions48. Although no one pretends that the yeast incorporates the complex regulation of metazoan organisms, it is very likely that many of the strategies of cell cycle control will be first understood in yeast. In somatic mammalian cells the newly discovered Gl cyclins have served as lures to explore their control. The tools are much more limited than the genetic tools found in yeast, and at present no biochemical system exists for Gl cyclins in mammalian cells that approaches the power of the in vitro systems for G2/M in frog. However, the initial results tie cyclin A (a cyclin protein that is made in early S phase and is degraded in mitosis) and some of the new Gl cyclins, such as cyclin E, to the recessive oncogenes encoding RB and pl07 and to the elusive transcription factor E2F49,50. These connections suggest that recessive oncogenes are targets of the Gl-activated kinase regulated by the Gl cyclins. The purpose of these phosphorylations may be to control the transcription of the Gl cyclins, an auto-feedback loop that has been suggested for the Gl cyclins in yeast, and parallels the postradiational autoactivating pathway demonstrated for the G2 cyclins in the frog.

Checkpoint controls
One of the early mysteries of the cell cycle was the apparent autonomy of the cell cycle reactions in the frog egg and the extreme dependence in yeast. Though no one now questions the generality of the mechanisms, it is clear that the exact appearance of the resulting pathway can be very different, depending on which reactions are rate determining and which regulatory pathways are interconnected by feedback loops and checkpoint controls. Hartwell and Weinert specifically looked for such negative controls that might halt the yeast cell cycle in response to a failure to complete a downstream task; they chose the failure to repair DNA damage 51. They reasoned that there should be a subclass of radiation-sensitive mutants that would be sensitive because they failed to arrest the cell cycle in response to DNA damage, and hence would be deficient in allocating enough time in the cell cycle for DNA damage to be repaired. These 'checkpoint' mutants have defined several pathways involved in feedback control. Similar mutants have also been found that regulate the exit from mitosis in response to abnormalities in the mitotic spindle52,53. In mammalian cells, Kishi-moto used a genetic approach to identify another apparent feedback system involving a chromosomal protein, RCC1, that is a GTP exchange factor for a common small G protein in the Ras class called Ran5455. At present the mechanisms of sensing damage are not known and the pathways for regulating the cell cycle machinery are also unknown. However, knowledge of these pathways and better understanding of the biochemistry of the cell cycle events promise to clarify these important systems well before the 300th issue of TIBS.

The future lies ahead of us

As the history of the past eight-and-a-third years (100 issues of TIBS, a new and now indispensable unit of biological time) has shown it is futile to try to predict the' pathway of discovery, though it is probably possible to choose some goals. Immediate goals include a better description of the biochemistry of checkpoint controls and enzymes that regulate the activation of cdc2 and related kinases. They include a more complete description of downstream targets of the mitotic kinase, a description of the process of cyclin degradation, and events in S phase that are regulated by the 'Gl' cyclins. We need to understand the Gl transition or transitions and in particular if cyclin degradation is required to proceed to the next phase. Longer-term goals would be to try to connect the regulation of cell division with developmental decisions and even to intervene in promoting division of non-proliferating cells or inhibiting the division of proliferating cells. Intervention in checkpoint controls might also improve the effectiveness of chemotherapy. If research on the cell cycle has made any contribution to the culture of science, it is best expressed by the motto found on every US coin: E pluribus unum, which loosely translated means 'from many biological systems, one biological principle'. There is no doubt that the situation will get more complicated in the future, as there are many cyclins and cdc2-related proteins, and perhaps other mitotic kinases. Yet it is particularly gratifying that what did emerge emerged from so many sources and so many experimental approaches. There is a similarity between the efforts in the recent period of cell cycle research and the common practice of searching for homologies among related proteins. In both cases comparison helps focus attention on the highly conserved and most important parts of a sequence or process. The ability to amalgamate results from studies of the cell cycle of frogs, yeast, sea urchins and mammals saved us from being distracted by the peculiarities of each system and facilitated a rapid understanding of the general biological process.

En los ltimos aos un modelo general de control del ciclo celular se ha establecido ESTABLECIDO para todas las clulas eucariotas. Los experimentos de una variedad de organismos y de una variedad de enfoques experimentales han identificado una protena quinasa y su reglamentacin subunidad inestable como el activador de la mitosis, molculas relacionadas parecen estar implicados n i la activacin de la replicacin del cromosoma. La identificacin de los componentes bioqumicos de estas vas de reglamentacin importante es proporcionar varios nuevos conocimientos sobre los mecanismos de control del desarrollo y la homeostasis en los organismos superiores. COMO LOS PIONEROS moleculares de cada dos llegar a la jubilacin loga, que han comenzado a entusiasmarse por la sencillez y unidad de propsito que el carcter industrializados su poca. En contraste con la anterior era vious, donde la generalidad de la biologa pareca surgir de un estudio de su y DIVERSIDAD, enfatiza la biologa molecular empresas el valor de concentrarse en un modelo de sistemas de pocos, como E. coli y del fago. En los ltimos aos la plumapndulo ha comenzado a volver a adoptar una estrategia de reconstruccin de las verdades generales de la gran cantidad de casos especiales que ofrece la biologa. Este comienzo revisionista gia ha florecido durante el perodo cubierto por los ltimos 100 temas de TIBS y en ningn lugar con tanta claridad como en la investigacin sobre el ciclo celular. Aqu el bastin prohibido de ciclo de control celular fue violada, no por un ataque concertado f Rontal en el sistema de un modelo o una tcnica abrumadora, sino por la ocultacin, engao y la casualidad de que slo poda encontrarse en diversos rganos ismos y enfoques diversos. Primeras ideas, el montaje del molde En 1980 asist a mi primera celda le simposio ciclorama. La mayora de las conversaciones en ese perodo de sesiones se diferencia de cualquier otra que se haba encontrado con anterioridad, sino que eran en su mayora sobre la teora y medicin. El campo del ciclo celular en ese momento era de Con preocupados con las clulas somticas o de organismos unicelulares simples y se llene de correo d con conceptos arcanos, como la oscilacin lmite dores y las probabilidades de transicin. El mensaje de mi breve charla, por el contrario, era muy poco sofisticado. Me mostr una pelcula de huevos de rana, brutalmente de diversas maneras (enucleado, ecentriolated, emicrotubuleated). Cuando se ve en lapso de tiempo, los huevos apareci arriba y hacia abajo con la misma cadencia regular como la escisin de sus hermanos prstina (Fig. 1). La conclusin era evidente: debe haber un oscilador bioqumicas en el citoplasma plasma que regula el ciclo celular. F ue un reloj que felizmente marcado en sus manos, incluso sin Desde entonces he aprendido que una pelcula lo convierte en un seminario muy popular, pero perdi lo que las ilusiones que tena sobre mi propia popularidad, cuando en lugar de recibir invitaciones a seminarios, empec a recibir nvitations i enviar slo mi pelcula.
una.

En 1984 los progresos se han realizado verdaderos de los componentes del ciclo celular. Lee Hartwell haba trabajado durante aos la definicin de los genes que podran estar involucrados en el ciclo celular en Saccharomyces cerevisiae,pero el golpe de gracia antes de la era de la clonacin y la pre-gen de las clulas (ciclo CDC) en mu tantes eran slo nmeros para m. Su foto tura del ciclo celular en la levadura no se parece en nada a los huevos de rana que despide, sino que fue una cadena de montaje. Cuando nunca Lee y yo nos conocimos, nos habra conversaciones t iones interesante y yo no poda dejar de estar impresionado por la profundidad de su pensamiento y la inteligencia de sus planteamientos. Creo que ambos nos alej de creer que la desaparicin del ciclo celular pointingly no era muy general. Sin embargo, la

generalidad de los componentes, si no en ms de una fisiologa ll, estaba a la vuelta de la esquina. Paul Nurse, tomando un enfoque gentico similar en lo oscuro la levadura de fisin Schizosaccharomyces pombe ms, haba identificado un gen, cdc2, que pareca controlar la entrada en mitosis. En 1982 y de la playa David mostr que este gen se homologa a la S. gen cerevisiae, Cdc28 (descubierto por Hartwell que tambin regula el ciclo celular, y que la S. gen Saccharomyces podra sustitucin tuto para el gen cdc2 3. A pesar de la divergencia evolutiva de estas dos especies de levadura, que no estaba claro la relevancia de su ciclo celular fue a la de los organismos metazoos.
2),

Durante varios aos despus que regres de mi ao sabtico, estaba interesado en encontrar los mecanismos bioqumicos subyacentes al oscilador principal en la rana. Con John Erhart G y Wu Michael en Berkeley cuidadosamente medido la actividad de promocin de la maduracin de los factores (MPF) en la divisin de los huevos-y no en los ovocitos Este factor intracelular que causa la maduracin de ovocitos fue descubierto Ered por Yoshio Masui y por Dennis Smith en l dcada de 1970 y para entonces se saba que se encuentran en una amplia variedad de clulas eucariotas 6. Su descubrimiento Ery en las clulas somticas presagiaba su diversin papel fundamental en las transiciones del ciclo celular. Se encontr que MPF oscilado en los huevos rebote, as como en la norma lly dividiendo los huevos y, a excepcin de la primera divisin meitica, estas oscilaciones requiere la sntesis de protenas. Esta fue la primera marcador bioqumico para el oscilador autnomo, pero esta experiencia cin no distingue si MPF condujo el ciclo celular o m erely responsabilidad ded a ella. Casi al mismo tiempo Ryn Miake-leja en mi laboratorio y Lohka Fred en el laboratorio de Masui mostr que parcialmente purificado MPF podra inducir eventos mittica in vitro y con John Newport hemos demostrado que simplemente sumar y restar F MP podra conducir el mittico ciclo completo, incluyendo el ADN replicacin de MPF se convirti en el santo grial de control del ciclo celular en huevos de rana, as como cdc2 se convirti en el santo grial en la levadura. Podra alguien duda de que las dos misiones que llevan al mismo fin?
4. 5 7-9.

El ingrediente ma jor por ltima vez en el ciclo celular se encontr casi por accidente por Tim Hunt y sus alumnos del Curso de Fisiologa en Woods Hole. Tim no estaba buscando un nuevo regulador del ciclo celular, pero fue slo en busca de un experimento sencillo para los estudiantes con vistas al mar huevos de erizo. Su experimento de etiquetado huevos continuamente con S-metionina mostr que una protena, que llamaron la ciclina, oscil en abundancia en cada ciclo celular durante las etapas de divisin sincrnica temprana en erizos de mar. Tim Hunt reconoci que una protena que se acumula en los intervalos entre fase y se degrad durante la mitosis es un candidato perfecto para un activador del ciclo celular. Durante un tiempo pareca que nada poda hacer, pero especular sobre cualquier relacin entre la protena oscilante y la regulacin del ciclo celular, y sobre la ciclina, cdc2 y MPF.
35 10

Hacia un mecanismo general, montaje de la escena Incluso si ciclina haba algn papel en el ciclo celular, no haba ninguna indicacin de que se trataba de un regulador central. Haba, en efecto, razones para creer que la ciclina no poda ser MPF, desde sndrome de protenas tesis no estaba obligado a activar la primera divisin meitica en las ranas. (Ahora sabemos que en la ciclina ovocitos de rana ya ha sido sintetizado y MPF se mantiene en un estado de inactivacin v erelacional de un bloque de posttrans.) Sin embargo, significativamente, tanto en "las ranas y otros huevos, hubo una uni requisito universal para sndrome de protenas tesis para cada divisin mittica. Un requisito para la sntesis de protenas puede parecer

anodina para los estudiantes de gro W y la divisin en las clulas somticas, despus de todo, cada clula debe duplicar todo su contenido antes de cada divisin. Los huevos, sin embargo, parecen haber guardado la mayor parte de los materiales necesarios para muchas divisiones celulares rpida, como las histonas, desoxirribonucletidos y Tubul i n. En retrospectiva, el requisito para la sntesis de protenas es muy importante y result ser una parte ntima de la regulacin del ciclo celular. El desenlace del ciclo de mecanismos celulares bsicos no tard en llegar en los ltimos ocho aos, sobre todo en los ltimos cuatro aos. Hubo varios momentos de gran dramatismo. Primero fue el creeping'sense de la generalidad de los mecanismos, fol seguidas por una apreciacin de por qu la rana y clulas de levadura, que en un principio pareca tan diferentes, se fun cuenta la misma. A riesgo de ofender a algunos, voy a enumerar los puntos altos para m. (1) La complementacin de la levadura cdc2 por un gen homlogo humano de Lee y la enfermera despejado cualquier duda sobre la conservacin de la evolucin del ciclo celular (2) La activacin de ovocitos de rana ma turacin por cl am ciclina ARN por Swenson y Ruderman era un puz Zling resultado en cierto modo, desde la primera divisin meitica no requera la sntesis de protenas nuevas, pero dio la primera indicacin de que las ciclinas podra tener una actividad reguladora (3) El desarrollo de Concentr extractos serie ATED que respondieron al MPF por Manfred Lohka y Masui Yoshio y por John Newport y Ryn Miake leja en mi laboratorio mostraron que la adicin y la eliminacin de MPF podra conducir todo el ciclo celular, por lo que la sntesis de protenas y pre- presumiblemente sintetizando s ciclina fue re requeridas para activar el MPF slo "9. (4) El desarrollo de un extracto que gener MPF activa en ausencia de sntesis de protenas por Martha Cyert en mi laboratorio estimulado la bsqueda de reglamentacintrans-relacional modificaciones posteriores en la activacin vacin del MPF
11. 12. 7 13.

La vinculacin de MPF a cdc2 y en ltima aproximadamente a la ciclina vinieron de muchas di correcciones. cromatografa de afinidad por Dunphy, Beach y Newport sugiri que cdc2 estaba en rana MPF El ar a largo duous tarea de purificar MPF se llev a cabo finalmente por un Lohk y Mailer, quien junto a Jean Gautier confirm la Conferencia conexin entre cdc2 y MPF por im-munoblotting con anti-cdc2 anticuerpos obtenidos a partir de Enfermera La identificacin cin de una actividad quinasa oscilante HI que contena cdc2 en las clulas humanas por el gr upo de playa de y en los huevos de estrellas de mar por Doree ms el apoyo y la generacin generalizados a la identificacin de cdc2 con MPF. Pero si MPF oscil como una actividad, por lo que debe cdc2. Sin embargo, en todos los sistemas cdc2 no parecen variar durante el ciclo celular. Otra cosa que debe ser responsable. El mejor candidato era ciclina, pero la evidencia es puramente circunstancial. Exasperante, una camiseta de ese momento no se conoca ningn mutante de ciclina y por lo tanto no existe ninguna prueba gentica para su papel.
14. 15. 16 17

La reconstitucin in vitro es un objetivo de toda la investigacin bioqumica. La reconstitucin de los procesos complejos, tales como el ciclo celular o mitosis, puede haber parecido imposible di fcil para algunos, pero para m siempre me pareci un pequeo paso en lugar de la inyeccin de un huevo y que sirva como un tubo de ensayo en vivo a apretar el huevo en un tubo de ensayo real y utilizarlo como un sistema in vitro en bioqumica. El huevo de la rana tiene varias ventajas sin igual de este enfoque. Se trata esencialmente de citoplasma puro, que contiene las reservas de los componentes

celulares. Es detenido en un solo estado del ciclo celular, y se puede hacer para pasar de un estado a otro por Adems de las molculas purificadas. En los aos desde 1984, varias reacciones complicadas se han reconstituido de la purificada citoplasma cerca de obtener de huevos de rana. Los ncleos se han reconstituido as como husos mitticos el inicio de ADN eplication r el transporte nuclear y la duplicacin del centrosoma (S. Doxsey y M. Kirschner, no publicado).
18, 19, 20, 21

En 1989, la apoteosis de todos los sistemas in vitro fue la reconstruccin de la va completa de la progresin del ciclo celular por Andrew Murray en mi laboratorio 2. Uso de la rana citoplasma del huevo concentrado empobrecido de las transcripciones endgena, demostr que la ciclina cumplido el requisito de la sntesis de protenas de todo el ciclo celular, medida por la aparicin y desaparicin cclica del MPF, el desglose y la reforma de la membrana nuclear, y des de montaje de montaje del huso mittico y la replicacin del ADN. La sntesis de protenas-requisito buscado durante mucho tiempo para el ciclo de progresin de la clula ha demostrado ser ciclina. Junto con los resultados de T im laboratorio de caza que muestra una nueva ciclina requisito para la progresin del ciclo celular las pruebas bioqumicas que demuestran la asociacin de las ciclinas cdc2 con y la identificacin de uno de los genes del ciclo celular de la levadura como la ciclina "28, la universa l paradigma y bsicos del ciclo celular se estableci (Fig. . 2).
2 23, 24,25 26

El campo del ciclo celular no se ha detenido para consolidar los logros alcanzados desde 1989. Se ha movido en seis direcciones principales a la vez, impulsado por la conservacin aparente de las reacciones bsicas y por la facilidad de pasar de mayor a menor eucariotas-otas y de la gentica a la bioqumica. La ciclina-cdc2 complejo y la mitosis Puede el orquestada secuencia de eventos en la mitosis se atribuye a la activacin de una quinasa individual en un solo lugar y en una sola vez? Almo c / todos los componentes de la clula es radicalmente remodelado en la mitosis.Significa esto que cada uno es un sustrato para cdc2-ciclina o significa que esta protena se encuentra en el nodo de una red de regulacin de las quinasas u otras enzimas que llevan a cabo el proceso mittico o pr? No habr respuesta completa a esta pregunta hasta que cada subproceso de la mitosis es el examen INED. La composicin de la membrana nuclear ha sido la ms clara bio objetivo qumica de MPF. La protena lamina nuclear es un miembro de la clase de bienes no perecederos muy l filamento protenas e intermedios. Su fosforilacin provoca su solubilizacin completa, su-fosforilacin causas dephos montaje. En el ltimo par de aos de trabajo de Gary Ward en mi laboratorio y Peter Mattheus Nigg en el laboratorio de Erich ha demostrado que in vitro MPF fosforila un residuo de serina especficos en las protenas de Lamin Adems, otros sitios en las laminas son fosforilados por quinasas cuya actividad es activado por los FPO. As cdc2, el monarca de todas las quinasas, no es demasiado orgulloso para actuar direccin temente en los substratos mittica comn, sin embargo, tambin acta a travs de intermediarios. El temporal de control complejos en la mitosis es sin duda edly una interaccin de estos intermediarios Aries, que a su vez puede responder al estado de realizacin de eventos especficos. Jue s, incluso si es un MPF-off en que las seales del inicio de la mitosis, los acontecimientos posteriores individual puede darse en un orden temporal debido a un sustrato-producto secuencia impuesta. Lamin desmontaje es slo un proceso de mitosis, cada uno de los otros procesos, tales como la formacin del huso o el reconocimiento Constitucin del retculo endoplasmtico y aparato de Golgi, aunque depende en ltima aproximadamente de ciclina y cdc2, tendr su propia historia de la regulacin.
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La activacin de cdc2 por ciclina La combinacin de la ciclina con cdc2 no im inmediatamente activar la actividad quinasa. Estudios genticos en 5. pombe haban identificado por primera vez en un regulador negativo WEEL, que result ser una tirosina quinasa especfica y una regulacin positiva Lator, Cdc25, que tras un esfuerzo considerable bioqumica demostr ser un miem nmero de una nueva clase de tirosina fosfatasa phatases ambos actuaron en un Antag onistic manera de controlar la actividad final de la ciclina-cdc2 complejo en una sola tirosina en cdc2 identificados por Kathy Gould y Paul Nurse Bio experimentos qumicos en la rana de clulas ex vas identificadas otras dos actividades, una quinasa responsable de la activacin de cdc2 y una fosfatasa responsable de su inactivacin Estas reacciones, que son responsables de la activacin de cdc2 de ciclina, se han estudiado en los extractos o vitr con la adicin de la PU componentes rified por Mark Solomon en mi laboratorio En conjunto, estas reacciones nes constituyen la cooperativa de transicin muy en mitosis que muestra un umbral de concentracin de ciclina y un retraso despus de la adicin de la ciclina. Algunas de estas quinasas y fosfatasas pueden servir como limitante de la velocidad en las actividades de induccin mittico en ciertas etapas de desarrollo cin. En Drosophila, a pesar de la obligacin de ciclina habitual para la entrada en mi apoptosis, la actividad de Cdc25 (la tirosina phosphata se) es la limitacin de velocidad y por lo tanto el control de los elementos principales Estas reacciones tambin son puntos de entrada para la regulacin mento de puestos de control se describen a continuacin.
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La degradacin de la ciclina En 1970, mientras todava era un estudiante graduado, he ledo un comentario memorables de Bob Schimke sobre la degradacin de la protena que sostiene que para que no se dividen las clulas, el volumen de negocios protena podra jugar como seal un papel significativo en el control de ca enzima dad como la transcripcin y traduccin Los aos transcurridos no han sido amables con esta opinin, como receta transicin y el procesamiento del ARN han demostrado en complejidad creble y capacidad de control, mientras que la degradacin de protenas ha sido relegado al papel de un sistema de eliminacin de residuos. Sin embargo, durante este tiempo de los experimentos de fisiologa del ciclo celular oftalmlogos como Pa dee r Arthur mantenido viva la idea de que la acumulacin de las Naciones Unidas protenas estables podra regular transicin siciones en el ciclo celular El campo del ciclo celular ha revivido el inters en la regulacin potencial de historia de la degradacin de protenas. La reaccin ms inusual que ha sido Identificacin entified en el ciclo celular es la destruccin altamente regulada de la ciclina. Ciclina se acumula como 9Aestable de la protena en la interfase y se degrada rpidamente en la anafase ". experimentos de Michael Glotzer y Andrew Murray en mi laboratorio oratoria han demostrado que la estabilidad de la ciclina es controlada por una secuencia de reconocimiento especfico cerca del extremo amino terminal de la molcula Las protenas fusionadas artificialmente a esta secuencia se degradan por la va de la ubiquitina durante la mitosis, pero no en la interfase.Mutantes i n este s cuencia provocar un fallo que se ubiquitina-serie ATED y la falta de ser degradado, lo que conduce a un paro metafase dominante. Cmo este sistema se regula es la terra incognita del ciclo de la investigacin con clulas.
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Ciclina, cdc2 y el Gl / S transicin El G2 / M Paradi GM ha servido como un buen modelo para el Gl / S transiciones y tal vez

otras transiciones en el ciclo celular. Los experimentos genticos de la levadura se haba demostrado que era necesario cdc2 dos veces, una como parte de lo que hoy conocemos como MPF, y como un requisito de ser otro ADN tanto eplication r, un tiempo ligeramente llamado Gl / lmite S Sin embargo, a pesar de estos indicios, el descubrimiento de las ciclinas cdc2 transicin Gl no vino de mirar cdc2 sino que lleg a travs de diferentes experimentos genticos dirigidos a los genes que controlan la sensibilidad a un factor de la detencin o el tamao del control celular Estos genes identificados regulador de las protenas Gl con algunos, aunque homologa dbil para las ciclinas mitticas. Posteriormente se demostr por el laboratorio de Reed, Steve que un conjunto redundante de ciclinas Gl cooperar para impulsar la clula de levadura en la fase S
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complementacin gentica de levaduras mutantes deficientes-ciclina con el ADN humano, as como otras propiedades fisiolgicas han permitido la clonacin de humanos ciclinas Gl Ahora hay pieles hay evidencia de su ex episdica presin en Gl o S y sus combinaciones nacin con cdc2 o una protena estrechamente relacionado llamado CDK2 Es importante hacer hincapi en lo poco que sabemos acerca de 'GI' ciclinas, puesto que no sabemos de ninguna transicin anloga a la G2 / M transicin transicin, ni tampoco sabemos de ningn fsforo phorylated objetivos, ni sabemos si como la fase G2 / M no es un requisito especfico para la degradacin de la ciclina dacin. Sin embargo, el Gl / S transicin est ms cerca del corazn de los bilogos interesados en controlar el crecimiento, ya que m o c clulas de detencin en esa fase del ciclo celular.
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Los objetivos de los reguladores del ciclo celular exgena La regulacin de la divisin celular en la levadura en respuesta a Phero apareamiento Mones es probablemente el mejor-va para entender la diferenciacin celular y el crecimiento celular. La clula de levadura utiliza medios estndar de comunicacin celular a los trans producir una seal de apareamiento especfico que se establecen objetivos de la corriente, a travs de una cascada de quinasas que activan genes especficos. Ira Herskowitz ha sido particularmente entre interesados en los genes activados que yo nhibit ciclo de progresin de la clula, y con Fred Chang encontr que uno de ellos, FAR1, interacta directamente con una de las ciclinas Gl, CLN2 En principio, la va de reglamentacin de toda una ciclina Gl ahora se remonta a una seal extracelular inicial. Con gran rapidez nuevas Gl y G2 ciclinas se han identificado en la levadura. Cada uno tiene su propia historia y el trans-relacional de control transcripcional y cada uno sirve para aclarar y homeosttico mecanismos fisiolgicos que integran el crecimiento, ciclo celular s n DECISI, y las decisiones de desarrollo Aunque nadie pretende que la levadura incorpora la compleja regulacin de los organismos metazoos, es muy probable que muchas de las estrategias de control del ciclo celular sern los primeros en estaba en la levadura.
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En mamferos las clulas somticas n el recin descubierto ciclinas Gl han servido como seuelos para explorar su control. Las herramientas son mucho ms limitadas que las herramientas genticas que se encuentran en la levadura, y en la actualidad no existe sistema bioqumico de ciclinas Gl en clulas de mamfero que AP enfoques de energa e de la en los sistemas in vitro MET en el G2 / M en rana. Sin embargo, en la resultados itial ciclina empate A (una protena ciclina que est hecho a principios de la fase S y se degrada en la mitosis) y algunos de los nuevos ciclinas Gl, como la ciclina E, a los oncogenes recesivos codificacin R B y pl07 y la transcripcin difcil factores tor E2F Estas conexiones sugieren que oncogenes recesivos son los objetivos de la GIquinasa activada regulados por las ciclinas Gl. El propsito de estas fosforilaciones puede ser para controlar la transcripcin o la f ciclinas Gl, un bucle de retroalimentacin automtica que se ha sugerido para las ciclinas Gl en la levadura, y es paralela a la ruta
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de acceso autoactivating postradiational Demostracin de la autopista de las ciclinas G2 en la rana. Puesto de control de los controles Uno de los misterios iniciales de la celda ycle c fue la aparente autonoma de las reacciones del ciclo celular en el huevo de ranas y la dependencia extrema en la levadura. Aunque ya nadie cuestiona la generacin erality de los mecanismos, es evidente que el aspecto exacto de la nueva va resultante se pueden enviar en alquiler esta muy, dependiendo de qu reacciones son determinar la tasa y cul es el camino de reglamentacin formas estn interconectadas por lazos de retroalimentacin y puestos de control. Hartwell y Weinert especficamente busc como controles negativos que podran detener el ciclo celular de la levadura en respuesta a una falla Ure para completar una tarea posterior, sino que opt por la falta de reparacin de dao en el DNA Pensaron que no debe ser una subclase de la radiacin-sen TIVO mutantes que ser sensible, ya que no la detencin del ciclo celular en Onse resp al dao del ADN, y por lo tanto sera deficiente en la asignacin de suficiente tiempo en el ciclo celular de los daos del ADN para ser reparado. Estos control 'Mutantes puntuales han definido varias vas involucradas en el control de retroalimentacin. mutantes similares tambin se han encontrado que el e r gulate la salida de la mitosis en volver respuesta a las anormalidades en el huso mittico En clulas de mamferos, Kishi-moto utiliza un enfoque gentico para ident ify otro sistema de retroalimentacin evidente que implica a las protenas cromosmicas, RCC1, que es un hecho de cambio r GTP para una pequea protena G comn en la clase Ras llamado Ran En la actualidad los mecanismos de deteccin de daos no se conocen y las vas para la regulacin de la maquinaria del ciclo celular son tambin desconocidos. Sin embargo, el conocimiento de estas vas y mejores understandi ng de la bioqumica del ciclo de eventos de clulas promesa de aclarar estas importaciones sistemas de hormiga mucho antes de la 300a edicin de TIBS.
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El futuro est delante de nosotros Como la historia de los ocho-y-un-tercer ao pasado (100 cuestiones de TIBS, y ahora una nueva unidad indispensable de biolgi tiempo de cal) ha demostrado que es intil tratar de predecir el itinerario de descubrimiento, aunque es probable que sea posible elegir algunos de los objetivos. objetivos inmediatos incluyen una mejor descripcin de la bio qumica de los puestos de control y las enzimas que r e gulate la activacin de las quinasas cdc2 y relacionados.Ellos incluyen una descripcin ms completa de abajo objetivos de flujo de la quinasa mittica, una descripcin del proceso de degradacin de la ciclina, y eventos en la fase S que estn regulados por 'Gl' ciclinas el. Nos n id a entender la transicin Gl o transiciones y, en particular si la degradacin de la ciclina se requiere para pasar a la siguiente fase. Las metas a largo plazo sera la de tratar de conectar la regulacin Reglamento de la divisin celular con DESARROLLO las decisiones de capital y hasta t en ervene en divisin de la promocin de la no proliferacin de las clulas o la inhibicin de la divisin de programas liferating clulas. Intervencin en jaque controles de los puntos tambin se podra mejorar la eficacia de la quimioterapia. Si la investigacin sobre el ciclo celular ha hecho ningn aporte a la cultura de la ciencia cia, que se expresa mejor por el lema que se encuentran en cada moneda EE.UU.: E Pluribus Unum, que traducido libremente significa "de muchos sistemas biolgicos, una biografa principio lgico. No s i no cabe duda de que la situacin se complica ms cated en el futuro, ya que hay muchas ciclinas y las protenas

relacionadas con cdc2, y tal vez otras quinasas mitticas. Sin embargo, es especialmente gratificante que lo que surgi surgi de muchas fuentes y muchos as lo enfoques experimentales. Hay una similitud entre los esfuerzos en los ltimos tiempos del ciclo de volver a la clula bsqueda y la prctica comn de la bsqueda de homologas entre las protenas relacionadas. En ambos casos comparacin ayuda a centrar la atencin en el altamente con r s ved y ms importante parte de una secuencia o proceso. La capacidad para amalgamar los resultados de los estudios del ciclo celular de las ranas, la levadura, los erizos de mar y los mamferos nos salv de ser des atrados por las peculiaridades de cada sistema temperatura y facilit una u n rpida comprensin del proceso biolgico en general.