Molekularna genetika

Kazalo
Nukleinske kisline ...................................................................................................................... 4 Struktura nukleinskih kislin ................................................................................................... 4 Dodatno zvitje .................................................................................................................... 6 Sekundarna struktura ssRNA ............................................................................................. 7 Genom ................................................................................................................................ 8 Gen ............................................................................................................................................. 9 Razlike v organizaciji prokariontskih in evkariontskih genov............................................. 10 Strukura evkariontskih genov............................................................................................... 11 Pol I geni .......................................................................................................................... 11 Pol II geni ......................................................................................................................... 12 Pol III geni........................................................................................................................ 13 Mitohondrijski geni .......................................................................................................... 13 Kloroplastni geni .............................................................................................................. 14 Podvojevanje DNA in RNA................................................................................................. 15 Dvosmerna θ-replikacija .................................................................................................. 16 Enosmerna θ-replikacija................................................................................................... 16 Enosmerna D-replikacija.................................................................................................. 18 Kotaleči se krog (rolling circle) ....................................................................................... 19 Dvosmerna θ-replikacija s kotalečim se krogom ............................................................. 20 Vezava proteinov.............................................................................................................. 20 Dvosmerno linearno podvojevanje................................................................................... 20 Potek replikacije dsDNA...................................................................................................... 21 Replikacija pri E. coli....................................................................................................... 22 Mutacije in popravljalni mehanizmi ........................................................................................ 25 Popravljanje napak ............................................................................................................... 26 Direktno popravljanje....................................................................................................... 26 Izrezovalno popravljanje .................................................................................................. 27 Uvr sistem .................................................................................................................... 27 Glikozilazni sistem....................................................................................................... 27 Popravljanje napačnega parjenja...................................................................................... 27 Prednostno popravljanje............................................................................................... 28 Dam-popravljanje......................................................................................................... 28 Tolerančni sistemi ............................................................................................................ 28 Rekombinacijsko popravljanje..................................................................................... 28 Rekombinacija.......................................................................................................................... 30 Homologna rekombinacija ................................................................................................... 30 Modeli homologne rekombinacije ................................................................................... 30 Bakterijska homologna rekombinacija............................................................................. 31 Genska konverzija ............................................................................................................ 33 Mestno-specifična rekombinacija ........................................................................................ 33 Transpozicija ........................................................................................................................ 34 Transpozicij je več vrst .................................................................................................... 35 Insercijske sekvence (IS).................................................................................................. 36 Sestavljeni Tn................................................................................................................... 36 Evkariontski Tn ................................................................................................................ 37 Retrotranspozoni (retropozoni) ........................................................................................ 38 Sinteza RNA............................................................................................................................. 40 Zgradba RNA-polimeraze pri E. coli ................................................................................... 41
Aedificator fecit AD MMII.

~2~

Zgradba bakterijskega promotorja ....................................................................................... 42 Terminacija........................................................................................................................... 42 Regulacija genske ekspresije.................................................................................................... 44 O delovanju represorjev in aktivatorjev ............................................................................... 44 Regulacija na ravni transkripcije.......................................................................................... 46 Lac operon........................................................................................................................ 46 Ara operon........................................................................................................................ 47 Regulacija SOS genov...................................................................................................... 48 Regulacija z izbiro σ-podenote ........................................................................................ 48 Genetska polarnost ........................................................................................................... 48 Antiterminacija................................................................................................................. 49 Regulacija z antiterminacijskimi faktorji ..................................................................... 49 Regulacija s sekundarno strukturo mRNA - atenuacija ............................................... 50 Regulacija na ravni transkripcije in translacije .................................................................... 52 Gvanozin tetrafosfat in gvanozin pentafosfat................................................................... 52 Regulacija na ravni stabilnosti in procesiranja mRNA ........................................................ 53 Stabilnost mRNA ............................................................................................................. 53 Procesiranje mRNA.......................................................................................................... 53 Regulacija na ravni translacije ............................................................................................. 54 Ribosomska regulacija ..................................................................................................... 54 Regulacija s translacijskimi represorji ............................................................................. 54 Avtogena regulacija.......................................................................................................... 54 Regulacija s sekundarno strukturo mRNA....................................................................... 55 Avtogena regulacija sinteze RF2...................................................................................... 55 Regulacija s komplementarno RNA................................................................................. 56 Regulacija s proteolizo ......................................................................................................... 57 Translacija ................................................................................................................................ 58 Struktura tRNA .................................................................................................................... 58 Struktura ribosomov............................................................................................................. 60 Genski kod............................................................................................................................ 62 Potek translacije ................................................................................................................... 63 Iniciacija ........................................................................................................................... 63 Elongacija......................................................................................................................... 64 Terminacija....................................................................................................................... 64 Zgradba prokariontske in evkariontske mRNA ................................................................... 65 Supresije ................................................................................................................................... 66 Intragenska supresija ............................................................................................................ 66 Intergenske (ekstragenske) supresije.................................................................................... 66 Supresorske tRNA................................................................................................................ 66 Struktura genoma pri višjih evkariontih................................................................................... 68 Zgradba kromosomov .......................................................................................................... 69 Zgradba nukleosomov .......................................................................................................... 72

Aedificator fecit AD MMII.

~3~

gvanin in uracil. Citozin se modificira v reakciji do 5-metil-dC. Zaporedje nukleotidov se zato vedno podaja od 5'-konca do 3'konca. V RNA je namesto timina uracil. na katero je vezan ribozni sladkor (riboza ali deoksiriboza). kot poteka sinteza Slika 1: Propeller-twist Aedificator fecit AD MMII. ~4~ . nucleus . Nukleotid je sestavljen iz fosfatne skupine. uracil (U). Nukleozid je sestavljen samo iz organske baze in riboznega sladkorja. Nukleotidi so med sabo povezani s fosfodiestrskimi vezmi. timin (T). Pri pisanju se deoksiribonukleotide označi z dNTP. gvanin (G). ki se lahko tvorijo med posameznimi bazami. najpogostejše modifikacije so metilacije adenina pri bakterijah v N6-metil-dA in citozina. ta pojav se imenuje propeller twist (12° pri parih A-T in 7° pri parih G-C). preko dušika na mestu N1 (piridinska baza . citozin. Prikazane so tudi vodikove vezi. ampak so rahlo obrnjene ena glede na drugo.Py) ali N9 (purinska baza . kjer se oba tipa nukleinskih kislin nahajata. Dušikove baze v DNA ne ležijo v isti ravnini. Modificirani nukleotidi so zelo pogosti v tRNA. Purinski bazi sta: adenin (A). ki je prisotna tako pri prokariontih kot pri evkariontih. DNA je pri vseh organizmih razen RNA virusov glavna nosilka dednih informacij. Izraz izhaja iz latinskega izraza za jedro. ki so med sabo povezani s fosfodiestrskimi vezmi. linearni polimeri nukleotidov.Nukleinske kisline Struktura nukleinskih kislin Struktura nukleinskih kislin Nukleinske kisline so lahko glede na svojo zgradbo bodisi ribonukleinske bodisi deoksiribonukleinske. Po zgradbi so nukleinske kisline Slika 2: Struktura DNA. ki se tvorijo med hidroksilno skupino na 3'-mestu sladkorja prvega nukleotida in fosfatno skupino na 5'-mestu naslednjega sladkorja. ribonukleotide pa kot rNTP. Nekateri tipi nukleinskih kislin se lahko nahajajo tudi izven celičnega jedra.grški prevod istega izraza je karion (od tu izraz prokarionti in evkarionti). torej tako. Dušikove baze so lahko modificirane. Na ribozni sladkor je lahko vezana ena od petih organskih baz: adenin. timin. Dušikova baza se lahko veže na sladkor na mesto 1'. Pirimidinske baze so: citozin (C).Pu).

da ima DNA strukturo dvojne vijačnice (dvojnega heliksa).. v celicah so to bazični proteini . predpostavila. krajši odseki so lahko v dvoverižni obliki. Slika 3: Različne oblike DNA. ki so opisane v Tabeli 1. Franklin in Wilkins). S spreminjanjem odstotka parov G-C je moč tudi spreminjati tališče začetnikov (primerjev) pri PCR reakciji. ~5~ . Struktura DNA je bila odkrita leta 1953. Negativen naboj v raztopini nevtralizirajo kovinski ioni (najpogosteje Mg2+). Ker je vodikovih vezi več. DNA v celicah je običajno dvoverižna . je taka DNA bolj odporna na višjo temperaturo. Kljub vsemu pa struktura DNA ni statična. ki se lahko tvorijo med organskimi bazami: med adeninom in timinom se lahko tvorita dve. V odvisnosti od okolja (pH. kar je pomembno. ugotovljenih prednostnih keto tavtomernih oblik baz in dejstva. proteinov) in zaporedja nukleotidov lahko DNA zavzame različne konformacije. o katerih bo več govora kasneje.histoni.vodilne verige pri replikaciji DNA. Njihove lastnosti so v Tabeli 1. redkeje enoverižna ss (single stranded). da je število parov G-C zelo veliko pri hipertermofilnih bakterijah. Aedificator fecit AD MMII. prisotnost vode. v zadnjem primeru jo stabilizirajo SSB-proteini (single-strand binding proteini). ko sta Watson in Crick na podlagi že prej poznanih Chargaffovih pravil (število A=T in C=G).ds (double stranded). koncentracija ionov. RNA v celicah je praviloma v enoverižni obliki. ker je s tem mogoče povsem prilagoditi začetnike uporabljeni polimerazi. Struktura DNA je stabilna zaradi velikega števila vodikovih vezi. kar je posledica parjenja komplementarnih baz. da ima DNA strukturo heliksa (difrakcija rentgenskih žarkov. med gvaninom in citozinom pa tri. Pri fizioloških pogojih in pH so nukleinske kisline polianioni zaradi negativnega naboja fosfatnih skupin. Zanimivo je dejstvo.

tanka dvig na navoj v nm 3. DNA v organizmih je običajno negativno dodatno zvita.topoizomeraze I . da se DNA navije okoli svoje osi.4 orientacija glikozidne vezi anti Tabela 1: Lastnosti najpogostejših tipov DNA A-DNA desni kratka. Z-DNA je bila opažena samo in vitro pri visokih koncentracijah soli in pri zaporedjih (Pu-Py)n.8 12 anti pri Py. DNA v raztopini je dinamična. Dodatno zvitje omogočajo topoizomeraze. sin pri Pu B-oblika predstavlja idealno strukturo običajne DNA. In vitro so bile odkrite še druge oblike (C. D.začasno prekinejo eno verigo DNA → odvija DNA . E). Dodatno zvitje je bilo opaženo praktično pri vseh organizmih. Dodatno zvitje DNA v človeških celicah je dolga približno 1.5 1.8 metra. široka 2. ~6~ .giraze .3 11 anti Z-DNA levi podaljšana. ki jih predstavlja hidroksilna skupina na 2'-mestu na riboznem sladkorju.B-DNA heliks desni oblika dolga.4 premer v nm 1. RNA B-oblike ne more tvoriti zaradi steričnih ovir. Aedificator fecit AD MMII. razteza. da se dodatno zvije. upogiba. Do njega pride tako.9 število bp/zavoj 10. v organizmih je verjetno zelo redka. tvori pa lahko A-obliko. ki lahko začasno cepijo bodisi eno bodisi obe verigi DNA: . Dejanska struktura je odvisna od okolja in zaporedja nukleotidov. saj se zvija. coli Slika 4: Človeška topoizomeraza I v kompleksu z DNA. V celico se lahko pakira samo tako. tanka 4.8 2.topoizomeraze II .začasno prekinejo obe verigi DNA → zvija DNA Slika 5: DNA v E.

Sekundarna struktura ssRNA Določeni deli RNA se lahko med sabo komplementirajo in tvorijo daljše ali krajše dvoverižne odseke. spet drugi se spreminjajo(semi-invariant) ali so celo odsotni (absent). kjer je sekundarna struktura v obliki lista detelje (cloverleaf).zanke: proste. kar lepo sledi iz slike. Gibbsova prosta energija za to reakcijo je negativna. končne.steblo (stem) v dvoverižni obliki . Slika 6: Sekundarna struktura tRNA. razvejitvene . Poleg heliksa lahko RNA tvori še elemente sekundarne strukture: . terciarna pa v obliki črke L.izbokline .lasnice (hairpin) RNA lahko zavzame tudi terciarno strukturo. ki je prisotna v tRNA. Aedificator fecit AD MMII. notranje. Pri nastanku teh struktur so po padajoči jakosti interakcije udeleženi pari: GC > AU (~ AT) > GU. ~7~ . Določeni deli tRNA imajo konstantno sestavo. drugi deli se močno spreminjajo od ene tRNA do druge.Določeni deli tRNA imajo konstantno sestavo (invariant).

ds DNA/RNA: genom virusov - Oblika genoma in njegova velikost sta v neposredni zvezi s stopnjo evolucijskega razvoja posameznega organizma in njegovim načinom življenja. rastlinski paraziti. da je linearna. Slika 7: Struktura PSTVd viroida. ki jih leta kodira. je prikaz velikosti in tipov genomov pri nekaterih organizmih. da lahko virusi kristalizirajo linearna molekula. pri replikaciji ciklizira krožen linearen. Kar sledi v naslednji tabeli.Genom Obstaja več različnih vrst genoma: nDNA: genom. ki se nahaja v celičnem jedru mtDNA: genom mitohondrijev ctDNA: genom kloroplastov dsDNA: genom bakterij ss. ki lahko obstaja v hudi (severe) ali mili (mild) obliki. ~8~ . ki se med sabo razlikujeta v mutacijah na treh mestih. Možne so tudi razlike v organizaciji genomov. verigi med sabo kovalentno povezani najmanjše glive E. Aedificator fecit AD MMII. prvega posekvenirali linearen. satelitski virus rabi pomoč helper virusa pri TMV je bilo ugotovljeno. ki so označena. a fragmentiran linearen krožen. sativa dsDNA nDNA Tabela 2: Genomi se razlikujejo tako po tipu nukleinske kisline. PSTVd 1 protein kapside. podvržena mutacijam. njeni dolžini in številu genov. tip genoma krožna ssRNA organizem viroidi STNV ssRNA TMV virus gripe dsRNA ssDNA reovirus parvovirus ΦX174 bakteriofag λ SV40 vakcinia virus mikoplazme bakterije nevretenčarji sesalci rastline število bp/nt 359 1300 6400 13500 23000 5000 53878 48502 5226 192000 < 106 $ 107 # 108 3 × 109 < 1011 število genov 0 1 4 12 22 5 11 60 6 300 500 3000 15000 > 25000 < 50000 oblika genoma genom je v obliki palčke. genom fragmentiran linearen. vendar daje zaradi mnogih vodikovih vezi vtis.3 × 109 C. coli morska vetrnica človek: 3. Molekula viroida je krožna.

Cistron je mogoče dobiti s komplementacijskim testom. Podoben izraz za gen je cistron. Slika 9: Shematski prikaz centralne dogme molekularne biologije Aedificator fecit AD MMII. Geni se prepisujejo v različne tipe RNA.Gen Gen je osnovna enota dednosti. Če sta v cis konfiguraciji. ~9~ . Slika 8: S cis/trans komplementacijskim testom se ugotavlja. se mutacija ne pokaže. Gen je funkcionalna enota kodirajoče ali nekodirajoče regije. kako relativna konfiguracija vpliva na ekspresijo. vendar se nanaša na protein. Pri dvojnih heterozigotih se dve mutaciji na istem genu pokažeta. ki se nato lahko prevedejo v proteine. To je centralna dogma molekularne biologije. če sta gena v trans konfiguraciji. ki vsebuje informacijo za določeno polipeptidno verigo ali RNA. Mogoče je tudi. da se RNA z reverzno transkriptazo prevede nazaj v DNA.

medtem ko so regije operonov med sabo ločene s 50-200 bp. Regulacija genske ekspresije je zapletena in vključuje še mnoge dodatne molekule. da je posamezen gen prisoten v samo eni kopiji na genom. Medgenske regije v takem genomu so kratke. Prednost intronov je v tem. Ker je genom majhen. Zaradi enostavnosti prokariontskih genov se bo nadaljni pregled osredotočil na gene evkariontov. Bakterijske gene prepisuje samo ena RNA polimeraza. dolžine 10 bp. je moč sklepati. katere prepis se regulira in vsebuje tako kontrolne kot strukturne elemente. ipd. Prokariontski geni so večinoma policistronski. Genomi evkariontov so bolj kompleksni. sintezi steroidnih hormonov. da RNA-prepis vsebuje informacijo za več proteinov/polipeptidnih verig. Geni pri prokariontih so brez intronov. Pri bakterijah tak policistronski gen predstavlja operon. pri nastajanju protiteles. da se iz enega gena sintetizira več različnih produktov. Operon je enota bakterijske genske ekspresije. Regulatorne regije so blizu gena in so enostavne. Geni se velikokrat prekrivajo.Razlike v organizaciji prokariontskih Razlike v organizaciji prokariontskih in evkariontskih genov in evkariontskih genov Ne samo. zaradi česar je mogoče slediti zaporedju aminokislin v nukleotidih na DNA. ojačevalna zaporedja (enhancerje). Geni so večinoma monocistronski z introni. Proces izrezovanja intronov se imenuje splicing. ~ 10 ~ . da njihov različen izrez omogoča. da se velika večina informacije prepiše v RNA. Jasno je viden začetek transkripcije in DNA matrica. ampak se ta razlika kaže tudi v organizaciji genoma pri obeh tipih celic. Pri arhejah so prisotni introni v rRNA in tRNA. Njihova kompleksnost je povezana z razvojem celičnega jedra in tkiv. Slika 10: Transkripcija rRNA genov. npr. da se prokariontska celica razlikuje od evkariontske v prisotnih celičnih strukturah. ki jih prepoznava regulatorni protein. kar pomeni. izjema so rRNA geni. Aedificator fecit AD MMII. Pogosto se zgodi.

Geni so večinoma v večih skupinah.8S-28S rRNA.pri E. Masa celotnega enicma je približno 500 kDa. Procesiranje RNA poteka v jedrcu. Introni se lahko izrežejo tudi samostojno . ki se izrežejo in iz njih nastanejo snoRNP. ki zadostuje za osnovno polimerazno funkcijo in je petkrat bolj učinkovita od bakterijske. a) Struktura bakterijskih RNA-polimeraz: .jedrni geni (n) se nahajajo v celičnem jedru . se imenuje nukleolarni organizator. Pred in znotraj gena so spacerji. območje genov. Promotorske regije med posameznimi geni so slabo ohranjene. II. Tako nastanejo snoRNP (small nucleolar ribonuclear particle). Vsaka je sestavljena iz desetih do dvanajstih podenot. ki ga sestavlja. Tako je bilo ugotovljeno. Slika 11: Shema tandema . Pri evkariontih gene prepisujejo tri jedrne RNA-polimeraze.kloroplastni (ct) Ti geni se prepisujejo z različnimi RNA-polimerazami. Pol I geni DNA-polimeraza I (Pol I) prepisuje rRNA gene. da je za delovanje ribosoma dovolj samo rRNA. Nekatere podenote so skupne vsem trem encimom. Aedificator fecit AD MMII. Med posameznimi odseki rRNA so regije. Med tandemi so intergenske regije z osnovnim promotorjem. ena mitohondrijska in ena ali dve klorpoplastni. ki imajo notranjo tandemsko ureditev.Strukura evkariontskih genov Strukura evkariontskih genov Glavni kriterij za razdelitev evkariontskih genov je njihovo nahajanje znotraj celice: . b) Evkarionti: Gene pri evkariontih prepisujejo tri RNA-polimeraze (Pol I.transkripcijske enote znotraj grozda (clustra) rRNA genov. znotraj katerega se izoblikuje jedrce. . Gen je sestavljen iz 18S-5. Različne rRNA (razen 5S) se prepišejo v obliki skupnega prekurzorja (45S).brez encimov. III). ~ 11 ~ . kar v končni fazi poveča ali zmanjša ekspresijo določenega gena.mitohondrijski geni (mt) . Prepisovanje rRNA genov poteka v jedrcu (nucleolus). Dejansko se izkaže. da imajo nekatere RNA tudi določeno katalitično aktivnost. ki se izrežejo. pred katerim se nahaja vmesni promotor in enhancer. na njihovo delovanje vplivajo različni regulacijski faktorji. druge so specifične. coli: pet podenot (α2ββ'σ) z maso okoli 480 kDa.pri fagu T7: polipeptidna veriga z maso 98 kDa. Take RNA se imenujejo ribocimi in naj bi po nekaterih teorijah predstavljale prve encime. ki je fosforiliran na 5'koncu (5'-ppp). Encimi prepoznavajo različne promotorje in operatorje.

katerih dolžina in število so lahko različni. Izkaže se.. cAMP Response Element) so regulatorni elementi. 7'-Me-G).AP1.in 5'-konca (3':poliA. katere C-terminal vsebuje ponovitve heptapeptida YSPTSPS (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser).GRE. Prepisovanje poteka preko nukleosoma. ipd. Iniciatorska regija na mRNA ima naslednjo obliko: Py2CA1+Py5. . C. ACCCCGG ali GGCCCCA) . ki jih prepisuje Pol II navadno vsebujejo introne. Za svoje delovanje potrebuje encim še več splošnih faktorjev prepisa (GTF) in še okoli deset drugih proteinov (TFIIX.) TFIIH je recimo faktor za fosforilacijo heptapeptida na C-terminalnem koncu. ki so pred ALI za genom in delujejo v obeh orientacijah (ni pomembno ali je npr.zaporedje CAAT . ~ 12 ~ . B. CRE (Gene Response Element. Po prepisu pride do modifikacije 3'. Aedificator fecit AD MMII. Slika 13: Modifikacija 3'konca mRNA in nastanek čepice (cap). Prepis se začne približno 25 nt za TATA sekvenco. X=A.GC-oktamerno zaporedje . Introni se prepišejo in kasneje natančno izrežejo. na katere se vežejo DNA-vezavni elementi .. Fosforilacija heptapeptida je znak za začetek prepisovanja.TATA zaporedje na mestu -25 (pri bakterijah na -10) .cis regulacijski elementi se prepišejo/delujejo iz iste verige DNA.Pol II geni RNA-polimeraza II (Pol II) prepisuje mRNA in večino snRNA (small nuclear RNA). Promotorske sekvence so večinoma kratke in se nahajajo pred kodirajočo regijo in vsebujejo sekvence za vezavo različnih transkripcijskih faktorjev. 5': ppp. pri sesalcih se to zaporedje ponovi kar 52×. Geni. Razdalja med elementi AP1/AP2 in GRE/CRE je lahko tudi več kb. Posebnost Pol II je velika podenota (M = 230 kDa). da ima vsak gen svoje značilnosti: promotor. Osnovne komponente promotorja so tako: . AP2 so ojačevalna zaporedja. trans se prepišejo/delujejo iz druge verige DNA Slika 12: Struktura promotorja. enhancer.

Intron na pre-tRNA se izreže na poseben način. Promotorji so večinoma sredi kodirajoče regije (interni). tudi monomer večinoma monocistronski mRNA nima poliA repa prepis posebna genska koda: UGA → Trp. podoben fagni T7 prepis policistronski mRNA ima poliA rep zgradba regulatorna regija rastline 200 – 250 kb nekateri geni z introni več promotorjev mtRNA-polimeraza slabo poznana. oriH pa na L-verigi. sicer stop Tabela 3: Razlika v organizaciji mitohondrijskega genoma živali in rastlin Pri živalih se promotorja za težko (H) in lahko (L) verigo nahajata na nasprotnih verigah: oriL leži na H-verigi. 12S in 16S rRNA in 22 tRNA. Mitohondrijski genom vretenčarjev kodira: 13 proteinov. od 10 do več kot 100 genov za vsako vrsto (pri človeku več skupin. da se samo gen za citokrom b prepisuje v obratni smeri od vseh. Slika 14: Genska mapa živalskega mitohondrija. ~ 13 ~ . Mitohondrijski geni živali 15 – 20 kb pri nižjih organizmih introni na vsaki verigi po 1 promotor regulacija večinoma posttranslacijska mtRNA-polimeraza monomer. Geni za tRNA vsebujejo majhen intron (en nukleotid) na 3'-koncu in so v večih skupinah. Geni za 5S rRNA so tandemsko urejeni v eni (človek. Puščice označujejo smer prepisa. Genom mitohondrija je bil verjetno v začetku večji. skupno 1300 genov).Pol III geni RNA-polimeraza III (Pol III) prepisuje gene za tRNA. 200 genov) ali večih skupinah. ki so razporejene po genomu. Prepis je 5'-ppp. V vsaki skupini so različne vrste tRNA. Aedificator fecit AD MMII. signal zanj dajejo eksoni. Izkaže se. Na območju D-zanke ni nobenega gena. pred geni so regulatorne regije. vendar se je tekom evolucije del informacije preselil v okvir jedrne DNA. 5S rRNA in nekatere druge manjše rRNA.

coli. Promotorske regije so tako podobne tistim v E. da je mogoče doseči ekspresijo kloroplastnih genov v celicah E. kaj kodirajo. Kloroplastni geni kodirajo 4 rRNA. RNA-polimeraza (lahko sta tudi dve) je sestavljena iz večih podenot in je po zgradbi podobna bakterijski. subgenome. Tabela 4: Produkti kloroplastnih genov. coli. 30 tRNA in približno petdeset proteinov. od katerih imajo nekateri introne. Geni se večinoma prepisujejo policistronsko. ~ 14 ~ .Kloroplastni geni Genom kloroplasta je velik 120 – 150 kb in vsebuje približno 120 genov. ki niso vezani na celično jedro. Aedificator fecit AD MMII. Mitohondrijski in kloroplastni genomi spadajo med t.i. Podrobna vsebina sledi iz Tabele 4. Za precej genov še ni ugotovljeno.

kjer pride do začetka replikacije z razmikom obeh verig DNA. mtDNA in ctDNA. Pri replikaciji nastanejo replikacijske vilice. njegova splošna značilnost je veliko število AT parov.synthesis).gap. Nekatere celice (npr. Dokaz za to je gojenje bakterij na gojišču. kje naj ustavi replikacijo.delitev celice . Poleg težav. V grobem je celični cikel možno razdeliti na dva dela: .večina časa: faza trajanje v urah DNA G1 6 . Replikacija je glede na smer lahko enosmerna ali dvosmerna.N × 104.12 2n S 6-8 2n → 4n G2 3-4 4n Tabela 5: Okvirno trajanje posameznih faz celičnega cikla (G . je tu še problem linearnih replikonov. Aedificator fecit AD MMII.Podvojevanje DNA in RNA Podvojevanje DNA in RNA Pred vsako celično delitvijo se mora genom enkrat natančno podvojiti. ki se lahko samostojno podvojuje. ki se pojavijo pri replikaciji. Replikacija DNA je semikonzervativna. nastane lahko tudi več kopij. Replikon vsebuje tudi mesto konca replikacije. kjer mora replikacijski sistem ugotoviti. Pod elektronskim mikroskopom se vidi replikacijsko oko. ko se celica ne deli. do celične delitve ne more priti. ki je bogato z 15N (težkim dušikom).interfaza . Dokler se DNA podvaja.autonomously replicating sequence).M-faza . 4n je podvojeni diploidni genom. To je mesto. kar velja za plazmide. ~ 15 ~ . pri evkariontih je to število mnogo večje.origin ali ARS . pri krožni DNA pride do nastanka θ-strukture. Replikon je enota DNA. eritrociti) so v G0 fazi. ampak miruje. Podvojevanje DNA torej pripravi celico na naslednjo delitev. ki ustreza DNA. S . Tretji problem so krožni genomi. 2n je diploiden genom. ker vsebuje mesto začetka podvojevanja (ori . kjer se mora encim še pravočasno ustaviti. Slika 15: Prikaz problemov. Pri izolaciji in centrifugiranju DNA teh bakterij nastane ena proga. Prokarionti imajo samo en replikon. N × 102 . Pri replikaciji največkrat nastane ena kopija izvirne DNA (kromosomi evkariontov in prokariontov). ki jih prinaša sinteza verige v smeri 3'-5'.

je vprašanje. kje naj konča podvojevanje. da ima ena hčerinska celica en plazmid. Rezultat tega je. RNA virusi imajo povečini njim lastne replikaze. se plazmida ne podvojita. Če je DNA recimo krožna. Enosmerna θ-replikacija Poznana je pri plazmidih ColE1 in pMB1 (izvor pUC plazmidov). Drugi problem pri replikaciji je podvojevanje verige. Pri linearnih replikonih je ta problem replikacija njihovih koncev. a) Podvojevanje RNA: Krožna ssRNA viroidov naj bi se vsaj delno podvajala po principu kotalečega se kolesa. da ko se celica deli. in čez čas izoliramo DNA bakterij. ki ima v eni verigi 15 N in v drugi 14N. kot bi encim “jecljal”. Sinteza te verige namreč teče v smeri 3' proti 5'. Če del teh bakterij preselimo na gojišče z “normalnim” dušikom. V drugi generaciji bosta progi dve: prva ustreza DNA z 14N. Hitrost replikacije je 300 nt/s (pri bakterijah). Tudi pri naslednjih generacijah sta vedno prisotni dve progi. Replikacija se ustavi na ter sekvencah. druga pa DNA. Spreminja se samo razmerje med obema tipoma DNA. Aedificator fecit AD MMII. coli. kar se rešuje s telomerazami. ki je prikazan na Sliki 16. ki so dolge približno 23 bp. Pri podvojevanju DNA naletimo na dva zanimiva problema. ki se podvajajo preko dsDNA intermediata. se njeno gibanje na ter sekvencah upočasni. b) Podvojevanje DNA DNA virusi pogosto uporabljajo celične DNA-polimeraze (izjema sta faga T4. Mesto začetka replikacije se imenuje oriC in je veliko 245 bp. Plazmida sta v celicah nekompatibilna zaradi podobnih sekvenc za začetek replikacije. Na podoben način poteka replikacija nekaterih plazmidov. kako naj DNA-polimeraza ugotovi. ki ima v eni verigi 14N in v drugi 15 N.ki ima v bazah 15N. ki teče v smeri od 5' proti 3'. ki ustreza DNA. druga pa drugi plazmid. bomo dobili eno progo. zdi se. 14N. Dvosmerna θ-replikacija Tako se podvojuje genom E. Če zaradi takšnega ali drugačnega razloga ena od DNA-polimeraz “pohiti”. izjema so retrovirusi. T7). ~ 16 ~ . kar pomeni.

coli Aedificator fecit AD MMII. ~ 17 ~ .Slika 16:Dvosmerna θ-replikacija pri E.

Enosmerna Dreplikacija Z enosmerno Dreplikacijo se podvojuje mtDNA. Napisa H in L je potrebno zamenjati. ki je na (stari) H-verigi. in se v nasprotni smeri začne še sinteza L-verige. pride do mesta oriL. Ko nastajajoča Hveriga doseže dolžino približno 2/3 kroga dvoverižne mtDNA. Slika 17: Potek enosmerne θ-replikacije pri mtDNA. da slika ustreza dejanskemu poteku. Pri vretenčarski mtDNA razlikujemo dve (komplementarni) verigi. takoj za promotorjem LSP) sintetizira H-veriga. Pri replikaciji mtDNA se najprej (z mesta oriH. ~ 18 ~ . Težka veriga (H-strand) ima za razliko od lahke verige (L-strand) večjo vsebnost baz G+T. ki leži na L-verigi v področju D-zanke. Aedificator fecit AD MMII. imenovana tudi vodilna veriga.

ki mu sledi sinteza druge verige z DNA-polimerazo. DNA se najprej pretvori v dsDNA obliko. ki se pretvorijo v dvoverižno obliko (t.prenosu določenih pDNA (plazmidnih DNA) iz ene bakterije v drugo. . ΦX174) in nekateri plazmidi. Po prekinitvi ene v verige v dvoverižni obliki pride do sinteze na 3'-koncu in kotalečega se kroga.Kotaleči se krog (rolling circle) Preko kotalečega se kroga se podvojujejo krožni ssDNA virusi (M13. Na DNA se najprej sintetizira kratek RNAzačetnik.i. Slika 19: Novo sintetizirana DNA je vidna kot rep Slika 18: Shematski prikaz replikacije po principu kotalečega se kolesa Aedificator fecit AD MMII. replicating form).enoverižnih krožnih fagih. Replikacijo po principu kotalečega se kolesa srečamo pri: . ~ 19 ~ .

ki ji sledi kotaleči se krog. Aedificator fecit AD MMII. Genom obeh je dsDNA. ki jo omogočajo cos mesta na 5'-koncu DNA. Po cepitvi se konkatemere pakirajo v virusne partikle.se pravi so med sabo povezane. ki že nosi prvo bazo (C) bodoče komplementarne verige. medtem ko pri ostalih višjih organizmih še ni jasno. Vezava proteinov Vezava proteinov je prisotna pri adenovirusih in Φ29 (linearna dsDNA). če gre za specifična zaporedja ali ne. Najprej poteče ciklizacija. kar je desetkrat manj kot pri E. Konkatemere so molekule DNA. ki ga izpodrine 80K protein. Slika 20: Kompleks 55K in 80K proteina Dvosmerno linearno podvojevanje Dvosmerno linearno se podvojujejo evkariontske jedrne DNA.coli. ki so podobne členkom na verižici . ~ 20 ~ . Pri kvasovkah se replikacija prične na ARS sekvencah. Pri podvojevanju po principu kotalečega se kolesa se tvorijo konkatemere.Dvosmerna θ-replikacija s kotalečim se krogom Z dvosmerno θ-replikacijo. Konce ( splošna oblika (TTAGGG)n ) replicirajo telomeraze po posebnem mehanizmu. Hitrost replikacije je 30 nt/s. Na 5'-konec DNA je kovalentno vezan 55K protein (preko serina na citozin). se podvajata λ-fag in herpes virus.

ι. κ.Potek replikacije dsDNA Potek replikacije dsDNA Osnovne faze replikacije DNA so: . M = 90 kDa heteromultimera. kjer sodeluje proteinski kompleks primosom . M = 103 kDa monomera. Samo parjenje baz je dovolj za “samo” 1/1000 napaka/bp. Z replikacijo je ta vrednost dosti nižja. rastejo lahko namreč le v ozkem temperaturnem območju. enako velja tudi za nekatere DNA-polimeraze. Nekatere DNA-polimeraze imajo tudi 5'eksonukleazno aktivnost.iniciacija. kar je posledica 3'-eksonukleazne aktivnosti. θ. η. začetnike sintetizirajo primaze in za ligacijo fragmentov skrbijo ligaze. I II III IV V monomera. Novo verigo sintetizirajo DNA-polimeraze. manjši fragment ima samo 5'-eksonukleazno Aedificator fecit AD MMII. Pri proteolitski cepitvi DNA-polimeraze I in vitro nastaneta dva fragmenta. Klenow fragment. Reverzna transkriptaza nima možnosti kontrolnega branja.oligonukleotid. polimerazna in eksonukleazna. 1/106. popravljanje DNA Tabela 6: DNA-polimeraze pri E. pri sesalcih je do sedaj znanih dvanajst.elongacija. kjer sodeluje proteinski kompleks repliosom . razvitje začetkov replikacije omogočijo ori-vezavni proteini. Obstajata dve vrsti dna mutant: hitre-stop (quick-stop) imajo okvaro elongacije počasne-stop (slow-stop) imajo okvaro iniciacije (dlje časa rastejo) Replikacija je zelo natančen proces. Vse DNA-polimeraze potrebujejo za začetek sinteze nove verige kratek začetnik . razvito enojno verigo stabilizirajo SSB-proteini. pomožna funkcija popravljanje DNA replikazna funkcija SOS odgovor. sinteza zaostajajoče verige sinteza vodilne verige popravljanje DNA replikacija mtDNA popravljanje DNA Tabela 7: Sesalske DNA-polimeraze in njihove funkcije pri replikacije Pri replikaciji sodeluje več različnih proteinov. coli je poznanih pet. ki so pogojno letalne mutante. Študij podvojevanja DNA in odkrivanje posameznih komponent replikacije sta potekala s pomočjo temperaturno občutljivih mutant. ima polimerazno in 3'-eksonukleazno aktivnost. Obe aktivnosti. potekata na različnih delih encima. Večji. coli in njihove funkcije v replikaciji α δ β ε γ ξ. ~ 21 ~ . torzijske napetosti sproščajo DNA-topoizomeraze. λ. verigi DNA razvijajo DNA-helikaze. ki omogoča ponovno branje in zamenjavo nepravilne baze (proofreading). V E. Temperaturno občutljive mutante imajo mutirane dna gene. M = 900 kDa monomera heteromultimera popravljanje DNA. Sinteza nove verige teče vedno v smeri 5'→ 3'.terminacija Osnovni encimi za sintezo DNA so DNA-polimeraze. µ začetek.

druga veriga v sintezi zaostaja in je sestavljena iz Okazakijevih fragmentov (1. ki se pred začetkom replikacije metilirajo (GATC. coli 1. nekatere viruse in plazmide . Aedificator fecit AD MMII. Slika 21:Shematski prikaz nick-translacije Nobena DNA-polimeraza ne more začeti de novo sinteze DNA.obstoječa RNA za retroviruse .aktivnost. Pri bakterijah je osnovna replikaza DNA-polimeraza III. coli mesto oriC vsebuje 11 GATC palindromnih mest. Celoten encim lahko sintetizira DNA samo na mestih prekinitve ene verige tako.proteini z vezano bazo pri adenovirusih Ena od verig se sintetizira kontinuirno (vodilna veriga). Replikacija pri E. ~ 22 ~ . V tem procesu sodelujejo še: giraza. drugega pa tri ponovitve po trinajst baznih parov (zaporedje bogato z AT).veriga DNA pri “nick” translaciji in kotalečem se krogu . povezan s šestimi monomerami DnaC proteina. ki je lahko bodisi DNA. RNA ali protein: . da najprej poteče razgradnja stare verige DNA (“nick” translacija). Za začetek je nujno potreben začetni oligonukleotid. Na takšen odprt kompleks se veže heksameren DnaB protein (helikazna funkcija).000-2. Najprej se na . SSB-protein in protein Hu. DNA se razvije v dolžini < 60 bp. Enega predstavljajo štiri ponovitve po devet baznih parov. vloga DNA-polimeraze I je v razgradnji RNA-primerjev in zapolnitvi nastalih vrzeli. dam metilaza) Mesto oriC vsebuje dva pomembna odseka. ko nastanejo replikacijske vilice. DNA se ovije okoli tega proteinskega jedra. Sledi razvitje DNA v območju 3 × 13 bp ponovitev in nastanek odprtega kompleksa.000 nt). nastane zaprti kompleks. Vsi ti proteini tvorijo predzačetni kompleks (prepriming complex). 4 × 9 bp oriC veže 20-40 monomer DnaA proteina. Iniciacija: Pri E. Proteina DnaJ in DnaK verjetno omogočata sprostitev tega kompleksa in dejanski začetek replikacije. vsakega začenja začetnik (10 nt). Okazakijeve fragmente poveže s kovalentno vezjo DNAligaza.kratek RNA začetnik za celično DNA.

V tem preprostem primeru (oriC) je primosom v bistvu le DnaB protein, ki je predhodno v kompleksu z DNA-primazo. DnaB razvija DNA heliks in aktivira DnaG - primazo, ki sintetizira kratke RNA začetnike. V drugih primerih (ΦX174) so v primosomu še nekateri drugi proteini (PriA, PriB, PriC, DnaT, DnaB, DnaC). Primosom začenja sintezo Okazakijevih fragmentov, po DNA potuje v nasprotni smeri od sinteze vodilne verige. Pri vodilni verigi se sintetizira RNA-začetnik le na začetku. Za replikacijo in z njo povezane procese je potrebna energija ATP.

2. Elongacija
Bakterijska DNA-polimeraza III opravlja sintezo obeh verig. Sestavljena je iz sedemnajstih podenot in verjetno deluje kot asimetrična dimera: 2× (αεθτ β 2 ) + γδδ'χψ.

Slika 22: Shematski prikaz pre-priming reakcije sinteza α kontrolno branje ε sestava kompleksa θ tvorba dimere τ β prepozna DNA, skrbi za interakcijo z DNA γ Tabela 8: Vloga podenot pri DNA-polimerazi III

Predpostavljeni model delovanja
Polovica encima z DnaB (helikazo) je potrebna za sintezo zaostajajoče verige, druga polovica pa za sintezo vodilne verige. Ena molekula holoencima, ki je približno enako velika kot mala podenota ribosoma, lahko sintetizira več tisoč nukleotidov. Celoten replisom vključuje še druge proteine.

Aedificator fecit AD MMII.

~ 23 ~

Slika 23: Struktura DNA polimeraze III po vezavi na DNA

3. Terminacija
Pri E. coli se na ter sekvence (~ 23 bp) veže produkt tus gena in ustavi replikacijo.

Slika 24: Gibanje replikacijskih vilic pri E. coli in terminacija replikacije.

Aedificator fecit AD MMII.

~ 24 ~

Mutacije in popravljalni mehanizmi
Mutacija je proces, pri katerem pride do spremembe genetskega materiala, ki se lahko odrazi na fenotipu organizma. Organizem, gen, zaporedje z mutacijo je mutant/-a. Obstaja več tipov mutacij in sicer so lahko na nivoju: delecija - tranzicije: Pu → Pu insercija gena točkovne mutacije - transverzije: Pu → Py substitucija ali Py → Pu delecija duplikacija kromosoma inverzija translokacija anevploidija Downov sindrom: trisomija 21. kromosoma genoma poliploidija podvojitev celotne garniture kromosomov Tabela 9: Pregled mutacij glede na velikost in nekatere posledice Manjše mutacije so bolj pogoste od večjih; substitucija > delecija > insercija. Pri mutacijah je treba omeniti še pojem alel, ki predstavlja različno obliko istega gena, npr. gen za oči, alel za modre, rjave, ... Do mutacij lahko pride pri/zaradi: replikaciji DNA spontanih mutacij na vročih točkah (hot spots); npr. demetilacija 5-Me-C → T ali oksidativna deaminacija C → U. delovanja retrovirusov in transpozicijskih elementov fizikalnih mutagenov: ionizirajoče sevanje, UV napačnega popravljanja poškodb na DNA kemičnih mutagenov: DNA-reaktivne kemikalije analogi baz: 5-bromo-uracil analogi bp: premik bralnega okvirja (frameshift)

Analogi baz so nevarni zato, ker se lahko komplementirajo tako s Pu kot Py, preferenčne vezave tipa A-T in G-C ni, zato prihaja do napak pri replikaciji takšne DNA. Mutacije se delijo tudi glede na tip celic, v katerih pride do mutacije. Če pride do mutacij v somatskih celicah, se to odraža na fenotipu posameznika bolj redko, nevarnejše so mutacije v spolnih celicah, ker se dedujejo. Ni vsaka mutacija negativna! Mutatorji so geni, ki lahko povečajo število mutacij, njihovi produkti so vključeni v mehanizme popravljanja DNA. Mutatorji so lahko tudi geni, ki so neposredno vključeni v proces replikacije, npr. ε-podenota DNA-Pol III, gen za ε-podenoto je mutator.
Aedificator fecit AD MMII.

~ 25 ~

direktno popravljanje (direct repair) . SOS-odgovor) Direktno popravljanje Direktno popravljanje je razmeroma redko. Gre za preprosto odstranitev poškodbe oziroma povratno reakcijo. Domnevati je mogoče. da so procesi znotraj drugih celic oziroma organizmov podobni.Slika 25: Posledice napačnega parjenja baz. Aedificator fecit AD MMII. ~ 26 ~ . ena molekula encima ireverzibilno veže eno metilno skupino. ki jih povzroči 2-bromouracil Popravljanje napak Popravljanje napak Procesi popravljanja so najbolj raziskani pri E. ki vzpostavi prvotno stanje: DNA-polimeraze imajo sposobnost kontrolnega branja → 3'-eksonukleazna aktivnost Fotoliaza (produkt phr gena) omogoča reaktivacijo pirimidinskih dimerov ob prisotnosti vidne svetlobe O6-metilgvanin transferaza (ada gen) odstrani metilno skupino iz gvanina in tudi s sladkornofosfatnega ogrodja.tolerančni sistem (rekombinacijsko popravljanje. Bakterijska celica ima na voljo več popravljalnih mehanizmov: .popravljanje napačnega parjenja (mismatch repair) .izrezovalno popravljanje (excision reapir) . coli.

Tako nastala vrzel je velika ~ 12 nt. kar omogoči prepoznavanje in zamenjavo poškodba povzroči zamenjavo v eno od običajnih baz. Popravljanje napačnega parjenja Posledici napačnega parjenja baz sta lahko dve: poškodba privede do nenaravne baze. popravljalni mehanizmi morajo popraviti bazo v pravi verigi.določen sistem prepozna okvarjeno ali nepravilno sparjeno bazo in jo izreže . Aedificator fecit AD MMII.sinteza nove verige ob delovanju DNA-Pol I in DNA-ligaze Uvr siisttem Uvr s s em DNA cepi UvrABC endonukleaza: dimera UvrAB prepozna poškodbo. sicer pride od mutacije. Glliikoziillaznii siisttem G koz azn s s em Različne glikozilaze odstranijo določeno spremenjeno bazo z deoksiriboze.odstranitev dela okvarjene verige (5'-eksonukleaza) . veže se UvrC. ~ 27 ~ . ki jim je skupno: . ki navadno povzroči delno spremembo v strukturi dsDNA.Izrezovalno popravljanje Obstaja več različnih sistemov izrezovalnega popravljanja. Pred nastalo vrzeljo . UvrA disociira.cepi AP-endonukleaza in s tem omogoči delovanje DNA-pol I in ligaze. Vezavi sledi prekinitev verige sedem nukleotidov pred poškodbo in štiri nukleotide po poškodbi. Sledi delovanje DNA-pol I in ligaze.AP mestom . Slika 26: Delovanje Uvr sistema pri popravljanju napak na DNA. Pri razvijanju sodeluje UvrD.

kjer se na nastali kompleks veže MutH (endonukleaza). Končno se zapolni še tako nastala nova vrzel. Aedificator fecit AD MMII. Napačna baza se izreže.S → MutHLS. Sledi translokacija do prvega GATC mesta. Sledi delovanje DNA-pol III in ligaze. mutS in VsrDNA. Aktivirajo se geni mutL. Na MutS2 se vežeta dimera MutL. Mehanizem je naslednji: dve dimeri MutS se vežeta na mesto z napačnim parjenjem baz. ko nova veriga še ni metilirana in odstrani vmesni del. Dam--popravlljjanjje Dam poprav an e Poseben sistem (missmatch correction system. UvrD) prepozna napačno parjenje v bližini dam metilacijskih mest. ki so udeležene pri dam popravljanju Tolerančni sistemi Rekombiinaciijjsko popravlljjanjje Rekomb nac sko poprav an e Okvaro na DNA DNA-Pol III pri replikaciji preskoči.L. ki sicer sodeluje pri homologni rekombinaciji. ~ 28 ~ . geni mutH. ki se je podvojila brez prekinitve. Nastala vrzel se zapolni z ustreznim fragmentom iz druge verige. Sledi delovanje DNA-polimeraze III. V tem sistemu je udeležen RecA protein. Slika 27: Funkcije posameznih komponent.Prednosttno popravlljjanjje Prednos no poprav an e Zamenjava T v primeru nepravilnih G:T in C:T povezav.

RecA aktivira UmuD v UmuD'. UmuC in UmuD. ~ 29 ~ . Celoten SOS-odgovor je zelo učinkovit. ki preprečuje prepis različnih genov. Pri SOS-odgovoru se navadno poveča število mutacij. SOS-repair) → mutageno popravljanje Pri podvojevanju se nasproti modificirane baze vgradi nekomplementarna baza. Dve monomeri UmuD' se povežeta z UmuC v DNA-polimerazo V.a) Popravljanje z napako (error-prone. se hitro vključi in izključi. Ob tem sodeluje še DimB = DNA-polimeraza IV. b) SOS-odgovor RecA vpliva na popravljanje napak na indirekten način pri indukciji SOS-genov. pogosto pride do indukcije nekaterih profagov. coli Aedificator fecit AD MMII. lexA. Svoj delež pri tem procesu ima tudi DNA-pol III. Slika 28: Retrieval sistem oziroma rekombinacijsko popravljanje pri E. ta povzroči cepitev LexA-represorja. Po svoji strukturi je DimB podoben UmuC. Sodeluje RecA. vključno z recA. Na tak način se lahko prepreči še hujša poškodba (bypass sinteza). Operon umuDC se aktivira pri SOS-odgovoru bakterij na večje poškodbe DNA. Ko se zaradi poškodbe aktivira RecA.

transpozicija.možnost regulacije genske ekspresije → tehnologija rekombinantne DNA V splošnem je lahko rekombinacija treh tipov: . sekvenčna podobnost ni pogoj Homologna rekombinacija Homologna rekombinacija Homologna rekombinacija je mogoča med regijami DNA z enakim ali zelo podobnim zaporedjem. vsaj 75 baznih parov.mestno specifična rekombinacija. ki omogoča: . kjer gre za prenos genskega materiala znotraj genoma. ~ 30 ~ . Na molekularnem nivoju sta v leptotenu profaze prve mejotske delitve prisotni po dve sestrski kromatidi na homolognem kromosomu. Pogostost rekombinacije ni enaka vzdolž celotnega kromosoma.genetsko variabilnost: ločevanje pozitivnih od negativnih mutacij in s tem posledično boljšo evolucijo . ki je udeležena pri homologni rekombinaciji. Za samo komplementarno parjenje ssDNA zadošča že zaporedje desetih baznih parov. Do nje pride po nastanku prekinitev v eni ali obeh verigah DNA. skupno torej štiri DNA dupleksi. Pri rekombinaciji pride do parjenja komplementarnih baz v predelu ssDNA. pri prvi mejotski delitvi . V predelu heterokromatina je manjša. sledi navzkrižna povezava prekinjenih verig. npr. Gre za fizične prelome in ponovne združitve delov kromosoma (breakage and reunion). odvisna je tudi od tipa celic: pri oogenezi je štirikrat bolj pogosta kot pri spermatogenezi. Proces rekombinacije je viden pod mikroskopom v prvi fazi mejoze v obliki kiazem na kromosomih.popravljanje poškodovane DNA . ki poteče pri integraciji fagnega genoma . Nastala Hollidayeva struktura se lahko reši na več načinov: • • do druge prekinitve pride na isti verigi → → DNA vsebuje hibridne regije do druge prekinitve pride na drugi verigi → → DNA vsebuje izmenjane dele dvojne verige Slika 29: Hollidayeva struktura Aedificator fecit AD MMII.homologna (splošna) rekombinacija. Pri prokariontih mora biti dolžina regije. Modeli homologne rekombinacije klasični Hollidayev model Najprej pride do prekinitve ene verige v vsakem od obeh dupleksov DNA. kjer prihaja do križanja kromosomov (crossing over). Področja parjenja so kiazme. V pahitenu pride do rekombinacije med dvema sestrskima (homolognima) kromatidama.Rekombinacija Rekombinacija je eden od osnovnih reguliranih celičnih procesov.

~ 31 ~ . Slika 30: Rekombinacija lahko poteče na dva načina. Poti za potek je več. Aedificator fecit AD MMII. Rezultat pri prvem so izmenjane regije ssDNA . Na teh mestih pride do prekinitve ene verige z eksonukleazo V. 5'-GCTGGTGG-3') na vsakih 5 . ki stimulirajo rekombinacijo. pri drugi pa izmenjane regije dsDNA. ob tem lahko pride do delne izgube informacij. sledi eksonukleazno delovanje in nato napad 3'konca ene verige v homologno regijo donorske dsDNA. Prihaja do ponovne sinteze na obeh dupleksih DNA. Predpogoj za rekombinacijo je del DNA z enoverižno strukturo in prostim 3'-koncem. niso pa zanjo neobhodno potrebna. ki je produkt recBCD genov. V genomu E.- model dvojne prekinitve Model dvojne prekinitve je bolj verjeten. Bakterijska homologna rekombinacija Pri bakterijski homologni rekombinaciji gre večinoma za izmenjavo manjših delov DNA.10 kbp. V začetku pride do prekinitve obeh verig (DSB .double strand break) recipientske DNA z endonukleazo. informacijo zanjo daje v obeh primerih donorska DNA. coli so posebna zapredja χ (“chi”.

Pri evkariontih so že bili odkriti proteini. Pri rekombinaciji ima ključno vlogo encim RecA. ki prepozna Hollidayevo strukturo. Pomembno funkcijo ima še RuvB protein. ki postane 1. na katerega se navije ssDNA. njihova struktura in delovanje sta drugačni. Hitrost potovanja strukture je 10-20 bp/s. coli. ki imajo podobno funkcijo kot RecA v E. ki ima ATPazno funkcijo in je odgovoren za potovanje strukture vzdolž DNA. Pri potovanju sodeluje še RuvA. Monomere tega proteina tvorijo nit v obliki dvojnega heliksa. Slika 32: Potovanje Hollidayeve strukture omogočata proteina RuvA in RuvB. ~ 32 ~ . RecBC pa nadaljuje kot helikaza. na verigo DNA se veže v obliki tetramere.Slika 31: RecBCD se veže na prelom v dvojni verigi DNA. sledi prepoznavanje podobnih regij z drugo verigo v dsDNA (nastane trojni heliks DNA). Naposled Hollidayevo strukturo reši RuvC. Nastala struktura potuje od mesta razvejitve ob porabi ATP.5× bolj raztegnjena kot sicer. Sledi razvijanje tripleksa in zamenjava ene verige v dupleksu z verigo ssDNA. Aedificator fecit AD MMII. RecBCD odvija DNA in deluje kot eksonukleaza. Na chi sekvencah se encim ustavi in endonukleaza cepi eno od verig. Spremeni se tudi struktura DNA. RecD nato disociira.

Sledi prepoznavanje mesta attB. včasih pa pride do nerecipročnosti. Drugo mesto. V ekscizijo sta vključeni še mesti attL in attR. Mestno-specifična rekombinacija Mestno-specifična rekombinacija Mestno-specifična rekombinacija se pojavlja pri fagih. ki se lahko nato razvijajo samostojno. Genska konverzija ima velik pomen za evolucijo. Mestno specifična rekombinacija je pomembna pri regulaciji ekspresije nekaterih genov in tvorbi različnih genov za Aedificator fecit AD MMII. dobimo običajno dve kopiji očetovega in dve kopiji materinega alela (razmerje 2:2). Obe mesti imata enako osnovno sekvenco petnajstih baznih parov.attλ se nahaja na bakterijskem kromosomu in je večinoma veliko okrog 23 bp. ki ima tudi topoizomerazno aktivnost.integracijo faga v bakterijski kromosom in prehod v lizogeno fazo . Prehod med obema fazama vključuje: . Pri mejozi npr. Vzrok za gensko konverzijo je v napačnem popravljanju ene od verig hibridne DNA. oziroma attB na razdalji sedmih baz.ekscizijo (izrez) iz kromosoma in omogoči litično fazo V integracijo sta vključeni po dve mesti z oznako att (attachment). attP. nastala struktura je intasom. Integracija poteka tako. v redkih primerih lahko pride od razmerja 3:1 oziroma genske konverzije.Genska konverzija Homologna rekombinacija je običajno recipročna. je dolgo 240 bp. ki jo obdajata specifični sekvenci ob straneh. da se gen obdrži v večih kopijah. ki imajo lahko tako litično ali lizogeno fazo. Pri integraciji najprej pride do zaporedne asimetrične prekinitve na attP Slika 33: Integracija / ekscizija faga v bakterijski genom poteče v več fazah. Sledi razrešitev strukture. Omogoča namreč. ~ 33 ~ . Prvo mesto attB . in IHF navije mesto attP. vendar je stopnja integracije tisočkrat manjša. da se okoli več molekul integraze. Pri konverziji sodelujeta homologna rekombinacija in DNA-popravljanje. Pri integraciji/eksciziji sodelujeta še IHF (integration host factor) in Xis (ekscizionaza). Integracija lahko poteka tudi brez mesta attλ. Integracijo/ekscizijo pogojuje količina integraze/ekscizionaze.

sestavljeni Tn. ki se prenašajo preko RNA intermediatov in so bolj ali manj podobni retrovirusom Aedificator fecit AD MMII. transpozona .TE.retropozone. Transpozicijske elemente lahko razdelimo na: . ki se prenašajo preko DNA: insercijske sekvence-IS. ki omogočajo direktne ali indirektne preureditve genoma. ~ 34 ~ . Vplivajo lahko tudi na ekspresijo genov. Transpozicija poteka tako pri prokariontih kot evkariontih. na novo mesto v genomu in je neodvisna od podobnosti sekvenc donorja in recipienta. Transpozicija Transpozicija Transpozicija predstavlja premik transpozicijskega elementa.transpozone. TE so interni genomski vektorji. evkariontski Tn Slika 34: Nekaj tipov insercijskih sekvenc s tarčnimi mesti .protitelesa.

gre za upognjeno DNA. le da tu običajno ni podobnosti v mestih. Replikativna transpozicija: Pri replikativni transpoziciji pride do podvojitve TE. Na tak način se premikajo TnA transpozoni: Tn3. Konjugativna transpozicija: Aedificator fecit AD MMII. ~ 35 ~ . Gre za podoben mehanizem kot pri integraciji λfaga. 3. V tem primeru se DNA stopničasto prereže. Na tak način se premikajo: IS. Konjugativni transpozoni so promiskuitetni. Združitev Tn na mestih enoverižnih koncev 3. Tn10. Sledi intracelularna ali intercelularna transpozicija (s konjugacijo). ki imajo na koncih samo obrnjeno zaporedje. Ena kopija ostane na prvotnem mestu.Transpozicija največkrat poteče v treh fazah: 1. Zapolnitev vrzeli Transpozicij je več vrst 1. druga se vgradi na tarčno mesto. Slika 36: Potek nereplikativne transpozicije. ki deluje na kopijo TE. ker prenašajo rezistenco na antibiotike. Asimetrična prekinitev tarčne DNA 2. Na mestu vstavitve se tarčno mesto podvoji. Tn1000. konca Tn se lahko povežeta navzkrižno (strand transfer complex) lahko pa nastane kointegrat. in resolvaza. Transpozonske rekombinaze so podobne integrazi. Za ta način prenosa zadošča le transpozaza. kar se zgodi preko kointegrata. Omeniti velja element IS1 pri fagu Mu. Tarčna mesta niso niti specifična niti homologna. Tn5. Slika 35: Potek replikativne transpozicije 2. Sodelujeta transpozaza. ki se lahko prenaša bodisi replikativno ali nereplikativno. Transpozon se s stopničastim rezom izreže iz donorske molekule DNA in tvori zaprti krožni intermediat. ki deluje na koncih izvirnega TE. Nereplikativna transpozicija: Pri nereplikativni transpoziciji preide TE iz donorskega mesta na tarčno. ki so rekombinirana.

Odsotne so direktne ponovitve. ki največkrat vsebuje gene za rezistenco na antibiotike. ~ 36 ~ . ki vsebuje gen tetR. Značilnost TnA so insercijske sekvence na koncih. Slika 38: Transpozoni iz družine TnA imajo več genov. Sestavljeni Tn Sestavljeni Tn so večji in imajo osrednji specifični del. 10-40 bp dolge. ki vsebuje gen kanR. IS so neodvisni elementi in vsebujejo gene za lastno transpozicijo. in Tn10. Insercijske sekvence (IS) IS so najbolj preprosti TE. Aedificator fecit AD MMII. Sestavljeni Tn so: Tn5.i. IS1) ali bolj določena zaporedja. Na obeh koncih Tn so direktne ali obrnjene IS. Na mestih vstavitve povzročijo kratke direktne ponovitve. med njimi je tudi gen za transpozazo. obrnjene ponovitve. Na obeh koncih imajo kratke. Njihova velikost je ~ 1000 bp. t.Slika 37: Direktne ponovitve na koncih transpozona nastanejo s stopničastim rezom v tarčni DNA. Tarčna mesta so lahko naključna (npr. potnik (passenger).

aberacije kromosomov.Evkariontski Tn Prototip vseh evkariontskih transpozonov je Tn916.avtonomni elementi.neavtonomni elementi. ~ 37 ~ . ki nastanejo iz avtonomnih z delecijo ali kakšno drugo spremembo.neavtonomni geni . obratno ne velja. Sterilnost se pojavi pri križanju tipa I (%) s tipom R (&). Do hibridne disgeneze pride pri križanju nekaterih sort vinske mušice. prisotni so lahko še drugi . Aedificator fecit AD MMII. ki se prenašajo sami. Drugi sistem razdeli mušice na tip P (paternal) in tip M (maternal). Pri prvem sistemu je moč vinske mušice razdeliti v tip I (inducer) in R (reducer). ki inaktivira transpozazni gen. Pri evkariontih se imenujejo “kontrolni elementi”. nepravilna ločitev kromosomov pri mejozi in sterilnost. odkrila jih je B. a ohrani tarčna mesta za delovanje transpozaze Slika 39: Družine kontrolnih elementov Posledica delovanja kontrolnih elementov je hibridna disgeneza. Tudi tu križanje P (%) z M (&) povzroči disgenezo. Obstaja več tipov kontrolnih elementov: . Posledice hibridne disgeneze so: mutacije. Pri vinski mušici sta bila ugotovljena dva sistema. obratno pa ne. McClintock pri koruzi. osnovna komponenta je gen za transpozazo.

ki kodirajo različne encime. 7SL RNA je kodirana na genih. Poleg tega so lahko prisotni tudi zapisi v drugih bralnih okvirjih (ORF). vmesni del ne kodira ničesar. Možno je torej.nevirusna skupina je nastala iz virusne. V haploidnem genomu je približno 300. ki je del SRP (signal recognition particle . Alu sekvenca je povezana s 7S RNA.000 takih ponovitev.virusna skupina. Slika 40: Retropozoni lahko vsebujejo gene. ki ga uporablja pri transpoziciji. . Podobne sekvence so bile odkrite tudi pri miših (družina B1) in hrčku (Alu-equivalent family) in v drugih sesalcih. kar pomeni. primera sta Ty pri kvasovkah in copia pri D. da ne pride do litične faze v celicah. ~ 38 ~ . Ta tip retropozonov je verjetno nastal iz celičnih transkriptov preko neznanega encima. Slika 41: Sistematska razdelitev retropozonov in osnovne značilnosti posameznih tipov V človeškem genomu velik del ponovitev predstavljajo približno tristo baznih parov dolge ponovitve. njihova nadaljna delitev je: • LTR . ki usmerja protein na določeno mesto znotraj celice) zaradi tega ima oznako 7SL (7S-like) RNA in ustreza 90 bazam na 5' terminalnem delu Alu-sekvence. primer je LINE . ki jih aktivno prepisuje DNA-polimeraza III.sekvenca na začetku polipeptidne verige. da so Alu sekvence nastale z inaktivacijo 7SL RNA. Vmesni del nima homologije.long interspersed element Virusna skupina se od retrovirusov razlikuje v tem. ki vsebuje bralni okvir za reverzno transkriptazo / integrazo in ima na terminih direktne ponovitve. zadnjih 40 baz na 3'-koncu pa ustreza desnemu delu Alu. Bistvene razlike med obema skupinama retropozonov so povzete v Sliki 41. Te sekvence cepi prbližno 170 bp od začetka endonukleaza Alu I (AG↓CT). virusna skupina je retrovirusom podobna v mehanizmu.long terminal repeat. V genomu je take retropozone mogoče prepoznati po terminih. Aedificator fecit AD MMII. da se tako zaporedje pojavi na vsakih 6 kb genoma.Retrotranspozoni (retropozoni) Retropozone je mogoče razdeliti na dve skupini: . melanogaster • non-LTR. med katerimi so poljubna zaporedja DNA.

Aedificator fecit AD MMII. Možno je. ki se vežeta na lastno mRNA.Retropozon LINES L1 se prenaša preko RNA intermediata. ker omogoča primitivno rekombinacijo in regulacijo genske ekspresije. da so se virusi razvili ravno iz transpozicijskih elementov. ki se prevede v dva proteina. retropozoni. virusi Slika 42: Retropozoni lahko nosijo gene v različnih bralnih okvirjih. Možno razvojno pot prikazuje shema: IS → Tn → plazmid → Φ. ~ 39 ~ . obenem pa omogoča evolucijo genov in genomov. Transpozicija je pomembna zato.

Transkripcijski start ima oznako +1. Promotor je regija na DNA. V tem procesu druga veriga DNA služi kot matrica. Obenem je transkripcija tudi edini način sinteze celične RNA. pri istih organizmih je hitrost translacije 15 aa/s in replikacije 800 nt/s. Terminacija je zaključek sinteze RNA. ki ga povzroči terminacijsko zaporedje na DNA. Elongacija je rast enojne verige RNA. ko pride do sinteze prvih nekaj fosfatnih vezi . Transkripcija poteče v večih fazah: 1. downstream (po +1) oziroma bližnje (proksimalno) in daljno (distalno). 4. ki se nahajajo med promotorjem in terminatorjem. Iniciacija. Definicija velja za primarni transkript DNA. Slika 43: Transkripcija tipičnega Po II gena.do devet nukleotidov 3. na katero se veže RNA-polimeraza na začetku transkripcije. Enota transkripcije DNA vključuje vse sekvence. glede na ta start so definirani pojmi upstream (pred +1). da je na DNA vedno vezan določen delež RNA-polimeraz. Aedificator fecit AD MMII. Hitrost transkripcije je 40 nt/s (bakterije pri 37°C). za katero je značilna vezava RNA-polimeraze na promotor in lokalno razvitje DNA.Sinteza RNA Transkripcija je proces sinteze verige RNA. Transkripcijski mehurček predstavlja zaporedje štirinajstih baz. RNADNA hibrid je dolg 8-9 bp. za katero je značilno hitro premikanje transkripcijskega mehurčka vzdolž DNA. Jasno je vidna DNA. ki so razvite in se prepisujejo. Prepoznavanje matrice. ki pa ne morejo začeti transkripcije. ~ 40 ~ . mRNA ni vidna. ker se prevaja v protein na ribosomih. 2. ki je po sekvenci enaka kodirajoči verigi DNA. V zadnjem času se sicer zdi.

Vezava σ-faktorja zmanjša to afiniteto za faktor 104× in za tisočkrat poveča afiniteto do promotorja. Kompleks RNA-polimeraze z DNA je lahko v treh oblikah. V grobem je moč strukturo encima razdeliti na jedro encima in σ-faktor. zadnji del encima zaostaja. coli Zgradba RNA-polimeraze pri E. Zdi se. kot bi encim pednjal. v fazi elongacije se encim “skrajša”. coli je sestavljena iz petih podenot (α2ββ'σ) in deluje kot heteromultimera. V fazi elongacije RNA-polimeraza ne potuje enakomerno po DNA. V encimu ima vsaka podenota določeno vlogo. σ β β' Slika 44: Zgornja shema prikazuje dele RNA-polimeraze Slika 45: V stopnji iniciacije je RNApolimeraza daljša.Zgradba RNA-polimeraze pri E. coli Jedro encima ima splošno afiniteto do DNA. Aedificator fecit AD MMII. po iniciaciji se sprosti vezava nukleotida (rNTP) vezava DNA sestavljanje jedra in interakcija s promotorjem in α nekaterimi regulatornimi proteini Tabela 10: Vloga podenot v RNA-polimerazi E. ki je prikazana v tabeli: prepoznavanje promotorja. coli RNA-polimeraza pri E. ~ 41 ~ . prednji del potuje kontinuirno.

coli tri različne σ-faktorje: .je na mestu -10 heksamerno zaporedje TATAAT . obenem se tudi encim sprosti z DNA. ~ 42 ~ . Aedificator fecit AD MMII.Pribnowo zaporedje.σ70 je splošni faktor transkripcije . kar jim omogoča uporabo celičnih encimov za sintezo virusnih proteinov in obenem tudi kontrolo nad potekom infekcije . ko nastane zaprt kompleks. 3. Mesto -35 je mesto prepoznavanja DNA s strani RNA-polimeraze. ki stabilizirajo strukturo celičnih proteinov. Na mestu -10 se DNA razvije in nastane odprti kompleks. Terminacija Terminacija Terminacija je zaključek sinteze RNA. da ima E. Pri transkripciji imajo pomembno vlogo topoizomeraze: . RNA in DNA. Glede na način terminacije tako ločimo: od ρ-faktorja (rho) neodvisno terminacijo: Na koncu gena. zmanjšati sinteza proteinov plašča in se mora začeti sinteza drugih proteinov.na določeni stopnji se mora npr. da je mogoče z izbiro σfaktorja izvajati določeno kontrolo nad prepisovanjem DNA. Slika 46: Lasnica na mRNA nastane pri od ρ-neodvisni terminaciji.je prvi nukleotid v mRNA večinoma Pu.Zgradba bakterijskega promotorja Zgradba bakterijskega promotorja Za bakterijski promotor v splošnem velja. da se RNA sprosti z encima. Več σ-faktorjev imajo tudi virusi. Ugotovljeno je bilo.je razdalja med TATAAT in TTGACA 16-18 bp. subtilis ima približno deset različnih σ-faktorjev. da se ob prepisu v RNA tvori steblo na slednji.σ32 je faktor. Nastalo steblo na RNA ustavi RNApolimerazo. da: 1.giraza (topoizomeraza II) deluje pred RNA-polimerazo in uvaja dodatno negativno zvitje . se nahaja palindromna sekvenca G-C parov. 2. je mogoče sklepati. šibke interakcije A (na DNA)-U (na RNA) povzročijo sprostitev encima. 4. Za zaključek transkripcije je značilno. Ker njegova vezava na jedro encima RNA-polimeraze spremeni njeno afiniteto do DNA. ki omogoča. ki se veže na RNA-polimerazo v primeru vročinskega šoka in sproži prepis genov za HSP (heat shock protein). .je na mestu -35 heksamerno zaporedje TTGACA. kjer pride do razvitja dvanajstih baznih parov ( -9 do +3). tej vezavi sledi vezava na mestu -10.σ54 sproži prepis genov v primeru dušikovega stradanja B.topoizomeraza I deluje za RNA-polimerazo in uvaja dodatno pozitivno zvitje σ-faktor ima pomembno funkcijo pri regulaciji transkripcije. Encim se najprej veže na mesto -35. ki ga prepisuje RNA-polimeraza. Palindromni sekvenci sledi zaporedje šestih adeninov (na DNA) oziroma šestih uracilov (prepis A v RNA).

~ 43 ~ . Pri evkariontih še ni natančno znano. ki jih prepoznava ρ-faktor.- od ρ-odvisno terminacijo: Splošna značilnost tega tipa terminacije je regija. kako pride do terminacije transkripcije. ki deluje kot heksamera. ki jo zaustavi šibko steblo. Zdi se. Slika 47: Vezava ρ-faktorja. ρ-faktor potuje po RNA in dohiti RNA-polimerazo. NusA je pomožna molekula. da na terminacijo vpliva sekundarna struktura RNA in zaporedje baz. v RNA-prepisih. ki se nahaja 50-90 nt pred koncem RNA in je bogata s citozini. ki lahko sodeluje pri transkripciji. še posebej uracilov. Kompleks se sprosti ob porabi ATP. Aedificator fecit AD MMII.

Korepresor aktivira represor.na ravni procesiranja RNA . lahko so represorji IN aktivatorji. ki so regulirani samo s promotorjem. Pri pozitivni regulaciji je gen aktiven. pozitivno regulirani: a) Indukcija . ki jih kodirajo: . ki vplivajo na transkripcijo v okviru verige. Trans-delujoči faktor (lahko je gen. GRE. encime . . npr. dokler ga na izključi represor. da je tako pri prokariontih kot pri evkariontih najpomembnejša regulacija na ravni transkripcije. RNA. Njihov vpliv na ekspresijo je pozitiven ali negativen. ~ 44 ~ .na ravni transkripcije .regulatorni: kodirajo regulatorne proteine. Trp-represor. Nekateri regulatorni proteini imajo dvojno vlogo.kontrolirani geni.apoinduktor. Cis-delujoča mesta so mesta.na ravni translacije . ko ga aktivira aktivator . geni so lahko inducibilni ali represibilni Za negativno regulacijo velja. O delovanju represorjev in O delovanju represorjev in aktivatorjev aktivatorjev Represor se veže na operator. kot so npr. ki vplivajo na transkripcijo Regulatorni proteini so trans-delujoči faktorji. npr.Induktor inaktivira represor. . ki je v bližini promotorja ali se celo z njim prekriva.post-translacijsko Vse kaže. ki jih regulirajo trans-delujoči faktorji. Aedificator fecit AD MMII.Regulacija genske ekspresije Regulacija sinteze/aktivnosti proteinov lahko poteka: . Pri bakterijah je genska regulacija v splošnem negativna. pri evkariontih pa pozitivna. mednje sodijo hišni (house-keeping) geni . Geni so lahko glede na funkcijo produktov.Induktor aktivira aktivator. CRE. Glede na kontrolo njihove ekspresije ločimo: . elementi AP1.strukturni: kodirajo strukturne proteine. sistem laktoza-lac represor. Mutacija v genu za represor povzroči konstitutivno ekspresijo takega gena .Korepresor inaktivira aktivator. ki se vežejo na cis-delujoča mesta (zaporedja DNA ali RNA).konstitutivne gene. Če pride do mutacije v genu za aktivator. AP2. regulacija je lahko bodisi pozitivna ali negativna. ali protein) vpliva na prepis na nasprotni verigi. se gen ne eksprimira več. sistem cAMP-CRP.odvisna je samo od promotorja. Tako inducibilni kot represibilni geni so lahko negativno. da je gen aktiven. npr. na kateri se nahajajo. b) Represijo: .

Slika 48: Kontrolno vezje Induktor oziroma korepresor pogosto povzroči alosterično spremembo regulatornega proteina in ga s tem aktivira/inaktivira. ~ 45 ~ . Aedificator fecit AD MMII. V drugih primerih lahko aktivacija poteče preko fosforilacije ali celo oksidacije v nekaterih primerih.

po čemer je mogoče sklepati.izopropil-βD-1-tiogalaktopiranozo. ki kaže na pomanjkanje glukoze. znotraj katere se veže še CAP. Ta encim . glukozno-občutljive operone. ki sintetizira cAMP. za pozitivno pa protein CAP . Posledica tega sistema je tudi.CRP (catabolite activator protein . Za negativno regulacijo skrbi lac-represor (homotetramer). vendar se v celicah ne razgrajuje. da je lahko sladkor katerakoli alolaktoza. Ker se cAMP sintetizira iz ATP. Zadnja stopnja regulacije poteka na nivoju laktozne permeaze. je malo tudi fosfatnih skupin. je nivo cAMP zelo nizek. Ko je namreč v gojišču glukoza. ki deluje kot induktor. Izkaže. ~ 46 ~ . sinteza cAMP je nizka. Represor se sprosti ob vezavi induktorja laktoze. Slika 49: Struktura Lac-represorja Aedificator fecit AD MMII. ki se eksprimira konstantno Vezava lac-represorja na operatorsko sekvenco povzroči nastanek zanke na DNA. Sklep: če je v gojišču glukoza. gre za t. Pozitivna regulacija poteka s CRP. da eden od katabolitov glukoze inhibira delovanje adenilat ciklaze. CRP aktivira povišan nivo cAMP. Ta način regulacije preprečuje nepotrebno prepisovanje operonov. je nivo cAMP zelo nizek. ko te zmanjka pa drugi metaboliti. coli so raziskovalci uporabljali IPTG . Posledica: če sta v gojišču glukoza in laktoza. Pri raziskavah genske ekspresije v E. če naj funkcionira.cAMP receptor protein).Regulacija na ravni transkripcije Regulacija na ravni transkripcije Lac operon Lac operon je primer inducibilnega operona.transporter mora biti fosforiliran. CRP je tudi pozitivni regulator gal in ara operonov.i. da se v gojišču najprej preferenčno porablja glukoza. ki skrbi za vnos laktoze v celico. Permeaza zato ni fosforilirana in zato ni aktivna. se bo v celico prenašala samo glukoza. Lac operon kodira naslednje proteine: lacZ za β-galaktozidazo lacY za β-galaktozidno permeazo lacA za β-galaktozidno transacetilazo lacI za laktozni represor.

ki prepoznava dve obmejni zaporedji TGTGA. da se protein lahko veže na DNA. deluje kot represor. ipd. arabinoza.Še nekaj besed o strukturi CRP. CRP sodi med splošne aktivatorje. pomanjkanje glukoze. Aedificator fecit AD MMII. Če se na C-protein veže arabinoza. katerih transkripti so potrebni samo v določenih pogojih. ki kažejo. Specifični aktivatorji se uporabljajo tudi za gene. O-operator). Slika 50: Vezava induktorja spremeni strukturo represorja tako. maltoza. Negativno regulira prepisovanje lastnega gena . Na vsaki podenoti dve kratki α-vijačnici tvorita helix-turn-helix motiv. da se ne more več vezati na DNA.gre torej za avtoregulacijo . Ara operon Pri ara operonu sodeluje pri regulaciji še C-protein. dušika. ki je lahko pozitivni ali negativni regulator. Prisotnost HTH-motiva je eden od znakov.in genov za metabolizem arabinoze. npr. mora priti še do vezave cAMP na CRP. CRP je sestavljen iz dveh enakih podenot (2 × 22. Gen za C-protein se prepisuje v obratni smeri od ostalih genov ara operona. npr. ki ležita 22 bp pred PO-regijo (P-promotor. katerih produkti sodelujejo v metabolizmu določenih spojin. serin. ~ 47 ~ . Če na C-protein ni vezana arabinoza. deluje kot aktivator. Za aktivacijo transkripcije. ki regulirajo gene. fosfata.5 kDa). ki poteče z vezavo na PBAD.

Regulacija SOS genov RecA je induktor. ki reprimira različne SOS-gene. Prepisovanje je odvisno od razdalje med koncem enega gena in začetkom drugega. se inducirajo pri težjih poškodbah. ki močno vežejo LexA-represor. ~ 48 ~ . celo lastnega. Geni. večja je polarnost . Genetska polarnost Genetska polarnost pomeni različno prepisovanje genov enega in istega operona. Polarnost preprečuje jalovo prepisovanje genov pri stradanju. ki popravlja DNA z rekombinacijo. in gene za RecA. Poveča se tudi koncentracija drugih proteinov. Slika 51: Delovanje LexA-represorja Regulacija z izbiro σ-podenote Splošni geni se prepisujejo z uporabo σ70 podenote. Na podoben način je regulirana transkripcija virusnih genov.slabši je prepis naslednjega gena. Po cepitvi se poveča koncentracija RecA. ki povzroči cepitev LexA-represorja. Tisti operatorji. Če so celice izpostavljene temperaturnemu šoku. ki šibko vežejo LexA-represor. V primeru dušikovega stradanja poteka prepisovanje s σ54 podenoto. Večina večjih genov ima od ρ-faktorja odvisno terminacijo. se inducirajo že pri šibkih poškodbah. ribosom disociira in dostop ρ-faktorja je lažji. Aedificator fecit AD MMII. Prvi stop kodon ustavi translacijo. Večja je ta razdalja. ki popravljajo DNA. se geni prepisujejo s σ32 podenoto. kar zniža nivo LexA le malo.

NusB-S10). nastane lasnica. ki se vežejo na RNA-polimerazo in povzročijo. Aedificator fecit AD MMII. Slika 52: Primerjava terminacije in antiterminacije.s sekundarno strukturo mRNA.Antiterminacija Antiterminacija lahko poteka preko dveh mehanizmov: . da se transkripcija nadaljuje tudi preko terminacijskih sekvenc . Regullaciijja z anttiittermiinaciijjskiimii ffakttorjjii Regu ac a z an erm nac sk m ak or Regulacija z antiterminacijskimi faktorji je relativno redka. da se na mRNA veže faktor. Splošni transkripcijski faktor NusA se tako veže na jedro encima RNA-polimeraza po disociaciji σ faktorja in ostaja z njo povezan vse do terminacije. Primer zanjo je λ-fag. se lasnica ne tvori in transkripcija se nadaljuje.faktor Q. RNA-polimeraza zato disociira in konča transkripcijo. Pri bakterijah je ta način regulacije prisoten pri rRNA operonih (rm geni. V primeru. ~ 49 ~ . ki povzroči prepis poznih genov preko terminatorja kasnejših zgodnjih genov.faktor N. ki povzroči prepis kasnejših zgodnjih genov preko terminatorjev tL1 in tR1 . kjer sta bila odkrita dva antiterminacijska faktorja: .z antiterminacijskimi faktorji. Antiterminacijski faktorji lahko tudi povečajo učinkovitost Nus (N-utilization substance) faktorjev.

~ 50 ~ . ki je sestavljen iz petih strukturnih genov. ki kodirajo encime za sintezo triptofana. Slika 53: Princip atenuacije Aedificator fecit AD MMII. ki deluje kot korepresor. deset odstotkov regulacije predstavlja atenuacija. obenem pa omogoča notranjo terminacijo prepisa.attenuaciijja Regu ac a s sekundarno s ruk uro mRNA a enuac a Atenuator je notranji terminator na začetku transkripcijske enote. V obeh primerih na transkripcijo vpliva raven triptofana. Regulacija transkripcije poteka v sedemdesetih odstotkih preko triptofanskega represorja. Primer regulacije z atenuacijo je trp operon.Regullaciijja s sekundarno sttruktturo mRNA -.

atenuatorjem. Tvorita se stebli 1||2 in 3||4. ki omogočajo tvorbo različnih stebel: 1||2. se steblo 3||4 ne more.Začetni del mRNA prepisa. ki kodirajo encime za sintezo aminokislin.dovolj triptofana: Če je dovolj triptofana. ki je dolg 140 nt. RNApolimeraza lahko prepiše gene EDCBA. gre ribosom hitreje preko regije 1 in se ustavi v regiji 2. . . Možnosti za tvorbo stebla je več. Thr. Prevod se takoj konča. Če se tvori steblo 2||3. His. Ko pride ribosom do dveh Trp kodonov v regiji 1. vse so odvisne od nivoja triptofana: . kar omogoči tvorbo atenuatorja. kodira vodilni peptid iz štirinajstih aminokislin. 2||3 in 3||4. prepis je s tem blokiran. Zaporedje nukleotidov na področju te vodilne sekvence kaže štiri komplementarne regije. Leu.malo triptofana: Če je malo triptofana. . Slika 54: Regulacija z atenuacijo na primeru triptofanskega operona Aedificator fecit AD MMII. je malo tudi TrptRNA. ki se kmalu konča s terminacijskim steblom (steblo 3||4) ... Atenuacija je prisotna tudi pri drugih operonih. ~ 51 ~ . Prepis se ustavi po koncu vodilne sekvence. ki onemogoča nastanek atenuatorja (3||4). se zato ustavi. tvori se steblo 2||3. Sledi stop kodon. Phe.stradanje: Pri stradanju manjkajo še nekatere druge aminokisline.

AppppA-pomanjkanje tRNA.i. ZTP-pomanjkanje fosfata. kar privede do zaustavitve sinteze proteina oziroma do praznega teka (idling reaction).Regulacija na ravni transkripcije in Regulacija na ravni transkripcije in translacije translacije Gvanozin tetrafosfat in gvanozin pentafosfat (p)ppGpp je splošni signal za stradanje in predstavlja enega od odgovorov na težavne razmere v bakterijski celici (t. Spojini sodita med alarmone (alarmne hormone). kar je glavna pot . stringent response).zniža sintezo rRNA in tRNA . Slika 55: ppGpp lahko nastaja po dveh različnih poteh: . da protein RelA sintetizira (p)ppGpp in sprosti tRNA z ribosoma. ko se na A-mesto ribosoma veže nenabita tRNA (brez aminokisline). da vpliva na aktivnost ribosomskih proteinov.zmanjša ekspresijo enih genov in stimulira ekspresijo proteinov.iz GDP in ATP.iz GTP in ATP. ~ 52 ~ . ki ga aktivira RelA s pomočjo konformacijske spremembe prvega. ki so potrebni v primeru stradanja • prevajanje: zmanjša hitrost sinteze proteinov tako. L11 je velika podenota ribosomskega proteina. Do odgovora na težavne razmere pride. ki je manjša pot ppGpp vpliva na: • prepisovanje: . podobno kot cAMP-pomanjkanje glukoze. ki katalizirajo tvorbo peptidne vezi. Aedificator fecit AD MMII. Prisotnost nenabite tRNA povzroči. Po sintezi (p)ppGpp se proteinska sinteza hitro zniža na 5%-10% predhodne ravni.

ribosomi na mRNA onemogočajo dostop Rnazam .1. Rnaza III prepoznava določen tip lasnic Procesiranje mRNA Procesiranje mRNA pri evkariontih vključuje izrezovanje intronov in transport mRNA iz jedra v citoplazmo.2 mRNA. ki onemogoča iniciacijo translacije 1. Aedificator fecit AD MMII. Produkt cepitve so tako 4 monocistronske mRNA in 1 bicistronska . mRNA za pomembne proteine so zelo stabilne.2 omogoča translacijo bicistronske 1. Encimski razgradnji sledi fosforilacija nukleotidov in njihova ponovna uporaba. coli je kratka t½ ~ 2 min pri 37°C.2 . Šele cepitev na koncu gena 1.1/1. ki jih prepoznavajo določene Rnaze. Šele ustrezna cepitev omogoči prepis genov. Necepljena mRNA tvori sekundarno strukturo. Slika 56: Zgodnji geni pri fagu T7 se prepisuje v obliki policistronske mRNA.odsotnost signalov.Regulacija na ravni stabilnosti in Regulacija na ravni stabilnosti in procesiranja mRNA procesiranja mRNA Stabilnost mRNA Povprečna življenjska doba mRNA v E.1 mRNA. Razloga sta dva: . pri bakterijah je to cepitev policistronskih mRNA a) Prepisovanje zgodnjih genov pri fagu T7 Najprej se prepiše policistronska mRNA. npr. ki se z Rnazo III cepi v pet mRNA.1/1. ~ 53 ~ .

pri lac operonu je tako: β-galaktozidaza : permeaza : transacetilaza = 1 : 1/2 : 1/5. S tem ustavi tudi svojo lastno sintezo. Regulacija s translacijskimi represorji Nekateri regulatorni proteini se vežejo na RBS in preprečijo vezavo ribosoma. Pri fagu T4 vezava RegA proteina prepreči translacijo različnih zgodnjih mRNA. Prekurzorska 30S RNA se najprej cepi z Rnazo III. Avtogena regulacija • na primeru policistronskega operona Avtogena regulacija tega tipa je prisotna pri genih.. ki so povezani s proteinsko sintezo. . Razloga za to sta: . Gre za operone. ki se veže na sprednji del svoje mRNA in s tem prepreči translacijo zapisov. V teh operonih je tudi zapis za tRNA. Pri RNA fagu R17 protein plašča prepreči translacijo mRNA za replikazo. Eden od genskih produktov je r-protein (S1. ki omogočijo tvorbo končnih oblik rRNA in tRNA.b) pre-rRNA Pri E. coli sedem rrn operonov kodira 16S-23S-5S rRNA. Ribosomska regulacija Pri translaciji proteinov iz ene policistronske mRNA se proteini sintetizirajo v padajočem molskem razmerju. ~ 54 ~ . ko mora ribosom dlje časa čakati. Aedificator fecit AD MMII. S2.različna hitrost vezave ribosomov na RBS (ribosome binding site) na mRNA Na prevajanje vplivajo tudi kodoni za redke tRNA. ki vključujejo gene za ribosomske proteine. tej cepitvi sledi cepitev z ostalimi Rnazami. coli Regulacija na ravni translacije Regulacija na ravni translacije Kontrola na ravni translacije običajno poteka na stopnji iniciacije in terminacije podobno kot pri transkripciji.po branju prvega stop kodona odpade nekaj ribosomov .). nekatere translacijske faktorje (EF) in nekatere podenote RNA-polimeraze. Slika 57: Cepitev pre-rRNA pri E.. ki sledijo (negativna avtogena regulacija).

Na tem mestu je smotrno predpostaviti. kar je zelo pomembno pri ekspresiji rekombinantnih proteinov v bakterijah. Regulacija s sekundarno strukturo mRNA Struktura mRNA v predelu RBS in začetnega dela kodirajočega zaporedja omogoča boljšo/slabšo vezavo ribosoma in s tem boljšo/slabšo sintezo proteina. pride do povezave r-proteinov z njo in translacija rproteinov se lahko nadaljuje. Tvorita se stebli 1||2 in 3||4. zato je dovolj časa za premik bralnega okvirja. Aedificator fecit AD MMII. Pri mRNA za RF2 je prvih 25 aminokislin v pravem ORF. RF2 prepoznava tudi lastni UGA kodon. Avtogena regulacija sinteze RF2 RF2 prepoznava stop kodona UGA in UAA (RF1 pa UAA in UAG).če ni rRNA. 23S. ki je kodirana na plazmidih nekaterih Gram-pozitivnih bakterij. kar prepreči vezavo antibiotika eritromicina. se noben več ne ustavi in sinteza metilaze se konča. Situaciji sta lahko dve: 1) Dovolj RF2: Z ribosoma se sprosti prvih 25 aminokislin. ki ga prepoznava RF1. 2) Malo RF2: Sprostitev peptida zamuja. kar omogoči tvorbo stebla 2||3. Možnosti sta torej dve: 1) Eritromicina ni v gojišču: Ribosom zlahka prevede vodilni peptid in zapusti mRNA. • na primeru monocistronskega gena DNA-polimeraza faga T4 inhibira translacijo lastne mRNA z vezavo na mRNA v področju ShineDalgarno sekvence. Adenin metilaza metilira adenin v 23S rRNA. . Omogočen je dostop drugega ribosoma do začetnega kodona metilaze. Tvorijo se podobna stebla kot pri atenuaciji. za β in β ' podenoto RNA-polimeraze v rif operonu). ki je prisoten v štirih kopijah na ribosom in se prevaja bolj učinkovito od ostalih. Translacija se nadaljuje do končnega stop kodona UAG. Ko je dovolj rezistentnih ribosomov.Povezava s sintezo rRNA je naslednja: . Regulacijo s sekundarno strukturo najbolje ilustrira sinteza adenin metilaze.ko je na razpolago rRNA (16S. razen že sintetiziranega. kar onemogoči dostop ribosomu do iniciacijskega kodona. izjema je tudi r-protein L7/L12. le da gre v tem primeru za kontrolo začetka proteinske sinteze. RF1 takšne kontrole nima. 2) Eritromicin je prisoten v gojišču: Zaradi antibiotika se upočasni prevajanje vodilnega peptida. ki se pri kompletni sintezi prevedejo v Asp s premikom bralnega okvirja.8S). da je v celici vedno nekaj rezistentnih ribosomov. na katero se sicer veže ribosom. Po kodonih za 25 aminokislin sledijo baze UGAC. naslednje pa so v +1. Steblo 3||4 se ne more tvoriti. se r-protein akumulira v celici in blokira translacijo lastne mRNA Določeni geni v takšni policistronski enoti so neodvisni od te regulacije (npr. V celici ni funkcionalnega RF2. ~ 55 ~ . 5.

ki vključuje SD in AUG kodon. ki se skupaj z micRNA sintetizirata kot odgovor na spremembo v osmolarnosti medija. kar vpliva na strukturo RNA. ki je pozitivni regulator genov ompC in micF. Tvori se RNA-RNA heliks.Regulacija s komplementarno RNA Pri regulaciji s komplementarno RNA gre za vezavo ssRNA (antisense) na mRNA bodisi neposredno v predelu začetka translacije bodisi kje drugje. Pri povečanju osmolarnosti EnvZ aktivira OmpR. Slika 58: Regulacija s komplementarno RNA Aedificator fecit AD MMII. ~ 56 ~ . ki je komplementarna predelu na mRNA za OmpF. ki prepreči translacijo ompF mRNA. Produkt micF gena je RNA dolžine 174 nukleotidov z imenom micRNA (mRNA-interferingcomplementary RNA). Primer takšne regulacije je sinteza porina OmpF (outer membrane porine). ki jo zazna EnvZ.

Protein SulA je inhibitor celične delitve in je produkt SOS-genov. SulA) so manj stabilni in se hitro razgradijo. Po popravi poškodbe SulA ni več potreben. Lon mutante so letalno občutljive na UV. se SulA ne razgradi in celica se ne more deliti in kasneje propade. Ko UV sevanja ni več. Pri obsevanju z UV pride namreč do cepitve LexA-represorja in sinteze SulA. drugi proteini (LexA-represor. λ-represor.Regulacija s proteolizo Regulacija s proteolizo Nekateri bakterijski proteini so bolj stabilni. kar je posledica primarne strukture in kompaktne terciarne strukture. Po indukciji SOS-genov. Aedificator fecit AD MMII. Lon proteinaza SulA hitro razgradi. ~ 57 ~ . ki odstranjuje nezrele in prekratke proteine. se SulA akumulira in prepreči delitev celice. njegov gen je reprimiran z represosorjem LexA. SulA cepi proteinaza Lon.

G-ψ.Translacija Translacija . ki jo ta tRNA prenaša.prenaša aminokisline in mRNA . tRNA .nosi informacijo za zaporedje aminokislin. ki je derivat gvanozina. listi predstavljajo t. Struktura tRNA Struktura tRNA tRNA ima sekundarno strukturo v obliki štiri/petperesnega lista detelje. ne pa v aminokislini. Slika 59: Sekundarna in terciarna struktura tRNA Aedificator fecit AD MMII.prevod je proces. tRNA ima terciarno strukturo v obliki črke L. Zaradi modificiranih baz je možna tvorba drugačnih. pri katerem se informacija iz mRNA prevede v zaporedje aminokislin. roke. Posamezna tRNA-sintetaza prepozna določeno aminokislino in vse različne tRNA (in posledično vse antikodone na njih). Pomen določene tRNA je “napisan” v antikodonu. ki so: roka D (dihidrouridin) antikodonska roka dodatna roka. ki ga katalizirajo aminoacil-tRNA sintetaze ob prisotnosti ATP. Celotna tRNA je dolga 74-95 nt. Pregled modificranih baz sledi. A-ψ). ki jo lahko vežejo. V tem procesu sodelujejo vsi glavni tipi RNA in sicer: rRNA . šibkejših povezav med bazami: G-U.psevdouridin) akceptorska roka (zaporedje -CCA-3') Za tRNA so značilne modificirane baze. ki je lahko različno dolga roka TψC (ψ . Posamezna aminokislina se veže na 2' ali 3' hidroksilno skupino riboze zadnjega nukleotida v procesu. poleg prej omenjenih je tu še kvevozin.glavna komponenta ribosomov. ~ 58 ~ .i.

Siva barva vezi nakazuje mesto vezave na ribozni sladkor. Modificirane baze se pojavljajo v tRNA in nekaterih tipih rRNA.Slika 60: Modificiranih baz je več. Skrajno levo so narisane izvorne baze. pri interakcijah kodon-antikodon. Modifikacija malenkost spremeni kemijske lastnosti prokurzorske baze. kar je pomembno npr. Z rdečo barve so označene modifikacije. Aedificator fecit AD MMII. ki sestavljajo ribosom. ~ 59 ~ . zlasti tistih.

Pri sintezi proteinov je lahko na eni mRNA več ribosomov. ki so različnih velikosti: .ribosomih. En ribosom prekrije območje 30-35 nt.8 rRNA. ki jo prevajajo. kakšna bi naj bila sekundarna struktura ribosoma. evkariontski so krajši . puromicin peptidil transferazno delovanje: eritromicin. ki imajo točno določeno mesto v mali podenoti. Modeli so bili tudi preverjeni na celih ribosomih s primerjavo 3D-struktur. Izhodna domena sodeluje pri vezavi ribosoma na membrano (gER pri evkariontih). kloramfenikol translokacija: fuzidna kislina Ribosom je sestavljen iz translacijske in izhodne domene.Struktura ribosomov Struktura ribosomov Translacija poteka na ribonukleoproteinskih partiklih . ki in vitro asociirata ob zvišanju koncentracije Mg2+ in disociirata ob njenem znižanju. Študij proteinske sinteze poteka s pomočjo antibiotikov. v mitohondrijskih ribosomih tako ni 5S in 5. Sintetizirani protein se prične zvijati že ob koncu sinteze.v dvoverižni obliki. ki inhibirajo posamezne stopnje translacije: inciacija: streptomicin elongacija: kiromicin. L7 v 4 kopijah evkariontski ribosom (80S) 40S : 18S rRNA 33 proteinov 60S : 28S rRNA 5. EF-G. specifičnimi modifikacijami in delovanjem nukleaz in specifičnih proteinov. peptidil transferazno.povprečno 8 ribosomov na molekulo RNA.pri evkariontih je njihova masa 80S (40S + 60S) Vsak ribosom je sestavljen iz dveh podenot.manj kot 8 bp .pri prokariontih je njihova masa 70S (30S + 50S) .8 rRNA ~ začetku 23S rRNA 5S rRNA Tabela 11: Razlika v strukturi bakterijskih in prokariontskih ribosomov Masa ribosoma je več kot 1000 kDa. Aedificator fecit AD MMII. Ribosomi organelov so drugačni od citosolnih. V ribosomih je prisotnih 80% vseh rRNA v celici. Ribosom se delno sestavi že pri transkripciji. Slika 61: Polisomi mala podenota velika podenota bakterijski ribosom (70S) 30S : 16S rRNA 21 proteinov 50S : 23S rRNA 5S rRNA 31 proteinov. nastala struktura je polisom. porablja se GTP. 16S rRNA ima štiri domene. EF-Tu in 5S rRNA. Pri delovanju se konformacija ribosoma spreminja. A. in mesto za vezavo mRNA. le tretjina odpade na proteine. Na translacijski domeni so aktivna mesta P. ~ 60 ~ . S primerjavo primarnih struktur rRNA pri podobnih organizmih je bilo ugotovljeno. pri čemer dve tretjini k celotni masi prispevajo rRNA. Nekatere baze v rRNA so metilirane. Prevajanje se vrši na stiku obeh podenot. Bakterijski polisomi so daljši. Pokazalo se je. da so kratki odseki .

Možnost napake pri translaciji ( < 10-5) je veliko manjša od možnosti napačnega parjenja kodonantikodon. Slika 62(zgoraj): Mala podenota 30S ribosoma pod elektronskim mikroskopom Slika 63: 16S rRNA. pri katerem delno sodelujejo tudi translacijski faktorji. ker ima ribosom tudi kontrolno branje. ki je ena od komponent ribosoma. Aedificator fecit AD MMII. ~ 61 ~ . Verjetnost vezave napačne aminokisline na tRNA z aa-tRNAaa-sintetazo je tudi < 10-5. Vsaka domena ima določeno funkcijo pri translaciji. je sestavljena iz štirih domen.

ki je na mestu 3 v kodonu. Pokaže se. Pogosto je ta baza inozin. Povprečno aminokislino kodirajo trije kodoni. UGA UAG). Do odstopanj pride v mitohondrijih: UGG → Trp.Genski kod Genski kod Na mestu kodona je lahko katerakoli kombinacija treh nukleotidov. UGA → Trp (sicer je to stop): v mitohondrijih vretenčarjev delujeta AGA in AGG kot stop kodona. ki kodirajo isto aminokislino. ~ 62 ~ . so sinonimni. ki lahko tvori več vodikovih vezi (za razliko od A-T. 1961). izjemi sta Met in Trp. da velik del aminokislin kodira več kodonov . Se pravi. G-C). da se je pojavila že zelo zgodaj v evoluciji.degeneracija genskega koda. ker predstavljajo stop kodone (UAA. Kodoni. Vseh možnih kombinacij nukleotidov je 64. od tega tri odpadejo. Skoraj popolna univerzalnost genetske kode kaže na to. Slika 64: Genski kod Aedificator fecit AD MMII. da se kodoni med sabo največkrat razlikujejo v bazi. Genetska koda je bila razvozlana s pomočjo sintetičnih polinukleotidov in vezave radioaktivno označenih aa-tRNA (Nirenberg in Matthaei.

ki traja do nastanka prve peptidne vezi. IF-2 in IF-3. tRNA se na ribosomu premika v isti smeri kot mRNA: A → P → E. peptidilno. Tretje mesto. Obe mesti ležita na veliki podenoti ribosoma. Pri iniciaciji sodelujejo iniciacijski faktorji: IF-1. 2) Elongacija je hitra faza sinteze peptidnih vezi 3) Terminacija je faza. Sinteza proteinov je energijsko potraten proces. Del ribosomov je prostih. če je aminokislina metionin. Formilacija poteče po vezavi Met na tRNA. ki je pred mestom A. Iniciacija V bakterijah je večina ribosomov vključenih v sintezo proteinov. ki pokrije območje desetih kodonov (30 nt). Zakaj ravno Met? S poskusi je bilo ugotovljeno. ki ob tem disociira na obe podenoti. Mesto za vezavo ribosoma (RBS) pri prokariontih je sestavljeno iz dveh delov: Shine-Dalgarnovega zaporedja (AGGAGG). v kateri se sintetizirani protein sprosti z ribosoma. UUG Prva aminokislina pri sintezi vseh bakterijskih proteinov je formil-metionin (f-Met). porablja se energija GTP. pri čemer gre za dinamično ravnotežje 70S kompleksa in obeh podenot.Potek translacije Potek translacije Sinteza proteinov poteče v treh fazah: 1) Iniciacija je počasna faza. druge destabilizirajo. Vsi evkariontski proteini se pričnejo z Met.mesto P. IF-1 stabilizira iniciacijski kompleks. Nekatere aminokisline protein stabilizirajo. ki preprečujejo nepotrebno sintezo . ki je komplementarno 3' koncu 16S rRNA začetni kodon AUG. Stabilizacija je največja. Zaradi potratnosti tega procesa imajo celice veliko mehanizmov. Sledi vezava na RBS mesto in nastanek iniciacijskega kompleksa. ki lahko služita kot iniciatorska. tretje nimajo nobenega učinka. Kodona GUG in UUG. aminoacilno. Aedificator fecit AD MMII. ki sodelujta pri tvorbi peptidnih vezi: . redkeje GUG. V tej fazi se ribosom veže na mRNA in nastane iniciacijski kompleks. Začetni metionin se pri veliko proteinih post-translacijsko odstrani s specifično deformilazo oziroma aminopeptidazo.mesto A. ~ 63 ~ . sodeluje pri sprostitvi deaminoacilirane tRNA z ribosoma. b) Po disociaciji IF-3 se lahko na 30S podenoto veže še 50S podenota. Proces vezave ribosoma na mRNA poteče v treh fazah: a) Najprej se 30S podenota poveže z IF-3. na katerega se veže aa-tRNA . IF-3 ima tako dvojno vlogo: a) stabilizira prosto 30S podenoto b) poskrbi za vezavo male podenote na mRNA IF-2 je pomemben pri vezavi iniciatorske t-RNA (formil-Met-tRNAf ). na katerega se veže peptidil-tRNA. se interno bereta kot Val oziroma Leu. Na mRNA se najprej veže mala podenota ribosoma. da na stabilnost določenega proteina močno vpliva njegova primarna struktura. mesto E. Na ribosomu sta dve mesti za vezavo tRNA.

Proces poteče v treh fazah: a) Vezava aa-tRNAaa na ribosom b) Prenos polipeptidne verige c) Premik ribosoma za en kodon naprej ad a) Pri bakterijah je pri vezavi aa-tRNAaa na ribosom vključen EF-Tu-GTP. RF2. Mala podenota se veže na 5'-konec mRNA in potuje do iniciacijskega kodona.5S rRNA. RF3 in RRF.RRF .ribosome recycling factor. Terminacija V bakterijah več sprostitvenih faktorjev prepoznava stop kodon. donor začetnega Met je Met-tRNAi. Velika podenota ima torej peptidil-transferazno aktivnost. Pri iniciaciji sodeluje več iniciacijskih faktorjev. EF in eEF. eIF. Shine-Dalgarnovega zaporedja ni. ki se reciklira s pomočjo EF-Ts. Pri tem sodeluje tudi RF3 (G-protein!) in RF4 . Pri bakterijah sodeluje pri sintezi proteinov tudi 4. Na tem mestu velja omeniti molekulsko mimikrijo. tRNA se sprosti. RF1 prepoznava UAA in UAG. Pri vezavi 50S podenote se cepi GTP. ~ 64 ~ . proces je znan pod imenom gvanilatna izmenjava. da molekule oponašajo molekule: EF-G oponaša EF-Tu-GTP. Pomembni faktorji sodelujejo tudi pri evkariontski terminaciji: eRF1 in eRF3 (GTP!). isto molekulo oponašajo tudi RF1. Aedificator fecit AD MMII. EF-Tu sodi med GTP-vezavne proteine. Temu sledi vezava večje podenote in vezava aa-tRNAaa na A-mesto. se pravi. Elongacija Pri elongaciji sodeluje veliko elongacijskih faktorjev. eEF-1βγ ter eEF-2.GTP vezavnih proteinov). ad b) Pri vzpostavitvi peptidne vezi pride do prenosa polipeptidne verige peptidil-tRNA iz mesta P na aa-tRNA na mestu A. Pri sprostitvi tRNA se porablja energija GTP. v proces je vključen EF-G. AUG je skoraj vedno začetni kodon. pri čemer sodeluje IF-2 (eden od G-proteinov . ad c) V tretji fazi se ribosom pomakne za en kodon vzdolž mRNA. Iniciacija pri evkariontih je drugačna.Po tvorbi iniciatorskega kompleksa se na delno P-mesto na ribosomu veže f-Met-tRNAf. ki je predhodnik SRP. Po vezavi se cepi GTP. nato se veže še 60S podenota. RF2 pa UGA in UAA. Evkarionti imajo proteine s podobno funkcijo: eEF-1α.

vendar vzrok ni v naknadni poenostavitvi. translacija. ki tako nastane. Razdalja med cistroni (intercistronska regija) in sekundarna struktura mRNA igrata pomembno vlogo pri iniciaciji translacije. Dodajanje G na 5'-konec evkariontske mRNA katalizira gvanilil-transferaza. izjeme arheje prisotni transport ni nujen nujen vezava na ribosom Shine-Dalgarno najprej 5'-konec translacija hitrejša .Zgradba prokariontske in evkariontske Zgradba prokariontske in evkariontske mRNA mRNA Večina razlik med obema tipoma mRNA izhaja iz različne organizacije obeh tipov celic in posameznih enot transkripcije. se imenuje kapica (cap) in vsebuje povezavo 5'-ppp-5'. se ta rep postopoma krajša. prostorsko ločene. mRNA za histone nimajo poliA repa. ki na 3'-konec RNA transkripta doda približno 200 A. obenem degradacija vendar obenem Tabela 12: Razlike v organizaciji mRNA pri prokarionith in evkariontih Slika 65: Na policistronski mRNA se lahko geni prepisujejo neodvisno eden od drugega.2 aa/s t½ nekaj minut daljši polisomi daljši krajši transkripcija. katalizira encim poli (A)-polimeraza. Zaradi njihovega načina življenja je ta organizacija optimalna. Struktura. prokarionti evkarionti (RNA-pol II) transkripcijska enota policistronska monocistronska 5'-konec ppp-5' metilirana kapica. oocitah Xenopus levis (krastača). da so se prokarionti tekom evolucije pojavili prej. Na mestu 7' je G metiliran. poliA rep torej podaljša življenjsko dobo mRNA v celici. dodatno sta lahko metilirani tudi naslednji dve bazi. ~ 65 ~ . Sintezo poliA repa. Ko mRNA pride v citoplazmo. Čeprav je translacija pri evkariontih zapletena. s formalno oznako poli(A)+. Aedificator fecit AD MMII. jo je mogoče izvajati in vitro v brezceličnih sistemih.15 aa/s počasnejša .5'Gppp-5' tvorba 3'-konca s terminacijo prepisa s cepitvijo 3'-konec zadnja baza mRNA poliA rep introni odsotni. Prva baza je običajno purin. ampak v dejstvu. Prokariontska mRNA je enostavnejša.

supresorske tRNA . npr. V E. produkti drugih so pogosto temperaturno občutljivi proteini. ki ima zamenjanih le nekaj aminokislin. ~ 66 ~ . kar velikokrat ne vpliva bistveno na delovanje proteina. Intragenska supresija Intragenska supresija Pri intragenski supresiji se lahko delecija enega nukleotida kompenzira tako. ki so sposobne prepoznati kodon UAG. večinoma gre za supresorsko mutacijo v antikodonu ali blizu njega . Primer: Mutacija kodona UUG → UAG. kako delujejo celični mehanizmi. kjer predstavlja supresorska mutacija spremembo antikodona tako. je v antikodonu tRNA. da prepozna mutiran kodon in se vstavi aminokislina. da se negativni učinek mutacije kompenzira v največji možni meri. navadno nefunkcionalni proteini.aminoacil-tRNA sintetaze . navzdol od mesta delecije.Supresije Že pred nekaj poglavji je bilo omenjeno. vsakemu terminacijskemu kodonu ustreza ena. V končni fazi se namesto Leu oziroma stop vgradi Tyr. Aedificator fecit AD MMII. da se v bližini. Supresorska tRNA tekmuje za vezavo na stop kodon s sprostitvenima faktorjema. Intergenske (ekstragenske) supresije Intergenske (ekstragenske) supresije Intergensko supresijo navadno vršijo tRNA. coli je vsaj šest supresorskih tRNA. sekundarna mutacija. ki lahko šibko suprimirajo nesmiselne in drugo-smiselne mutacije . Primarna mutacija je torej v proteinskem genu ali mRNA. do katerega je prišlo s točkasto mutacijo v divjem tipu. Posledica take mutacije je protein. da kodirajo različne molekule. ki modificirajo tRNA. njihov antikodon je največkrat CUA← (puščica označuje smer branja).encimi. ki so lahko bodisi intragenske (znotraj) genske ali intergenske (medgenske). Supresorski geni omogočajo supresijo mutacij v drugih genih. ki popravi vpliv te mutacije. Supresorske tRNA Supresorske tRNA a) Supresija nesmiselnih mutacij Obstajajo tri skupine supresorjev. Eden od način popravljanja mutacij so tudi supresorske mutacije. ki so vključene v translacijo: . vstavi en nukleotid. abnormalni hemoglobini. ki še omogoča funkcionalnost proteina. Spremenjeni kodon prepozna supresorska Tyr-tRNATyr. Delujejo tako. Spremembo kodona povzročijo bodisi nesmiselne (nonsense) bodisi drugosmiselne (missense) mutacije. ki odpravljajo mutacije.ribosomski proteini. ki ima mutiran kodon GUA← v CUA←. Produkti prvih so krajši.elongacijski faktorji Supresorski geni imajo posreden vpliv na mutiran gen: spremenjena (mutirana) mRNA se prevede tako.

da se kljub mutaciji vstavi pravilna aminokislina. Primer: Mutacija kodona GGA → AGA.b) Supresija drugosmiselnih mutacij Drugosmiselne mutacije je moč suprimirati tako. Končni rezultat je vgradnja Gly namesto Arg. Spremenjeni kodon prepozna supresorska Gly-tRNA. Posledica take sinteze so daljši proteini. ker so vsi bralni okvirji razen “pravega” blokirani z velikim številom stop kodonov. je. ki ima v antiokodonu CCCC←. Primer: supresorska Gly-tRNA. Spremenjeni kodon AGA prepoznavata tako Arg-tRNAArg kot supresorska Gly-tRNAGly. da sinteza proteina poteče preko stop kodona. ki ga imajo lahko supresorske tRNA. Aedificator fecit AD MMII. Supresija je torej delna. ki ima mutiran antikodon UCC ← UCU. ki je še sprejemljiva za protein. supresorska tRNA omogoči ponovno vzpostavitev pravega bralnega okvirja. c) Supresija spremembe bralnega okvirja Če pride do insercije ali delecije nukleotida. V splošnem se translacija v napačnem bralnem okvirju prezgodaj konča oziroma je v večini primerov blokirana. ali z vstavitvijo aminokisline. Slika 66: Tretji učinek. ~ 67 ~ . omogoči vzpostavitev pravega bralnega okvirja.

3) Neponavljajočih se zaporedij. vse ostalo so introni. V človeškem genomu zazvemajo 30-50% celotnega genoma. ki ne kodirajo ničesar. V praksi se izkaže. Alu I ponovitve. da le 25% od tega dejansko ustreza genom.Struktura genoma pri višjih evkariontih Evkariontski genom je sestavljen iz: 1) visoko ponavljajočih se zaporedij. ker potečejo na kakšnem ponavljajočem se zaporedju ali intronu. katere del se nahaja v področju centromer. ki so razmetana po genomu in so prisotna v manjšem številu kopij. ki so enostavna. Sklep: Velik del čoveškega genoma ne kodira ničesar! Ogromen presežek sekvenc. Primeri teh zaporedij vključujejo TE. Gre za t. da velik del genoma vseh organizmov vsebuje znatne deleže ponovitev.i. da se velik del mutacij sploh ne pozna. Visoko ponavljajoča se zaporedja zavzemajo manj kot deset odstotkov celotnega genoma. ~ 68 ~ . ki zavzemajo 40-60% človeškega genoma. dolga 10-100 bp in so pogosto tandemsko urejena. ki so zelo variabilni. V določenem tipu celic (tkivu) evkariontov je hkrati aktivnih od deset do dvajset tisoč genov. še posebej mikrosateliti. kot so L1-elementi. kar se uporablja pri ugotavljanju očetovstva. Od te četrtine le 1% zavzemajo eksoni. 2) zmerno ponavljajočih se zaporedij. satelitsko DNA. ki omogoča. nad dejanskimi geni je pomembna varovalka. kar ustreza od 3040000 genov. Slika 67: Analiza vsebnosti posameznih elementov genoma pri človeku in drugih organizmih pokaže. Visoko ponavljajoča se zaporedja sestavljajo mini in mikrosateliti. Aedificator fecit AD MMII.

Slika 69: Politeni kromosomi pri D. je evkromatin in pri Aedificator fecit AD MMII. Seveda so lahko kromosomi vidni Slika 68: Zankasta vlakna. Celoten diploidni genom človeka znotraj ene celice je torej dolg 1.Zgradba kromosomov Zgradba kromosomov Haploidni evkariontski genom sestavlja DNA. Pri lizi bakterijske celice se DNA pojavi v obliki zankastih vlaken. Premer vlakna je 10 nm (DNA v nukleosomih). coli jih je okoli sto. ki je dolga okoli 4 cm. Temna območja ustrezajo območjem z intenzivnejšo transkripcijo. Genetski material je v bakterijah viden v obliki nukleoida. rahlejši. Povprečna zanka je dolga 560 kb. Velikost zank je ~ 40 kb. melanogaster. Prvi. pri celični delitvi se ta gostota še poveča. Dedni material je v celici zelo učinkovito pakiran. v evkariontskem jedru je viden v interfazi celične delitve kot kromatin. ki so pritrjena na osrednji proteinski podstavek. Kromatin je pod mikroskopom viden v dveh oblikah. Gostota bakerijske DNA je desetkrat manjša.8 metra. coli tudi prej. Po odstranitvi histonov v metafazi se DNA pojavi v obliki zankastih vlaken. ki je sestavljen iz kompleksa DNA-proteini. Gostota DNA v celici je kar 100 mg/mL. pri E. ~ 69 ~ .matrix associated region. Posamezno vlakno je kompleks dsDNA z bazičnimi proteini (histoni). melanogaster V evkariontskem jedru je kromatin pritrjen na jedrni matriks z MAR-zaporedji . Proteinski podstavek je viden pri obeh kromatidah. ki nastanejo pri lizi celice E. Te regije verjetno igrajo pomembno vlogo tudi pri replikaciji in transkripciji. Do lize evkariontskega jedra pride v interfazi. Možno jih je videti kot krtačaste ali politene kromosome v celicah D. ki so pritrjena na dele plazmaleme.

Heterokromatin je lahko konstitutivni ali fakultativni. Dejansko se DNA ne skrajša. ki služi kot podstavek. Posamezen kromosom je viden kot par sestrskih kromatid. se interfazna DNA skrajša za 5× . ~ 70 ~ . drugi se lahko prepisuje občasno. se zanke DNA pakirajo na takšen način.človeku zavzema 90% kromosomov. vsako tvori vlakno s premerom 30 nm. Slika 70: Če iz kromosoma odstranimo histone. Črna lisa na dnu slike je proteinsko jedro. ampak se samo bolj na tesno pakira. prvi se nikoli ne prepisuje. na katerega se veže DNA. Fakultativni heterokromatin predstavljajo celotni neaktivni kromosomi (v primeru diploidnih genomov).10×. Aedificator fecit AD MMII. 8% predstavlja heterokromatin. Ko se v interfazi pojavijo kromosomi.

4× krajša 30 nm vlakno. Aedificator fecit AD MMII. Kromosomi kažejo urejeno strukturo iz temnih-G pasov in svetlih-R pasov. G se nanaša na barvilo Giemsa.Pri pakiranju kromatina naslednja hierarhija: - v kromosom velja dsDNA s premerom 2 nm 10 nm vlakno. Kromosomi so sestavljeni iz dveh krakov: krajšega p in daljšega q. kjer sta obe kromatidi povezani. Slika 71: Struktura telomeraznega dela kromosomov je sestavljena iz večjega števila zank. ~ 71 ~ . Vsak posamezen pas je sestavljen iz okoli 107 bp. pri človeku (TTAGGG)n Slika 72: Sestrski kromatidi s premerom 30 nm. ≤ 10000× krajša Humani kariotip je vidni prikaz vseh 46 človeških kromosomov v mitozi. Jasno se vidi centromera. Osnovni elementi za obstoj kromosoma: začetek replikacije centromere za ločevanje kromatid telomeri za vzdrževanje koncev. 40× krajša tvorba zank. ≥ 1000× krajša tvorba kromatide. ki ob pomoči RNA-primerjev sintetizira konce. Za replikacijo teh koncev je potreben encim telomeraza.

ki delno nevtralizira pozitivni naboj histonov. ki je nekoliko večji od ostalih in bolj variabilen. Ko nastane 30 nm vlakno. ali je podedovan od matere ali od očeta. Žičnati model na spodnji sliki je stranski pogled na histonsko jedro z navito DNA. Struktura je verjetno vijačna. Obroč na prvi sliki nakazuje navitje DNA. ki naredi dva zavoja okrog histonskega jedra v dolžini 160 bp Histoni so bazični proteini (velik delež Lys. ki ga sestavlja: histonsko oktamerno jedro (H2A+H2B+H3+H4)2 dsDNA ~ 200 bp. Pri nastanku gamet pride do resetiranja vzorca.mesta za regulacijo transkripcije .structural maintenance of chromosomes. ki jih povzroči acetilacija. V sesalskem genomu je približno 30000 CpG otokov. v teh področjih so lahko tudi MAR-zaporedja. predvsem v področju promotorja. če pogledamo na histonsko jedro do zgoraj. Področja prepisovanja kažejo povečano občutljivost za cepitev z Dnazo I. ~ 72 ~ .i. Aedificator fecit AD MMII. ostali histoni so močno acetilirani. včasih so odstranjeni tudi ti.Zgradba nukleosomov Zgradba nukleosomov Nukleosom je osnovna enota evkariontskega kromatina.nukleosomi postanejo v tem delu bolj občutljivi za delovanje Dnaze I .mesta začetka replikacije . Pri spermijih in jajčnih celicah je lahko vzorec metilacije drugačen in specifičen. Hipersenzitivna mesta za Dnazo I se pojavijo na vsakih 200 bp in so večinoma: .zmanjšana metilacija (5-Me-C). ni več mogoča ekspresija genov. kjer so pogosto t. CpG otoki. Slika 73: Tridimenzionalna struktura histonskega jedra. Arg) z molekulsko maso 11-15 kDa. Pri celični DNA živali je 2-7% citozinov metiliranih. metilacija ali fosforilacija histonov. da je ekspresija določenega alela v zarodku odvisna od tega.i. Pri aktivaciji genov se to področje nukleosomske DNA malenkost spremeni: . Gre za t.področja centromer Ta mesta velikokrat prekrivajo drugi proteini. Pri spermatogenezi se vsi aleli demetilirajo ne glede na to ali so bili prej metilirani ali ne. ki je osnovna komponenta kromosoma. Za izgradnjo 30 nm vlakna je potreben histon H1. ki imajo zmanjšano vsebnost histonov H1. podedovan vzorec (imprinting-vtisnjenje). Pri oogenezi se vsi metilirajo. Metilacija C preprečuje transkripcijo. večina metilnih skupin je na CG-dubletih. kar kaže na spremembe v strukturi nukleosoma. kar pomeni. Pri nadaljnem pakiranju v kromosom sodelujejo še različni nehistonski proteini iz družine SMC . Prepisovanje genov poteka preko nukleosomov.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful