A30.

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ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE (analítica e preparativa)
PREPARAÇÃO DO GEL DE AGAROSE:
1. Para 100mL de gel, pesar 0,8g de agarose. 2. Adicionar 100mL de TAE 1X. 3. Fundir a solução no microondas até homogeneizar (sugestão: 2 a 2,5 min, potência 7). 4. Enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte de gel, selando as laterais com fita crepe ou na própria cuba. 5. Acrescentar 5µL de Brometo de Etídeo (10mg/mL) e misturar com agitação leve. Obs.: Brometo de Etídio é mutagênico e deve ser manuseado com luvas. 6. Despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas. 7. Colocar o pente da espessura desejada no suporte. Obs.: Verificar o número e o volume das amostras para escolher o pente mais adequado. 8. Esperar a solução solidificar. 9. Colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese. Adicionar tampão TAE 1X até cobrir a superfície do gel.

ANALÍTICA:
1. Extrair 3µL da amostra de DNA. 2. Homogeinizar com 1µL de tampão de corrida 5X (Loading Buffer). 3. Aplicar as amostras nos poços. 4. Reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida (Ladder-1Kb). 5. Ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média utilizada 80V). 6. Analisar o gel sob radiação ultravioleta (Alpha Imager). 7. Tirar foto dos resultados obtidos.

PREPARATIVA:
• • Adicionar tampão de corrida ao material a ser purificado (diluição de 5X). Aplicar as amostras nos poços, pulando um poço entre cada amostra para evitar contaminação. Para volumes maiores, montar o gel com o pente de dentes largos ou unir os dentes do pente com fita adesiva antes de colocar o pente no gel ainda líquido (morno). • • • • • Aplicar em outro poço o padrão de tamanho molecular (Ladder-1kb). Ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (média utilizada 80V). Vizualizar as bandas no gel utilizando a luz ultravioleta manual no comprimento de onda longo. Cortar a banda desejada utilizando bisturi limpo e colocá-la em um tubo de microcentrífuga previamente pesado. Seguir protocolo de Purificação de DNA a partir de Gel.

Protocolos – Sandro R. Valentini

NaCl 50mM.Tris 40mM.0mL 1000.2 SOLUÇÕES: • Tampão de corrida: solução TAE 1X ( Tampão Tris-Acetate .p. guardar a 4 C. 100mL o Agitar durante 16 horas.0 q.1µg/µL) Tampão (Tris 10mM pH7. EDTA 0.0625g 0. Acetico 20mM.s.p.0mL p/ 1L 242.125%) Xileno Cianol (0.0g 57. EDTA 1mM) diluir a solução estoque 50x em água Milli-Q • TAE 50X (Solução estoque) Trizma-Base Ácido acético glacial EDTA 0.1mL 100.p.s. obs.1mM) Loading Buffer 5X • (0.0mL 0. • Padrão de tamanho molecular ( Ladder-1kb) Ladder 1kb (Gibco BRL . Valentini . • Tampão de amostra 5X ( Loading Buffer ) Glicerol (50%) Azul de Bromofenol (0.0625g 50.A30.125%) TE pH8.s. Ac.5M pH 8.0mL Brometo de etídeo (10mg/mL) Brometo de etídeo 1g Água Milli-Q q.: concentração no gel: 5µg/mL Protocolos – Sandro R.5.1µg/µL) 100µL 500µL 400µL p/ 50mL 25.0 água q.