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IEB 448 LABORATORIO DE BIORREACTORES METODOLOGÍA ANALÍTICA EXPERIENCIAS DE FERMENTACIÓN GUÍA DE LABORATORIO

INTRODUCCIÓN Para llevar a cabo las experiencias relacionadas con la puesta en marcha y operación de fermentadores, es necesario utilizar diversas técnicas analíticas para la determinación de las variables involucradas en el proceso. Dentro de las variables más importantes a analizar se encuentran la concentración celular, la concentración de sustratos y la concentración de productos si los hubiera. En este curso las experiencias de fermentación se llevarán a cabo utilizando una cepa de Saccharomyces cerevisiae, utilizando glucosa como fuente de carbono y energía y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno. Para determinar la concentración celular se empleará la técnica del peso seco. La concentración de sacarosa se determinará utilizando la técnica de determinación de azúcares reductores del ácido dinitrosalicílico. OBJETIVOS Familiarizarse con los procedimientos de las metodologías analíticas que se emplearan en las experiencias de fermentación. Confeccionar las curvas patrones para las metodologías analíticas de las determinaciones de concentración celular y concentración de fuente de carbono. METODOLOGÍA Determinación de la concentración celular mediante la técnica del peso seco • A la suspensión celular que se les entregará en el laboratorio se le debe determinar la masa de células secas por unidad de volumen en duplicado. Para esto se centrifuga un volumen conocido de suspensión (20 mL) a 10.000 rpm por 10 minutos, se retira el sobrenadante y se lava el residuo de células con agua desionizada. El lavado del residuo se realiza resuspendiendo las células en agua desionizada y centrifugando de la misma forma que la suspensión original. Se realizan al menos tres lavados. Después del último lavado, se retira el sobrenadante, el pellet se resuspende en una cantidad mínima de agua desionizada (suficiente para poder vaciarlo al recipiente donde se secará) y se introduce en la estufa de secado en un recipiente previamente secado y pesado. Las dos muestras de células se dejen secar a 105 ºC hasta que alcancen peso constante. La concentración celular de la suspensión se obtiene con los valores del peso seco de las células y el volumen de suspensión de donde se extrajeron. Para realizar la curva patrón de células, la suspensión celular inicial se debe someter a sucesivas diluciones y determinar su absorbancia a 650nm utilizando agua desionizada como blanco. Para construir la curva patrón se grafica la absorbancia a 650 nm versus la concentración celular. La concentración celular correspondiente a cada valor de absorbancia se obtiene a partir de la concentración celular de la suspensión original y la dilución de la misma.

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Se debe realizar una curva patrón con glucosa en un rango entre 0 y 1. Enfriar y aforar a 250 mL con agua desionizada. Procedimiento • • • • • • En tubos de ensayo con tapa rosca se adicionan 1 mL de la muestra a analizar y 1 mL del reactivo DNS. 0.1.4. Introducir los tubos tapados en un baño de agua a ebullición.5 g de ácido dinitrosalicílico. en donde se incuban por 5 minutos. 0. Adicionar 10 mL de agua desionizada a cada tubo y dejar reposar por 10 min. 0.6. Calentar y agregar lentamente 2.Determinación de glucosa mediante el método del Ácido dinitrosalicílico Preparación del reactivo Para preparar 250 ml de reactivo DNS se debe proceder de la siguiente manera: • • • • A alrededor de 120 mL de agua desionizada se adicionan 4 g de NaOH y se solubilizan bajo agitación.0 g/L (0. Disolver luego en esta mezcla. Determinar la absorbancia a 540 nm utilizando como blanco una muestra de 1 mL de agua desionizada. 75 g de tartrato de sodio y potasio. también bajo agitación.8 y 1. 2 .0 g/L). Enfriar los tubos en un baño de hielo.