UNIVERSITATEA „TRANSILVANIA” BRAŞOV

FACULTATEA DE SILVICULTURĂ ŞI EXPLOATĂRI FORESTIERE

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. frainetto) din pădurea Seaca-Optăşani, O. S. Slatina

Absolvent: Elisa- Mariana Vlăsceanu

Coordonator ştiinŃific : Conf. dr. ing. Alexandru-Lucian Curtu 2011
1

Quercus frainetto

2

CUPRINS

A. PIESE SCRISE

CAPITOLUL I - Aspecte generale privind gârnița (Q. frainetto) 1.1 Încadrarea sistematică ........................................................................6 1.2 Morfologie...........................................................................................6 1.3 Areal ...................................................................................................7 1.4 CerinŃe ecologice ................................................................................8 1.5 Însuşiri biologice.................................................................................9

CAPITOLUL II - Cadrul natural al pădurii Seaca-Optăşani 2.1 Elementele de identificare a UP .....................................................11 2.2 CondiŃii geologice ..........................................................................13 2.3 CondiŃii geomorfologice ...............................................................13 2.4 CondiŃii climatice ..........................................................................14 2.4.1Regimul termic .............................................................................14 2.4.2 Regimul pluviometric..................................................................16 2.4.3 Regimul eolian.............................................................................17 2.4.4 Caracterizarea generală a climei .................................................17 2.5 CondiŃii hidrologice .......................................................................18 2.6 CondiŃii edafice ..............................................................................18 2.7 Tipuri de staŃiune ...........................................................................19. 2.8 Tipuri de pădure..............................................................................21 2.9 Concluzii privind condiŃiile staŃionale şi de vegetaŃiei ...................22 3

CAPITOLUL III - Material şi metodă de lucru 3.1 Recoltarea probelor pentru analiză…………………………………..24 3.2 Izolarea ADN-ului……………………………………………………26 3.3 ReacŃia de polimerizare în lanŃ (PCR)………………………………..36 3.4 SecvenŃele simple repetitive de ADN………………………………..40 3.5 Electroforeza capilară………………………………………………..42 3.6 Calculul indicilor diversității genetice……………………………….46

CAPITOLUL IV - Diversitatea genetică a gârniței 4.1 Date primare……………………………………………………........54 4.2 Structura genotipică ..............................................................................67 4.3 Structura alelică ....................................................................................75 4.4 Indicii diversității genetice ...................................................................82 4.5 Concluzii ...............................................................................................85

CAPITOLUL V - Bibliografie ...............................................................86

B. PIESE DESENATE

4

CAPITOLUL I Aspecte generale privind gârniŃa (Q. frainetto) 5 .

tomentoşi.conferta Kit.cu înălŃimi până la 30-40 m.2 Morfologie Arbore de mărimea I. 1. Lujerii sunt viguroşi. 2007). cenuşii. brăzdat longitudinal.1.2 Frunză şi ghindă 6 . cu peri simpli bruni sau brun-gălbui şi peri fasciculaŃi.măslinii. cu numeroase lenticele mari..cu ritidom potrivit de gros ( mai gros decât al gorunului.spre toamnă. glabrescenŃi.Gârniță Încrengatura : Magnoliophyta Clasa : Magnoliatae Ordinul : Fagales Familia : Fagaceae Genul : Quercus Specia : Quercus frainetto (Şofletea şi Curtu. încâlciŃi. cenuşiu-negricios.hungarica Hubney). frainetto) 1.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.friabil. caracteristic solzos.1 Ritidom de gârniŃă Fig. 1. Fig.iar coroana este largă şi relativ deasă. Q. dar mai subŃire decât la stejar). Tulpina este bine conformată.1 Încadrarea sistematică Quercus frainetto ( Q. de regulă.moale.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q . lat-eliptice până la obovat-eliptice. 7 . la circa 450 m altiutdine.lacşi. spre toamnă adesea glabrescente.gârniŃa nu este o specie autohtonă. lobii sunt dispuşi simetric.de până la 1. despărŃiŃi adesea prin sinuri foarte înguste şi adânci. de circa 612 mm înălŃime. ( Şofletea şi Curtu.pădurea Seaca.cei terminali înconjuraŃi de câteva stipele persistente. la început sunt catifelat-cenuşiu-păroase.3 Areal GârniŃa este o specie sudică şi sud-estică.constituind arborete pure sau de amestec cu cerul. continuând prin Peninsula Balcanică.8 cm lungime. În Ungaria. de până la 2. relativ scurte. cu areal mult mai restrâns decât al cerului.până în nord-vestul Asiei Mici. ci a fost introdusă formând câteva arborete de mică întindere. cu peri bruni. de 10-18 cm lungime şi 6-12 cm lăŃime. pe platforma Cotmeana. La noi in Ńară ocupă circa 2% din suprafaŃa păduroasă . bruni-gălbui. fiind prezentă îndeosebi la vest de râul IalomiŃa.penat-fidate.5 cm lungime.ovoizi. din sivostepa Olteniei şi Munteniei până în altitudine în Banat şi în regiunea dealurilor subcarpatice. acuŃi.stejarul. Apare insular şi în sudul Republicii Moldova. Ghindele sesile sau foarte scurt pendunculate . la bază auriculate şi sesile sau scurt peŃiolate.dezlipiŃi de peretele cupei. în Turcia.frainetto) Mugurii sunt mari.aproape patenŃi. 2008 ) 1. cu 8-9(10) perechi de lobi. Cupa este lat-conică. la vârf trunchiate sau obtuze. Frunzele relativ mari. îndeosebi în judeŃul Olt. ocupată de această specie în proporŃie de 80%. Pe dos. ovoidal-elipsoidale. Limita nordică a arealului său se află în Ńara noastră (la circa 47° latitudine nordică). începând din sudul Italiei. bruni-gălbuitomentoşi. îngrămădite spre vârful lujerului. între râurile Vedea şi Teleorman. câte 2-8 la un loc. cu solzi liniar lanceolaŃi. Cele mai întinse păduri de gârniŃă din întregul areal al speciei se afla la noi în Ńară.

care îi sunt favorabile.coborârea sa din Ńinuturile colinare. Solurile din staŃiunile caracteristice gârniŃei prezintă fenomene accentuate de podzolire şi sunt caracterizate adeseori prin regim alternant de umiditate. este o specie semixerofită.gorun şi cer. În pădurea din Seaca-Optăşani. Temperamentul este de lumină. dar mai heliofil decât al stejarului (heliofil-subheliofil). primăvara îmbibate puternic cu apa din precipitaŃii.dar manifestă sensibilitate faŃă de îngheŃuri. are capacitatea de a-şi reduce transpiraŃia 1. MaturaŃia este anuală. Pe lângă înmulŃirea pe cale generativă. Spre deosebire de cer.în contact cu silvostepa.gâ)rniŃa este sensibilă faŃă de concentraŃia solului în CaCOз. ca şi în cazul altor specii de cvercinee. iar periodicitatea fructificatiei este de 4-6 ani.puternic îndesate pentru că dispune de o forŃă apreciabilă de extragere a apei din soluri cu textură fină.este mai înceată decât la stejar. ca la toate speciile din subgenul Lepidobalanus. GârniŃa preferă solurile cele mai compacte.iar puterea germinativă este de circa 50-70%. la fel ca şi cerul. cu veri lungi şi călduroase.de Ńinuturi cu climă moderată. Rezistă mulŃumitor faŃă de gerurile mari din iarnă. frainetto) 1. iar vara devin extrem de uscate şi crapă. fapt care face posibilă. Totodată. silvostepice.este o specie eutermă-mezotermă.5 Însuşiri biologice Maturitatea este târzie.4 CerinŃe ecologice GârniŃa. limitează răspândirea sa în Ńinuturile în perioadela secetoase.în zone cu 450-500 mm precipitaŃii medii anuale.preferând solurile cu compoziŃie silicioasă. cu coeficient mare de ofilire şi apa freatică situată la mare adâncime. dar şi în general.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. jud. Olt s-au evidenŃiat cazuri de înmulŃire vegetativă prin drajoni. Uscăciunea aerului constituie un factor care mulŃumindu-se cu cantităŃi reduse de apă.până la câmpie . Creşterea în tinereŃe.uneori. 8 . gârniŃa dispune de o bună capacitate de lăstărire până la vârste înaintate.

peste10 ani. capabilă să pună în valoare staŃiunile cu solurile cele mai compacte şi mai argiloase. Înaceste rezervaŃii s-au constatat deosebiri între vitalitatea şi capacitatea de bioacumularea arborilor. În spaŃiul românesc există suprafeŃe întinse cu soluri extrem de argiloase sau soluri superficiale uscate şi drenate în adâncime pe versanŃi însoriŃi. arboretele de gârniŃă produc circa 4.foarte tare şi rezistent. este utilizat în construcŃii şi industria mobilei.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. a impus necesitatea efectuării de cercetări privind cunoaşterea cauzelor caredetermină acest fenomen. deoarece crăpă adeseori. ImportanŃa gârniŃei Lemnul de gârniŃă este greu. Numărul de cromozomi pentru gârniŃă este de 2n=24.iar la 120 de ani productivitatea poate ajunge la circa 6 m³/an/ha. Scopul cercetărilor de faŃă a fost analiza structurii arboretelor rezervaŃii deseminŃe de gârniŃă în vederea producerii de sămânŃă cu fond genetic valoros. pe de altă parte. Este valoros ca lemn de foc. GârniŃa (Quercus frainetto Ten.la 100 de ani. în special în arboretele desemnate rezervaŃii de seminŃe. Este mai puŃin apreciat pentru confecŃionarea butoaielor.în tâmplărie.5 m³/an/ha. pe de o parte şi capacitatea de fructificaŃie şi aptitudinile de regenerare naturală.) este o specie de mare valoare ecologică şi economico-socială. şi stabilireade măsuri de gospodărire în vederea stimulării înfloririi şi menŃinerii fructificaŃiei. unde gârniŃa este singura specie capabilă să reziste şi să pună în valoare foarte productiv aceste soluri Lipsa fructificaŃiilor abundente la această specie o perioada îndelungată. 9 . frainetto) În condiŃii optime.

CAPITOLUL II Cadrul natural al pădurii Seaca-Optăşani 10 .

etc. cucută de pădure . Unitatea de producŃie Seaca este situată în partea de nord a judeŃului Olt .1. dragaveiul . Ocrotirea ei constitue o problemă de interes naŃional şi european pentru că aici se găseşte cel mai reprezentativ eşantion de gârniŃă. gălbenele . 11 . VegetaŃia ierboasă cuprinde numeroase specii : fragii de pădure . Elemente de identificare a unităŃii de producŃie Pădurea Seaca-Optăşani se găseşte în unitatea de producŃie V Seaca din cadrul Ocololui Silvic Slatina. frainetto) 2. sovarul . căpsuni de câmp . lăptucile . etc. coada mielului . VegetaŃia lemnoasă mai cuprinde şi alte specii de arborii : ulmul de cîmp . lemnul câinesc . cornul . Se întinde pe o suprafaŃa de 1398 ha. în stânga OlteŃului. gorunul .Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.

2.1 Localizarea pe hartă U.P V Seaca 12 .Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. frainetto) Fig.

Substraturile de argile. 2. fragmentarea verticală 150-300 . ravenelor. la est de terasa Argeşului. care are drept caracteristică fragmentarea deluroasă complexă. nord-est de drumul naŃional Piteşti-Râmnicu Vâlcea. Pe tot cuprinsul teritoriului se găsesc întinse arborete de gârniŃă din care cele mai reprezentative sunt cele de la Seaca. Altitudine minimă este de 220 m (u.2 CondiŃii geologice Teritoriul unităŃii de producŃie aparŃine imensului con de dejecŃie dintre Olt şi Argeş.3 CondiŃii geomorfologice Teritoriul unităŃii de producŃie Seaca V se încadrează din punct de vedere geomorfologic în Piemontul Cotmenei care este limitat la vest de terasa Oltului. altele spre Vedea(SE). marne şi nisipuri levantine sub acŃiunea factorilor exogeni modelatori a înregistrat modificări generate de eroziune ducând la apariŃia şi dezvoltarea ogaşelor. Morfostructural Piemontul Cotmenei aparŃine de Piemontul Getic. la sud aproximativ pe linia Slatina-Corbi(Piteşti). frainetto) 2. iar cea maximă de 330 m (u. iar spre nord. Pe acest loc.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.începând cu levantinul superior şi până în prima perioadă a cuaternarului sa depus un strat gros de pietrişuri levantine.a 32 F). Văile sunt divergente pentru că unele curg spre Olt(SV). alteori largi cu terase şi povârnişuri repezi. provenite din degajarea micaşisturilor sărace În calcar ale MunŃilor Făgăraş.văile sunt uneori strâmte. 13 .a 72 A). Pe aceste depozite s-au format soluri brune de pădure mai mult sau mai puŃin podzolite ( luvosol ) le prezintă numeroase variante în funcŃie de adâncimea stratului de pietriş şi alŃi factori locali.aluviuni de argilă fină.

1 11. din această cauză conturul livezilor este foarte sinuos. iar ultimul îngheŃ apare în luna mai ( 5-10 mai ).7 5. II III IV V VI VII 22.0 10. respectiv ultimul îngheŃ . Tipurile de soluri sunt strâns legate de formele de relief. 2. primul îngheŃ are loc în perioada 20-25 octombrie.3 10. mai rar de gârniŃete cerete şi de gârniŃete gorunete. unitatea de relief predominantă este platoul. lunară Luna I t (oC) În tabelul 2.7 17.2 sunt prezentate date referitoare la primul.dar şi datele privind primul şi ultimul îngheŃ prezente în tabelul următor: Tabelul 2. soluri brune luvice tipice pe versanŃii mijlocii şi inferiori cu pante 10-30°.4 -0.5 4. valori maxime şi minime.1 VIII IX X XI Valoare XII anuală 0.4 CondiŃii climatice 2. o parte din platou a fost defrişat şi ocupat de sate şi terenuri agricole.4. frainetto) Relieful se caracterizează printr-o fragmentare orizontală verticală mică.9 16.temperaturi medii pentru perioada bioactivă şi cea de vegetaŃie.1 19.1 Temperatura aerului Temperatura medie. În trecut. care în general se prezintă astfel – – – – soluri aluviale în lunci joase.6 -2.8 21. tice pseudogleizate pe platouri şi coame cu pante mici.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.1 Regimul termic Regimul termic este caracterizat prin temperaturi medii lunare şi anuale. care este ocupat în cea mai mare partea de gârniŃete. soluri brun luvice pseudogleizate şi brun luvice vertice.1 14 .

având o influenŃă negativă asupra arboretelor tinere.aerul cald.vine din nordul Africii şi produce o creştere accentuată a temperaturii până la 41.IV ULTIMUL ÎNGHEł Data Date extreme mai Cel târziu 22. suficient pentru lignificarea puieŃilor.XII 6.IX mai Cel târziu 1. se deplasează din Rusia sau din Peninsula Scandinavică spre Peninsula Balcanică.aerul rece. de origine polară. dar şi asupra arboretelor mature.1°C în luna iulie şi un minim de -2. astfel încât temperatura scade până la -30°C.5°C. de origine tropicală. frainetto) Tabelul 2. media temperaturilor anuale 10.bilanŃul termic relativ ridicat. – – – valorile medii lunare ale temperaturii aerului are un maxim de 22. iar ultima zi cu 15 . iar numărul mediu al zilelor cu temperaturi peste 10ºC este de 199. care pot fii calamitate .Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. cât şi gospodărirea pădurilor din cadrul unităŃii de producŃie.III mai medie Cel Numărul de zile cu temperaturi mai mici de 0ºC este de 120.7°C în luna ianuarie.X Date extreme Cel timpuriu 8.atât în ceea ce priveşte întemeierea noilor arborete. prezintă un climat cu caracter continental moderat.V mai timpuriu 3. Iarna. Prima zi de îngheŃ se situează în intervalul 20-25 octombrie. provocând uscarea acestora.2 Datele medii şi extreme ale primului şi ultimului îngheŃ PRIMUL ÎNGHEł Data medie 25. timp îngheŃ în intervalul 5-10 mai. Vara.6°C. Aceste date caracterizează din punct de vedere termic zona şi sunt folosite la stabilirea soluŃiilor.

5 46. frainetto) 2.4.3 VALORI LUNARE VALOARE Luna P (mm) I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII ANUALĂ 35.6 mm. Cea mai mare cantitate de precipitaŃii se înregistrează în jumătatea caldă a anului.2 30.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.8 mm nu este uniformă în decursul anului.7 47.variind de la o lună la alta şi de la un an la altul. lipsit de precipitaŃii. cu un maxim în luna iulie 68. Tabelul 2.3 51.2 Regimul pluviometric Regimul pluviometric este caracterizat prin precipitaŃii atmosferice(mm).5 28.1 mm.6 74.ploi torenŃiale şi abundente.2 41.4 EvapotranspiraŃia potenŃială VALORI LUNARE Luna ETP(mm) I II III 17 IV 52 V 95 VI 125 VII 146 VIII 127 IX 85 X 46 XI 14 XII 0 VALOARE ANUALĂ 0 0 707 16 . are un minim în luna martie de 27.4 82.5 46. evapotranspiraŃie: PrecipitaŃii atmosferice medii lunare şi anuale Tabelul 2.8 Cantitatea medie anuală de precipitaŃii 578. cantităŃi maxime în 24 ore.9 578. medii lunare şi anuale.3 37. Anotimpul rece .6 50.

iar al celor cu viteze peste 16 m/s este de 13.3 Regimul eolian În unitatea de producŃie V Seaca sunt predominante vânturile ce bat din partea de est şi cele care bat din partea de vest.3%.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.2 m/s la cele care bat dinspre vest. 2.2 m/s la cele care bat dinspre sud pânăla 4.4. Vânturile ce bat din est au o frecvenŃă mai mare pe timp de iarnă. iar vânturile care bat din partea de vest au o frecvenŃă mai mare vara şi primăvara.um maxim se înregistrează în lunile iulie-augustseptembrie. Umiditatea relativă a aerului are o valoare maximă în luna decembrie 86% şi o minimă în luna august 59%.4 Caracterizarea generală a climei Indicele de ariditate de Martonne: P T + 10 12 p t + 10 Ia = il = 17 .7 zile. În ultimii ani secetele prelungite au o influenŃă nefavorabilă asupra vegetaŃiei forestiere.6%.8 zile. frecvenŃa medie anuală este de 18. Viteza medie anuală a vânturilor variază de la 1. FrecvenŃa medie anuală a zilelor de calm atmospheric este de 26. Deficitul de apă din sol se înregistrează în timpul sezonului de vegetaŃie.7%.P. Vânturile ce bat cu viteze moderate au o influenŃă favorabilă asupra vegetaŃiei forestiere. V Seaca sunt: viscolul(iarna) şi austrul (primăvara). 2.4. frecvenŃa medie anuală este de 24. Numărul zilelor în care vânturile bat cu viteze de peste 11 m/s este de 66. Principalele vânturi care bat pe teritoriul U. frainetto) Regimul precipitaŃiilor atmosferice şi cel al evapotranspiraŃiei şi raporturile dintre acestea au o mare influenŃă asupra vegetaŃiei forestiere.

3 VI 2.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. 18 .0 Indicele 4.9 25.0 XI 2.9 IV 1. cât şi Vedea au văi asimetrice. Atât Cotmeana.6 CondiŃii edafice VegetaŃia forestieră are o importanŃă deosebită pentru specificul ecologic şi potenŃialul productiv al staŃiunilor şi pentru formarea diverselor tipuri de soluri. t = temperaturi medii anuale şi lunare Indicele de ariditate de Martonne VALOARE ANUALĂ Tab.9 VII 1. fac parte din bazinul mijlociu Cotmeana-Vedea. 2. 2.4 X 2.7 VIII IX 1.0 III 1.valea Burdei. iar în cursul inferior se găsesc o serie de văi: valea Tecuciului. Vara toate văile.0 şi indică faptul că zona luată în studiu prezintă un climat favorabil pădurilor. Bazinul hidrografic Cotmeana-Vedea este alcătuit în cursul lui superior din văi adânci.5 CondiŃii hidrologice Pădurea Seaca se găseşte amplasată pe interfluviul dintre văile Plopcea Mare şi Plopcea Mică. Numele localităŃii şi a pădurii exprimă lipsa de apă. Râul Vâlcea are în cursul superior ca afluent pârâul Plopcea.versantul drept este evident mai înalt. T.0 Indicele de ariditate anual are valoarea de 25.5 Luna VALORI LUNARE I II 3. chiar şi Vedea sunt lipsite de apă o perioadă de 2-3 luni. Apele freatice ale teritoriului se află la adâncimi mari mari 25-30 m.8 XII 4. frainetto) P.valea Tinoasa şi valea Câinelui care alcătuiesc afluenŃii de stânga a râului Vedea.(Seaca) Regimul hidrologic al cursurilor de apă este caracterizat printr-un mediu scăzut. iar primăvara există pericolul viiturilor.2.8 V 2. p = precipitaŃii medii anuale şi lunare.2 1.fără terase pe când cel stâng este mai prelung de 2-3 terase.

frainetto) Tipul de sol prezent în această unitate de producŃie este luvosolul.0.7 Tipuri de staŃiuni Pe teritoriul unităŃii de producŃie V Seaca cele mai răspândite tipuri de staŃiuni fac parte din etajul FD1– staŃiuni de cvercete cu stejar (cu cer.6-5.6-5. foarte slab la foarte bine aprovizionat cu azot total pe întregul profil. şi anume: – deluros de cvercete cu stejar Pm. Factorii limitativi care apar în cadrul acestui sol sunt: troficitatea moderată. 19 . cu luturi grele. foarte bine aprovizionat cu potasiu mobil.3-5. format pe lcuri aşezate. podzolit cu Poa PratensisCarex Cayaphyllea.7 ha. slab humifer cu un conŃinut de humus de 2.cu un grad de saturaŃie în baze N=36-85% cu valorile cele mai mici în orizontul debazificat El. pe versanŃii slab înclinaŃii este puternic acid la acid cu pH=4. Factorii limitativi ai acestui sol sunt: compactitatea ridicată şi drenajul defectuos ce conduce la variaŃii de umiditate în sezonul de vegetaŃie.conŃinut de humus de 3. Ph=5. 2.3-6. de regulă pe platouri.3% în orizontul Ao. ocupă o suprafaŃă foarte mică de 13. format pe gresii fine silicioase sau alternante cu luturi.P. Aluvic tipic Ao-C. puternic la moderat acid cu pH=4. Brun luvic-pseudogleizat are următorul profil: Ao-El-Btw-C.gârniŃă. Bonitatea acestui sol este determinată de compactitatea orizontului Bt care limitează pătrunderea rădăcinilor şi de volumul edafic mijlociu. În pădurea Seaca se găseşte un singur tip de staŃiune.8.9. uneori slab aprovizionat cu fosfor mobil. are valori mai mici în orizontul podzolit El. pH=4..5-7.6 slab humifer.. adică 1% din suprafaŃa U. regimul de umiditate alternant şi compactitatea ridicată datorită conŃinutului mare de argilă în orizontul Bt. Brun luvic tipic are următorul profil: Aο-El-Bt-C.3%. Brun luvic vertic-pseudogleizat cu profilul: Ao-El-Btzw-Cw are cea mai mare pondere în unitatea de producŃie (70%). are o grosime de 3-10 cm.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.gorun şi amestecuri ale acestora).

GÎ. o zonă situată până la 350 m se află în zona de suboptim. Speciile de bază existente în uniitatea de producŃie sunt GO. urmate de gorunetele pure (3%) şi stejerete pure de stejar (1%).8 Tipuri de pădure În pădurea Seaca tipul de pădure este: – gârniŃet de platou de productivitate superioară (s). o luvosolul-caracteristicile sale aflate în zona de optim ecologic este de bonitate superioară pentru gârniŃă.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. 2. frainetto) 2.4 ha. o altitudinea la care se găseşte populaŃia studiată are valori optime până la 300 m.CE. Prin compararea datelor privind condiŃiile staŃionale şi de vegetaŃie cu cele prezentate în fişa ecologică a speciei se pot desprinde următoarele concluzii: o temperatura medie anuală şi precipitaŃiile medii anuale sunt optime pentru gârniŃă. care ocupă o suprafaŃă 1382. rezistente la acŃiunea factorilor destabilizatori.P V Seaca sunt gârniŃetele pure (96%). aacestea sunt corespunzătoare zonei fitoclimatice şi sunt folosite la crearea de arborete valoroase .9 Concluzii privind condiŃiile staŃionale şi de vegetaŃie Din cele prezentate la subcapitolele anterioare se desprinde concluzia că factorii staŃionali favorizează biocenozele forestiere locale care au în componenŃă gârniŃa. Cele mai importante şi cele mai răspândite formaŃii forestiere din U. o lungimea perioadei bioactive se situează în zona de suboptim ecologic. 20 .

CAPITOLUL III Material şi metodă de lucru 21 .

P V Seaca cu o suprafaŃă de 1398 ha.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. În teren.1). Pozele au fost făcute cu ajutorul programului Google Earth în care s-a importat un fişier de tip KMZ care conŃine coordonatele geografice ale populaŃiei studiate. Probele s-au recoltat cu ajutorul une foarfeci. fiecare exemplar luat în studiu a fost numerotat cu cifre arabe de la 1 până la 53 (figura 3. din cadrul U. câte 2-3 lujeri cu muguri din fiecare arbore luat în studiu. În total s-au eşantionat 53 de exemplare. În populaŃia de gârniŃă din Seaca-Optăşani exemplarele s-a ales la o distanŃă de cel puŃin 30-50 m unul faŃă de altul. coordonate care au fost preluate cu ajutorul unui aparat GPS. în vederea reducerii probabilităŃii ca două sau mai multe exemplare să provină din regenerarea din sămânŃă de la acelaşi exemplar mamă. frainetto) 3.1 Recoltarea probelor pentru analiză Pentru a studia diversitatea genetică a populaŃiei de gârniŃă a fost necesar să se recolteze lujeri cu muguri din fiecare arbore luat în studiu. 22 .

1 Imaginea satelitară cu arborii eşantionaŃi în pădurea Seaca-Optăşani 23 . frainetto) Fig 3.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. apoi se acoperă tuburile cu capacele furnizate. Rnase A . Se combină Buffer AP1 . Izolarea propiu-zisă a ADN-ului terbuie să respecte un protocol de lucru specific (Qiagen DNeasy96 Plant Kit) care constă în parcurgerea următorilor paşi: 1.2 Izolarea ADN-ului Izolarea ADN-ului necesită pregătirea probelor şi parcurgerea următoarelor etape: – s-a secŃionat longitudinal fiecare mugure. se introduce în două plăci (racks) . materialul prelevat s-a Ńinut în gheaŃă pentru a evita degradarea ADN-ului până la izolarea acestuia. Reagent DX potrivit tabelului urmator (tabelul 3. frainetto) 3. pentru a se efectua aceste operaŃii s-a folosit bisturiul şi penseta care se curăŃă după prelevarea materialului de la fiecare arbore pentru a evita contaminarea probelor. 3. Se adaugă cu pipeta 400 l din această soluŃie în fiecare tub .1) pentru a crea o soluŃie adecvată . Materialul recoltat din muguri sau frunze într-o cantitate de aproximativ 50 mg. Fig 3. 2. fiecare a câte 96 tuburi (collection microtube) . 24 .2 SecŃionarea mugurilor – – – s-a recoltat material necesar analizei din trimea superioară a mugurelui ( aproximativ 50 mg pentru fiecare arbore). Se adaugă câte o bilă de wolfram în fiecare tub din cele două plăci .

1 Volum de reactivi pe probă extrasă Volum/proba Buffer AP1 RNase A (100 mg/ml ) Reagent DX 400 l 1 l 1 l Volum/2x96 probe 90 ml 225 l 225 l 4.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. Se scot plăcile din dispozitivele de prindere ale morii şi se reaşează intr-o nouă poziŃie opusă primei poziŃii. Se aşează fiecare placă cu tuburi între dispozitivele de prindere ale morii cu bile (TissueLyser) . Figura 3.3 Moara cu bile TissueLyser 6. Se macină probele timp de 1.5 minute la frecvenŃa de 30 Hz (figura 3. Important : Prelungirea timpului de macinare conduce la dezagregarea ADN-ului. 25 .3). frainetto) Tabelul 3. 5.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.5 minute la 30 Hz. l de supernatant în plăci cu tuburi. se va ajusta cantitatea de Buffer AP3/E din urmatotul pas in mod corespunzător . Se scot şi se aruncă capacele. Se vor sedimenta granule compacte. 10. 12. se asigură că tuburile sunt acoperite corespunzător pentru a evita scurgerea soluŃiei şi în continuare se vor agita viguros timp de 15 s . Se macină probele pentru alte 1. Se scot plăcile din moara cu bile . Se acoperă cu grijă tuburile cu capace noi . Bilele de wolfram din fiecare tub se vor recupera şi refolosi . asigurându-se o 26 . dar unele particule pot să plutească şi se va acorda atenŃie pentru ca acestea să nu se transfere în paşii următori . frainetto) Important : Simpla rotaŃie a plăcilor în dispozitivele de prindere nu este suficienta deoarece aceleaşi probe care au fost periferice morii in faza iniŃială vor rămâne periferice si în a doua fază. Se scot şi se aruncă capacele tuburilor după care se adaugă 130 l Buffer AP2 în fiecare tub. Se transferă cu grijă 400 orientare corectă a acestora. În continuare plăcile se vor centrifuga până la 3000 rpm pentru a se colecta soluŃia rămasă pe capace . Notă : Centrifugarea are rolul de a preveni îngheŃarea soluŃiei de pe capace ceea ce ar conduce la o îngreunare a îndepărtării acestora după incubarea probelor la -20˚C . Se centrifughează plăcile timp de 5 minute la 6000 rpm. Plăcile se vor incuba timp de 10 minute la -20˚C . 7. 8. Nu se transferă mai mult de 400 l de supernatant deoarece capacitatea plăcilor DNeasy 96 şi S-Blocks . 13. folosite in paşii următori va fi depăşită. 9. Dacă se va extrage mai puŃin de 400 l supernatant . acestea se vor centrifuga pâna când centrifuga va atinge turaŃia de 3000 rpm. Pentru a nu rămâne soluŃie pe capacele tuburilor . 11.

Tuburile se acoperă cu capace noi şi se agită viguros 15 secunde manual după care se centrifughează până la 3000 rpm .5 Placa cu membrană Dneasy 96 27 . Plăcile Dneasy 96 se marchează pentru ca probele să se poată identifica mai târziu. 15. frainetto) Fig 3. Fig 3. Notă: Se verifică dacă etanolul a fost adăugat în Buffer AP3/E. Se aşeaza două plăci Dneasy 96 (figura 3.5) deasupra plăcilor S-Blocks . 16.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.4 Extragerea supernatantului 14. Se adaugă 600 l Buffer AP3/E in fiecare probă.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. frainetto) 28 . După centrifugare se verifică dacă toată soluŃia a trecut prin membranele plăcilor Dneasy 96 . plăcile Dneasy 96 nu se acoperă cu banda adezivă.6 Încărcarea plăcilor Dneasy 96 18. Se centrifughează timp de 15 minute la 6000 rpm pentru a usca membranele Dneasy (figura 3. Fig 3. Important : Etanolul rezidual din membranele Dneasy derivat din Buffer AW poate inhiba PCR-ul si trebuie îndepărtat prin centrifugare înaintea eluŃiei ADN-ului.7). Banda adezivă cu pori previne contaminarea reciprocă a probelor în timpul centrifugării . 19. Pentru o uscare eficientă . După centifugare se aruncă solutia din plăcile S-Blocks . Dacă nu a trecut toată soluŃia se mai centrifughează înca 4 minute.6). frainetto) 17. Notă : Se verifică dacă a fost adăugat etanol la Buffer AW înainte de utilizare 20. Se scot şi se aruncă capacele de pe colecŃia de microtuburi după care se transferă cu atenŃie 1 ml din fiecare probă în fiecare orificiu al plăcilor Dneasy 96 (figura3. Se îndepărtează banda adezivă şi se adaugă cu grijă 800 l Buffer AW în fiecare probă.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. Se acoperă fiecare placă Dneasy 96 cu bandă adezivă (AirPore Tape Sheet ) Se centrifughează 4 minute la 6000 rpm.

După un minut probele se centrifughează timp de 2 minute la 6000 rpm.7 Centrifugarea probelor 21.9) se vor acoperi cu capacele furnizate şi se vor păstra la -20ºC până în momentul în care se vor efectua experimentele.Fig 3. Fig 3. 22. se adaugă 100 l Buffer AE în fiecare probă şi se acoperă plăcile cu bandă adezivă. Pentru eluŃia ADN-ului se aşează plăcile Dneasy în poziŃia corectă pe noile plăci Elution Microtubes RS (figura 3.8).8 Placa Elution Microtubes RS 29 . Plăcile Elution Microtubes RS (figura 3.

5g de agaroză (s-a cântărit pe o 30 .Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. Fig 3. frainetto) Testarea ADN-ului După ce s-a încheiat izolarea ADN-ului se doreşte o testare a probelor pentru a se vedea dacă toate au fost izolate în mod corespunzător.9 Transferul cu ajutorul pipetei multicanal 2) Pregătirea gelului de agaroză – într-un vas Erlenmayer se toarnă 100 ml apă bidistilată (TAE 1%) peste care se adaugă 1. Testarea se realizează prin parcurgerea următorilor paşi: • • • • • • • Colorarea soluŃiei de ADN Pregătirea gelului de agaroză Încărcarea gelului cu soluŃia de ADN Punerea în funcŃiune a electroforezei orizontale Colorarea gelului de agaroză Transferarea gelului în spectrul ultra-violet Interpretarea rezultatelor 1) Colorarea soluŃiei de ADN – cu ajutorul unei pipete dispencer se încarcă într-o placă 2 µl de colorant (DYE) peste care cu ajutorul unei pipete multicanal se încarcă 4 µl din soluŃia obŃinută în urma izolării ADN-ului (figura 3.9).

pregătită anterior. soluŃia se fierbe şi după răcirea parŃială a acesteia se toarnă într-o tavă pregătită cu doi piepteni. formându-se 2 rânduri a câte 30 de locaşuri pentru testare. frainetto ) balanŃă electronică cu o precizie de 10-3g). După agitare şi realizarea omogenizării (figura 3. Figura 3.12).11) unde urmează îndepărtarea pieptenilor.10 Omogenizarea gelului Fig.10). După ce s-a întărit gelul. după care urmează setarea voltajului şi a duratei de funcŃionare (figura 3. În mod uzual s-a folosit un voltaj de 100V timp de 30-45 de minute. Electroforeza este o metodă analitică şi preparativă de separare a particulelor sau ansamblurilor de particule încărcate electric. spre locaşurile gelului de agaroză care se află submersate în apă bidistilată.11 Introducerea gelului în unitatea de electroforeză orizontală 3) Încărcarea gelului cu soluŃia de ADN – se realizează cu ajutorul unei pipete care transferă soluŃia de ADN colorată. sub acŃiunea unui câmp electric uniform aplicat din exterior. deplasarea se face de la 31 . 3. 4) Punerea în funcŃiune a electroforezei orizontale – unitatea de electroforeză se conectează la sursa de curent electric prin intermediul unor fire.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. marginile metalice ale tăvii se îndepărtează iar tava împreună cu gelul este introdusă în baia electroforezei orizontale (figura 3. Metoda are la bază fenomenul fizico-chimic de deplasare sau migrare diferenŃiată a diferitelor specii de particule într-un câmp electric.

Se foloseşte un leagăn electronic(figura 3. Fig 3. Fig 3.13) pentru o mai bună colorare a gelului de agaroză. frainetto) electrodul catod (-) la anod (+). iar între electrozi şi elementele de separat nu au loc reacŃii.14).Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. 32 .12 Electroforeza orizontală 5) Colorarea gelului de agaroză – după ce s-a încheiat migrarea sub acŃiunea curentului electric.13 Colorarea gelului de agaroză 6) Transferarea gelului în spectrul ultra-violet – după colorarea gelului timp de 2030 de minute urmează transferul acestuia spre un transiluminator cu ultraviolete (UVP) cu ajutorul căruia se pot observa probele care conŃin ADN (figura 3. gelul de agaroză se transferă într-o tavă în care se află o soluŃie de gel red.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.15 Vizualizarea probelor cu AND 33 . frainetto) Fig 3.14 Transiluminatorul UVP 7) Interpretarea rezultatelor . Fig 3.În imaginea următoare se poate observa că în toate probele s-a găsit ADN (figura 3.15).

5 2. PCR) este o metodă folosită în biologia moleculară. Realizarea amestecului (mix-ului) presupune combinarea următoarelor substanŃe într-un tub cu un volum cunoscut (tabelul 3. frainetto) 3.5 Volum pentru 9 probe. denumită şi Taq pentru că a fost extrasă iniŃial dintr-o bacterie care trăieşte în apele termale – Thermus aquaticus. Polymerase Chain Reaction. bazele acesteia au fost puse de Kary Mullis in anii 80.3 ReacŃia de polimerizare în lanŃ ReacŃia de polimerizare în lanŃ (engl. putând fi o genă sau un segment ADN anonim din ADN-ul cloroplastic. obŃinute sintetic.5 13.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. Această reacŃie se parcurge tampon din: • • ADN izolat de la individul respectiv (engl.5 13. presc. doi primeri (amorse) – polinucleotide scurte monocatenare. µl 67.1 Protocolul folosit în cadrul reacŃiei de polimerizare în lanŃ SubstanŃa Master Mix Primer A(+) Primer B (-) H2O Volum pentru 1 probă. dCTP şi dTTP). primind premiul Nobel pentru medicină. o enzimă de tip ADN polimeraza care rezistă la temperaturi ridicate.5 22. dGTP.5 1. ReacŃia de polimerizare în lanŃ este precedată de diluŃia ADN-ului care constă în adăugarea unei anumite cantităŃi de apă (H2O) peste soluŃia obŃinută cu ajutorul kitului Qiagen DNeasy96.5 1. template DNA) printr-un procedeu special.1): Tabelul 3.5 prin realizarea unui amestec într-o soluŃie 34 . • • cele patru tipuri de nucleotide din ADN dar trifosforilate (dATP. mitocondrial sau nuclear. µl 7. cu rolul de a fi folosite de ADN-polimeraza Taq pentru iniŃierea replicaŃiei. ReacŃia de polimerizare în lanŃ are ca scop identificarea şi amplificarea unei regiuni „Ńintă” de ADN.

denaturarea ADN-ului prin ruperea punŃilor de hidrogen dintre cele două catene complementare ale ADN-ului la temperatura de 94ºC timp de 50 de secunde. 4 de încă 31 de ori (rezultă 32 de cicluri) cu scopul de a obŃine un număr foarte mare de copii ale fragmentului Ńintă. prevăzut cu infrared şi primerul B(-). Maşinile care au rulat reacŃia de polimerizare în lanŃ sunt: Fig 3.legarea primerilor (engl.1 Eppendorf Master Cycler Fig 3. frainetto) În continuare se adaugă câte 5 pmoli pentru cei doi primeri A(+). Apoi se pregătesc tuburile specifice reacŃiei de polimerizare şi fiecare probă este numerotată pentru a fi identificată. de ordinul zecilor şi sutelor de milioane.denaturarea iniŃială a ADN-ului la temperatura de 94ºC timp de 3 minute. 3. acest pas se mai numeşte şi hibridare şi are loc la temperatura de 56ºC timp de 50 de secunde. În fiecare tub se vor pipeta 13 µl din mix-ul pregătit anterior. de regulă se calculează o probă în plus deoarece se pot face greşeli de pipetare. ReacŃia se efectuează într-o maşină specială numită thermocycler care are rolul să ridice şi să scadă temperatura din tuburi după un program setat iniŃial.sintetizarea sau elongarea noilor catene. annealing) pe cele două catene antisens la capetele zonei de amplificat.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. 35 . 4 . 3 . 2 .2 Palm-Cycler Aceste aparate au rulat programul ZAG9 după următori paşi: 1 . proces ce are loc la temperatura de 72ºC timp de 1 minut. apoi 2 µl din soluŃia rezultată în urma diluŃiei ADN.repetarea paşilor 2. 5 .

completarea catenelor la temperatura de 72ºC timp de 10 minute. Figura 3. legea primerilor.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.menŃinerea probelor la o temperatură constantă de 8ºC până în momentul scoaterii lor din aparat de către operator .3 Principiul reacŃiei de polimerizare în lanŃ Principiul reacŃiei de polimerizare în lanŃ urmăreşte: – – – denaturarea. sinteza noilor catene. 7 . frainetto) 6 . 36 .

37 . Benzile pot fi evidenŃiate prin colorare. spre anod.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.matriŃa ADN este o macromoleculă polimerică alcătuită din 2 catene complementare. astfel încât fragmentele de mărimi specifice vor migra diferenŃiat pe suportul de gel. la anumite distanŃe faŃă de punctul de plecare. în unele proceduri de lucru se foloseşte şi metoda de evidenŃiere a ADN prin autoradiografiere sau prin electroforeză capilară cu ajutorul unui analizor genetic care determină lungimea fragmentelor prin intermediul laserului. antiparalele.4 Denaturarea ADN-ului Copiile secvenŃelor iniŃiale de ADN pot fi vizualizate cu ajutorul electri\oforezei orizontale. astfel încât la o temperatură de 94°C cele 2 catene se separă având loc denaturarea. Testarea produselor PCR se face combinând 4 µl produse PCR cu 2 µl de DYE (vopsea-ne ajută să vedem dacă migrează în câmpul electroforezei orizontale. frainetto) 1) Denaturarea moleculei de ADN. rezultând benzi electroforetice. Fig 3.

4 SecvenŃele simple repetitive de ADN Marker-ul genetic (engl. frainetto) Înainte de electroforeză s-a turnat un gel de agaroză cu concentraŃia de 2% ( în 2 g de agarozăla 100 ml soluŃie TAE). 3.5 o parte din probele testate nu au funcŃionat pentru că nu apar cele două benzi specifice.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. Fig 3. Pentru probele care nu au trecut acest test se va face o nouă reacŃie de polimerizare în lanŃ. Acest tip de marker genetic face parte din familia markerilor moleculari sau ADN care se folosesc în prezent la investigarea atentă şi profundă a genomului organismelor. Markerii genetici sunt secvenŃe simple repetitive folosiŃi în genetică în studiul eredităŃii şi studiul populaŃiilor. inclusiv cel al arborilor. genetic marker) este un caracter calitativ care oferă informaŃii despre gena care controlează expresia acelui caracter.5 Testarea produselor PCR prin electroforeză orizontală În figura 3. 38 . Markeri sunt consideraŃi instrumente utile şi sunt folosiŃi la estimarea nivelului de variaŃie genetică în populaŃiile de arbori.

markerii de tipul microsateliŃilor oferă o unealtă puternică pentru estimarea cantităŃii intraspecifice şi interspecifice ale fluxului de gene (Down şi Ashley.figura 3. Un alt avantaj al microsateliŃilor este că sunt nişte markeri codominanŃi (heterozigoŃii sunt direct observabili). La cvercinee (Quercus spp. Detectarea secvenŃelor simple repetitive din ADN ( Primerii PCR( notaŃi cu săgeată gri) sunt destinaŃi să mărginească regiunea cu microsateliŃi.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. Aceste secvenŃe se repetă de un anumit număr de ori : de la 3-4 până la peste 200.1998) şi privind structura genetică din interiorul populaŃiilor (Streiff et al. un gen de plante lemnoase răspândit în emisfera nordică. Fig 3. 1998). Se găsesc atât în nucleu cât şi în organite (cloroplaste şi mitocondrii). Singură pereche de primeri PCR va funcŃiona pentru fiecare individ şi va realiza produse de mărimi diferite pentru fiecare dintre microsateliŃii de lungimi diferite.6.). 39 .6.. SSRs .simple sequence repeats sau microsatellites) sunt regiuni din ADN cu repetări a unor secvenŃe scurte de 1 până la 6 baze. MicrosateliŃii sunt nişte markeri „hipervariabili” având adesea peste 20 de alele (variante) la un singur locus. frainetto) SecvenŃele simple repetitive sau microsateliŃii (engl. Detectarea microsateliŃilor se face prin proiectarea primerilor PCR care sunt unici pentru un locus din genom şi pentru perechea de bază din ambele părŃi ale regiunii repetate .

ZAG39. o atenŃie specială trebuie acordată variaŃiei secvenŃelor din regiunile de margine ale microsateliŃilor în amplificarea dintre specii. ZAG11. În cadrul acestui proiect s-a lucrat cu 7 microsateliŃi numiŃi ZAG112.5 Electroforeza capilară Electroforeza capilară este o tehnică mai nouă care combină mecanismele de separare ale electroforezei cu aparatura si automatizarea cromatografiei. focalizare izoelectrică si izotacoforeza. SecvenŃa repetitivă este AG (adenină . Principiul pe care se bazează electroforeza este acela că moleculele încărcate vor migra spre polul opus şi se vor separa unele de altele datorită caracteristicilor fizice. Există numeroase variante de electroforeză capilară care soluŃionează diversele probleme de separare. ZAG96. Electroforeza are doi factori limitativi: – – detectarea moleculelor după completarea separării electroforetice. Puterea extraordinară de separare.guanină) care se repetă de 12 ori. electroforeza pe gel. Cei doi primeri sunt următorii: o primerul înainte : gcaattacaggctaggctgg. Acestea includ electroforeza zonală. 40 . frainetto) MicrosateliŃii sunt de obicei localizaŃi în regiuni foarte repetitive aceştia sunt subiectul unei rate mari a mutaŃiei. ZAG110. Electroforeza este o metodă puternică care a fost pusă la punct înaintea apariŃiei biologiei moleculare. se putea folosi doar un voltaj scăzut pentru a preveni daunele probelor provocate de căldură. o primerul înapoi : gtctggacctagccctcatg.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. o genă care a fost descoperită pentru prima oară în Austria la gorun (Quercus petraea). 3. viteza analizelor si sensibilitatea extremă (o singura moleculă prin detectarea cu fluorescenŃa indusă cu laser) conduc la aplicarea intensivă a electroforezei capilare de către multe dintre cele mai bune laboratoare de cercetare analitică din lume. fiind cunoscută în literatura de specialitate sub următoarea formă: ssrQpZAG9.

Se aplică probelor fie o presiune şi se injectează 10 .7) . Detectarea moleculelor migrate se realizează cu ajutorul unei surse de lumină care iluminează o porŃiune a tuburilor şi detectează lumina emisă din partea opusă (figura 3.30 kV).100 nL . transmitând-o apoi spre un computer. Probele sunt furnizate tuburilor capilare atunci când soluŃia tampon (buffer) de la catod este îndepărtată şi orificiile în care se găsesc probele sunt aranjate în dreptul tuburilor capilare. fie se aplică un curent electric şi doar moleculele încărcate intră în capilare.7 Schema unui sistem de electroforeză capilară Probele intră în tub prin partea dreaptă şi migrează spre stânga unde se găseşte sistemul de detectare care înregistrează cromatograma. Figura 3.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.Timpul de rulare al probelor este foarte scurt datorită voltajului înalt (10 . frainetto) Tuburile capilare au o suprafaŃă întinsă raportat la volum. Sistemul de electroforeză capilară folosit în cadrul acestui proiect este secvenŃiatorul Beckman Coulter cu 8 capilare. 41 . aceasta radiază uşor căldura şi astfel probele nu se supraîncălzelzesc.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.56 0. în timp ce pentru probele cu o concentraŃie mai redusă s-a efectuat o diluŃie de 1:3.8 SecvenŃiator cu 8 capilare 1.44 2 1 ≈40.64 L 62 8 ≈1240 L L 42 . 2.2 Volumul de reactivi Componente SLS Standardul SZ400 Microsatelit Probe Volum total 1 Probă 37.2): Tabelul 3. Efectuarea diluŃiei produselor PCR .36 L 13.această operaŃie se va efectua respectând următoarele volume (tabelul 3.în urma testării produselor PCR s-a ajuns la concluzia că unele probe au o concentraŃie mai mare decât altele şi astfel trebuie efectuată o diluŃie diferenŃiată. Pentru probele concentrate s-a ales ca diluŃia să fie de 1:15.0 L L L L 8 Probe 1164. Pregătirea probelor . frainetto) Figura 3.

În figura următoare se oferă o imagine stilizată a unei secvenŃieri pentru patru probe : Separarea la un voltaj de 6000V. OperaŃia de înlocuire a matrix-ului din capilare minimizează posibilitatea de contaminare a probelor între rulări.constă în echiparea acestuia cu cele 8 capilare şi cu un gel de poliacrilamidă. Separarea probelor în aparat Metodele de separare FRAG-1 şi FRAG-3 sunt corespunzătoare pentru folosire cu mărimea scării standard 400.Metoda de separare folosită a fost FRAG3 pentru Standardul 400 care constă în efectuarea următoarelor operaŃii succesive: – Denaturarea la temperatura de 90˚C. În cadrul proiectului electroforeza capilară s-a folosit pentru determinarea mărimii produselor obŃinute în urma ReacŃiei de Polimerizare în LanŃ (PCR). Pregătirea secvenŃiatorului . 3. Într-o placă se va adăuga buffer necesar pentru spălarea capilarelor.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. în fiecare orificiu se va adăuga o picătură de ulei mineral. Pentru ca probele să nu se evaporeze datorită temperaturilor înalte.36 µl din SLS şi 13. apoi se adaugă 38 µl din amestecul din SLS+Standard.64 µl Standard. conŃinutul capilarelor este aruncat şi un nou matrix va umple tuburile. Dacă mărimea standard 600 este folosită atunci parametrii de analiză corespunzători vor trebui modificaŃi pentru folosirea setului de mărime standard 600 şi a modelului Quartic. timp de120 secunde. Metodele de separare FRAG-2 şi FRAG-4 sunt optime pentru folosire cu mărimea scării standard 600. Dacă separarea are loc cu mărimea standard 400 atunci parametrii fragmentelor de analiză sunt corespunzători pentru demarare. se va închide capacul şi va urma setarea din software-ul aparatului. După ce separarea electroforetică este completă. frainetto) Pentru a rula 8 probe se vor amesteca într-un tub 1164. În continuare se va adăuga şi placa cu probele pregătite. timp de 60 de minute 43 . În placa de secvenŃiator se pipetează în fiecare orificiu 2 L din soluŃia PCR diluată.

6 Calculul indicilor diversității genetice Parametrii variabilităŃii genetice intrapopulaŃionale (în interiorul populaŃiilor) se calculează separat pentru fiecare populaŃie în parte. Cei • mai folosiŃi parametri pentru evaluarea variabilităŃii genetice intrapopulaŃionale sunt: Numărul mediu de alele pe locus sau rata medie a alelismului (A/L. Calculul parametrilor genetici se bazează întotdeauna pe distribuŃia frecvenŃelor variantelor genetice într-una sau mai multe populaŃii (structurile genetice). 3. Pentru un individ heterozigot există două vârfuri principale corespunzătoare celor două alele ale genotipului (probele 1.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. 3). în timp ce pentru un individ homozigot există un singur vârf principal (proba 4). curs 2010 44 . frainetto) Figura 3. Curtu. mean number of alleles per locus). Aceste benzi formează nişte vârfuri (engl. peaks) principale dar se poate observa că există şi alte vârfuri mai mici cu 2 nucleotide care poartă denumirea de stutter peaks. engl.9 Exemplu stilizat de electroforeză capilară. 2.

allele frequency) se calculează în funcŃie de frecvenŃa genotipurilor pi = Pii + ½ ∑ Pij (condiŃie: i =1 K ∑p i =1 K i = 1). genetic diversity). frainetto) • • • • Numărul efectiv de alele pe locus sau numărul de alele eficace (Ae. L reprezintă numărul de loci observaŃi. în care: Pii = frecvenŃa genotipurilor homozigote în locusul K (numărul de genotipuri ii = homozigote / numărul total de genotipuri). FrecvenŃa alelică (pi. FrecvenŃa alelelor nu reprezintă un indicator al diversităŃii genetice dar cu ajutorul lor se pot calcula toŃi parametri care măsoară diversitatea şi structura genetică a populaŃiilor. 45 . expected heterozygosity. engl. Pij = frecvenŃa genotipurilor heterozigote în locusul ij în locusul K. în care: A/ L reprezintă numărul mediu de alele pe locus.(He. gene diversity. HeterozigoŃia observată (Ho. Indicele de fixare – Fk. observed heterozygosity).Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. effective number of alleles per locus). HeterozigoŃia aşteptată – denumiri sinonime: diversitatea genică. engl. diversitatea genetică . na reprezintă numărul de alele la locusul A. Numărul mediu de alele pe locus (A/L) Acest indice se calculează ca raport între numărul total de alele observate la toŃi locii genici şi numărul de loci genici analizaŃi: A/ L = ∑n a (a) L . engl.

este un indicator deosebit de expresiv în caracterizarea populaŃiilor de arbori. În cazul în care alelele au aceeaşi frecvenŃă – şi anume pi(a)=1/ni(a). Numărul efectiv de alele pe locus (Ae) Numărul efectiv de alele pe locus ca parametru genetic al variabilităŃii intrapopulaŃionale. Aşadar intervalul de variaŃie al acestui indice este: 1≤ Ae(a) ≤ ni(a) 46 . acest lucru este luat în considerare la calculul parametrului denumit numărul efectiv de alele. Atunci când se cuantifică variaŃia genetică la un anumit locus genic se pleacă de la ideea că nivelul cel mai ridicat de variaŃie genetică este considerat a fi atins atunci când alelele au o frecvenŃă egală. frainetto) Valoarea minimă pentru parametrul A/L este 1 în timp ce valoarea maximă este 2N. Dacă pentru primii doi parametri nu s-a Ńinut seama de frecvenŃa relativă a alelelor. Numărul efectiv de alele pe locus se calculează după cum urmează (CROW and KIMURA 1970): Ae ( a ) = 1 ∑ i pi2( a ) . unde N este numărul de indivizi diploizi dintr-o populaŃie. pi(a) reprezintă frecvenŃa relativă a alelei Ai la locusul genic A. unde ni(a) reprezintă numărul de alele la gena A – parametrul atinge valoare maximă: Ae ( a ) = 1 n( a ) × 1 n(2a ) 1 = n( a ) 1 n( a ) ( )= Valoarea minimă (1) este atinsă în cazul în care locusul genic este monomorf. Această valoarea maximă este atinsă numai atunci când toŃi indivizii unei populaŃii sunt heterozigoŃi şi fiecare alelă este reprezentată o singură dată în populaŃie.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. în care: Ae(a) reprezintă numărul efectiv de alele la locusul genic A.

frainetto) Dacă se calculează numărul efectiv de alele la mai mulŃi loci (pentru fondul de gene) se foloseşte media armonică: 1 1   Ae =  ∑ L a A  e(a )   −1 HeterozigoŃia aşteptată (He) Este parametrul cel mai cunoscut şi cel mai utilizat pentru caracterizarea variaŃiei genetice intrapopulaŃionale. Se poate deduce uşor că pentru acest parametru este valabilă relaŃia: 0≤ He < 1. Se calculează cu următoarea formulă: H e ( a ) = 1 − ∑ pi2( a ) . în care: i He(a) reprezintă heterozigoŃia aşteptată la locusul genic A.frecvenŃa relativă a alelei Ai la locusul genic A. Totuşi termenul de heterozigoŃie aşteptată este cel mai folosit pe plan internaŃional.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. Astfel. gene diversity) (NEI 1973). este important de reŃinut că acest parametru se bazează exlusiv pe structurile alelice. Valoarea heterozigoŃiei aşteptate pentru fondul de gene se calculează ca medie aritmetică: 47 . Pe de altă parte. heterozigoŃia este un atribut al genotipurilor (indivizilor) iar observarea heterozigoŃiei presupune cunoaşterea structurilor genotipice. şi în prezentul tratat chiar dacă poate fi oarecum greşit interpretat. În funcŃie de autor acest parametru este denumit heterozigoŃia aşteptată sau diversitatea genetică (engl. fiind adoptat. ceea ce înseamnă că poate fi calculat în absenŃa oricărei informaŃii privind structurile genotipice. pi(a) . expected heterozygosity sau genetic diversity) (BERG and HAMRICK 1997) respectiv diversitate genică (engl.

frainetto) He = ∑H a e(a) L În unele lucrări parametrul He este dat şi ca valoare procentuală (înmulŃit cu 100). Pii (a ) .Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. parametrul numit heterozigoŃia observată corespunde proporŃiei heterozigoŃilor în populaŃia dată. Dacă 48 . în care: i j i H o (a ) reprezintă heterozigoŃia observată. multiplicity).frecvenŃa relativă a genotipurilor heterozigote la locusul genic A. aceşti doi parametrii se mai numesc indici ai multiplicităŃii (engl. calculul parametrilor variaŃiei genetice intrapopulaŃionale se poate baza fie pe identificarea locilor polimorfi (PPL) sau numărarea alelelor care apar la mai mulŃi loci genici (A/L) fără însă să se Ńină cont de frecvenŃele alelelor. De aceea. HeterozigoŃia observată (Ho) La un locus genic A. Pij (a ) . Se calculează după cum urmează: H o ( a ) = ∑∑ Pij ( a ) = 1 − ∑ Pii ( a ) cu i ≠ j. HeterozigoŃia este un atribut al genotipurilor şi de aceea heterozigoŃia observată spre deosebire de heterozigoŃia aşteptată se bazează numai pe structura genotipică şi nu poate fi calculată plecând de la strucutra alelică a unui locus genic. Evident este valabilă relaŃia: 0 ≤ Ho ≤ 1. Valoarea heterozigoŃiei observate pentru fondul de gene se calculează ca medie aritmetică: Ho = ∑H a o(a) L În concluzie.frecvenŃa relativă a genotipurilor homozigote la locusul genic A.

În cazul în care indicele de fixare are valori pozitive.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. Ho – reprezintă heterozigoŃia observată. frainetto) însă se iau în considerare frecvenŃele tipurilor genetice. iar dacă FK are valori negative. cu atât populaŃia este mai apropiată de starea de echilibru genetic. He – reprezintă heterozigoŃia aşteptată. În cazul unui ansamblu de m loci se calculează un indice de fixare mediu după următoarea formulă: 1 m ∑ FK m K =1 F= 49 . în care: He FK – indicele de fixare. Cu cât valorile FK sunt mai mici. 1986) şi redă măsura în care o populaŃie se abate de la starea de echilibru Hardy – Weinberg. fiind extins ulterior de Nei (1977. şi aici ne referim in principal la alele. Între cei doi parametrii există următoarea relaŃie: H e = 1 − ∑ pi2 = 1 − 1 1 =1− 2 i ∑p 1 Ae Indicele de fixare Acest indice a fost propus de Wright (1965) pentru cazurile de bialelism. FK = 1Ho . se vorbeşte de indici ai diversităŃii. atunci populaŃia respectivă poate fi caracterizată cu un deficit de heterozigoŃi. Cei mai importanŃi parametri ai diversităŃii sunt Ae şi He. populaŃia prezintă un exces de heterozigoŃi.

conform următoarelor formule: Pii = pi2 pentru toŃi homozigoŃii Pij = 2 pi pj pentru toŃi heterozigoŃii. heterozigoŃia observată (Ho) şi indicele de fixare (Fk). numărul efectiv de alele pe locus (Ne). Dacă există încrucişare randomizată atunci există o legătură între structura alelică şi structura genotipică.1). iar probabilitatea de a se forma un genotip Aj Ai este: pj♀ x pi♂=pjpi. În concluzie. Dacă se unesc două tipuri diferite de gameŃi avem: pipj. diversitatea genetică) (He). Iar frecvenŃa acestor genotipuri va avea: Ai Ai (Pii) =( pi♀ x pj♂) + (pj♀ x pi♂) = 2 50 . frainetto) Structura Hardy-Weinberg SavanŃii Hardy (englez) şi Weinberg (german) au putut demonstra că frecvenŃa homozigoŃilor şi cea a heterozigoŃilor într-o populaŃie rămâne constantă timp de generaŃii dacă anumite condiŃii sunt îndeplinite. Structură alelică cunoscută rezultă structura genetică. Fie o populaŃie în care încrucişarea are loc pe bază de întâmplare iar la locusul genic A avem: pi = pi♀=pi♂ (frecvenŃa alelei i este aceeaşi atât în gameŃii femeli cât şi în cei masculi). iar probabilitatea de a se forma un genotip Ai Ai este: pi♀ x pi♂=pi2 . numărul mediu de alele pe locus (Na). cu toŃi aceşti parametrii se poate estima diversitatea genetică în populaŃia de gârniŃă din U. probabilitatea de a se forma un genotip Ai Aj este: pi♀ x pj♂=pipj. iar frecvenŃa homozigoŃilor de tipul Ai Ai (Pii) = pi2 . heterozigoŃia aşteptată (diversitatea genică. După care a urmat prelucrarea datelor obŃinute cu ajutorul programului GenAlex (Version 6.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.P V Seaca luată în studiu. Cu ajutorul programului GenAlex se poate determina frecvenŃa alelelor.

CAPITOLUL IV Diversitatea genetică a gârniței 51 .

29. Arborii heterozigoŃi au două peak-uri . frainetto) 4. iar arborii homozigoŃi au un singur peak.4.heterozigot cu genotipul 269/271 bp 52 . În urma rulării celor 32 de probe de ADN cu ajutorul secvenŃiatorului au fost obŃinute următoarele rezultate: 1. Pentru primul locus marker ZAG11 vor fi prezentate în continuare câteva exemple de arbori heterozigoŃi şi câteva exemple de arbori homozigoŃi.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.PIE040. Pentru locusul ZAG11. atât heterozigoŃi. cât şi homozigoŃi sunt reprezentaŃi prin culoare verde. GOT004).1 Arborele nr. Fig.1 Date primare În cadrul proiectului s-au determinat cu ajutorul secvenŃiatorului Beckman-Coulter electroforegramele pentru fiecare locus marker ( ZAG.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.homozigot cu genotipul 250 bp Fig.2 Arborele 19.38.3 Arborele nr.homozigot cu genotipul 252 bp 53 . 4. frainetto) Fig. 4.

homozigot cu genotipul 125 bp 54 . frainetto) Pentru locusul marker ZAG39 arborii atât heterozigoŃi şi homozigoŃi sunt de culoare neagră.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.17. Exemple de electroforegrame pentru acest marker sunt redate în figurile: Fig.4 Arborele nr.4.

heterozigot cu genotipul 108/112 bp Fig.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.5 Arborele nr. frainetto) Fig.heterozigot cu genotipul 143/145 bp 55 .4.6 Arborele nr. 39.4. 23.

4. frainetto) .8 Arborele nr.homozigot cu genotipul 160 bp Fig.14-homozigot cu genotipul 162 bp 56 .locusul marker ZAG96 este de culoare verde ca şi ZAG11.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.17. Fig.4.7 Arborele nr.

9 Arborele nr. 15.locusul marker ZAG110 este de culoare albastră.homozigot cu genotipul 207 bp 57 .homozigot cu genotipul 208 bp Fig.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. frainetto) . Fig.10 Arborele nr. 30. 4.4.

heterozigot cu genotipul 207/213 bp Fig.homozigot cu genotipul 207 bp 58 .Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. frainetto) Fig. 12 Arborele nr. 37.11 Arborele nr.36. 4.4.

4.heterozigot cu genotipul 86/88 bp 59 . 10-heterozigot cu genotipul 86/88 bp Fig. Fig.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. 4.locusul marker ZAG112 este de culoare albastră ca şi ZAG110. frainetto) .13 Arborele nr. 14 Arborele nr. 22.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. În continuare vor fi câteva exemple: Fig. Următorul locus marker este GOT004.4. Arborii homozigoŃi au un singur peak.4.11.15 Arborele nr.heterozigot cu genotipul 98/100 bp 2. frainetto) Fig. acesta este repezentat prin culoare albastră la fel ca ZAG110 şi ZAG112.16 Arborele nr.iar cei heterozigoŃi au doua peak-uri.25-homozigot cu genotipul 293 bp 60 .

frainetto) Fig 4.17 Arborele nr.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. 31.homozigot cu genotipul 285 bp 61 .

heterozigot cu genotipul 284/285 bp 3.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. Exemple de electroforegrame pentru acest marker sunt redate în figurile următoare: 62 .18 Arborele nr. având aceeaşi culoare ca ZAG11 şi ZAG96. Şi în acest locus regăsim arbori homozigoŃi cu un singur peak şi heterozigoŃi cu două peak-uri. 30. Ultimul locus marker PIE040 este de culoare verde. frainetto) Fig.4.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. 32.4. frainetto) Fig.20 Arborele nr.19 Arborele nr.4.26-heterozigot cu genotipul 176/184 bp Fig.heterozigot cu genotipul 181/184 bp 63 .

21 Arborele nr.heterozigot cu genotipul 176/181 bp Fig.40.4.heterozigot cu genotipul 178/180 bp 64 .Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.4. frainetto) Fig.22 Arborele nr.33.

iar 22 de arbori n-au rulat.1) au fost observaŃi 24 de arbori homozigoŃi şi 7 arbori heterozigoŃi.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. Au fost observate alele ce diferă ca un multiplu de baze. . 25.2 Structura genotipică Stuctura genotipică arată distribuŃia frecvenŃelor relative ale genotipurilor. 4.23 Arborele nr. La markerul ZAG112 (tabelul4.în cazul locusului ZAG39 (tabelul 4. urmând a fi rulaŃi într-o altă etapă. 16 nu au rulat.homozigot cu genotipul 181 bp 4. 65 . frainetto) Fig. iar restul până la 31 de arbori genotipizaŃi. Genotipurile arborilor studiaŃi din populaŃia de gârniŃă din Seaca-Optăşani sunt redate în următoarele tabele: În tabel au fost genotipizaŃi 31 de arbori.2) au fost observaŃi 6 arbori homozigoŃi şi 9 arbori heterozigoŃi.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.1 Tabel centralizator cu genotipurile observate la markerul ZAG112 Arborele de gârniŃă 9 10 11 12 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 PopulaŃia Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Genotipul 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 86 88 88 88 88 88 88 88 86 86 88 88 88 88 86 88 88 88 88 88 88 100 88 88 96 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 96 88 88 88 88 88 88 66 . frainetto) Tabelul 4.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. frainetto) Tabelul 4.2 Tabel centralizator cu genotipurile observate la markerul ZAG39 Arborele de gârniŃă 9 10 11 12 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 PopulaŃia Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Genotipul 0 111 0 0 0 0 0 125 143 0 0 0 0 143 0 127 111 115 0 123 125 123 0 111 113 111 123 127 156 164 0 0 129 0 0 0 0 0 125 169 0 0 0 0 145 0 161 111 115 0 123 125 169 0 111 133 159 161 159 159 168 0 67 .

68 . frainetto) Tabelul 4.3 Tabel centralizator cu genotipurile observate la markerul ZAG96 Arborele de gârniŃă PopulaŃia Genotipul – 9 Seaca 0 0 Seaca 10 162 180 Seaca 11 162 164 Seaca 12 156 156 Seaca 14 162 162 Seaca 15 154 168 Seaca 16 0 0 Seaca 17 160 160 Seaca 18 154 156 Seaca 19 160 162 Seaca 20 158 166 Seaca 21 0 0 Seaca 22 0 0 Seaca 23 162 164 Seaca 24 166 166 Seaca 25 162 170 Seaca 26 158 160 Seaca 27 154 162 Seaca 28 154 168 Seaca 29 154 170 Seaca 30 150 162 Seaca 31 152 166 Seaca 32 0 0 Seaca 33 154 164 Seaca 34 164 172 Seaca 35 164 166 Seaca 36 144 152 Seaca 37 152 168 Seaca 38 156 160 39 Seaca 164 168 40 Seaca 146 146 pentru acest locus au fost observaŃi 5 arbori homozigoŃi şi 21 arbori heterozigoŃi.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.

frainetto) Tabelul 4.4 Tabel centralizator cu genotipurile observate la markerul ZAG110 Arborele de gârniŃă PopulaŃia Genotipul – 9 Seaca 0 0 Seaca 10 207 221 Seaca 11 207 213 Seaca 12 207 213 Seaca 14 207 213 Seaca 15 209 223 Seaca 16 0 0 Seaca 17 207 211 Seaca 18 207 211 Seaca 19 207 207 Seaca 20 207 209 Seaca 21 0 0 Seaca 22 0 0 Seaca 23 207 209 Seaca 24 209 223 Seaca 25 207 217 Seaca 26 207 207 Seaca 27 207 207 Seaca 28 207 207 Seaca 29 207 229 Seaca 30 207 207 Seaca 31 207 207 Seaca 32 207 207 Seaca 33 207 217 Seaca 34 207 207 Seaca 35 207 207 Seaca 36 207 213 Seaca 37 207 207 Seaca 38 207 207 39 Seaca 207 219 40 Seaca 207 227 pentru ZAG110 au fost observaŃi 16 arbori heterozigoŃi şi 13 arbori homozigoŃi. 69 .Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. frainetto) Tabelul 4.5 Tabel centralizator cu genotipurile observate la markerul ZAG11 Arborele de gârniŃă PopulaŃia Genotipul – 9 Seaca 0 0 Seaca 10 253 269 Seaca 11 253 253 Seaca 12 0 0 Seaca 14 253 271 Seaca 15 243 251 Seaca 16 0 0 Seaca 17 253 279 Seaca 18 243 253 Seaca 19 253 253 Seaca 20 251 253 Seaca 21 0 0 Seaca 22 0 0 Seaca 23 253 271 Seaca 24 253 253 Seaca 25 253 253 Seaca 26 251 251 Seaca 27 253 269 Seaca 28 251 253 Seaca 29 269 271 Seaca 30 253 253 Seaca 31 251 269 Seaca 32 253 253 Seaca 33 255 255 Seaca 34 253 269 Seaca 35 253 253 Seaca 36 253 253 Seaca 37 253 253 Seaca 38 253 253 39 Seaca 257 269 40 Seaca 253 269 pentru ZAG11 au fost observaŃi 14 arbori heterozigoŃi şi 12 arbori homozigoŃi 70 .

71 . frainetto) Tabelul 4.6 Tabel centralizator cu genotipurile observate la markerul PIE040 – Arborele de gârniŃă PopulaŃia Genotipul Seaca 17 181 181 Seaca 18 180 184 Seaca 19 180 181 Seaca 20 180 190 Seaca 21 180 181 Seaca 22 180 183 Seaca 23 180 181 Seaca 24 180 180 Seaca 25 180 180 Seaca 26 176 184 Seaca 27 180 184 Seaca 28 180 181 Seaca 29 180 181 Seaca 30 180 184 Seaca 31 180 184 Seaca 32 180 184 Seaca 33 176 180 Seaca 34 180 180 Seaca 35 180 181 Seaca 36 180 180 Seaca 37 180 181 Seaca 38 180 181 39 Seaca 181 184 40 Seaca 179 180 pentru PIE040 au fost observaŃi 19 arbori heterozigoŃi şi 5 arbori homozigoŃi.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. frainetto) Tabelul 4. PopulaŃia Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Seaca Genotipul 72 .7 Tabel centralizator cu genotipurile observate la markerul GOT004 Arborele de gârniŃă – 17 291 293 18 295 306 19 284 291 20 284 303 21 282 298 22 300 303 23 291 294 24 287 291 25 293 304 26 284 289 27 282 284 28 289 304 29 295 304 30 283 285 31 285 304 32 284 304 33 293 304 34 283 284 35 289 299 36 295 303 37 293 303 38 293 296 39 Seaca 283 285 40 Seaca 283 284 pentru PIE040 au fost observaŃi 24 arbori heterozigoŃi şi 0 arbori homozigoŃi.

200 0.8 Structura alelică la markerul ZAG112 Alela 86 88 96 100 FrecvenŃa 0. întâlnite la mai multe din speciile actuale de cvercinee) (Curtu et al.600 0. Freque ncy 1. Cea mai mică frecvenŃă se găseşte la alelele 100.800 0.000 0. nici una nu depăşeşte pragul de 10%. frainetto) 4. Celelalte alele au frecvenŃe foarte reduse.887 0.032 0.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.3 Structura alelică Structura alelică arată distribuŃia frecvenŃelor alelelor la un anumit locus genic şi cu ajutorul acesteia se poate afla care este cea mai reprezentativă alelă pentru populaŃia studiată. respectiv 96 şi care se consideră a fi rezultatul unor indels (se presupune că alele de lungimi mari sunt nişte alele foarte vechi.016 În figura 4.24 FrecvenŃa alelelor pentru ZAG112 Prin compararea datelor de mai sus s-a constatat că în cazul populaŃiei de gârniŃă analizate. 73 .065 0.24 este reprezentată frecvenŃa alelelor (ZAG112) în populaŃia SeacaOptăşani. la locusul ZAG112 din cele 4 alele descoperite cea mai ridicată frecvenŃă o are alela 88 bp care atinge frecvenŃa de 80%. 2004). Tabelul 4.000 Slatina 86 88 ZAG112 Locus 96 100 Figura 4.400 0.

176 0.050 0.25 FrecvenŃa alelelor pentru ZAG39 74 .Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. Tabelul 4.029 0.029 0.200 0.059 Freque ncy 0.9).118 0.100 0.150 0.118 0.059 0.088 0.059 0.029 0. frainetto) Pentru markerul ZAG39 structura alelică este mai variată( tabelul 4.000 Slatina 111 113 115 123 125 127 129 133 143 145 156 159 161 164 168 169 ZAG39 Locus Figura 4.059 0.029 0.029 0.059 0.029 0.9 Structura alelică la markerul ZAG39 Alela 111 113 115 123 125 127 129 133 143 145 156 159 161 164 168 169 FrecvenŃa 0.029 0.

5%. 125 au frecvenŃe mai reduse decât alela 111.019 0.200 0.173 0.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. Tabelul 4.019 Freque ncy 0.10 Structura alelică la markerul ZAG96 Alela 144 146 150 152 154 156 158 160 162 164 166 168 170 172 180 FrecvenŃa 0.000 144 146 150 152 154 156 158 160 162 164 166 168 170 172 180 ZAG96 Locus Figura 4.26 FrecvenŃa alelelor pentru ZAG96 Slatina 75 . nedepăşind pragul de 10%.038 0.100 0.5%. frainetto) În cazul markerului ZAG39 din cele 16 alele descoperite cea mai ridicată frecvenŃă o alealela 111 care atinge frecvenŃa de 15.115 0. Alele 123 şi.038 0.058 0.019 0. şi anume 11.096 0.077 0.077 0.038 0.050 0.115 0. Celelalte alele au frecvenŃe reduse.150 0.096 0.019 0.

400 0.27 alela cu cea mai mare frecvenŃă este 207 cu un procent de 65. alela 162 are frecvenŃa ce mai mare de 15.019 0.600 0. 150. acestea se consideră a fi rezultatul unor indels (se presupune că alele de lungimi mari sunt nişte alele foarte vechi.000 Slatina 207 209 211 213 217 219 221 223 227 229 ZAG110 Locus Figura 4.037 0.037 0. întâlnite la mai multe din speciile actuale de cvercinee) (Curtu et al. celelalte având frecvenŃe reduse ce nu depăşeşte 20%.800 0.27 FrecvenŃa alelelor pentru ZAG110 76 .019 0.5%.667 0.200 0.019 0.11 Structura alelică la markerul ZAG110 Alela 207 209 211 213 217 219 221 223 227 229 FrecvenŃa 0. 2004). Tabelul 4. 172 şi 180 au aceeaşi frecvenŃă de aproximativ 10%.5%.alele 144.037 0.074 0. frainetto) Referitor la markerul ZAG96. Freque ncy 0.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.074 0.019 În figura 4.

038 0.019 0.800 0.115 0.577 0.019 Pentru locusul ZAG11.000 Slatina 243 251 253 255 257 269 271 279 ZAG11 Locus Figura 4.400 0.12 Structura alelică la markerul ZAG11 Alela 243 251 253 255 257 269 271 279 FrecvenŃa 0. Freque ncy 0.600 0. alela 269 are o valoare de 20%.038 0.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. iar celelalte alele nu depăşesc nici 10%. frainetto) Tabelul 4.058 0.28 FrecvenŃa alelelor pentru ZAG11 77 . adică alele de lungimi foarte mari sunt alele foarte vechi.135 0.alela cu cea mai mare frecvenŃă este alela 253 care are o valoare ce atinge 60%. Ca şi la ZAG110 alelele cu frecvenŃă sub 10% sunt considerate rezultatul unor indels.200 0.

urmată de alela 181 cu o frecvenŃă de 30% şi alela 184 cu o frecvenŃă de 15%.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.500 0.5%.600 0.521 0.13 Structura alelică la markerul PIE040 Alela 176 179 180 181 183 184 190 FrecvenŃa 0.200 0. alela 180 are frecvenŃa cea mai mare de 55. Freque ncy 0.29 FrecvenŃa alelelor pentru PIE040 183 184 190 78 .300 0.100 0.229 0. celelalte au o frecvenŃă sub 10%.042 0.000 Slatina 176 179 180 181 PIE040 Locus Figura 4.146 0. frainetto) Tabelul 4.021 0.021 0.400 0.021 Pentru locusul PIE040.

021 Pentru GOT004.021 0.063 0. şi anume alelele 283. Freque ncy 0.021 0.100 0.150 0.050 0.125 0.021 0. alelele au frecvenŃe destul de ridicate.30 FrecvenŃa alelelor pentru GOT004 79 .083 0.083 0.146 0.042 0.14 Structura alelică la markerul GOT004 Alela 282 283 284 285 287 289 291 293 294 295 296 298 299 300 303 304 306 FrecvenŃa 0.021 0.104 0.304.000 Slatina 282 283 284 285 287 289 291 293 294 295 296 298 299 300 303 304 306 GOT004 Locus Figura 4.5%.063 0.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.021 0.293.urmată de celelalte alele cu valori apropiate de cea a alelei 284.083 0.303.021 0.200 0. DiferenŃele între alele sunt de o singură pereche de baze.291. frainetto) Tabelul 4.063 0. dar cea mai mare valoare o are alela 284 de 16.

000 8. • He .226.indicele de fixare.792 1.15 Valorile estimate pentru indicii diversității genetice Locus ZAG112 ZAG39 ZAG96 ZAG110 ZAG11 PIE040 GOT004 N 31 17 26 27 26 24 24 Na 4.099 0.6% din indivizii analizaŃi sunt heterozigoŃi.170 2.115 10.numărul efectiv de alele pe locus.000 15.093 • N .910 0.652 0.000 Ne 1.208. În populaŃia de gârniŃă Seaca au fost analizaŃi 31 de arbori.755 Ho 0. ceea ce înseamnă că populaŃia studiată se apropie de stare de echilibru genetic( F=-0. Când indicele de fixare are volori negative populaŃia prezintă un exces de heterozigoŃi. 1.numărul mediu de alele pe locus.808 0. HeterozigoŃia observată Ho=0.262.593 0.000 7.088).000 16.144 -0.226 0.647 0.000 He 0.629 0.000 10.208 0. • F .000 17.106 -0.538 0.088 0. Tabelul 4.numărul de arbori analizaŃi. 4 Indicii diversității genetice Cu ajutorul structurilor genotipice şi alelice prezentate anterior s-au estimat indicii genetici cu programul GenAlex.heterozigoŃia aşteptată (diversitatea genetică).Diversitatea genetică a gârniŃei (Q.873 11. 80 .915 F -0.214 -0. HeterozigoŃia aşteptată conform legii Hardy-Weinberg He=0.904 0.262 11.693 2. frainetto) 4.289 0. • Ho . La locusul genic ZAG112 au fost găsite 4 alele.heterozigoŃia observată. Numărul efectiv de alele pe locus este de 1. ceea ce înseamnă că 22.539 0. Indicele de fixare are valori negative. • Ne .400 2. • Na .

3. La locusul PIE040 au fost găsite 7 alele.647. numărul efectiv de alele pe locus este de 2.2% 81 . Indicele de fixare are valori pozitive (F=0. numărul efectiv de alele pe locus este de 2.Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. ceea ce înseamnă că 79.808. numărul efectiv de alele pe locus este de 2. HeterozigoŃia observată Ho=0. La locusul ZAG11 au fost găsite 8 alele.7% din indivizii analizaŃi sunt heterozigoŃi.400. HeterozigoŃia observată Ho=0.538. HeterozigoŃia aşteptată conform legii Hardy-Weinberg He=0. La locusul ZAG96 au fost găsite 15 alele.099). 5. La locusul ZAG39 au fost găsite 16 alele. Indicele de fixare are valori pozitive( F=0.115 . Indicele de fixare are valori pozitive (F=0. 4. ceea ce înseamnă că 59. 6. ceea ce înseamnă că populaŃia studiată se apropie de stare de echilibru genetic( F=-0.8% din indivizii analizaŃi sunt heterozigoŃi. La locusul ZAG110 au fost găsite 10 alele.792.170.8% din indivizii analizaŃi sunt heterozigoŃi.873. Când indicele de fixare are volori negative populaŃia prezintă un exces de heterozigoŃi. numărul efectiv de alele pe locus este de 10. deci populaŃia este apropiată de starea de echilibru genetic.693. HeterozigoŃia observată Ho=0. ceea ce înseamnă că 53. numărul efectiv de alele pe locus este de 11.3% din indivizii analizaŃi sunt heterozigoŃi.106).289) ceea ce înseamnă că populaŃia este apropiată de starea de echilibru genetic. HeterozigoŃia observată Ho=0. Când indicele de fixare are volori pozitive populaŃia prezintă un exces de homozigoŃi. Indicele de fixare are valori negative.144). deci populaŃia este apropiată de starea de echilibru genetic.629. HeterozigoŃia aşteptată conform legii Hardy-Weinberg He=0. HeterozigoŃia observată Ho=0. HeterozigoŃia aşteptată conform legii Hardy-Weinberg He=0. HeterozigoŃia aşteptată conform legii Hardy-Weinberg He=0.593.593. frainetto) 2.910. ceea ce înseamnă că 64. ceea ce înseamnă că 80.904.

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. frainetto)

din indivizii analizaŃi sunt heterozigoŃi. HeterozigoŃia aşteptată conform legii Hardy-Weinberg He=0,652. Indicele de fixare are valori negative (F=-0,214), deci populaŃia este apropiată de starea de echilibru genetic şi populaŃia prezintă un exces de heterozigoŃi. 7. La locusul GOT004 au fost găsite 17 alele, numărul efectiv de alele pe locus este de 11,755. HeterozigoŃia observată Ho=1,000, ceea ce înseamnă că 100% din indivizii analizaŃi sunt heterozigoŃi. HeterozigoŃia aşteptată conform legii Hardy-Weinberg He=0,915. Indicele de fixare are valori negative (F=-0,093), deci populaŃia este apropiată de starea de echilibru genetic şi populaŃia prezintă un exces de heterozigoŃi. Testarea echilibrului Hardy – Weinberg, presupune evaluarea diferenŃelor dintre frecvenŃele observate şi cele teoretice (aşteptate) ale genotipurilor în ipoteza panmixiei. Printr-o distanŃă genetică se cuantifică cât de mult sau de puŃin se deosebesc structurile genetice a două populaŃii. Parametrii de distanŃă se bazează, de regulă, pe structurile alelice.

Tabelul 4.16 Testarea echilibrului genetic Locus
ZAG112 ZAG39 ZAG96 ZAG110 ZAG11 PIE040 GOT004 ns= nesemnificativ *p<0,05 ; **p<0,01 ; ***p<0,001.

Probe
0.998 0.005 0.514 0.963 0.067 0.995 0.534

Nesemnificativ
ns ** ns ns ns ns ns

– – – –

82

Diversitatea genetică a gârniŃei (Q. frainetto)

4.5 Concluzii
Prin aplicarea unor metode de ultimă generaŃie s-a determinat genotipul pentru 49 de arbori la locusul genic ZAG112,ZAG39, ZAG96, ZAG110, ZAG11; PopulaŃia de gârniŃă Seaca este foarte apropiată de starea de echilibru genetic; Indicele de fixare tinde mai mult spre valori negative, ceea ce înseamnă că populaŃia prezintă un exces de heterozigoŃi; O singură genă marker a fost suficientă pentru diferenŃiearea a 31 de genotipuri; Este primul studiu din Ńara noastră privind estimarea variabilităŃii genetice cu ajutorul secvenŃelor simple repetitive de ADN prin electroforeză capilară la specii de interes forestier; Diversitatea genică estimată a fost de circa 4 ori mai mare decât cea raportată în studiile efectuate cu ajurul aloenzimelor;

83

B. Piese scrise

84

CAPITOLUL V Bibliografie

85

1... vol.. Stănescu V. 1985: Genetica ecologică. ecologia şi însuşirile ecologice ale speciilor). Şofletea N. ChiriŃă C. Şofletea N. Şofletea N. 1977: StaŃiuni forestiere. D. Gailing O...R. EdiŃia a III-a. vol. Valeriu E... Şofletea N. Editura „Pentru ViaŃă”. Editura „ Pentru ViaŃă”. Editura „Pentru ViaŃă”. 2000: Soluri şi staŃiuni forestiere (Lucrări practice). 2001: Fiziologia plantelor lemnoase. Braşov 17.. Editura CERES. Nei M. Bucureşti. Editura CERES.a. Bucureşti. Braşov. ş.. Bucureşti..S.. Spârchez Gh. Târziu D. II (Corologia. 2001: Dendrologie.. Braşov. 1998: Silvicultura cu bazele geneticii forestiere. Braşov. Curtu L.. 1997: Elemente de geologie şi geomorfologie. Târziu. 1997: Pedologie şi StaŃiuni forestiere.. 2. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 70 6. Editura UniversităŃii Transilvania. Editura Silvodel. Marcu M.. Braşov. Bucureşti 5. Braşov. Editura „Pentru ViaŃă”. 10. Haralamb A. 11. Curtu L. Bucureşti. Parascan D. Popescu O. Târziu D. Braşov.. Vlad I. 2001: Dendrologie. 2005: Genetică şi ameliorarea arborilor.. Braşov. 14. Dincă L. Bucureşti.. Stănescu V. Curtu A. Finkeldey R. 12...T. Târziu D. 2006: Pedologie şi staŃiuni forestiere. Editura CERES. 16.. Danciu M. 4. Editura „Pentru ViaŃă”. 7. 13. Curtu L. Şofletea N....... 2007: Dendrologie. 86 .. Editura Lux Libres. 1973: Analysis of gene diversity in subdivided populations.). Şofletea N. Editura CERES. Editura Academiei R. 2004: Comparative sequencing of a microsatellite locus reveals size homoplasy within and between european oak species (Quercus spp. 1997: Flora forestieră lemnoasă a României. Plant Molecular Biology Reporter 3.1983: Meteorologie şi climatologie forestieră. Bucureşti. 15. Spârchez Gh.. Editura Agro-Silvică.. Editura CERES.. I (Determinarea şi descrierea speciilor).. 8.L. 9. 1967: Cultura speciilor forestiere.

Gailing O.. Vornam B. Conserv Genet 19.) based on microsatellite markers. Decarli N.. 2004: Spatial distribution of genetic variation in a natural beech stand (Fagus sylvatica L.18. 87 ..