I – INTRODUÇÃO: Enzimas

Para que a vida seja possível, é necessário que as reações químicas que acontecem, aconteçam a uma certa velocidade. Muitas das reações bioquímicas não aconteceriam na velocidade que acontecem nos seres vivos, que são elevadas, se não fossem catalisadas. Nos seres vivos, a catálise de reações químicas é feita por enzimas. As enzimas são proteínas que, atuam como catalisadores na maioria das reações bioquímicas, elas baixam a energia de ativação necessária para que ocorra uma reação química. As enzimas aceleram as reações na ordem de 106 a 1012! Por exemplo, uma enzima que acelerou a reação na ordem de 1012 e concluiu a reação em 1 segundo, se esta reação acontece sem a enzima levaria aproximadamente 317,1 centenas de anos!

Estrutura

Estruturalmente, as enzimas possuem todas as características das proteínas, tendo zonas da sua estrutura responsáveis pela catálise. A zona reativa da enzima é denominada sítio ativo e é onde se liga o substrato que vai ser transformado no produto. Existem também outras zonas da cadeia polipeptídica que são sensíveis à presença de algumas espécies químicas, regulando a atividade da enzima. Essas zonas são denominadas centros alostéricos. A enzima deve manter sua estrutura e isso é importante para sua atividade. Essa estrutura pode ser perdida se a enzima é colocada num meio com um pH, temperatura ou concentração salina que favoreça sua desnaturação. Algumas enzimas não reagem apenas se chocando com o substrato, elas necessitam da presença de outras espécies químicas, cofatores e/ou coenzimas. Os co-fatores e as coenzimas são fundamentais na catálise porque se associam na estrutura da enzima, no sítio ativo ou próximo dele permitindo que o substrato seja ligado e catalisado ao produto. Os cofatores podem ser: podem ser íons metálicos, como o Mg2+, o Zn+ ou o Fe2+, etc. As coenzimas são moléculas orgânicas derivadas de lipídios, vitaminas ou outras moléculas orgânicas e quando estão em solução, eles se associam às enzimas para realizar a catálise, no final da catálise eles são liberados também, sem nenhuma modificação, por isso é chamado de co-fator ou co-enzima. Durante a reação, a enzima pode mudar sua estrutura, mas sempre voltará a sua estrutura inicial depois da reação. Pra que ocorra a uma reação, eu tenho que ter a enzima e o substrato num meio com temperatura, pH e concentração salina regulados, se a minha enzima usar um co-fator e coenzima, eu tenho que ter os 2, se ela usar 1, eu preciso de 1, se não usar ninguém, não preciso de ninguém.

Mecanismo

As enzimas atuam diminuindo a energia de ativação da reação que ela catalisa, elas fazem isso se estabilizando com uma ligação como ponte de sulfeto. Essa energia que estava sendo usada quando a enzima não estava ligada, depois da ligação está disponível para o sistema, essa energia é chamada de energia de energia livre de Gibbs (G), essa energia diminui a energia que é usada para a ativação da reação e torna a reação viável. Essa Em geral, uma enzima catalisa apenas um substrato na pela estrutura do seu sítio ativo. Quando um substrato se liga ao sítio ativo, forma-se o chamado complexo enzimasubstrato (ES). O substrato se altera enquanto se encontra ligado à enzima, transformando-se num produto, e forma o complexo enzima-produto. O produto desligase da enzima e ela está preparada para novo ciclo catalítico.

Explicando melhor:

E+S = o sítio ativo possui cargas, então ele atrai o substrato (que é o bastão no desenho) que também tem cargas, só que opostas as da enzima.

ES = As duas cargas são estabilizadas, a energia que foi disponibilizada para o sistema, a energia livre de Gibbs (G), foi usada para vencer a primeira barreira de ativação. Estado de transição - ele tencionado ao máximo!

EP = Catalise. Transformação do substrato em produto, passando pelo estado de transição. Para a enzima quebrar o bastão ela precisa “forçar”, as cargas que irão tencionar o bastão até quebrar. E + P = Depois do bastão (substrato) quebrado, a enzima está ligada a algo que não é o substrato, então a enzima libera o produto e é formada Enzima + Produto (estado mais estável).

Propriedades

Como são proteínas, e estão sujeitas a se desnaturar, cada enzima possui um pH ótimo e uma temperatura ótima de funcionamento. Fora dessa temperatura a enzima começa a sofrer desnaturação, perdendo a sua estrutura tridimensional e a sua função, que é a capacidade catalítica. As enzimas também sofrem desnaturação a temperaturas baixas. Uma mesma enzima pode catalisar muito rapidamente várias vezes a mesma reação, no entanto, pela mesma razão, as enzimas não alteram o equilíbrio químico da reação que catalisam. As enzimas são específicas para o seu substrato, catalisando uma só reação. Existem algumas enzimas que catalisam substratos similares, mas normalmente são mais específicas para um deles.

Velocidade inicial (Vo)

A maioria dos estudos da enzima é feio in vitro ("em vidro"), isso quer dizer que esse estudo é feito em um lugar fora dos sistemas vivos, em um ambiente controlado e fechado de um laboratório e que são feitos normalmente em recipientes de vidro. Normalmente, os estudos in vitro usam uma concentração de substrato muito superior à concentração de enzima, para que a probabilidade de uma enzima encontrar uma molécula de substrato seja o mais elevada possível. Outra vantagem do uso de uma concentração de substrato ([S]) maior que a concentração de enzima ([E]) é a possibilidade de calcular a variação da velocidade de reação com [E] sem que a [S] varie muito. Como S está a ser convertido em P, a [S] diminui com o tempo, e a [P] aumenta na solução. Como a [S] influência a formação do complexo ES e na formação de produto, ela vai influenciar também a velocidade da reação (V0). Mas se fizermos apenas o cálculo da velocidade inicial da reação, a variação de [S] não é grande e por isso ela pode considerada constante.

a variação de V0 x [S] é linear. à medida que se usam [S] mais elevadas a V0 varia cada vez menos. Convertendo a equação de Michaelis-Menten para gerar o gráfico do DUPLO RECÍPROCO A equação de Michaelis-Menten pode ser transformada numa equação da reta. por um instante. denominado: velocidade máxima.A velocidade medida (velocidade inicial. Vmax. tendendo para um valor limite. as moléculas de enzima não têm capacidade de catalisar todo o substrato. Um gráfico de V0 x [S] apresenta uma forma característica de semi-hipérbole: a baixas concentrações de substrato. a maior parte da enzima em solução está forma livre. do tipo y=ax+b: . quando a [S] está elevada. V0 Vmx a Vmx/2 a Km [S] A baixas concentrações de substrato. Equação de Michaelis-Menten A semi-hipérbole da velocidade de uma enzima pela concentração do substrato (V 0 x [S]) esta na forma da seguinte equação de Michaelis-Menten: KM é a constante de Michaelis. V0) depende apenas de [E]. mas mesmo que a [S] seja alta. na forma ES. todas as enzimas se encontraram.

Esta fórmula que gera um reta determina mais precisamente o Vmax. Um gráfico de Vo-1 (y) por [S]-1 (x) é uma reta igual a Km/V max (a). • Inibidores Os inibidores enzimáticos são compostos que podem diminuir a atividade de uma enzima. Este gráfico é chamado de duplo recíproco pois é uma representação gráfica do recíproco de ambos os parâmetros Vo e [S]. que intercepta o eixo das coordenadas (Y) no ponto Vmax-1 (b). a inibição enzimática pode ser reversível ou irreversível. Outra vantagem na utilização da equação de Lineweaver-Burk é visível em inibição enzimática. Neste caso a Vmax diminui e o Km também diminui. todos eles vão se ligar a enzima. interceptando também o eixo das abcissas (x) no ponto Km-1. a enzima não funciona mais. sendo mais fácil de detectar e distinguir entre diferentes tipos de inibição: ao usar diferentes concentrações de inibidores ou tipos de inibição diferentes.GRAFICO DO DUPLO RECÍPROCO: 1/V Km-1 Vmx a -1 Km/Vmx a [S]-1 A última forma da equação de Michaelis-Menten é conhecida como equação de Lineweaver-Burk. Existem 2 tipos de inibição enzimática Irreversível: O inibidor irreversível se liga ao sítio ativo onde o substrato se ligaria e não desligam. o gráfico do duplo recíproco muda. Abaixo um exemplo: 10E  5E + 10S + 5I 5EI 5ES  5EP 5E + 5P Vmax Vmax INC Vmax/2 Inibidor Irreversível Vmax/2 diminui Km Km diminui . um parâmetro que só se obtém por aproximação num gráfico de Michaelis-Menten.

Vmax não muda e Km aumenta. pois a disponibilidade de ES é menor. Vmax diminui.Inibição Enzimática Reversível Competitiva: Quando o inibidor se liga reversivelmente ao mesmo sítio de ligação do substrato. Este tipo de inibição depende apenas da concentração do inibidor. A ligação do Substrato independe da presença de I. Este tipo de inibição depende das concentrações de substrato e de inibidor. Vmax Inibidor Reversível competivo Vmax/2 Não muda Km Km aumenta . podendo estar ligado à mesma ao mesmo tempo que o substrato.Inibição Enzimática Reversível Não-Competitiva: Quando o inibidor liga-se reversivelmente à enzima em um sítio próprio de ligação. O efeito é revertido aumentando-se a concentração de substrato. eles não competem e Km é constante.Reversíveis: . E+S + I IE + S  ES  + I IES EP E+P Vmax Vmax INC Vmax/2 Vmax/2 diminui Inibidor Reversível nãocompetitivo Km = Km INC .

mas não é proporcional e se comporta de várias formas..Inibição Enzimática Reversível Acompetitiva: O inibidor só é capaz de se ligar a enzima depois do substrato.Gráfico do duplo recíproco das diferentes formas de inibidores: IAC Vo-1 INC IC Sem inibidor IAC – inibidor Acompetitivo (é paralelo à reta sem inibidor) IC – inibidor Competitivo INC – inibidor não-competitivo Km-1 [S]-1 . Vmax diminui poque [ES] diminui. Km diminui. E+S ES  + I IES EP E+P Vmax Vmax IAC Vmax/2 Inibidor Reversível Acompetitivo Vmax/2 diminui Km Km diminui . .Inibição Enzimática Reversível Mista: Vmax diminui e Km diminui.

2 e 5 mL PRÓPIPETES TUBOS DE ENSAIO VORTEX BANHO DE GELO (0ºC) BANHO-MARIA (37ºC) – marca: FISATOM BANHO-MARIA (68ºC) – marca: BIOMATIC CUBETAS ESPECTROFOTÔMETRO – marca: 22 RS SPECTRO Obs.5 SOLUÇÃO PADRÃO DE P-NITRO-FENIL-FOSFATO (PNPP) 10 mM EM TAMPÃO TRIS-HCl pH 9.5 SOLUÇÃO TAMPÃO CITRATO HCl 0.1. 10.5 e 7.5.II – MATERIAL: SOLUÇÃO PADRÃO DE P-NITROFENOL (PNP) 0.5 e 11.1.: Tris = [tris(hidroximetril)aminometano] ou 2-amino-2(hidroximetil).5 SOLUÇÃO TAMPÃO BORATO-NaOH 0. 6.2 M.5 SOLUÇÃO DE NaOH 2 M SOLUÇÃO DE ENZIMA: FOSFATASE ALCALINA (EC 3.5 SOLUÇÃO PADRÃO DE P-NITRO-FENIL-FOSFATO (PNPP) 1 mM EM TAMPÃO TRIS-HCl pH 9.3 M.3. pH 9.022 mg/mL (Sigma Fine Chemicals) PIPETADOR AUTOMÁTICO 20-100 Ul PIPETAS DE 1.5.1 mM EM TAMPÃO TRIS-HCl pH 9. pH 5.1) 0.3 propanodiol .

III . • Determinar o tipo de inibidor utilizado e a sua influência na cinética enzimática. comprovar a influência desses diferentes fatores na atividade e velocidade das reações enzimáticas. • Conhecer as condições ótimas de catálise. .OBJETIVO: Verificar a influência de diferentes fatores físico-químicos sobre a atividade da enzima como: • A partir dos valores obtidos na execução das práticas e suas respectivas representações gráficas.

2 1.2 1.5 Solução tampão Borato-NaOH (mL) pH 9.5 PNPP 1mM (mL) Enzim a (mL) B1 1.1 0.0 4 1.0 6 1.1 mL (100 μL) da solução de enzima aos tubos 1 a 9 em intervalos de 30 segundos.0 8 1.8 2. 3. alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo.4 1. adicionou-se 0.1 0.1 pH 7.5 1.0 mL (com NaOH).0 5 1.2 1.1 0.0 1. Transferiu-se.0 1 1.1 0.1 1.0 9 1.5 (mL) 2M (mL) Branco 3. 0.0 3 0.1 0. exceto a solução de enzima: Tubo nº Solução tampão citrato-HCl (mL) pH 5.2 2. Homogeneizaram-se os tubos manualmente.5 pH 8. com auxílio de pipeta e pró-pipete. 4. com auxilio de pipeta e pró-pipete.4 2.0 Obs: O volume final em todos os tubos foi rigorosamente o mesmo.8 1. Procedeu-se à leitura espectrofotométrica da absorbância.0 2 1.8 1.0 1.1 0. de cada um dos tubos.0 1.0 6 1.1 0.5 pH 10.0 B3 1.5 pH 9.1 5.0 1 0.0 1. Tubo nº 2. Utilizou-se o tubo branco como referência de calibração para o aparelho.0 1. 2. Transferiu-se.IV – PROCEDIMENTO: A) Construção de uma curva padrão de PNP: 1.1 0. Utilizando um pipetador automático.0 1.0 3 1. ou seja. determinando o horário exato de início do ensaio. B) Influência do pH 4.0 7 1. alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo: Solução padrão Tampão Tris-HCl. ou seja.0 4 1. . a 405 nm (filtro azul).1 1.5 Solução tampão Tris-HCl (mL) pH 7.5 pH 11. Solução NaOH de PNP (mL) pH 9.0 1.0 5 1.0 Obs: O volume final em todos os tubos foi rigorosamente o mesmo.1 mL.0 1.0 B2 1.6 1.0 1.5 pH 6.0 2 0.0 1.8 1.6 1.

5 mL (sem NaOH). Incubaram-se os tubos em banho-maria a 37°C por 10 minutos.0 37 0. Paralisou-se a reação adicionando 1.0 Obs: O volume final de todos os tubos foi rigorosamente o mesmo. Homogeneizaram-se os tubos com vigor. exceto a solução de enzima e de NaOH: Tampão Solução H2O PNPP Temperatura Enzima Tris-HCl de NaOH (mL) 1mM (mL) (°C) (mL) pH 9.1 1. adicionou-se 0.0 1.1 1.9 1.1 1.0 4B 0. Tubo nº 12. 10.5 2. 13. Homogeneizaram-se os tubos com vigor.9 1. B2 e B3) de cada um dos tampões como referência de calibração para o aparelho. 8.6.5 1. Incubou-se cada um dos tubos por 10 minutos cada um na temperatura indicada.0 25 1.0 mL de NaOH 2M aos tubos de 1 a 9 em intervalos de 30 segundos. Procedeu-se a leitura espectrofotométrica da absorbância.0 1. e posteriormente aos tubos restantes. 9. com auxilio de pipeta e pró-pipete. a 405 nm (filtro azul).0 2 0. alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo. 15. de cada um dos tubos. Utilizando o pipetador automático.0 3B 0.5 2.5 1. 3.0 1 0. D) Curso Temporal 18.1 1.0 68 1. alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo. Foi transferido com auxílio de pipeta e pró-pipete. exceto a solução de enzima e de NaOH: Tubo Tampão H2O PNPP 1 Enzima Tempo Solução de .0 0 0.0 mL de NaOH 2M aos tubos de 1 a 4 em intervalos de 30 segundos.0 68 0.0 2B 0.5 2.9 1. ou seja. Homogeneizaram-se os tubos com vigor.5 (mL) 1B 0.0 0 1.5 1. de cada um dos tubos.0 1.9 1.0 3 0. Homogeneizaram-se os tubos com vigor 7. determinando o horário exato de início do ensaio. a 405 nm (filtro azul). 17.0 37 1.5 1.1 mL (100 μm) da solução de enzima aos tubos 1 a 4 em intervalos de 30 segundos. Transferiu-se.0 25 0. Utilizaram-se os tubos brancos como referência de calibração para cada um dos tubos no aparelho. Paralisou-se a reação adicionando 1. 14.0 1. Utilizaram-se os tubos brancos (B1. C) Influência da temperatura 11.5 2. 16. Procedeu-se a leitura espectrofotométrica da absorbância.0 4 0.

1 30 1. utilizando o “tubo branco” como referência de calibração para o aparelho.5 2.1 0 1.5 0.0 0.5 1.1 0.5 2.5 1.1 1.1 1. 28.0 mL da solução de NaOH ao tubo B. determinando o horário exato de início do ensaio.5 1.0 0.1 9 1.5 0.7 0.0 0. 19.0 0. Foi transferido com auxílio de pipeta e pró-pipete. 27. 30. Foi utilizado um pipetador automático para adicionar 0. 28.1 6 1.5 2.5 1.2 0. Foi utilizado um pipetador automático para adicionar 0.6 mL (sem NaOH).1 1. 23. Utilizando um pipetador automático.2 0.0 0.1 12 1.7 1. ou seja.1 1. Foram homogeneizados os tubos com vigor.5 2. E) Curva do substrato 26.2 0. ou seja.0 0. 20.5 1.5 1.0 0. em cada um dos tubos.0 0.1 1.0 0.0 0.0 0. foi adicionado 1. 29.1 3 1.5 2.: O Tris-HCl pH (ml) mM (ml) (ml) (min) NaOH (ml) 9. de cada um dos tubos.0 0.0 1.0 0.0 0. 21. Os tubos foram homogeneizados com vigor.5 1.1 1.0 0.0 0.3 0.1 mL (100 µM) da solução de enzima aos tubos em intervalos de 30 segundos.5 (mL) 0.1 mL (sem NaOH).3 0.0 1.1 1.1 1.2 0.0 0.0 1.5 1.1 1.0 1. A leitura espectrofotométrica da absorbância foi feita a 405 nM (filtro azul).0 0.1 0.3 2.8 0.0 1.4 0.5 2.9 0.0 0.0 da solução de NaOH. 24.0 0.6 0.1 1.0 0.1 mL (100 uL) da solução de enzima.5 0.1 45 1.4 0. .0 0.1 1.4 0.0 final de todos os tubos é o mesmo.1 1.0 0.5 0. Todos os tubos foram encubados em banho-maria à 37ºC.1 2. 32.1 1.0 0.: O volume TAMPÃO H2 O PNPP 10 ENZIMA Solução Tris-HCl pH (mL) mM (mL) (mL) de NaOH 9.0 0. Os cubos foram incubados em banho-maria a 37ºC a 15 minutos. Foram homogeneizados os tubos com vigor.0 0.5 0.1 1.0 0. e depois aos tubos restantes.1 15 1.0 0. Foram homogeneizados os tubos com vigor. Respeitando o tempo de encubação de cada amostra.0 1. exceto a solução de enzima e de NaOH: TUBO Nº B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Obs.0 1. A reação foi paralisada adicionando 1.1 mL (100 uL) da solução de enzima aos tubos 1 à 7 em intervalos de 30 segundos determinando o intervalo exato de início do ensaio. e em seguida foi adicionado 0. 3. alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo.5 1. A reação foi paralisada adicionando 1.5 1.5 1.5 2.5 0.5 0.5 1.5 1. 25.0 0.8 0. 2.nº B 1 2 3 4 5 6 7 Obs. Foi efetuada a leitura espectrofotométrica da absorbância a 405 nM (filtro azul). 22.0 1.0 mL de NaOH 2M aos tubos em intervalos de 30 segundos.3 1. foi utilizado o tubo “branco” como referência de calibração para o aparelho.0 volume final de todos os tubos é o mesmo.0 0.

8 0. 35.0 0. utilizando o tubo “branco” como referência de calibração para o aparelho. Foi utilizado um pipetador automático para adicionar 0. 3.0 0.1 2.2 0.000 1.004 1.8 0. ou seja.006 1. 36.1 1. de cada um dos tubos.1 0.5 12 0.4 0.1 2.7 0.2 0. Foram homogeneizados os tubos com vigor.1 1.005 1.2 0.045 (sem NaOH).009 1.0 0.5 3 0.1 1.5 0.021 1.1 1. Foram homogeneizados os tubos com vigor e procedida a leitura espectrofotométrica da absorbância.1 mL (100 ul) da solução de enzima aos tubos em intervalos de 30 segundos.5 10 0.5 2 0.5 11 0. 37.5 9 0.035 1.1 todos os tubos é o mesmo.007 1.0 0.1 mL 1.: O volume final de H2 O (mL) PNPP 1 (mL) substrato mM ENZIMA (mL) Solução de NaOH (mL) Leitura da Abs (405 nM) 2.1 2.1 0.0 0. exceto a solução de enzima e de NaOH: TUBO Nº TAMPÃO Tris-PiHCl pH 9.5 2.1 0.7 1. 36.6 0.5 4 0.042 1.031 1.4 0.0 0.0 0.1 0.5 1 0. A reação foi paralisada adicionando 1.5 B 0. a 405 nM (filtro azul).3 2.5 5 0. .0 0.5 0. 34.1 0.041 1.3 0.0 0.5 8 0.0 mL de NaOH 2M aos tubos em intervalos de 30 segundos.0 0.1 2. Foi transferido alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo. Todos os tubos foram encubados em banho-maria a 37ºC por 15 minutos.4 0.5 1.0 0.1 0.013 1.F) Influência do inibidor 33.0 0.5 7 0.3 0.0 0.5 6 0.5 Obs.1 2.0 0.0 0.9 0.0 0.3 1.1 2.2 0.5 13 0.005 1.

030 mM 0.1000 mL 0.4.020 0.005 0.00018 mmols 0.045 mM 3.1000 mL x = 0.1000 mL x = 0.4 mL x = 0.4 mL x = 0.030 0.1 mM xNP -----.4.000x2 mmols ----.00018 mmols ----.068 0.502 0.1000 mL 0.V – RESULTADOS: a) Avaliação cinética da reação: 1.1.00008 mmols Tubo 4 0.00x02 mmols ----.035 mM 0.1 mM xNP -----.1000 mL 0.00x02 mmols ----.000x2 mmols ----.1 mM xNP -----.1000 mL x = 0.0.035 0.1000 mL 0.4.1000 mL 0.0 mL 0.1 mM xNP -----.00004 mmols Tubo 3 0.1000 mL x = 0.00012 mmols Tubo 5 0.1 mM PNP -----.005 mM 0.010 mM 0.00008 mmols ----.1 mM xNP -----.00012 mmols ----.0.1 mM xNP -----.1.00014 mmols Tubo 6 0.445 0. Concentração nos tubos: Tubo nº 1 2 3 4 5 6 [PNP] em mM 0.1 mM PNP -----.010 0.317 0.1000 mL x = 0.4.175 0.4.0 mL 0. Cálculo das concentrações de PNP para a construção da curva padrão: Tubo 1 0.1.0.1000 mL 0.8 mL x = 0.2 mL x = 0.1 mM PNP -----. Leitura da absorbância Tubo B 1 2 3 4 5 6 Abs (405 nm) 0.00x02 mmols ----.1 mM PNP -----.2 mL x = 0.8 mL x = 0.0 mL 0.00002 mmols Tubo 2 0.000 0.000x2 mmols ----.0 mL 0.00004 mmols ----.020 mM 0.045 .4.1 mM PNP -----.592 2.1000 mL x = 0.1 mM PNP -----.0 mL 0.00002 mmols ----.0 mL 0.00014 mmols ----.

32) a= a= ∆y ∆x 0. Leitura da absorbância: Tubo B1 1 2 3 Abs (405 nm) 0.040 0.020.00769 0.030.100 0.000 0.45) e B (0.149 0.68 x 10-3 .219 ÷a 13 13 = [PNP] (mM) 0.139 0.000 0.367 Tubo B3 7 8 9 Abs (405 nm) 0.000 0.0. Cálculo da equação da reta: y = ax • Escolhidos dois pontos na reta: A (0. Cálculo da velocidade da reação: y a x = [PNP ] x= [ PNP ] t = 10 min t [ PNP ] V = mM / min 10 V = Abs (405 nm) Abs1 Abs2 y 0.219 0.214 Tubo B2 4 5 6 Abs (405 nm) 0.100 0.0168 V = [PNP]/t 7.010 ∆ x 1 =0.13 = 13 0.010 2.149 0.07692= FCM= ∆ y 1 3 b) Influência do pH 1.4.0.69 x 10-4 1.

5 pH 9.5 pH 6.000354 0.214 0.07 x 10-3 2.54 x 10-5 pH Solução tampão Citratato-HCl (mL) pH 5.5 V = [PNP]/min 0.82 x 10-3 1.65 x 10-3 1.5 c) Influência da Temperatura: 1.149 0.001 0.Abs3 Abs4 Abs5 Abs6 Abs7 Abs8 Abs9 0.002 13 13 13 13 13 13 13 0.5 11.0282 0.000769 0.5 pH 9.002 Citrato [PN / m 0.5 pH 7.15 x 10-3 1.0025 0.00107 0.5 pH 11.367 0.54 x 10-4 1. Leitura da Absorbância Tubo Abs (405 nm) .139 0.0000154 In ê ciad p Vx[p ] flu n o H H 0.00282 0.0015 P] in Tris Borato 0.5 pH 10.000154 1.5 pH 8.003 0.046 0.5 Solução tampão Tris-HCl (mL) pH 7.0107 0.149 0.5 6.00168 0.00115 0.5 Solução tampão Borato-NaOH (mL) pH 9.15 x 10-3 3.5 10.0115 0.5 8.00354 0.0005 0 4.00165 0.0115 0.5 5.00115 0.5 7.0165 0.

.68 4.40E-03 1.B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 0.00E-04 4.0168 0.00461 V = [PNP]/t 5.000 0. o valor das absorbâncias foram obtidos com o Grupo 1. 10-3 1.60E-03 1.060 ÷a 13 13 13 13 = [PNP] (mM) 0. . min 10-4 10-3 10-3 10-4 Influência da Temperatura [PNP] / min 1. Cálculo da velocidade da reação y a x = [PNP ] x= [ PNP ] V = t = 10 min t [ PNP ] V = mM / min 10 Abs (405 nm) Abs1 Abs2 Abs3 Abs4 y 0. 10-4 Tubo nº 1 2 3 4 Temperatura em ºC 0 25 37 68 [PNP] 5.219 0.000 0.00E-04 0.165 0.00E-04 2.00E-04 6. 10-3 4.0127 0.073 0.20E-03 1.00561 0.073 0.61 / .61 1.61 .68 .00E+00 0°C 25°C V x temperatura T m ra e pe tura 37°C 68°C d) Curso temporal: • Como esta parte da prática não foi realizado pelo grupo. 10-4 1.000 0.27 1.00E-03 8.80E-03 1.219 0.165 0. por falta de tempo.27 . . .000 0.61 .060 2.

Leitura da absorbância Tubo B 1 2 3 4 5 6 7 Abs (405 nm) 0. 10-2 3.57 .334 0. 10-2 .183 0.38 .1. 10-2 2. 10-2 3. 10-2 5. 10-2 4. 10-2 • Tempo de incubação e [PNP]: Tubo nº Tempo (min) 1 3:00 2 6:00 3 9:00 4 12:00 5 15:00 6 30:00 7 45:00 [PNP] 8. 10-2 2.03 .77 .03 .2 . 10-3 0.620 0. 10-2 2.284 0.395 0.700 ÷a 13 13 13 13 13 13 13 = [PNP] 8.77 .014 .08 .38 .105 0.620 0.57 .183 0. 10-2 0.08 .395 0. 10-2 4.022 .700 2. Cálculo da concentração de produto y a x = [PNP ] x= Abs (405 nm) Abs1 Abs2 Abs3 Abs4 Abs5 Abs6 Abs7 y 0.284 0.105 0.334 0. 10-2 5.000 0. 10-3 1.4 .

por falta de tempo.386 0.150 0.118 0.04 0.203 0.Curso Temporal V x tempo(min) [PNP] (mM) 0.339 0.462 0.02 0.123 0.377 0.419 0.146 0.160 0. LEITURA DA ABSORBÂNCIA (405 nm) Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Professor 0.367 0.370 0.416 0.519 0.407 0.384 0.03 0.166 0.057 0.256 0.317 0.197 0.05 0.141 0.555 0.214 0.418 0.272 0.084 0.239 0.177 0.307 0. o valor das absorbâncias foram obtidos fazendo uma média dos resultados dos outros grupos.517 Tubo nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 .307 0.235 0.491 0.197 0.539 0.252 0.06 0.01 0 0 10 20 30 40 50 Tempo (min) e) Curva de Substrato 1.135 0.382 0.147 0.086 0.340 0.312 0.080 0.221 0.108 0.491 0.433 0.367 0. Leitura da absorbância: • Como esta parte da prática não foi realizado pelo nosso grupo.375 0.302 0.

2 0.3765 0.013 0.• Como são 4.93 x 10-3 1.371 0. a média foi feita da seguinte forma: foram pegos 4 valores por ponto e descartados o mais alta e o mais baixo e foi feita a média com os valores que sobraram.302 0.262 0.43 x 10-3 1.05 x 10-3 .3095 0.384 0.011 0.031 0.031 V=[PNP]/t 7.015 0.375 0.272 0.021 0. os grupos que obtiveram os valores da Abs.172 0.4 Tubo nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 2.028 0.3285 0.147 0. LEITURA DA ABSORBÂNCIA (405 nm) Grupo 2 Grupo 3 Média Aritmética 0.68 x 10-3 1.235 0.36 x 10-4 8.221 0.279 0.146 0.197 0.4 ÷a 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 = [PNP] 0.3885 0.279 0.228 0.3285 0.82 x10-4 1.382 0. Cálculo da velocidade da reação y a x =[PNP ] x= [ PNP ] t = 15 min t [ PNP ] V = mM / min 15 V = Abs (405 nm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 y 0.1435 0.17 x 10-3 1.030 0.99 x 10-3 2.256 0.025 0.407 0.34 x 10-3 1.307 0.317 0.371 0.9 x 10-3 1.4015 0.06 x 10-3 2.172 0.312 0.370 0.203 0.59 x 10-3 1.252 0.367 0.3765 0.141 0.2 0.029 0.367 0.02 x 10-3 1.262 0.3095 0.024 0.4015 0.386 0.017 0.1435 0.3885 0.418 0.197 0.228 0.419 0.020 0.340 0.

1 mL 0.0 mL x = 0.1 mL 0.3.006 mmol ----.008 mmol Tubo 7 10 mM PNPP -----.1000 mL .81 mM 0.1 mM xNP -----.1000 mL 0.58 mM 0.022 mmol ----.645 mM 0.024 mmol Tubo 13 10 mM PNPP -----.1 mL 0.45 mM 0.3.323 mM 0.1 mL 0.29 mM 0.1 mM xNP -----.1000 mL 0.000x2 ols ----.0.0 0x ols ----.1000 mL x = 7.10 mM 0.1 mM xNP -----.1000 mL x = 0.6 mL x = 0.0 0x ols ----.3.000x2 ols ----.1000 mL 0.1.3.87 mM 0.1 mM xNP -----.010 mmol ----.1 mM xNP -----.0 0x ols ----.1 mM xNP -----.010 mmol Tubo 8 10 mM PNPP -----.1 mM xNP -----.1000 mL x = 1.1000 mL 0.1000 mL x = 6.1 mL 0.0.1000 mL x = 0.3.1000 mL 0.0 0x ols ----.968 mM 0.2 mL x = 0.4 mL x = 0.1000 mL 0.1 mM xNP -----.94 mM 0.0 0x ols ----.1000 mL 0.024 mmol ----.000x2 ols ----.012 mmol Tubo 9 10 mM PNPP -----.3.0 mL x = 0.022 mmol Tubo 12 10 mM PNPP -----.1000 mL 0.1000 mL 0.1 mL 0.003 mmol Tubo 4 10 mM PNPP -----.2.3 mL x = 0.1 mL 0.018 mmol ----.000x2 ols ----.0 mL x = 0.3.1 mL 0.1 mL 0.006 mmol Tubo 6 10 mM PNPP -----.3.3.1000 mL x = 0.0 0x ols ----.1 mL 0.002 mmol Tubo 3 10 mM PNPP -----.3.001 mmol Tubo 2 10 mM PNPP -----.001 mmol ----.1 mM xNP -----.1000 mL x = 3.2 mL x = 0.1000 mL 0.1000 mL x = 7.000x2 ols ----.3.0 0x ols ----.000x2 ols ----.004 mmol ----.1 mL 0.1 mM xNP -----.2.5 mL 0.1.025 mmol ----.3.2.003 mmol ----.1 mL x = 0.002 mmol ----.008 mmol ----.8 mL x = 0.1 mM xNP -----.1000 mL x = 2.018 mmol Tubo 10 10 mM PNPP -----.1 mM xNP -----.2.020 mmol Tubo 11 10 mM PNPP -----.1000 mL 0.1 mM xNP -----.1 mL 0.0.0 mL x = 0.012 mmol ----.1000 mL 0.1 mL 0.1000 mL x = 5.1000 mL 0. Cálculos da concentração de substrato nos tubos: Tubo 1 10 mM PNPP -----.74 mM 0.23 mM 0.0.4 mL x = 0.020 mmol ----.0.3.004 mmol Tubo 5 10 mM PNPP -----.1000 mL x = 1.0.1.1000 mL x = 3.3.

97 1.29 1.001 0.68 x 10-3 1.43 x 10-3 1.74 8.000 0.968 1.81 6.041 .323 0.4 0.004 0.17 x 10-3 1.2 1.02 x 10-3 1.8 1.6 0.99 x 10-3 2.0 1.81 6.3 0.06 x 10-3 2.005 0.29 1.82 x 10-4 1.94 2.07 mM Tubo nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 [PNPP] (mM) 0.1 0.031 0.34 x 10-3 1.07 V = [PNP] / min 7.94 2.645 0.005 0.0005 0 0 0.1 7.45 7.07 [PNPP] f) Influência do inibidor 1.36 x 10-4 8.2 0.32 0.23 3.013 0.59 x 10-3 1.87 5.002 0.93 x 10-3 1.009 0.45 7.006 0.05 x 10-3 Curva de Substrato sem inibidor Vo x [PNPP] [PNP] / min 0. Leitura da absorbância: TUBO Nº B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PNPP 1 (mL) substrato 0.74 8.0 mM Leitura da Abs (405 nM) 0.58 3.87 5.8 2.10 7.007 0.23 3.9 x 10-3 1.x = 0.0025 0.021 0.0015 0.58 3.65 0.025 mmol x = 8.

042 0.23 x 10-3 2.11 12 13 2. 10-5 2. 10-5 2.1 x 10-4 2.021 0.46 x 10-3 V=[PNP]/t 2.564 x 10-5 3.968 1.009 0.08 x 10-5 3.59 x 10-4 2.92 x 10-4 1.564 x 10-5 3.4 2.07 x 10-4 6.077 x 10-4 3.045 ÷a 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 = [PNP] 3. a [PNPP] foi usada novamente.08 x 10-5 3.38 x 10-3 3.59 x 10-5 4.564 x 10-5 1.005 0.645 0.31 x 10-4 • Como concentração do substrato já foi calcula anteriormente e o volume da solução é o mesmo.69 x 10-3 3.29 1.042 0.035 0.07 V=[PNP]/t 2.004 0.87 5.2 2.031 0. Tubo nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 [PNPP] (mM) 0.15 x 10-4 1.61 x 10-5 1.31 x 10-4 .81 6.05 .07 x 10-4 6.1 x 10-4 2.10 7.38 x 10-4 6.005 0.61 x 10-4 5.15 x 10-4 1.61 x 10-3 1.013 0.846 x 10-4 4.05 .67 x 10-5 2.58 3.79 x 10-4 2.23 3.564 x 10-5 1.045 2.59 x 10-5 4.846 x 10-4 2.035 0.79 x 10-4 2. Cálculo da velocidade da reação y a x =[PNP ] x= [ PNP ] t = 15 min t [ PNP ] V = mM / min 15 V = Abs (405 nm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 y 0.00 x 10-3 3.006 0.94 2.007 0.323 0.61 x 10-5 1.59 x 10-4 2.041 0.15 x 10-3 3.74 8.5 0.67 x 10-5 2.45 7.

8 .95 .775 0.0025 0.002 0.13 .0015 0.310 0. 102 . 103 9.00005 0 [PNPP] 3. sobrepondo os dois. 103 1.29 .99 .258 y= 1 V 1.3 .36 .55 1.00015 0.09 1.8 . 102 8.001 0. Agora.0002 0.9 .515 0.2 .2 .388 0. 102 7.Curva de Substrato com inibidor V x [PNPP] [PNP] / min 0. Duplo recíproco SEM INIBIDOR: Inverso da velocidade x Inverso da concentração de substrato Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 x= 1 [P P ] NP 3.55 .1 7 9 3 0 2 5 4 8 7 1 5 4 . 102 6.4 . 102 6.00025 0. com e sem inibidor.9 .46 .7 0 0 0 1 1 2 3 3 5 6 7 8 . Curva de Substrato com e sem inibidor V x [PNPP] Sem inibidor Com inibidor [PNP] / min 0.5 .03 0.0 7 7 [ PP] PN 4.0005 0 .0001 0. 102 5.6 .8 .

85 4. .18 5.6 4 5 Quando 7 .002274 =1 / b =1 / 439 .124 5. . a reta corda o eixo da abscissa. y=0 .8 3 0 • A reta corta o eixo do x em -0.6 4 3 3 5 0 =5 na equação .5 -200 0 0.6 =5 7 . .2 m y =5 7 .141 0.88 .65 ∴ K m Vm ax =a ∴ a =5 7 .129 0.9 10 11 12 13 0.803.13 x +439 da reta.13x + 439. 4 9 .1 x +4 9 .1 4 3 Vm ax =0.1 x0.0 2 7 024 K =5 7 . . 1 =b∴ Vmáx Vmáx Vmáx = 0.0 2 7 m 4 3 024 K =1.65 -1 -0. .5 1 1. Cálculo de Vmáx e Km a partir da construção do duplo-recíproco • Os dois últimos valores foram descartados por estarem muito distantes da reta Y.5 1/[S] 5.172 0.1 x 3 5 4 3 x =0. 102 102 102 102 102 Método de Duplo Recíproco V x [S] 1/Vo 1200 1000 800 600 400 200 0 y = 547.155 0.26 5.02 4.

515 0.4 1/[S] 0.388 0.4 0 -0. Duplo recíproco SEM INIBIDOR: Inverso da velocidade x Inverso da concentração de substrato Tubo nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 • x= 1 [P P ] NP 3.55 1.172 0.2-5000 0 0.124 y= 1 V 48780 39001 32467 27855 21692 9346 14992 39001 6289 4762 4651 5586 4329 Novamente os dois últimos valores foram descartados por estarem muito distantes da reta Y.6.2 5.4 -5247. y=0 .4 1 1.09 1. Y=31019x+5247.6 0. Cálculo de Vmáx e Km a partir da construção do duplo-recíproco 1 =b∴ Vmáx =1 / b =1 / 5247 .000190 K m Vm ax =a ∴ a =31 19 0 Vm ax =0.169 .8 y = 31019x + 5247.4 ∴ Vmáx Vmáx = 0.4=31019x x=-0.2 0.129 0.258 0.9 m 1 Quando na equação da reta.155 0.4 0=31019x+5247.310 0.0 1 m 09 00 90 K =5.141 0.0 0 0 0 19 K =31 1 x0.03 0. V x [S] Método de Duplo Recíproco 45000 40000 35000 30000 25000 1/V 20000 15000 10000 5000 -0. a reta corda o eixo da abscissa.775 0.

5. • A faixa de pH 7. d. ou seja. b. a temperaturas muito altas ou muito baixas.5 do tampão Tris-HCl apresentou as maiores velocidades e o tampão borato-NaOH. e. teve a maior velocidade.• A reta corta o eixo do x em -0. ou seja. portanto ele possuía a menor eficiência para a enzima. ou seja. ela ainda apresentou uma pequena atividade. • A temperatura de 68°C ocasionou em uma desnaturação da enzima. • Na reação de formação de produto a enzima catalisa o PNPP formando o produto PNP que é um fosfato alcalino. • O tampão Tris-HCl. pois foi consumido pela enzima. . visto pela faixa linear do gráfico da curva de substrato obtido. O gráfico. de pH 9.1692. Vmax).5 – 9. • Como era de se esperar. • A curva que representa a presença do inibidor demonstrou valores de velocidades muito inferiores às velocidades da curva sem inibidor. Comprovada pelo do gráfico. Quando a concentração de substrato aumenta a enzima se encontra saturada por ele. não houve desnaturação. indicando presença de produto). esse aumento de absorbância e produto é representado por um gráfico linear e sua equação é determinada com os cálculos a partir dos pontos A e B da curva padrão. Construção da curva padrão de PNP • O aumento da concentração de PNP progressiva em cada um dos tubos induz a um aumento proporcional das absorbâncias observadas no espectrofotômetro. A menor velocidade foi com o pH 11. indicando a eficiência inibitória. porque o substrato vai acabando. observada no gráfico e na prática (tubo estava um pouco amarelo. no entanto. Curso Temporal • O aumento do tempo de incubação ou reação faz com que aumente a concentração do produto formado é representado pela faixa linear progressiva do gráfico.5. • À medida que a reação prossegue. já que a formação de produto perde velocidade.5. Curva de Substrato: • Quando a concentração de substrato é pequena. indicando assim uma temperatura ótima. a velocidade inicial é diretamente proporcional à concentração do substrato [PNPP]. Influência da Temperatura • A enzima apresentou maior atividade (velocidade) na temperatura de 37°C. apresentou as menores velocidades. Influência do pH • A enzima teve atividade em todas as faixas de pH. e a velocidade não depende mais da concentração (nesse ponto a velocidade tende à máxima. a maior eficácia. a velocidade de formação de produto vai diminuindo. c. portanto é modificado. VI – DISCUSSÃO: a.5 à 11. a atividade enzimática é reduzida. resultando na redução da velocidade. na faixa de pH 9.

foram compreendidas e provadas através da prática de enzimas. Importância dos tubos brancos nos experimentos • No tubo branco. .f. • As teorias. afetando tanto o KM quanto a velocidade máxima da reação. • revelou-se um inibidor misto. comprovamos que alterações do meio em que está a enzima e o substrato interferem na cinética enzimática. então ele pode afirmar que nesse tubo a absorbância é 0 (zero) e a partir daí atribuir valores de absorbância ou transmitância ao tubos com produto formado. VII – CONCLUSÃO FINAL: • Atingimos o objetivo. ou seja. pois o Km aumentou e Vmáx diminuiu. os valores de absorbância dos tubos seguintes puderam ser coerentes com as suas concentrações. Somente com o uso desse tubo. afetando tanto o KM quanto a velocidade máxima da reação. g. a concentração de PNP (produto) é nula. transmitância “100”. dadas em sala de aula. então calibrando o espectrofotômetro em absorbância “0”. Duplo-Recíproco: • A partir da construção do gráfico duplo-recíproco não foi possível identificar o inibidor correto. • De acordo com o observado no gráfico o inibidor revelou-se um inibidor misto.

4ª edição. Richard A. Lubert. Porto Alegre. Bioquímica Ilustrada. Editora Guanabara-Koogan. 6ª reimpressão Ed Edgard Blücher ltda.. John L. 2004. Editora Artmed. & HARVEY. Jeremy M. • CHAMPE. Editora Guanabara-Koogan. 7ª reimpressão. Albert L. São Paulo. 2ª edição.VIII – BIBLIOGRAFIA: • BERG. 1996. . TYMOCZKO. Rio de Janeiro. • LEHNINGER. 5ª edição. Rio de Janeiro. 1967. 2ª edição. Bioquímica – Compontentes moleculares da célula.. Lubert. Pámela C. Bioquímica. • STRYER. STRYER. 1996. Bioquímica.