La transmisión de la hepatitis C por inoculación intrahepática con ARN transcrito

1. 2. 3. 4. 5. 6. Alexander Kolykhalov A. , Eugene V. Agapov , Keril J. Tizón , Kathleen Mihalik , Stephen M. Feinstone y Charles M. arroz * +Afiliaciones de los autores 1. Kolykhalov AA, Agapov EV, Tizón KJ, arroz CM, Departamento de Microbiología Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, 660 South Euclid Avenue, St. Louis, MO 63110-1093, EE.UU. 2. Mihalik K. y Feinstone SM de la División de Virología del Centro de Evaluación e Investigación de Productos Biológicos, Administración de Alimentos y Medicamentos, Bethesda, MD 20892, EE.UU. RESUMEN Más del 1% de la población mundial está crónicamente infectadas con el virus de la hepatitis C (VHC).infección por el VHC puede dar lugar a hepatitis aguda, hepatitis crónica y cirrosis, que está fuertemente asociado con el desarrollo del carcinoma hepatocelular. Los estudios genéticos de replicación del VHC se han visto obstaculizados por la falta de un auténtico clon molecular infecciosas. clones completas funcionales de ADN complementarias se construyeron VHC. transcripciones de ARN de los clones resultaron ser infecciosas y de enfermedades en los chimpancés después de la inoculación intrahepática directa. Este trabajo define la estructura funcional de un genoma de ARN del VHC y demuestra que el VHC es suficiente para causar la enfermedad. En 1989, el VHC, el agente viral que se cree responsable de la mayoría postransfusional no-A, hepatitis B, no, fue clonado molecularmente ( 1 ). El VHC es un virus ARN envuelto positivos clasificados en la familia Flaviviridae ( 2 ). Caracterización del genoma del VHC organización y de expresión ha progresado rápidamente desde su descubrimiento ( 3 ). El genoma del ARN del VHC es de ~ 9,6 kb y consta de una región 5 'no traducida (NTR) que funciona como una entrada del sitio del ribosoma interno, un marco abierto de lectura de largo (ORF) que codifica una poliproteína de> 3000 aminoácidos, y un 3' NTR . El genoma de ARN fue pensado originalmente para terminar con poliadenilato [poli (A)] o polyuridylate [poli (U)] extensiones, pero estudios recientes han revelado la presencia de un interno de poli (U) / polipirimidina [poli (U / UC)] las vías seguidas por un 98 conserva a base de secuencia altamente ( 4 , 5 ). La poliproteína del VHC es procesado por la peptidasa señal de acogida y dos proteasas virales para producir por lo menos 10 diferentes estructurales y no estructurales (NS) (Fig. 1 ). Propiedades de muchas de las enzimas de replicación codificados-VHC, tales como la serina proteasa, helicasa de ARN, la polimerasa y han comenzado a surgir en el marco de los intensos esfuerzos para desarrollar tratamientos más eficaces para el VHC nuevos portadores infectados crónicamente.Estos esfuerzos se han visto obstaculizados, sin embargo, por la replicación pobres en el cultivo

celular, el rango de hospedadores limitada del virus (el chimpancé, Pan troglodytes , es el único huésped conocido no humanos), y la falta de un clon infeccioso moleculares para el análisis genético del VHC funciones.

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Figura 1 Características de la longitud consenso clon derivados total de 10 pruebas en los chimpancés. ( Arriba ) Esquema del VHC H77 consenso ADNc del ARN. El 5 'y 3' ZRSEs (líneas continuas) y el consenso ORF (caja abierta) se indican con la ubicación aproximada de la división productos poliproteína se muestra a continuación. ( Abajo ) El 10 transcripciones de ARN utiliza para la inoculación de chimpancés son diagrama.Adicional 5 'y 75 nucleótidos base de comparación 133-base de poli (U / UC) tractos se indican. Todos los clones y las transcripciones incluye dos sustituciones de nucleótidos en silencio: la posición 899 (C en lugar de U, asteriscos), la posición 5936 (C en lugar de A, círculos abiertos) (posiciones de nucleótidos que se refieren a la secuencia de H VHC). La sustitución en la posición 5936 inactivada un Bsm internos que el sitio en la secuencia del cDNA H77 para que un sitio Bsm de ingeniería que podría ser utilizado para la producción de la escorrentía de las transcripciones de ARN con la exacta 3 'del genoma de ARN del VHC ( 15 ). Los clones con otros 5 'bases contenía una mutación que inactive el marcador en silencio me Xho sitio en la posición 514 (triángulos sólidos). Los clones con 75 bases versus 133-base de poli (U / UC) tractos se distinguían por A (círculos sólidos) en comparación con G en la posición 8054, respectivamente. Los 10 derivados fueron creados por los métodos de ADN recombinante y sus estructuras fueron verificados por la digestión de restricción y análisis de la secuencia. Problemas con la construcción de un clon de ADNc VHC funcionales incluyen los altamente variable "cuasi-especies" la naturaleza de este virus de ARN, las pequeñas cantidades de ARN viral presente en muestras clínicas, que requieren en la amplificación in vitro antes de la clonación, y la falta de un simple y verificado transfección ensayo de infectividad. Como material de partida, se utilizó el suero obtenido de un paciente en la fase temprana de la infección (designado H77) ( 6 ). Esta específica de infecciosidad séricos elevados contiene ~ 10 8 moléculas de ARN y ~ 10 6.5 dosis infecciosa chimpancé por mililitro. Una biblioteca combinatoria con una complejidad de> 10 5 longitud ADNc del

o seroconversión) ( 9 ). Se utilizó esta información para dirigir el montaje de un clon de longitud completa que refleja la secuencia de consenso H77 ( 11 ). 233 de los clones fueron preseleccionadas mediante análisis de restricción. A partir de este análisis. las variantes del clon consenso con bases adicionales en el extremo 5 'y dos) tramos de poli (U / UC se construyeron diferentes (Fig. Las muestras de suero y biopsias de hígado fueron tomadas antes de la inoculación y en intervalos de una semana después. Durante 3 meses después de la inoculación. además de los 5'-terminal de la secuencia reportada (5'-GCCAG . En la región de codificación de proteínas estructurales.VHC-completo fue construido por la fidelidad de montaje de alta inversa-reacción en cadena de la polimerasa de transcripción (RT-PCR) seguida de subclonación en un recipiente que contiene el plásmido vector 5 'y 3' terminal de VHC secuencias consenso ( 7 ). así como uncloned RT-PCR los productos. histopatología. y había de referencia cantidades normales de enzimas hepáticas. fueron negativos para el ARN del VHC por RT-PCR. baja eficiencia de transfección de ARN in vivo. Un acompañamiento T7 promotor y un sitio de restricción específica de ingeniería permitió la producción de la escorrentía de las transcripciones de ARN. el NH 2 -terminal de la glicoproteína E2 sobre virión fue muy variable. una mayor heterogeneidad de la secuencia. el aumento de las enzimas hepáticas. Debido a la preocupación de este último se dirigió rápidamente. ARN transcrito a partir de 34 clones que pasaron estos análisis fueron analizadas para la infectividad por inyección intrahepática directa en dos ingenuo chimpancés-VHC ( 8 ). Falta secuencias terminales. Debido a que estas diferencias podrían ser funcionalmente importantes. sustituciones de nucleótidos Silencio fueron diseñados como marcadores para que el virus de recuperación de animales transfectadas podría ser secuenciado para identificar los clones infecciosos. Ni el animal de experimentación ni la de los animales control negativo exhibido signos de infección productiva (que circula el ARN del VHC. y los errores introducidos durante la síntesis de DNA o amplificación por PCR podría explicar estos resultados negativos. las muestras de suero fueron analizadas para las enzimas del hígado. -3') ( 12 ). Cerca de 3 '. En un experimento fallido. De cada uno de los 10 clones. lo que podría ser perjudicial y podría explicar los resultados negativos. de longitud sin tope salarial total ARN se transcribe a partir de ADN plantilla lineal ( 15 ) y se utiliza para la inoculación de dos chimpancés que fueron seronegativos para todos los virus de la hepatitis conocidos. el poli (U / CU) del tracto fue variable en longitud y la composición ( 14 ). secuenciado seis clones de la biblioteca combinatoria. Aparte de los cambios esporádicos corregido en este clon de consenso. un tercer animal recibieron inyecciones de este tipo con las transcripciones de un clon que contiene un amino ácido 20-marco que abarca la eliminación de la polimerasa NS5B sitio activo. se hizo evidente que cada uno de los seis clones secuenciados figuran numerosos consenso secuencia de cambios-no esparcidos por todo el genoma. el procesamiento poliproteína. para determinar una secuencia consenso para el aislamiento H77 ( 10 ).. Las muestras de suero fueron recolectadas durante 2 meses después de la inoculación y se analizó la evidencia de la replicación del VHC. Destaca la ausencia de ARN del VHC detectable circulan dos días después de la inoculación. encontramos un gran número de clones que contenían una o más bases. Como control negativo. Durante el análisis del extremo 5 '.. y la producción de la terminal NS5B proteína-COOH (el dependiente de la ARN polimerasa de ARN del VHC). según la evaluación de la cuantificación del ARN del VHC . 1 ). los anticuerpos de VHC y viremia. incluso se observó en tres regiones del genoma del VHC. Los animales fueron inoculados por intrahepática inyección directa en múltiples sitios ( 16 ). pero una secuencia predominante fue identificado ( 13 ).

Antes y después de la inoculación. en la semana 2 después de la inoculación. 2 C). Este animal se convirtió claramente seropositivos VHC en la semana 13 (Fig. los animales fueron controlados semanalmente por la cantidad de circulante del VHC ARN. 2 A) . 2 B). ALT disminuyó gradualmente a la cantidad de referencia preinoculacion y luego volvió a aumentar en las semanas 10 a 12 (Fig. pero 10 4 moléculas de ARN por mililitro de control de calidad se mide por RT-PCR. Enzimas hepáticas medida suero de alanina . ARN y la enzima del hígado de datos se muestran para los chimpancés 1535 ( A ) y 1536 ( B ). el aumento a 0. alcanzando 8. el ARN del VHC era indetectable título por bDNA (límite de detección.2 meq / ml o ~ 2 × 10 5 moléculas de ARN por mililitro). Ver una versión más grande: y En esta página En una nueva ventana Descargar diapositiva de PowerPoint para la enseñanza y  y Figura 2 .Chimpancé 1536 no mostró evidencia de daño hepático precoz (Fig. En la semana 1. la agrupación citoplasmática y vacuolización probablemente representan gotas de grasa ( 9 ). alteraciones del hepatocito incluidos los hepatocitos multinucleados.8 Meq / ml) y luego se negó a cantidades indetectables por bDNA en la semana 13. que es un marcador de daño hepático.3 Meq / ml en la semana 13. 2 C) ( 17 ). y luego siguió subiendo de manera constante. y la respuesta serológica viremia en los chimpancés inoculados con ARN transcrito.) y se reporta como equivalentes mega de ARN por mililitro (mEq / ml) (límite de detección es 0.28 Meq / ml).45 Meq / ml en la semana 1. Chimpancé 1536 había sufrido una seroconversión en la semana 10 (Fig. las concentraciones de ALT aumentó considerablemente y alcanzó su punto máximo en la semana 12. En la semana 10. disminuyó ligeramente en la semana 2 (0. RNA fue cuantificada por el ensayo bDNA (Chiron Corp. La gravedad de las lesiones histológicas aparecieron generalmente en paralelo a la elevación de la ALT.que circulan por ADN ramificado (bDNA) y cuantitativos a la competencia (CC) RT-PCR ( 5 ). El ARN circulante del VHC título alcanzó su punto máximo en la semana 10 (5. 0. Los títulos de VHC ARN indetectable antes de la inoculación. disminuyendo rápidamente a partir de entonces. y anticuerpos específicos contra el VHC. Chimpancé 1535 habían aumentado las concentraciones de alanina aminotransferasa (ALT). las transaminasas hepáticas.2 meq / ml). cambios histológicos en las biopsias de hígado fueron típicos de la hepatitis C en los chimpancés ( 18 ) y se caracteriza principalmente por la inflamación portal y necrosis focal. Estos perfiles son sorprendentemente patogenia recuerda a los obtenidos en los chimpancés inoculados con el material H77 infecciosas o de otro tipo que contienen las muestras-VHC ( 19 ). La hepatitis.

se analizaron todas las muestras por PCR sin transcripción inversa. se lava. Ningún producto se obtuvieron. ARN debe ser envasada en viriones envueltos y resistente a la degradación por la ribonucleasa (RNasa). no determinado). Para los análisis de la inmunoprecipitación. los mismos niveles de viremia se observaron (Fig. 1 mg de albúmina sérica bovina por mililitro. . lo que demuestra que las señales se detectaron por VHC ARN (Fig. que circula específica de ácido nucleico-VHC no se ha detectado. A pesar de esta diferencia de 150 veces ~. 23 ). Estos experimentos sugieren que circulan ARN fue el resultado de la replicación del virus en lugar de auténtica liberación de ácido nucleico inoculados. 1% de 2-mercaptoetanol. 3 A).4). y 20 mM DTT. y 20 mg de fluoruro fenilmetilsulfonilo por mililitro] . en dos experimentos con animales anterior (un total de seis animales). dilución de las proteínas eluye con 20 volúmenes de TNA. véase también ( 23 )]. Immunoprecipitates se recoge. 1 mM EDTA. 50 mM Tris-HCl (pH 7. Para demostrar que las señales detectadas en el bDNA y RT-PCR ensayos de control de calidad no se deben a la plantilla de ADN residual de las reacciones de transcripción. mientras que la transcripción de RNA residual debe ser sensible a la RNasa. Las células fueron lisadas en TNA [0. incluso a los 2 días después de la inoculación ( 9 ). Por otra parte. 2 ). respectivamente litro. y se incubaron con 2. y reprecipitación con un específico de antisuero policlonal de conejo NS3 del VHC ( 9 . marcado radiactivamente antígenos del VHC se produce por la infección de células BHK-21 con una vacuna recombinante que expresa toda la poliproteína del VHC H77 consenso (vvHCV 13011con) [( 9 ). De hecho. Por último. aclaró. EIA-Sólo las muestras positivas fueron analizadas por RIBA (ND.5 l de suero de chimpancé seguido de 3 l de anticuerpos de conejo a la inmunoglobulina humana. 3 B). así como por la precipitación inmune de metabólicamente etiquetados antígenos del VHC ( 23 ). Normales de ALT y la concentración de GGT rango de 18 a 45 y de 0 a 60 UI /.aminotransferasa incluido (ALT) (indicado en UI / litro) y -glutamil transferasa (GGT) (UI / litro). el ARN del VHC en muestras de suero de chimpancé era resistente a la digestión RNasa en condiciones completamente degradados exceso de desnudos competidor ARN (Fig. VHC NS3 estuvo presente en el 70kD especies immunoprecipitated por los sueros de chimpancés (flecha) como se muestra en la solubilización de la immunoprecipitates (en 2% SDS. Si el ARN del VHC en el suero se detectó el virus de replicarse.5% Triton X100. y separados por electroforesis en un 12% en gel de poliacrilamida-SDS. 200 mM NaCl. El importe total de la transcripción de ARN utiliza para la inoculación de chimpancés fue 1535 ~ 3000 g pero no fue hasta ~ 22 mg de chimpancé 1536. no hubo correlación entre el nivel de viremia aparente y la cantidad de ARN inoculados. y la calefacción a 80 º C durante 20 min ). ( C ) VHC-específica respuestas serológicas (+) fueron detectados por inmunoensayo enzimático comercial (EIA) y el ensayo de inmunoblot recombinante (RIBA) ( 17 ).

la intensidad relativa de los productos y cRNA genómica refleja los cerca de cinco veces la diferencia en las cantidades molares de estos RNAs de esta reacción de RT-PCR competitivo. que tenía un título de ARN del VHC. Una porción igual de cada mezcla de reacción se separan por electroforesis en un gel de poliacrilamida 6% y las bandas se visualizaron por tinción con bromuro de etidio.Ver una versión más grande: y En esta página y En una nueva ventana Descargar diapositiva de PowerPoint para la enseñanza  y Figura 3 Circulantes de ácido nucleico es ARN del VHC y es resistente a la RNasa. Los productos de RT-PCR correspondiente al VHC genómico y cRNA se indican. y se extrae con RNAzol. que recibió la mayor cantidad de inoculados ARN del VHC y donde el DNA de la plantilla no ha sido degradado por la digestión con DNasa I ( 16 ). 10 l de suero (que contiene ~ 6 × 10 4 moléculas de ARN del VHC) se mezcló con el exceso de cRNA (3 × 10 5 moléculas). En la exposición se muestra. una banda débil correspondiente al producto cRNA se puede ver en algunas calles (como la calle 8). En la calle 2. Carril 3. 10 l de suero se extrajo por primera vez con RNAzol y luego se mezcla con 3 × 10 5 moléculas de cRNA. Duplicar las muestras de ARN (de 10 l de suero) de la semana indicada después de la inoculación sin (carril 1) o con la competencia de ARN (CRNA) (10 2 moléculas en las calles 2 y 7. se ha añadido a 1 / 10 a 1 / 30. ( B ) circulante del VHC ARN de animales inoculados está protegida contra los RNasa. N específica banda de PCR se detectó en la ausencia de la síntesis de DNA. La muestra analizada fue de 6 semanas de suero de chimpancé 1536. que contiene una base de supresión de 29 internos. lo que indica que el ácido nucleico de la señal específica de VHC se debía al ARN. 10 3 moléculas en los carriles de 8 a 14) fueron amplificados por RT-PCR con (+) o sin (-) enzima en la etapa de RT ( 5 ). Extrae muestras de ARN fueron sometidos a RT-PCR ( 5 ) y una porción igual de cada mezcla de reacción se separan por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 6%. Carril 2. digerido con 0.Carril 1. Carril 4. de 6 × 10 6 moléculas por mililitro de control de calidad de RT-PCR. La banda .( A ) Las muestras de suero de los animales inoculados no contienen ADN molde prórroga. El análisis que se muestra es para los chimpancés 1535. 10 l de suero sin adición de cRNA se predigeridas con RNasa A y se extrae con RNAzol. el determinado previamente las concentraciones de ácido nucleico del VHC para servir como RT-PCR de control interno. el control negativo de RT-PCR. El cRNA.5 g de RNasa A por 15 min a temperatura ambiente.

. et al. Ciencia 244 . Recibido para su publicación el 16 de abril 1997. 1. Infecciosa del VHC ARN ahora se pueden producir en cantidades ilimitadas y se utiliza para identificar y optimizar los sistemas de cultivo de replicación de las células y para comenzar los análisis genéticos de replicación del VHC in vivo e in vitro.Dos mutaciones silenciosas en la posición 899 (C en lugar de T) y en la posición 5936 (C en lugar de A. Estos análisis se llevaron a cabo tanto para los chimpancés 1535 (semana 5) y el chimpancé 1536 (semana 6). marcados todos los ARNs transfectadas (Fig. Adicional marcadores silencio fueron analizadas para identificar la secuencia 5'-terminal (s) y la longitud (s) de poli (U / UC) las vías necesarias o preferido para iniciar la infección ( 20 . Transcripciones con otros 5 'nucleótidos también podría iniciar la infección. * ¿A quién debe dirigirse la correspondencia. Resumen / GRATIS Texto completo 2. 1 ). Aceptado para su publicación el 19 de junio 1997. REFERENCIAS Y NOTAS 1. 359 ( 1989 ).adicional de mayor masa molecular aparente representa un heterodúplex de la cRNA PCR productos y genómica. Las transcripciones que contienen las 75 de la base o el 133-base (U / UC) fueron tratados poli infecciosas. excepto para el marcador C ingeniería en NT 899 ( 9 ). aunque nuestro análisis no permiten distinguir entre los diversos derivados prueba (fig. y y y . no hay otros 5 'secuencias fueron requeridos para la infectividad y 3' poli (U / UC) tramos de longitud variable se toleraban. secuenciados directamente. y se encontró que la espera H77 secuencia consenso. 1 ). pero los 133 de la base de poli (U / UC) las vías se prefiere ( 21 ). La región de nt 5801 a 6257 también fue amplificado por RT-PCR y se encontró que era resistente a la digestión con Bsm I. enzima de restricción de la digestión y análisis de secuencias de ARN viral recuperado reveló la presencia de marcadores de ingeniería. Aparte de un genoma secuencia consenso. la región entre 466 y nt nt 950 fue amplificado por RT-PCR. los resultados demostraron claramente que las transcripciones de ARN sin ningún tipo de adicional de 5 'nucleótidos fueron infecciosas ( 20 ). La demostración de que el ARN transcrito a partir de DNA clonado del VHC puede iniciar la infección y causar la hepatitis en chimpancés transfectadas proporciona una prueba formal ( 22 ) que el VHC es el agente causal de esta enfermedad. demostrando que estas infecciones se derivó de la transcripción de ARN inoculados. pero no con otros cuatro enzimas sabe que unirá en esa región ( 9 ). Q. 21 ). que la ablación Bsm internos que el sitio en la posición 5934). patogenia y respuesta inmune de acogida pertinentes a la comprensión de los factores que determinan la eliminación del virus en comparación con infección crónica. la infección por el VHC puede ahora ponerse en marcha a partir de derivados de clones para facilitar los estudios sobre la evolución del virus. Choo 2. Aunque no es posible sacar conclusiones firmes acerca de las diferencias cuantitativas en la infectividad específicos. Para los nucleótidos (nt) 899 marcador. ver ( 5 ).-L. Con este modelo. Nuestros experimentos también definir los elementos funcionales del genoma de ARN del VHC.

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Virol. B . que puede alterar la longitud de la poli (U / UC) las vías ( 9 ). 1174 a 1356 (12). 3. 1. Acad. y AAAGTCC) fueron recuperados. 10. Resumen / GRATIS Texto completo 14. 227 . -3 '. 213.747 (227). GG. 6649 (1992)] y la enfermedad hemorrágica del conejo virus [ VF Ohlinger .941 (12). p. 5750 hasta 6208 (H-prototipo VHC). 2828-2977 (211). 66 . 11.068 (211) 4069-4544 (227).529 a 7.236 a 3477 (227). 3.046 hasta 1173 (248). La secuencia predominante. Que se derivan de las siguientes regiones y los clones (entre paréntesis): nt 580-1.. [ Nakajima.860 (213). y determinadas regiones amplificadas por RTPCR. ibid 64 . existe una considerable variabilidad en HVR1 N. M. 1. 3478 a 3732 (209). Fragmentos producidos por la digestión de la restricción de los clones secuenciados ( 10 ) se utilizaron para montar una longitud consenso clon completo de los métodos estándar. 2322-2439 [VHC-H prototipo. J. N. y 248) ( 7 ). La longitud y la composición de 3 de NTR 'poli del VHC (U / UC) las vías no se han determinado de forma inequívoca. 7861 hasta 8.942 hasta 4. 1748-1907 (209). 9. HR Miller .-J. cantidades suficientes de DNA de doble cadena no se pudo obtener de H77 suero para la clonación directa de esta región sin recurrir a la amplificación por PCR. Como se informó en otro lugar (AA Kolykhalov y arroz CM.intrahepática con ARN ha sido utilizado con éxito para iniciar la infección por dos virus ARN de cadena positiva: virus de hepatitis A [SU Emerson . 12. 3325 (1996). 10292]. 1. Thiel . GC. AA Kolykhalov et al. Tanto la ciclación de cDNA y PCR inversa y cDNA ligadura de oligonucleótidos (5 'amplificación rápida de extremos de cDNA) métodos se utilizaron para determinar la secuencia 5'-terminal de VHC ARN de título-H77 de alta del plasma ( 10 ). et al. 3.908 a 2. El NH 2 terminal de parte de E2 (HVR1) es muy variable y se cree que el objetivo de la selección inmune ( 3 ). Ogata .321 (12). F. 5'-GCCAGCC . datos no publicados. Ciencia. 209. 7. 3331 ( 1990 )]. Natl. desde 2440 hasta 2525 (213) 2526-2827 (VHC prototipo-H). Hijikata. G. AA.107 (227). Los clones resultantes de este procedimiento por lo que no puede reflejar la . . 8205 a 9219 (213). Yoshikura. 88 . Weiland . Meyer.UU. como se describe en ( 23 )]. Virol. 6209 hasta 6301 (213). Hemos secuenciado varios clones independientes de esta región ( 10 ) y la predominante HVR1 secuencia en cada posición se utilizó en el consenso clones nuestra. ibid.976 a 5. . 1357 hasta 1481 (209). 6302 -7528 (227).045 (213). J. el VHC H77 secuencia de consenso (número de acceso GenBank AF009606 ) fue determinada por la secuencia de seis clones de la colección combinatoria H77 (clones 12. 2.733-3.204 (209). et al . en preparación). En la muestra H77.978-3235 (209).Proc. A. EE . 13. G.482 a 1. H. 70 . H.609 (227) 5610-5749 (209). los clones con otros 5 'bases (incluyendo G.108 hasta 2.645 (248) 4646-4975 (211). 211. GGG. Shimizu YK. U.991 ). era idéntica a la fijada para la mayoría de cepas del VHC. 4545 a 4. 2.. Con menos frecuencia. Haas . 3392 ( 1. RH Purcell . HJ Alterar . 4. Inchauspe al.

una vez extraídos con fenol-cloroformo. Chimpancé 1536 se inoculó con cantidades más pequeñas de ARN que se habían mezclado con lipofectina (Bethesda Research Labs). y se precipitó con etanol. La base del tracto 133 se recuperó en sólo un clon de VHC-H (H77 # 10) ( 5 ). 0. Tan larga poli (U / UC) tratados aún no han sido reportados por otros ( 4 ). 20 l de la mezcla misma reacción de transcripción de los 10 de longitud completa VHC H77 plantillas fue tratado con desoxirribonucleasa (DNasa I) para extraer DNA de la plantilla. se inyecta en tres sitios distintos. 5 ).0 ensayo (Abbott Laboratories. En este caso.5 mg se diluyeron a 50 l con PBS y se almacenan a -80 ° C hasta su uso para la inoculación. Los experimentos chimpancé también fueron revisadas y aprobadas por el Servicio de Salud Pública Inter-Modelo Animal Comité. Los anticuerpos contra el VHC se midieron por inmunoensayo enzimático comercial. En múltiples clones independientes obtenidos por amplificación por PCR. mixtos. pellets de ADN se lavaron con etanol para eliminar las sales y se resuspendió en H 2 O. 100 l de PBS que contiene 9 g de lipofectina se añadió a cada muestra. 5 mM ditiotreitol (TDT). 100 unidades de T7 RNA polimerasa. según lo estimado por electroforesis en gel ( 9 ). Antes de la inoculación. Por lo tanto. cada preparación de la transcripción. abad Park.estructura nativa genoma de ARN del VHC.15 mg. 15. las vías fueron probados: 75 y 133 bases. las muestras fueron descongeladas y cada muestra se inyectó intrahepatically en dos sitios (~ 0.8). con distintas proporciones de ARN lipofectina /. mezclas de reacción de transcripción (120 l) que figuran los siguientes componentes: 12 ug de DNA del modelo lineal. un tramo de longitud similar se recuperó en un clon de un genotipo 4 aislar ( 5 ). Dos inoculación diferentes y protocolos de la transfección se utilizaron. 16. los rendimientos típicos eran alrededor de 350 mg con más del 80% de longitud completa de ARN. Después de las mezclas se descongelaron. residuos de aminoácidos de . 10 mM de NaCl. 3 mM de cada PNT. Los puntos de inyección para los 10 clones fueron distribuidos en tres lóbulos del hígado. IL) contiene tres antígenos recombinantes del VHC: HC34. 17. de 0. Estas condiciones de almacenamiento se han probado y demostrado que no tienen ningún efecto observable sobre la integridad de las transcripciones de ARN del VHC. Para los chimpancés 1535. Por lo tanto. 100 l de cada mezcla de reacción se diluyó la transcripción con 400 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se almacena congelado a -80 ° C hasta su uso para la inoculación.5 mg.02 la unidad de pirofosfatasa inorgánica.Después de 1 hora de incubación a 37 ° C. y se inyecta en un solo sitio. 40 mM Tris-HCl (pH 7. Los chimpancés fueron enjaulados y mantenerse en condiciones que cumplen todos los requisitos pertinentes para el uso de primates en una instalación aprobada. La longitud de la base de las vías 75 (del clon H77 # 8) ( 5 ) es en realidad acerca de la longitud media para todas las secuencias (de diferentes genotipos) informó por nosotros o por otros ( 4 . Plásmido ADN purificado se digirió a la terminación con Bsm I. y 0. 16 mM MgCl 2 . y las porciones de 1. protocolos de los animales fueron revisados y aprobados por el cuidado de los animales y los comités de uso de cada institución involucrada con los estudios de los chimpancés. dos diferentes longitudes de poli (U / UC). la longitud de este tramo variado desde 41 hasta 133 nt ( 5 ).25 ml por sitio). El VHC EIA Abbott 2.

residuos de 1694 a 1735 (COOH-terminal de la porción de NS4A y NH 2 terminal de parte de NS4B). 3.Histológico. . 91 ( 1. NS4A. 18. HC-31. Las pruebas se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante.. Un Pathol. Las pequeñas cantidades de circulación de ARN del VHC se oponen a la determinación directa de la terminal de secuencias de ARN-5 '. R. la fracción de los productos digeridos por el exceso de XhoI paralelo al inóculo de entrada: 20% fue digerido por XhoI. 1 ). La región que contiene este marcador fue amplificado por RT-PCR en condiciones que aseguró que un número representativo de cDNAs independientes [AA Kolykhalov. SM Feinstone . Por lo tanto. 5. Ed. Reed KE. Mihalik. en la hepatitis C Protocolos. . K. AM DiBisceglie . Infect. la digestión completa se observó que el CAC I. 2. Totowa. c100-3.. Biswas . y la mayoría de NS4B). el virus derivados de las transcripciones que contienen las más prevalentes extremo 5 '(5'AMCC . Una vez más. J. CrossRefMedline 19. en prensa] fueron analizados (> 50 en este caso). M. los residuos 2-120 (proteína del core del VHC). Shindo . HJ Alterar . New Jersey). . 45% fue digerido por XhoI. Para los chimpancés 1535 (semana 3 de la muestra). residuos de 1192 a 1457 (región interna de NS3). los chimpancés en 1536 se observó una ventaja de transcripciones sin necesidad de 5 'bases (5'-AMCC . 165 . 55% fue resistente a la digestión. CM Rice. Popper . JL Dienstag .. 1006 (1992). 21. c33c. una enzima que debe digerir este fragmento de todos los clones de entrada. que contiene cuatro antígenos recombinantes: c22-3. Jyn Lau. (Humana Press. 387 . ibid 1 66 . los residuos de 1569 hasta 1931 (la porción COOH-terminal de NS3. Virchows Arco. la digestión completa se observó que el CAC I. 1. Farci P. y c100-3. como control. 424 ( 1992 ). 20. Emeryville. Alfa Innotech Corp. -3') se distingue de los procedentes de las transcripciones con otros 5 'nucleótidos por la presencia o ausencia de la I Xho sitio en la posición 514 (Fig.980 ).0 SIA (Chiron Corporation. Por lo tanto.. Acc I. RH Purcell .). los residuos de 1192 a 1457 (una porción interna de NS3 ) y residuos de 1676 a 1931 (COOH-terminal de NS4A y la mayoría de NS4B). H. CA). et al.Los productos resultantes se analizaron para la digestión. el 80% fue resistente a la digestión (los valores se determinaron mediante el escaneo de etidio digestión patrones manchados-bromuro de con un SI1000 Digital Imaging System. Antígeno específico de la reactividad de los sueros positivos EIA se definió aún más con la tira de ensayo de inmunoblot RIBA VHC 2. 4. y 5-1-1.. -3'). Dis. SM Feinstone .la poliproteína 1-150 (proteína del core del VHC). Anat. En la semana 4 muestra analizada por los chimpancés 1536. ya sea con Xho I o.

22. Por lo tanto. 2. 1 ). Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La detección de la hepatitis C virus y anticuerpos en la sangre y manchas de sangre post mortemJ. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Servicio Público de Salud a CMR (CA57973 y AI40034). indicativas de los 133 a base de poli (U / UC) las vías. La región entre nt 7955 y 8088 fue amplificado por RT-PCR. Goldberg. 5.Las secuencias de 10 y 9 clones independientes fueron determinados para los chimpancés 1535 (semana 3) y el chimpancé 1536 (semana 4). Jyn Lau. Nueva Jersey. Virol. en prensa)]. 1. en la hepatitis C Protocolos . la base de las vías 133 parece ser preferida. J. y A. M. Acad. respectivamente. (Humana Press. C. Wychowski . 1385 ( 1 993 ). M.. 22 de marzo 2011 : 4991 .UU. SM Feinstone . Shapiro para la recolección y análisis de muestras de los chimpancés. Emerson para la hepatitis control positivo un cDNA virus. Grakoui. Macdonald.. 67 . CM Rice. DiBisceglie de bDNA análisis. Agradecemos a C. Ciencia. Purcell por su generosidad al poner a disposición sus instalaciones de primates. C. 3. S274 (1988). Lin . Lindenbach B. Clin. Heise M. 01 de marzo 2011 : 1122 . 23. Resumen Texto completo Texto completo (PDF) . J. Lea para la asistencia de expertos técnicos.. y molecularmente clonado. A. Infect. Amberg. R. con suficiente material de partida para garantizar la ampliación de más de 100 independientes moléculas de DNA [AA Kolykhalov. aunque no podemos descartar la posibilidad de que esta preferencia se debió a un efecto deletéreo de la mutación del marcador en las transcripciones con la base de las vías 75. Agradecemos también a A. S. y JA Lemm por su participación en las primeras fases de este trabajo y S. EE. Dis. y o o o y o o o Este artículo ha sido citado por otros artículos: MicroARN-122 antagonismo contra el virus de la hepatitis C genotipo 1-6 y reducción de la eficacia de la inserción de acogida o de ARN del VHC mutaciones en el 5 'UTRProc.4996 . Falkow S.Las transcripciones que contienen la base de 75 o 133 de la base de poli (U / UC) tractos se distinguían por el marcador de silencio en NT 8054 en el NS5B región codificante (Fig. D. Grandes Ligas. Grakoui . Se encontró que el 90% (chimpancé 1535) y el 67% (chimpancé 1536) de los clones contenía el G en NT 8054. útil para el debate y los comentarios sobre el manuscrito. Rev. 2). Ed.1123 . 10 (Supl. y Reed K. 4.. Reed KE. Hultgren S. CM Arroz . Microbiol. Natl. Resumen / GRATIS Texto completo 24. Totowa.

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