RFLP (Reaction Fragment Length Polymorphism

)

I.

Tujuan Melakukan analisis DNA dengan metode RFLP untuk menemukan DNA yang sama dengan bukti DNA di CS sampel DNA beberapa terangka.

II. 2.1.

Dasar Teori DNA, Informasi Genetik dan Polymorphism Informasi genetik suatu sel hidup tersimpan di dalam makromolekul biologis asam nukleat, terutama dalam bentuk asam deoksiribonukleat (DNA- Deoxyribonukleat Acid). Kode yang menyimpan informasi genetik disimpan dalam bentuk sekuens basa nitrogen yang bervariasi pada setiap nukleotida. DNA dan RNa adalah dua jenis asam nukleat yang ada pada setiap makhluk hidup. [erbedaan anatara DNA dan RNA adalah pada gula intinya. DNA menggunakan gula deoksiribosa sebagai inti nukleotida sementara RNA menggunakan gula ribosa. DNA ;ebih nerperan sebagai penyimpan informasi genetik sementara RNA berperan dalam penerjemah materi genetik tersebut menjadi suatu sifat genetik. 1,2 DNA adalah makromolekul herediter pembawa informasi genetik. DNA merupakan polimer asama nukleat yang memiliki monomer nukleotida. Nukleotida terdiri dari gula dengan atom karbon 5, deoksiribosa, dengan fosfat teresterifikasi pada atom karbon 5¶ dan basa nitrogen pada pada atom karbon 1¶. Dua tipe basa nitrogen yang tersedia adalah purin, basa nitrogen dengan dua cincin, yang terdiri dari Adenin dan Guanin, dan pirimidin, basa nitrogen dengan cincin tunggal, yang anggotanya adalah Timin dan

Satu sifat genetik dikodekan di satu bagian khusus pada DNA yang memiliki sekuens nukleotida yang khusus dengan panjang tertentu. Variasi antar kodon akan menyebabkan variasi antar asam amino yang menyusun setiap protein sehingga susunan asam amino tersebut akan memberikan karakteristik unik untuk protein yang dihasilkan. Penyebab utama dari polimorfisme genetik adalah akumulasi mutasi titik yang selektif dimana mutan. Dimana tiap kodon mengkode suatu asam amino. individu hasil mutasi. Sifat tersebut muncul dari protein yang terkode oleh setiap gen. Nukleotida berikatan kovalen dengan nukleotida lain membentuk polimer linier berbentuk untai yang terhubung dengan ikatan 3¶-5¶ fosfodiester antara gugus fosfat pada C5¶ satu nuukleotida dengan gugus OH pada C3¶ milik nukleotida lainnya. yaitu triplet sekuens basa nitrogen. Basa nitrogen Timin selalu berikatan dengan Adenin dengan 2 ikatan hydrogen sementara Guanin selalu berikatan dengan Citosin dengan 3 ikatan hydrogen.2 Variasi susunan sekuens basa nitrogen akan membentuk kode informasi genetik pada tiap sel hidup. Untai yang satu tersusun dengan orientasi 5¶-3¶ sememntara yang lainnya berorientasi 3¶-5¶. Sekuens asam nukleat sangatlah bervariasi antar makhluk hidup yang berbeda.1. Istilah polimorfisme biasanya digunakan untuk varian genetik yang dimiliki oleh setidaknya satu persen dari populasi. Molekul DNA terdiri dari dua untai tunggal yang berikatan dengan ikatan hydrogen anatara basa nitrogen membentuk struktur double helix antiparalel dimana orientasi anatara kedua untai berjalan kea rah yang berbeda. Ikatan hydrogen yang terbentuk dari basa nitrogennya terjadi secara eksklusif. sebuah gen terdiri dari kodon-kodon. Variasi antar individu yang berbeda ini dinamakan polimorfisme genetik.Sitosin. dapat bertahan hidup dan mewariskan materi genetik muatannya kepada . bahkan di dalam satu spesies.

1.keturunannya. Individu dengan DNA yang berbeda akan menghasilkan pola yang berbeda. diantaranya pemeriksaan forensic.3. Dalam proses RFLP yang akan dilakukan. Polimorfisme antar individu adalah subjek analisis dan pemeriksaan DNA dimana perbedaan sekuens DNA antar individu bisa digunakan untuk berbagai keperluan.2.4 . Beberapa contoh aplikasi RFLP adalah untuk mendeteksi diversitas genetik.4 Aplikasi terbaik RFLP digunakan untuk berbagai macam kegunaan. isolasi gen khusus dan konstruksi perpustakaan DNA.2.2. Perbedaan sekuens DNA antar individu akan mempengaruhi titik potong restriksi endonuklease sehingga fragmen yang terpotong akan memiliki panjang yang bervariasi. genetik drift. identifikasi korban.1. sejarah domestikasi. Teknik RFLP didasarkan pada aktivitas suatu enzim restriksi yang memotong DNA menjadi fragmen-fragmen spesifik. RFLP digunakan sebagai metode untuk mencocokkan bukti DNA CS dengan sampel DNA tersangka sehingga dapat diketahui siapa pelaku kejahatan dari beberapa orang pelaku tersangka. Hasil dari RFLP adalah profil pita-pita berdasarkan panjang fragmen. Perbedaan panjang fragmen akan terlihat setelah dilakukan elektroforesis gel. 1.3 2. genom mapping. terutama yang berhubungan dengan analisis DNA. RFLP Salah satu teknik pertama yang digunakan secara luas untuk mendeteksi variasi dan polimorfisme pada sekuens DNA adalah teknik Restriction Fragmen Length Polymorphism (RFLP). hibridisasi dan visualisasi. asal dan evolusi suatu spesies. diagnosis penyakit dan tes paternitas. hubungan kekerabatan. Polimorfisme pada manusia dapat berupa variasi antar individu dengan perbedaan satu nukleotida (SNP-Single Nucleotida Polymorphisme) maupun variasi pada sekuens nukleotida yang lebih banyak.

. 2.1. DNA akan mengendap dan terpisah dari senyawa lain. 2. 2. Transfer DNA dengan southern blotting.4 RFLP memerlukan DNA yang murni dan bebas dari kontaminan dengan berat molekul yang tinggi. Hal yang dapat mengganggu kemurnian DNA hasil isolasi adalah : 4 a. Isolasi DNA.3. bahan lain akan larut di dalam alkohol tersebut sehingga saat dilakukan sentrifugasi. Sel sampel DNA kemudian diproses dengan diterjen untuk melakukan lisis membrane sel dan inti sel. b. 4. DNA patah-patah selama proses isolasi. Setelah ektraksi DNA dilakukan presipitasi DNA dengan isopropanol 100%. 3 Isolasi DNA dilakukan dengan megambil sampel sel berinti yang memiliki DNA dari organism. Isolasi DNA Langkah pertama dalam melakukan analisis variasi individual dalam gen (fragmen DNA) adalah isolasi gen yang mengandung urutan sekuens nukleotida yang bervariasi untuk memperoleh jumlah DNA yang adekuat untuk penelitian. Selain DNA. DNA terdegradasi oleh enzim nuclease. lalu pemisahan DNA dari komponen sel lain.2. Hibridisasi DNA.3 Langkah-langkah RFLP Langkah-langkah untuk melakukan analisis RFLP di laboratorium adalah4 : 1. termasuk debris sel dengan sentrifugasi. 3. Pemotongan dengan enzim retriksi (digesti retriksi) dan elektroforesis gel.

1.2. Fragmen sticky lebih berguna dan mudah digunakan untuk proses ligase pada rekombinan DNA.5 Enzim restriksi endonuklease ini ditemukan pada berbagai jenis bacteria dan bertindaj sebagai mekanisme pertahanan bakteri dari molekul DNA asing. Adanya mutasi tertentu pada lokasi pemotongan akan menyebabkan DNA tidak terpotong seperti biasa dan terbentuk fragmen DNA yang lebih panjang. Pemotongan fragmen DNA dengan enzim restriksi (digesti restriksi). Hasil potongan DNA dapat berupa untai tumpul/blunt (ujung fragmen untai ganda) maupun lengket/sticky ( ujung fragmen untai tunggal). Metabolit sekunder ikut terisolasi. Terjadi kontaminasi oleh polisakarida. Enzim ini hanya memotong DNA pada sekuens yang khusus tidak seperti metode lain yang meotong DNA secara random.3. enzim restriksi akan mengenali sekuens pendek yang spesifik dan khusus sepanjang 4-7 basa. 2.2. misalnya enzim ecoRI berasal dari E. DNA murni hasil isolasi kemudian akan dipotong dengan enzim restriksi endonuklease membentuk potongan DNA spesifik. 1.c. d. Enzim restriksi tersebut memotong DNA dalam sekuens di dalam molekul (bukan di ujung molekul seperti enzim eksonuklease) dengan sekuens DNA yang spesifik. Sifat utama enzim ini adalah spesifitasnya dimana enzim yang sama akan selalu memutuskan DNA pada urutan tertentu.3 . Enzim tersebut dinamakan berdasarkan nama bakteri yang memilikinya. Variasi panjang fragmen inilah yang menjadi dasar analisis RFLP.Coli.

Semakin pendek fragmen DNA. Transfer DNA disebut ³Southern Blotting´. Fragmen restriksi biasanya diidentifikasi lebih lanjut dengan hibridisasi dan visualisasi dengan probe.3. 3. 2.4 Transfer DNA Southern Blotting Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari sel agarosa ke nilon berpori atau membrane nitroselulosa. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang memiliki perbedaan ukuran lebih besar.M. digunakan untuk DNA sequencing. mengacu kepada nama penemu teknik tersebut yaitu E. Gel poliakrilamid dapat memisahkan molekul DNA dengan perbedaan panjang satu nukleotida saja.3 Gel elektroforesis Setelah dilakukan pemotongan sampel DNA oleh enzim restriksi. semakin jauh fragmen tersebut berjalan menginfiltrasi gel. Perbedaan kecil antara fragmen restriksi tersebut dapat dideteksi dan dipisahkan dengan melakukan elektroforesis gel. akan terbentuk potongan fragmen DNA dalam berbagai ukuran.3. misalnya dengan pewarnaan etidium bromide akan menghasilkan flurosensi jingga di bawah sinar UV. DNA memiliki gugus fosfat yang bermuatan negative sehingga molekul DNA akan berjalan kea rah elektroda positif pada elektroforesis.6 Hasil elektroforesis gel akan memberikan pita-pita yang membentuk pola khusus untuk setiap individu. Gel yang digunakan tergantung dari utjuan dan aplikasinya.7 .2. Pola tersebut dapat dilihat dengan berbagai teknik. Gel elktroforesis akan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dengan menggunakan medan listrik. Southern (1975).

Probe ini merupakan DNA untai tunggal yang komplementer terhadap urutan DNA yang diinginkan. dan memungkinkan para peneliti untuk dapat mendeteksi dan menganalisis urutan DNA tertentu. dan probe ini dilekatkan ke fragmen restriksi yang mengandung urutan komplementer dengan cara berpasangan basa. Setiap sampel membentuk suatu pola pita yang khas. d. Lima teknik laboratorium yang digunakan anatara lain7 : a.Prosedur metode ini mengkombinasi lima teknik laboratorium. Blotting Aksi kapiler menarik larutan alkali ke atas melewati gel dan melewati selembar kertas nitroselulosa yang diletakkan di atasnya. Hibridisasi dengan probe radioaktif Blot kertas dipaparkan pada larutan yang mengandung probe berlabel radioaktif. Untai tunggal DNA melekat pada kertas yang ditempatkan dalam pita tepat seperti pada gel. b. e. c. kemudian enzim restriksi ditambahkan untuk menghasilkan fragmen restriksi. memindahkan DNA ke kertas tersebut serta mendenaturasinya dalam proses tersebut. Penyiapan fragmen restriksi Sampel DAN yang akan diuji dipersiapkan dari sumber yang tepat. Elektroforesis Campuran fragmen restriksi dari setiap sampel dipisahkan dengan elektroforesis. Autodiografi .

2.6 Probe pada umumnya berasal dari cDNA (dari hasil reverse transcriptase ke RNA). Tidak semua probe berikatan dengan label radioaktif.3 Mutasi dan perbedaan genotip akan menghasilkan sisi pengenalan enzim yang berbeda pada suatu sekuens DNA. oligonukleotida sintetik atau kadang RNA. Hibridisasi dan Visualisasi DNA yang telah ditransfer ke lembar nitroselulosa akan dihibridisasi dengan probe. film sinar-X tersebut akan terpajan oleh electron hasil disintegrasi atom radioaktif tepat di atas probe sehingga membentuk pola sesuai pita DNA yang ada. 2. Proses hibridisasi akan menyatukan kembali (Reannealing) probe dengan DNA untai tunggal pada nitroselulosa. Radioaktivitas pada probe yang terikat mempaar film untuk membentuk bayangan yang sesuai dengan pita DNA yang spesifik-pita yang mengadung DNA yang berpasangan basa dengan probe itu. probe dapat dideteksi dengan autodiografi.2.5.3. Dibuat autodiogram dengan membungkus bahan yang mengandung probe hybrid dengan kertas sinar-X. Biasanya probe membawa label radioaktif misalnya 35 P. fragmen DNA genom (diputuskan dari genom oleh enzim restriksi). Probe adalah DNA untai tunggal yang komplementer terhadap DNA pada nitroselulosa. Hasil dari teknik RFLP adalah pola pita DNA yang dideteksi dengan ada tidaknya fragmen DNA dengan panjang tertentu.Selembar film fotografik diletakkan di atas kertas. Probe dapat juga dilabeli dengan senyawa kimia tambahan misalnya fluorofhores yang dapat dideteksi dengan fluorosens.3. .

RFLP merupakan teknik yang sederhana apabila probe tersedia.4.Perbedaan antar genotip dari individu berbeda akan divisualisasikan sebagai pola fragmen restriksi yang berbeda. 2. atau individual. tidak diperlukan informasi sekuens DNA target. Kelebihan dan kekurangan RFLP RFLP merupakan metode yang mempunyai akurasi yang tinggi dan mudah ditransfer antar laboratorium. sulit digunakan pada beberapa spesies dengan tingkat polimorfisme rendah. spesies. merupakan marker lokus yang spesifik. serta membutuhkan waktu dan tenaga yang banyak 3. dan mempunyai kemampuan pemisahan yang tinggi baik pada tingkat populasi. memerlukan perpustakaan probe yang sesuai. Metodologi . RFLP bersifat kodominan sehingga dapat mendeteksi heterozigositas. Kekurangan RFLP adalah dibutuhkannya DNA dengan kemurnian tinggi dalam jumlah banyak. RFLP cocok digunakan untuk pembuatan peta linkage. mendeteksi lokus yang sedikit. tidak mungkin dilakukan automatisasi. dan area target berdasarkan homologi sekuens sehingga direkomendasikan untuk analisis filogenik anatar spesies ujung berkerabat.

biru. Alat  Sistem eletrokforesis sel agarosa (electrophoresis chamber. Bahan . 2-20 L sebanyak 1 buah  Tabung tes mikro yang telah diwarnai (hijau. 8-well comb) 1 buah. orange. casting tray.1 Alat dan Bahan a. red. 2-200 L sebanyak 15 tip  Mikro pipet. yellow masingmasing 1 buah)  Permanent marker 1 buah  Tempat sampah 1 buah  Busa mikro test tube holder 1 buah  Laboratory tape  Inkubator atau 37o waterbath (optional)  Mikrosentrifuge b.  Pipet tips. violet.Digesti Retriksi 3.

DNA tersangka 2.  Agarose 1% yang dicairkan dalam TAE 3. Campurkan komponen-komponen dengan menjentikkan tabung secara hati-hati dengan menggunakan jari. Tutup semua tabung dengan rapat. 3. Jika di laboratorium terdapat sentrifuge. pipet 10 L campuran enzim ³EN2´ ke dalam setiap tabung reaksi. DNA tersangka 1. Beri label ³EN2´ pada tabung tes mikro yang mengandung campuran enzim restriksi. Gunakan pipet tip baru untuk tiap sampel.2 langkah kerja 1. 5. 2. getarkan tabung selama 2 detik untuk memaksa cairan ke dasar tabung dan membuat reaktan tercampur dan terkombinasi . 4. Kombinasi dan reaksikan. Beri label pada tabung reaksi dengan ketentuan : Tabung hijau :pelaku (CS) Tabung biru Tabung orange :tersangka 1 (S1) :tersangka 2 (S2) Tabung violet :tersangka 3 (S3) Tabung merah :tersangka 4 (S4) Tabung kuning :tersangka 5 (S5) Simpan tabung-tabung tersebut ke busa penyimpanan tabung tes mikro. Dengan menggunakan tip yang baru. dan DNA tersangka 5. pindahkan 10 L masing-masing DNA ke tabung yang sesuai. DNA tersangka 4. DNA tersangka 3. ecoRI / PstI enzyme mix 80 L  DNA pelaku.

6. DAFTAR PUSTAKA . Jika tidak terdapat sentrifuge di laboratorium.(pastikan gaar susunan tabung diletakkan seimbang di baling-baling). DNA digest dapat disimpan di lemari pendingin sampai proses RFLP dilanjutkan. meletakkan tabung-tabung pada busa microtube holder dan menginkubasinya pada suhu 37oC selama 45 menit. Penginkubasian sampel. Pilihan alternatif yang dapat dilakukan adalah dengan menginkubasi tabung pada air yang dipanaskan sampai suhu 37Oc dalam jumlah banyak. tabung dikocok sekali dengan cepat. Tabung dan air diinkubasi semalaman dan suhu air akan mencapai suhu ruangan secara perlahan. Mengetukkan tabung ke meja juga dapat membantu proses pencampuran dan kombinasi isi tabung. Setelah inkubasi.

Dawn B. Gerald. 4) Fatchiyah dan Estilaras Arumingtyas. . New York: Mc Graw Hill. 2006..M. Jakarta : Bagian Kedokteran Forensik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 5th Edition. Robert K. 7) Campbell. Hoboken: Willey at Sons. Malang: Laboratorium Biologi Molekular dan Selular Universitas Brawijaya. 2000. Jakarta : Erlangga. 1997. 2006. Biologi : Jilid 1.1) Murray. Biokimia Kedokteran Dasar. Harper¶s Illustrated Biochemistry. 5) Budiyanto. et all. Jakarta: EGC. N. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiment. dan Lawrence G. 6) Stryer. 2006.A. Jakarta: EGC. et all. Manipulasi Gen dan RFLP Analysis. Jane B. 27th Edition. Arif et all. Lubert. 2002. ed. 2) Korp. 3) Marks. 2000. Ilmu Kedokteran Forensik.5.. Biokimia.R.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful