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LABORATORIO DE ANLISIS DE ALIMENTOS PRCTICA # 8 TCNICAS ANALTICAS PARA LA CUANTIFICACIN DE COMPONENTES QUMICOS DE FRUTAS Y HORTALIZAS DETERMINACIN DE AZCARES INTRODUCCIN En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas. Los azcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos de calidad los carbohidratos desempean un papel relevante, por ejemplo, el sabor est dado bsicamente por un balance entre azcares y cidos orgnicos. El sabor caracterstico de y diferente de las frutas se debe a la gran variacin en composicin y concentracin de los azcares; el color atractivo se debe principalmente a los glucsidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza est determinada por los polisacridos estructurales. Es importante sealar que las proporciones de los diversos carbohidratos existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia de la actividad metablica, ya que durante la maduracin se producen cambios intensos en donde los azcares son los sustratos preferidos para la biosntesis y suministro de energa pues son oxidados (va gluclisis) hasta cido pirvico, el cual a su vez, por descarboxilacin oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se metaboliza, va ciclo de Krebs, dando lugar a la formacin de CO2, H2O y ENERGA la cual queda disponible para la biosntesis de otros componentes (otros azcares, cidos orgnicos, cido ascrbico, protenas, nucletidos azucarados, glucsidos, etc.). Durante todo este proceso, el contenido de

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azcares

aumenta

casi

invariablemente

bsicamente

por

hidrlisis

que

experimentan los polisacridos, aunque algunos azcares sean utilizados como sustratos para la actividad respiratoria. Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios mtodos para su determinacin: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio: Todos los azcares con un grupo aldehdo libre o un grupo cetnico se clasifican como azcares reductores y se transforman fcilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fcilmente en presencia de oxgeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azcares en solucin alcalina rpidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los azcares se oxidan formando mezclas complejas de cidos. Esta accin reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas. Una de las tcnicas analticas ms potentes consiste en determinar la cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiacin absorbida por la misma. Esta tcnica se llama Espectrofotometra. Se puede utilizar el espectrofotmetro para determinar la longitud de onda de la radiacin necesaria para las determinaciones de la cantidad de azcar en las muestras bajo estudio, comparndola despus con la radiacin absorbida por un blanco. La regla especfica que relaciona la cantidad de radiacin absorbida por una substancia con la concentracin de esa misma substancia se llama Ley de Beer y se puede establecer como sigue: Log Io = abc I En donde: Io = Radiacin incidente o radiacin transmitida por el blanco. I = Radiacin transmitida por la muestra. Log Io = absorbancia de la muestra I

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En donde: a = coeficiente de absorbancia (absortividad) las unidades dependen de las unidades utilizadas para la determinacin de la concentracin. b = longitud de la celda usualmente en centmetros. c = concentracin de la muestra en las unidades apropiadas. I En esta prctica se emplear la tcnica colorimtrica de Nelson y Ting para determinar glucosa, fructosa y sacarosa. OBJETIVOS El estudiante explicar por escrito el fundamento del mtodo empleado para la determinacin de azcares en las muestras de frutas que se le asignarn. El estudiante relacionar los contenidos de azcares determinados en las muestras de diversos frutos. El estudiante se concientizar del concepto y los instrumentos de medicin utilizados en la espectrofotometra, y de la aplicacin de curvas estndar utilizando el mtodo de Nelson y Ting. MATERIAL 6 matraces volumtricos de 100 ml con tapn. 2 matraces volumtricos de 500 ml con tapn. 2 matraces volumtricos de 250 ml con tapn. 1 embudo de vidrio. 2 matraces Erlenmeyer de 125 ml. 6 pipetas de 10 ml. 2 pipetas de 1 ml. 2 pipetas de 5 ml. 2 vasos de precipitados de 250 ml. 1 bao Mara simple. 5 celdas de espectrofotmetro. 1 gradilla. 2 crculos de 10 cm de dimetro de papel filtro Whatman # 1. Papel sanitario blanco (proporcionado por el estudiante). Algodn o gasa . 1 cuchillo de cocina (proporcionado por el estudiante). 1 tabla para cortar la fruta (proporcionada por el estudiante). Fruta: 3 ejemplares por especie por equipo. En el caso del meln con 1 ejemplar basta (proporcionados por el estudiante).

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EQUIPO: 1 extractor de jugos. 1 licuadora o mortero. 1 potencimetro. 1 bao Mara con control de temperatura y agitacin. 1 espectrofotmetro Spectronic 20' a 515 nm. REACTIVOS Solucin alcalina de Ferricianuro. Solucin de Arsenomolibdato (25 g). H2SO4 2N. NaOH 10N, 1N y 0.1N. HCl 1:1 (Vol/Vol). Na2CO3 anhidro. (12.5 g) Na2CO3 monohidratado. (14.3 g). Tartrato de potasio (12.3 g). NaHCO3 (10 g). Na2SO4 anhidro disuelto en 35 ml de agua destilada. CuSO4 5H2O disuelto en 50 ml. de H2O. Glucosa (300 g/ml). MTODO PREPARACIN DE REACTIVOS Reactivo de Nelson A.- Disuelva 12.5 g Na2CO3 anhidro ( 14.3 g Na2CO3 H2O), 12.3 g de tartrato de potasio, 10 g de NaHCO3 y 100 g de Na2SO4 anhidro en 350 ml de H2O y afore a 500 ml. Reactivo de Nelson B.- Disuelva 7.5 g de CuSO4 5H2O en 50 ml. de H2O y aada una gota de H2SO4. Reactivo Alcalino de Nelson.- Mezcle 25 ml del reactivo de Nelson A + 1.0 ml. del reactivo de Nelson B. Curva de la Glucosa.- Elaborar una solucin stock de glucosa en agua que contenga 300 g/ml. Preparar una serie de diluciones desde 300 hasta 30 g/ml.

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Reactivo de Arsenomolibdato.- Disuelva 25 g de (NH4)6Mo7O24 4H2O (molibdato de amonio tetrahidratado) en 450 ml. de agua destilada.

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PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES TOTALES Prepare una serie de diluciones a partir de la solucin stock de glucosa. Las concentraciones debern ser de 300, 150, 75 y 30 g/ml. Utilice matraces volumtricos aforados con tapn y mrquelos con la concentracin correspondiente. 1. Pipetee 1 ml. de cada solucin estndar de glucosa y agua destilada como blanco en tubos de ensayo con capacidad de 25 ml. aforados. 2. Aada 1 ml. de reactivo alcalino de Nelson. 3. Mezcle. Colque los tubos en un bao de agua hirviendo durante 20 minutos y enfrelos al chorro de agua fra. 4. Aada 1 ml. de arsenomolibdato. 5. Mezcle bien por un perodode 5 min. (para disolver el Cu 2O para reducir el aresnomolibdato). 6. Afore a 25 ml. con agua destilada y mezcle. 7. Lea la absorbancia a 520 nm. Grafque la absorbancia contra la concentracin (g/g). Utilice esta curva estndar para determinar la concentracin de glucosa en las muestras de frutas. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS PARA LA DETERMINACIN DE AZCARES REDUCORES TOTALES 1.- Extraiga el jugo de la fruta asignada mediante un extractor de jugos. 2.- Diluya el jugo de la muestra con agua destilada (1:49). 3.- Colque 5 ml. del jugo diluido en un matraz volumtrico de 250 ml. y afore con agua destilada. DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES TOTALES 1.- Transfiera 1 ml. del jugo diluido a un matraz volumtrico aforado de 100ml. y aada 5 ml. de reactivo de ferricianuro. 2.- Colque los matraces en un bao de agua hirviendo por 10 minutos. 3.- Enfre los matraces inmediatamente bajo el chorro de agua fra. 4.- Neutralice el contenido de los matraces con 10 ml. de solucin de cido sulfrico 2N. 5.- Mezcle los contenidos de los matraces suavemente hasta que no emanen ms gases. 6.- Aada 4 ml. de arsenomolibdato. 7.- Mezcle una vez ms el contenido de los matraces. 8.- Afore a 100 ml. con agua destilada.

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9.- Tome una celda del espectrofotmetro y transfiera ah el contenido de cada matraz (uno por celda). 10.- Efecte la lectura en el espectrofotmetro a 520 nm. El blanco constar de todos los reactivos antes mencionados, excepto la muestra de jugo de fruta bajo estudio. No olvide ajustar el espectrofotmetro con agua destilada al principio. CLCULOS: A partir de la curva estndar se calcula el valor k para la determinacin de azcares reductores totales mediante la siguiente frmula: k = c/a En donde: k = El factor por unidad de absorbancia o pendiente de la curva. c = Concentracin de azcares reductores en gramos/100 ml. a = Absorbancia de la solucin a esa concentracin. Los valores k a diferentes concentraciones de azcar se promedian y se designan como K. El contenido total de azcares reductores, S, de la muestra se calcula de la frmula: S = K.A.D. En donde: S = Concentracin total de azcares reductores de la muestra en gramos/100 ml de jugo. K = Pendiente promedio de la curva. D = Factor de dilucin. DETERMINACIN DE FRUCTOSA NOTA: Esta determinacin no se realizar en esta sesin de laboratorio). Al calentar una mezcla de glucosa y fructosa a cierta temperatura - eg., 55C - con el reactivo alcalino de ferricianuro, la velocidad de oxidacin de la glucosa es considerablemente menor que la de fructosa. El resultado obtenido es conocido como fructosa aparente. sta es ligeramente ms alta que el contenido real de fructosa en la muestra, la cual puede ser calculada usando las frmulas adecuadas. El procedimiento para la determinacin de esta fructosa aparente es el mismo que para el clculo de los azcares reductores totales, excepto que se cambia la temperatura y el perodo de calentamiento a 55C por 30 minutos. Los valores de Kf y Kg de fructosa y glucosa respectivamente, oxidados a 55C se obtienen a partir de las curvas estndar de estos dos azcares, de la forma descrita para K. La proporcin de Kg a Kf Q se utiliza para el clculo real de glucosa y fructosa de la muestra con las siguientes ecuaciones simultneas:

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G+F=S G/Q + F = L En donde: G = Porcentaje de glucosa en la muestra. F = Porcentaje de fructosa en la muestra. S = Porcentaje de azcares reductores totales (Suma de G y F). L = Porcentaje aparente de fructosa. Q = Proporcin entre Kg y Kf (Kg/Kf) En una mezcla de glucosa y fructosa se asume que ambos azcares presentes son fructosa. La fructosa aparente L se calcula a partir de la frmula S = K.A.D., sustituyendo L por S y Kf por K. Se obtiene la siguiente frmula para el porcentaje de glucosa en la muestra: G = (S - L) X Q Q-1 El cociente q/(Q-1), se utiliza como una constante en los clculos del valor real de la glucosa. El valor real de la fructosa se obtiene por diferencia. DETERMINACIN DE AZCARES TOTALES Y SACAROSA Nota: Esta determinacin no se llevar a cabo en esta sesin de laboratorio) La sacarosa de la muestra es invertida con el cido clorhdrico. procedimiento se describe a continuacin: El

1.- Se colocan 50ml. del jugo diluido en un vaso de precipitados de 150 ml. y se aaden 10 ml. de cido clorhdrico (1:1). 2.- Se deja reposar esta mezcla durante 18 horas a temperatura ambiental. 3.- Se aaden 5 ml. de solucin de hidrxido de sodio 10N y los contenidos se ajustan a un pH de entre 5 y 7 con una solucin de hidrxido de sodio 1N mediante el uso de un potencimetro. 4.- Los contenidos se transfieren a un matraz volumtrico aforado de 100ml y se afora con agua destilada. 5.- Se toma una alcuota de 1 ml de esta solucin y se pipetea en un matraz volumtrico de 100 ml. y se sigue el procedimiento descrito para la determinacin de azcares reductores totales. 6.- Se calcula la cantidad de sacarosa de la diferencia entre el contenido de azcares reductores antes y despus de la inversin, multiplicada por el factor de 0.95.

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Elabore un reporte comparando los diversos valores obtenidos para cada especie de futas estudiadas en la sesin de laboratorio. CUESTIONARIO: 1.- Por qu la sacarosa no se considera como un azcar reductor? 2.- Para qu se utiliza el cobre en el reactivo de Nelson? BIBLIOGRAFIA: A.O.A.C. Official Methods of Analysis. 1980. Washington, U.S.A. Horwitz W. (ed). Ed. 13th.

Ting, S.V. 1956. Rapid Colorimetric Methods for Simultaneous Determination of Total Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices. Agric. Food Chem. Vol. 4(3) 263-266.