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ISSN 1679-6535 Dezembro, 2006 Fortaleza, CE


Foto: Maria do Socorro M. Rufino

Metodologia Cientfica: Determinao da Atividade Antioxidante Total em Frutas no Sistema -caroteno/cido Linolico

Maria do Socorro Moura Rufino1 Ricardo Elesbo Alves2 Edy Sousa de Brito3 Jorge Mancini Filho4 Ana Vldia Bandeira Moreira5

Introduo
Uma das maiores alteraes que ocorrem durante o processamento, distribuio, armazenamento e preparo dos alimentos a oxidao. E a oxidao lipdica se destaca, pois pode afetar a qualidade nutricional, segurana, cor, sabor, aroma e textura dos alimentos. As reaes oxidativas, alm de produzirem diminuio no valor nutricional dos alimentos, so tambm responsveis pela formao de compostos potencialmente txicos e antinutricionais para o organismo humano e animal (Kanazawa et al., 1985; Shahidi & Wanansundara, 1992). Existem substncias com propriedades antioxidantes utilizadas no processamento de leos e gorduras e nos alimentos que, em geral, so capazes de retardar a oxidao lipdica (Moreira & Mancini Filho, 2003). Os antioxidantes podem ser naturais, como cido ascrbico, -tocoferol e compostos fenlicos presentes nos alimentos, ou sintticos, como 6-hidroxi1 Engenheira

2,5,7,8-tetrametilchroman-2-cido carboxlico (Trolox), hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT). Dentre estes, Trolox o composto sinttico mais utilizado, por ser um anlogo da vitamina E e ser de natureza hidrossolvel. Os antioxidantes sintticos esto restritos a um mximo de 200 mg/kg pelos cdigos bromatolgicos de diversos pases, e tm sido freqentemente monitorados devido a possveis danos que eles podem vir a provocar no organismo (Babich, 1992). Componentes como o -caroteno agem inibindo o oxignio singleto e interagem sinergicamente com a vitamina E, para inibir a peroxidao lipdica. Outros constituintes fenlicos em alimentos, tais como os flavonides, podem tambm reduzir os danos causados pelo estresse oxidativo (Schwenke, 1998). O sistema -caroteno/cido linolico foi desenvolvido por Marco (1968), modificado por Miller (1971) e

Agrnoma, M. Sc., Bolsista da CAPES, Doutoranda, UFERSA, BR 110, Km 47, 59625-900, Mossor, RN, marisrufino@yahoo.com.br Agrnomo, D. Sc. em Ps-Colheita, Pesquisador da Embrapa Agroindstria Tropical, R. Dra. Sara Mesquita, 2270, Pici, 60511-110, Fortaleza, CE, elesbao@pesquisador.cnpq.br 3 Qumico Industrial, D. Sc. em Tecnologia de Alimentos, Pesquisador da Embrapa Agroindstria Tropical, edy@cnpat.embrapa.br 4 Farmacutico Bioqumico, Ph. D., Professor Titular, USP, Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 14, Butant, 05508-900, So Paulo, SP, jmancini@usp.br 5 Nutricionista, D. Sc., Professora Adjunta I, UFRN, Av. Cordeiro de Farias, s/n, Petrpolis, 59100-180 Natal, RN, ana.vladia@terra.com.br
2 Engenheiro

Metodologia Cientfica: Determinao da Atividade Antioxidante Total em Frutas no Sistema -caroteno/cido Linolico

utiliza o cido linolico, monopalmitato de polioxietileno sorbitan (Tween 40) e o -caroteno. Trata-se de um ensaio espectrofotomtrico baseado na oxidao (descolorao) do -caroteno induzida pelos produtos da degradao oxidativa do cido linolico (Silva et al., 1999), ou seja, o mtodo avalia a atividade de inibio de radicais livres gerados durante a peroxidao do cido linolico (Duarte-Almeida et al., 2006). Neste comunicado, so relatadas todas as informaes necessrias para a determinao da atividade antioxidante total em frutas no sistema -caroteno/ cido linolico, baseadas em adaptaes/modificaes feitas nos laboratrios da Embrapa Agroindstria Tropical.

Proveta de 50 mL Tubos de 2 mL Tubos de ensaio com tampa rosqueada (18 mL)

Preparo de Solues
Soluo de lcool Metlico a 50%
Em balo volumtrico de 1 L, adicionar 500 mL de lcool metlico; completar o volume para 1.000 mL com gua destilada, homogeneizar e transferir para um frasco de vidro devidamente etiquetado. Armazenar em temperatura ambiente por tempo indeterminado.

Soluo de Acetona a 70%


Em balo volumtrico de 1 L, adicionar 700 mL de acetona; completar o volume para 1.000 mL com gua destilada, homogeneizar e transferir para um frasco de vidro devidamente etiquetado. Armazenar em temperatura ambiente por tempo indeterminado.

2. Materiais Necessrios
Reagentes
-Caroteno - Merck, cdigo 01111324, ou equivalente. Acetona P.A. cido linolico - Acros organics, cdigo 01111322,
ou equivalente.

Soluo Controle de Trolox 200 mg/L


Dissolver 2 mg de Trolox em aproximadamente 5 mL de lcool etlico e completar o volume para 10 mL em um balo volumtrico com lcool etlico, homogeneizar e transferir para um frasco de vidro mbar devidamente etiquetado. Preparar e usar apenas no dia da anlise. Nos testes realizados em laboratrio, foi constatado que a concentrao de 200 mg/L de Trolox a que proporciona a maior proteo ao sistema, quando comparada a outras (Fig. 1), sugerindo-se, portanto, o seu uso.

gua destilada lcool etlico P.A. lcool metlico P.A. Clorofrmio Trolox (PM = 250,29) Sigma, cdigo 218940050,
ou equivalente.

Tween 40

Tratamento da gua Destilada


Submeter aproximadamente 500 mL de gua destilada a borbulhamento com oxignio (oxigenador) por 30 minutos.

Equipamentos e Vidrarias
Agitador de tubos de ensaio Balana analtica Balo volumtrico 100 mL e 1.000 mL Banho-maria Becker 25 mL e 100 mL Cronmetro digital Cubetas de vidro (4 x 1 cm) Erlenmeyer 250 mL Espectrofotmetro Oxigenador Pipeta automtica (10 1.000 L)

Soluo -Caroteno 20 mg/mL

Pesar 20 mg de -caroteno em um tubo de 2 mL, protegido da luz com papel alumnio, adicionar 1 mL de clorofrmio, agitar e utilizar imediatamente.

Soluo Sistema -caroteno/cido Linolico


Em um erlenmeyer, adicionar 40 L de cido linolico, 530 L de Tween 40, 50 L da soluo -caroteno e, para solubilizar, adicionar 1 mL de clorofrmio, homogeneizar e, posteriormente, evaporar o clorofrmio com o auxlio do oxigenador. Em seguida, adicionar a gua tratada com oxignio at obter uma

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sistema 200 mg/L 100 mg/L 50 mg/L 25 mg/L

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 15 30 45 60


Tempo (min)

Absorbncia (470 nm)

75

90

105

120

Fig. 1. Atividade antioxidante de diferentes concentraes de trolox no sistema -caroteno/cido linolico.

absorbncia entre 0,6 nm e 0,7 nm a 470 nm. A soluo sistema apresenta uma colorao amareloalaranjada (Fig. 2); deve ser sempre protegida da luz e prontamente utilizada.
Foto: Maria do Socorro M. Rufino

Embrapa Agroindstria Tropical, com diferentes frutas, tm-se utilizado de 1 g a 25 g de amostra, de acordo com a fruta. Pesar a amostra em um bquer de 100 mL, adicionar 40 mL de metanol 50%, homogeneizar e deixar em repouso por 60 minutos temperatura ambiente. Centrifugar a 25.406,55 g (15.000 rpm) durante 15 minutos, transferir o sobrenadante para um balo volumtrico de 100 mL. A partir do resduo da primeira extrao, adicionar 40 mL de acetona 70%, homogeneizar e deixar em repouso por 60 minutos temperatura ambiente. Centrifugar novamente a 25.406,55 g (15.000 rpm) durante 15 minutos, transferir o sobrenadante para o balo volumtrico contendo o primeiro sobrenadante e completar o volume para 100 mL com gua destilada.

Determinao da Atividade Antioxidante Total (AAT)


Fig. 2. Soluo -caroteno/cido linolico.

Protocolo do Mtodo -caroteno/cido Linolico


Obteno dos Extratos da Fruta
Este procedimento foi adaptado de Larrauri et al. (1997). Como a concentrao de compostos antioxidantes varia de fruta para fruta, fazem-se necessrios testes prvios. Em anlises realizadas no Laboratrio de Fisiologia e Tecnologia Ps-Colheita, da

A partir do extrato obtido no item anterior, preparar em tubos de ensaio, no mnimo trs diluies diferentes, em triplicata. Misturar 0,4 mL de cada diluio do extrato com 5 mL da soluo sistema (item soluo sistema -caroteno/cido linolico). Utilizar como controle 0,4 mL da soluo de trolox (item soluo controle de trolox 200 mg/L) com 5 mL da soluo sistema -caroteno/cido linolico, homogeneizar os tubos de ensaio em agitador e manter em banho-maria a 40 C. Realizar a primeira leitura (470 nm) aps 2 minutos de efetuada a mistura e depois em intervalos de quinze minutos at 120 minutos. O espectrofotmetro deve ser calibrado com gua.

Metodologia Cientfica: Determinao da Atividade Antioxidante Total em Frutas no Sistema -caroteno/cido Linolico

Os resultados so expressos em percentagem de inibio da oxidao. A reduo da absorbncia do sistema sem antioxidante (Eq. 1) considerada como 100% de oxidao. Reduo da absorbncia = Absinicial Absfinal (Eq. 1)

Referncias
BABICH, H. Butylated
hydroxytoluene (BHT): a review. Environmental Research, v.29, p.1-29, 1992. DUARTE-ALMEIDA, J.M.; SANTOS, R.J.; GENOVESE, M.I.; LAJOLO, F.M. Avaliao da atividade antioxidante utilizando sistema b-caroteno/cido linolico e mtodo de seqestro de radicais DPPH. Cincia e Tecnologia de Alimentos, v.26, n.2, p.446-452, 2006. KANAZAWA, K.; KANAZAWA, A.E.; NATAKE, M. Uptake of secundary autoxidation products of linoleic and by the rat. Lipids, v.20, n.7, p.412-419, 1985. LARRAURI, J.A.; RUPREZ, P.; SAURA-CALIXTO, F. Effect of drying temperature on the stabilitity of polyphenols and antioxidant activity of red grape pomace peels. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.45, p.1390-1393, 1997. MARCO, G. A rapid method for evaluation of antioxidants. Journal of the American Oil Chemists Society, v.45, p.594598, 1968. MILLER, H.E. A simplified method for the evaluation of antioxidant. Journal of the American Oil Chemists Society, v.48, p.91, 1971. MOREIRA, A.V.B.; MANCINI FILHO, J. Atividade antioxidante das especiarias mostarda, canela e erva-doce em sistemas aquoso e lipdico. Nutrire, v.25, p.31-46, 2003. SCHWENKE, D.C. Antioxidants and atherogenesis. The Journal of Nutritional Biochemistry, v.9, p.424-445, 1998. SHAHIDI, F.; WANASUNDARA, P.K.J.D. Phenolic antioxidants. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v.32, p.67, 1992. SILVA, F.A.M.; BORGES, M.F.M.; FERREIRA, M.A. Mtodos para avaliao do grau de oxidao lipdica e da capacidade antioxidante. Qumica Nova, v.22, n.1, p.95-103, 1999.

O decrscimo da leitura da absorbncia das amostras correlacionado com o sistema e estabelece a percentagem de oxidao (Eq. 2), subtraindo-se a percentagem de oxidao de cada amostra de 100 (Eq. 3). Verifica-se a ao antioxidante da amostra (fruta), comparando-a com a atividade do antioxidante sinttico (trolox). [(Reduo Abs) amostra x 100] (Reduo Abs) sistema

% Oxidao =

(Eq. 2)

% Proteo = 100 (% Oxidao)

(Eq. 3)

Agradecimentos
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) e Unio Europia pelo apoio financeiro - Projetos Atividade antioxidante de frutas do Nordeste brasileiro como fator de Proteo da Sade CNPq Edital CT-Sade/MCT/MS 030/2004 Processo 506.633/2004-7 e Producing added value from under-utilised tropical fruit crops with high commercial potential - Sixth Framework Programme Contrato 0015279, respectivamente.

Comunicado Tcnico, 126


Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Exemplares desta edio podem ser adquiridos na: Embrapa Agroindstria Tropical Endereo: Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Pici, CEP 60511-110 Fortaleza, CE Fone: (0xx85) 3299-1800 Fax: (0xx85) 3299-1803 / 3299-1833 E-mail: negocios@cnpat.embrapa.br 1a edio on line: dezembro de 2006

Comit de Publicaes

Presidente: Francisco Marto Pinto Viana Secretrio-Executivo: Marco Aurlio da Rocha Melo Membros: Janice Ribeiro Lima, Andra Hansen Oster, Antonio Teixeira Cavalcanti Jnior, Jos Jaime Vasconcelos Cavalcanti, Afrnio Arley Teles Montenegro, Ebenzer de Oliveira Silva. Supervisor editorial: Marco Aurlio da Rocha Melo Reviso de texto: Jos Ubiraci Alves Editorao eletrnica: Arilo Nobre de Oliveira Normalizao bibliogrfica: Ana Ftima Costa Pinto.

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